ES2260378T3 - Pcr multiplex cuantitativa con un intervalo dinamico elevado. - Google Patents
Pcr multiplex cuantitativa con un intervalo dinamico elevado.Info
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Abstract
Un método para una PCR multiplex cuantitativa con un intervalo dinámico de al menos 102, preferiblemente de 103 y más preferiblemente de 104, donde se utiliza una DNA polimerasa termoestable con una concentración final de al menos 0, 5 unidades/µl.
Description
PCR multiplex cuantitativa con un intervalo
dinámico elevado.
La presente invención se refiere al campo de las
PCR en tiempo real y, más concretamente, al campo de la
cuantificación de ácidos nucleicos, en concreto el mRNA celular.
La cuantificación del mRNA ha constituido una
tarea destacada en el campo de la biología molecular para obtener
información sobre la expresión de algunos genes de interés en
concreto. Tradicionalmente, esta se ha realizado mediante el
análisis Northen Blot semicuantitativo o mediante ensayos de
protección de ribonucleasas semicuantitativos.
Además, la disponibilidad de la tecnología de la
PCR y especialmente de la PCR asociada a transcriptasa inversa
(RT-PCR), ha proporcionado una detección
cuantitativa más sensible de los mRNA en poca abundancia de las
muestras pequeñas. En la RT-PCR, primero se produce
mediante el uso de la transcriptasa inversa un cDNA de cadena única
a partir del mRNA a analizar. A continuación, con la ayuda de la PCR
se genera un producto de amplificación de DNA de doble cadena.
Existe una distinción entre dos variantes
distintas de este método. En la denominada cuantificación relativa
el porcentaje de expresión de un determinado RNA diana se determina
con relación a la cantidad de RNA de un gen denominado de
mantenimiento (o "housekeeping", del inglés) que se supone que
está expresado de forma constitutiva en todas las células
independientemente de su respectivo estado fisiológico. Por lo tanto
el mRNA está presente en aproximadamente la misma cantidad en todas
las células. La ventaja de esto radica en que las diferentes
cualidades iniciales de los distintos materiales de muestra y el
proceso de preparación del RNA no influyen en el resultado en
particular. Sin embargo, con este método no es posible una
cuantificación absoluta.
De forma alternativa, la cantidad absoluta de
RNA utilizado se puede determinar con la ayuda de ácidos nucleicos
estándar con un número de copias conocido y la amplificación de una
serie de dilución correspondiente de este ácido nucleico estándar.
Cuando se utilizan referencias internas, es decir, mediante la
amplificación del ácido nucleico diana y el estándar en un
recipiente de reacción, se deben utilizar las referencias que tienen
secuencias diferentes en comparación con el ácido nucleico que se
analizará para poder hacer la distinción entre la amplificación del
ácido nucleico diana y la del estándar.
Se puede progresar aún más mediante la
aplicación de los métodos de la PCR en tiempo real o cinética, que
permiten un seguimiento cinético de la reacción de amplificación y
por lo tanto una cuantificación más precisa de determinadas
moléculas diana en concreto.
En este caso, en cada ciclo de la PCR se hace el
seguimiento de la formación de los productos de la PCR. Normalmente
la amplificación se mide en cicladores térmicos que tienen
dispositivos adicionales para medir las señales de fluorescencia
durante la reacción de amplificación. Un ejemplo típico es el Roche
Molecular Biochemicals LightCycler (Núm. Cat. 2 0110468). Por
ejemplo, los productos de amplificación se detectan por medio de
sondas de hibridación marcadas con fluorescencia que solo emiten
señales de fluorescencia cuando están unidas al ácido nucleico diana
o, también en algunos casos, por medio de colorantes fluorescentes
que se unen al DNA de doble
cadena.
cadena.
En todas las reacciones a analizar se determina
un umbral de señal definido y el número de ciclos de punto de corte
necesarios para alcanzar este valor de umbral para el ácido nucleico
diana y los ácidos nucleicos de referencia como el gen estándar o
el gen de mantenimiento. Los números absolutos o relativos de copias
de la molécula diana se pueden determinar mediante los valores de
Punto de corte obtenidos en el caso del ácido nucleico diana y el
ácido nucleico de referencia (Gibson, U.E., et al., Genome
Res 6 (1996) 995-1001.; Bieche, I., et al.,
Cancer Res 59 (1999) 2759-65.; WO 97/46707). Este
tipo de métodos también recibe el nombre de una PCR en tiempo
real.
A modo de resumen, en todos los métodos
descritos para la cuantificación de un ácido nucleico mediante PCR,
el número de copias formadas durante la reacción de amplificación
siempre está relacionado con el número de copias formadas de un
ácido nucleico de referencia que es un estándar o un RNA de un gen
de mantenimiento.
En muchos casos es de especial interés
cuantificar más de una diana de ácido nucleico dentro de un
recipiente de reacción en un formato de tipo multiplex. Por ejemplo,
este es el caso de realizaciones de cuantificación relativa en las
que el nivel de expresión de un determinado mRNA se determina en
comparación con el nivel de expresión de un gen de mantenimiento
típico (Meijerink, J., et al., J Mol Diag 3 (2001)
55-61). Además, la cuantificación simultánea de
diferentes especies de mRNA puede ser interesante en el caso de que
fuera necesario analizar patrones de expresión más complejos para
investigar o analizar procesos celulares complejos.
El inconveniente principal de las PCR multiplex
es que en muchas ocasiones no es posible amplificar con una
eficiencia razonable una especie diana de ácido nucleico con una
abundancia baja comparada con una segunda especie diana de ácido
nucleico, de modo que no se detecta la señal de amplificación
respectiva correspondiente a la diana de ácido nucleico de baja
abundancia (por ejemplo: Bercovich, D., et al., Biotechniques
27 (1999) 762-770). En otras palabras, el intervalo
dinámico de las cantidades de ácido nucleico detectables en un
formato multiplex es muy limitado en un gran número de casos.
En este contexto es importante destacar que el
intervalo dinámico de un formato multiplex normalmente es
independiente de los valores absolutos de los diferentes ácidos
nucleicos diana a detectar, pero depende casi exclusivamente de la
proporción molar de los diferentes ácidos nucleicos diana presentes
en la muestra a analizar.
Sin embargo, sorprendentemente, el intervalo
dinámico que se puede obtener parece ser dependiente del ensayo y
de la diana: Vet, J.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 96
(1999) 6394-9 describen un sofisticado ensayo
multiplex para la detección de cuatro Retrovirus patógenos
utilizando balizas moleculares en el que el intervalo dinámico es
10^{4}. Del mismo modo, Director-Myska, A. E.,
et al., Environ Mol Mutagen 37 (2001) 147-154
describen un análisis específico de mezcla de plásmidos cuantitativo
mediante el uso del formato nucleasa 5' fluorogénico (formato
TaqMan), en el que se alcanza un intervalo dinámico de entre
10^{3} y 10^{4}.
Tucker, R. A., et al., Mol Diagn 6 (2001)
39-47 describen un ensayo de PCR en tiempo real
TaqMan para una cuantificación relativa de mRNA de HPV16 frente a
mRNA de la beta-actina, donde la amplificación de 5
x 10^{4} copias de actina no afecta a la amplificación del RNA de
HPV16, sin embargo, por otro lado, un exceso de 100 veces del molde
de mRNA de HPV16 inhibe la amplificación de la
beta-actina. En especial a partir de este ejemplo,
se puede llegar a la conclusión de que aún falta mucho para entender
la base molecular de los problemas en la obtención de un intervalo
dinámico razonable en la PCR multiplex.
Los especialistas han intentado superar este
problema mediante un ajuste adecuado de las concentraciones de los
cebadores. Halminen, M., et al., Cytokine 11 (1999)
87-93 describen la cuantificación relativa del mRNA
del interferón gamma y el mRNA del interferón-4 en
comparación con la expresión de la beta-actina,
donde se utilizan cantidades limitadas de cebadores de la
beta-actina. Del mismo modo, Bercovich, D., et
al., Biotechniques 27 (1999) 762-770 recomiendan
la inclusión de una cantidad elevada de cebadores del ácido nucleico
diana con poca representación o, de forma alternativa, disminuir la
temperatura de hibridación de dichas reacciones multiplex.
Sin embargo, todos los métodos descritos en este
campo necesitan un amplio periodo de adaptación de las condiciones
de la PCR, como prerrequisito de una medición adecuada y precisa de
las concentraciones de ácido nucleico. Por lo tanto, es necesaria la
creación de un protocolo estándar para la PCR multiplex, que
proporcione un intervalo dinámico amplio y razonable sin una
adaptación específica en cuanto a la naturaleza de la diana o la
concentración de los cebadores utilizados.
Por consiguiente, la invención nueva proporciona
un método para la PCR multiplex cuantitativa con un intervalo
dinámico de al menos 10^{2}, donde se usa una DNA polimerasa
termoestable con una concentración final de al menos 0,5
unidades/\mul. Preferiblemente se obtiene un intervalo dinámico de
al menos 10^{3} y, más preferentemente, un intervalo dinámico de
al menos 10^{4}.
Más concretamente, la invención va dirigida a un
método para la cuantificación por medio de una PCR de al menos un
primer y segundo ácido nucleico de una muestra, que se caracteriza
por que la concentración inicial del primer ácido nucleico de la
muestra se encuentra en exceso según un factor de más de 100 en
comparación con la concentración inicial del segundo ácido
nucleico. Dicha PCR consta de: la adición de un primer par de
cebadores para la amplificación del primer ácido nucleico, la
adición de un segundo par de cebadores para la amplificación de un
segundo ácido nucleico y la amplificación de dos ácidos nucleicos
mediante una DNA polimerasa termoestable. De acuerdo con la
invención, dicha DNA polimerasa termoestable está presente en una
concentración de al menos 0,5 unidades/\mul de reacción, y la
amplificación del segundo ácido nucleico no se inhibe hasta menos
del 10% en comparación con la amplificación del segundo ácido
nucleico con el segundo par de cebadores en ausencia de dicho
primer par de cebadores.
También se ha demostrado que si una PCR de
acuerdo con la presente invención se lleva a cabo por medio del
inicio en caliente (hot start), es decir mediante una inhibición
adecuada de la formación del dímero del cebador, esto representa una
ventaja adicional. En este caso, la DNA polimerasa de acuerdo con la
invención está presente en una concentración de al menos 0,25
unidades/\mul.
El método innovador se puede aplicar
especialmente si se hace el seguimiento en tiempo real de la
amplificación por PCR. Preferentemente, cada uno de los productos de
amplificación obtenidos se detecta mediante al menos una sonda de
hibridación marcada con fluorescencia.
En una realización específica se utilizan dos
sondas de hibridación adyacente para cada ácido nucleico diana y
cada sonda se marcador apropiadamente con una fracción fluorescente
de tal modo que dichas fracciones pueden realizar una transferencia
de energía por resonancia de fluorescencia durante la hibridación
(sondas de hibridación FRET).
En otra realización preferida, que también puede
incluir el seguimiento en tiempo real, las reacciones de
amplificación se realizan por medio de un termociclado rápido, en el
que un ciclo dura menos de un minuto.
Desde otro punto de vista, la invención va
dirigida a equipos que constan de reactivos para llevar a cabo el
método(s) innovador(es). Preferentemente, dicho equipo
consta de una master mix (mezcla de reacción) formada por
una DNA polimerasa termoestable en una concentración suficiente para
proporcionar una concentración final de dicha DNA polimerasa de al
menos 0,5 unidades/\mul o, de forma alternativa, de al menos 0,25
unidades/\mul y por los compuestos adicionales necesarios para el
protocolo de amplificación de inicio en caliente.
La nueva invención proporciona un método para la
PCR mutliplex cuantitativa con un intervalo dinámico de al menos
10^{2}, en el que se utiliza una DNA polimerasa termoestable con
una concentración final de al menos 0,5 unidades/\mul.
Preferentemente, se obtiene un intervalo dinámico de al menos
10^{3} y más preferentemente, un intervalo dinámico de
10^{4}.
También es importante destacar que el método
innovador se puede aplicar a una amplia variedad de diferentes
concentraciones de la diana. En este contexto, en los ejemplos
también se demostrará que el mismo intervalo dinámico de acuerdo
con la invención se obtiene al menos en el caso de que los ácidos
nucleicos a amplificar en un ensayo multiplex estén presentes en
unas cantidades de copias comprendidas entre 10^{2} y
10^{8}.
En el contexto de la presente invención, se
define una unidad de DNA polimerasa termoestable como la cantidad de
enzima que incorpora 20 nmol del total de
desoxiribonucleosidotrifospatos en un DNA precipitable por ácido en
60 minutos, a 65ºC y bajo unas condiciones de ensayo estándar.
Estas condiciones son: 67 mM de Tris/HCl, pH
8,3/25ºC, 5 mM de MgCl_{2}, 10 mM de Mercaptoetanol, 0,2% de
polidocanol, 0,2 mg/ml de gelatina, 0,2 mM cada dATP, dGTP, dTTP y
0,1 mM dCTP, pH 8,3/25ºC.
La actividad se puede medir mediante la
incubación de M13mp9ss, cebador M13 (17 mer) y 1
\muCi(alfa-32-P)dCTP
con las diluciones adecuadas de Taq polimerasa en un tampón de
incubación de 50 \mul, a 65ºC y durante 60 minutos. Entonces,
mediante la precipitación de ácido tricloracético, se determina la
cantidad de dNTP incorporados.
La PCR multiplex de acuerdo con la invención,
además del modo en que se ha descrito anteriormente en el campo, se
define como un ensayo con PCR, en el que se amplifica más de una
secuencia diana de ácidos nucleicos en un recipiente de reacción en
presencia de más de un par de cebadores de amplificación.
La invención va dirigida de forma explícita
hacia un método para la cuantificación mediante PCR de al menos un
primer y un segundo ácido nucleico de una muestra. En muchas de sus
aplicaciones, los ácidos nucleicos diana a analizar derivan de un
RNA celular total o un RNA poli-A total (mRNA). Para
un análisis mediante RT-PCR como este, la
cuantificación se consigue mediante una síntesis de cDNA dependiente
de RNA anterior a la propia reacción de la amplificación. La
reacción de síntesis del cDNA se puede realizar utilizando una
transcriptasa inversa específica seguida de la amplificación con una
DNA polimerasa termoestable convencional. De forma alternativa, la
síntesis del cDNA y la RT-PCR se pueden realizar
utilizando una enzima termoestable que posee tanto la transcriptasa
inversa dependiente de RNA como la actividad DNA polimerasa
dependiente de DNA.
A pesar de lo anterior, el DNA genómico también
se puede analizar según un enfoque multiplex de acuerdo con la
invención; por ejemplo, para la determinación de las dosis de genes
o de la cantidad de secuencias repetitivas.
En el contexto de la presente invención, el
término "cuantificación de un ácido nucleico" puede comprender
diferentes posibilidades, como por ejemplo la determinación absoluta
de los números de copia de los múltiples ácidos nucleicos presentes
en una muestra en comparación con un estándar de referencia absoluto
o, de forma alternativa, la determinación de un valor relativo en
comparación con otros ácidos nucleicos encontrados en la
muestra.
Por supuesto, también entra dentro del marco de
la invención si no solo se amplifican dos sino más bien múltiples
ácidos nucleicos. En cuanto a la cantidad de dianas a analizar, aún
no se ha determinado el límite superior de forma experimental. Sin
embargo, en la práctica experimental el método innovador solo está
limitado por el número de posibilidades de detectar los distintos
fragmentos amplificados.
Las concentraciones iniciales de los distintos
ácidos nucleicos diana que son de interés según la invención pueden
diferenciarse unas de las otras en al menos un factor de 100.
Además, los inventores también han probado que el nuevo método se
puede aplicar de forma amplia a situaciones donde las
concentraciones de inicio de los distintos ácidos nucleicos diana
pueden diferenciarse entre ellas en un factor de 1000 o incluso de
10.000. En los ejemplos de más adelante se muestran los datos
respectivos a esto.
Un ensayo característico de acuerdo con la
invención constará de un par de cebadores de amplificación para
cada ácido nucleico diana que se debe cuantificar, un tampón
adecuado, desoxinucleósidos trifosfato y una DNA polimerasa
termoestable en una concentración de al menos 0,5 unidades/\mul de
reacción. Independientemente del tipo y de la cantidad de las dianas
de amplificación a cuantificar, la concentración de enzimas elevada
garantizará que la amplificación de las dianas de baja abundancia no
sea inhibida en más de un 10% por la presencia de otras dianas
amplificadas en comparación con la amplificación de la diana de
ácido nucleico de baja abundancia en un enfoque monoplex.
Por el contrario, la concentración máxima de la
polimerasa que se puede aplicar es normalmente de 10
unidades/\mul. Las concentraciones de alrededor de 5
unidades/\mul, es decir entre 3 y 7 unidades/\mul, o
preferiblemente alrededor de 2 unidades/\mul, es decir entre 1 y 3
unidades/\mul, también funciona muy bien en la mayoría de los
casos.
Además, la amplificación se puede realizar en
presencia de agentes que proporcionan un medio para la detección de
los productos de amplificación. Por ejemplo, puede ser que el
recipiente de reacción ya contenga las sondas de hibridación
adecuadas para la detección homogénea en tiempo real de los
productos de amplificación. Preferentemente, estas sondas se pueden
marcar de forma adecuada con fracciones fluorescentes.
También se han demostrado que si una PCR de
acuerdo con la invención se realiza por medio del inicio en
caliente, es decir mediante una inhibición adecuada de la formación
de dímeros de cebadores, representa una ventaja adicional. Dicha
formación de los dímeros de cebadores se debe principalmente a la
actividad residual de la polimerasa a las temperaturas ambientes
anteriores a la propia reacción de termociclado. En contraposición a
los protocolos de amplificación habituales, durante el protocolo de
inicio en caliente, la actividad de la polimerasa solo se activa
después del calentamiento inicial, excluyendo así cualquier
actividad a temperaturas inferiores que induzca a la hibridación o
la amplificación de producto no específico (p. ej. dímeros de
cebadores). Este paso resultó ser más crítico en el contexto de una
PCR multiplex donde hay una carga incrementada de oligonucleótidos
(cebadores, sondas fluorescentes, producto amplificado) en el mismo
recipiente de reacción.
Los inventores han demostrado que la aplicación
de una técnica de inicio en caliente escogida de forma arbitraria
reduce en un factor alrededor de dos la necesidad de las cantidades
en exceso de polimerasa termoestable. Por lo tanto, de acuerdo con
la invención, un protocolo fiable para una PCR multiplex con un
intervalo dinámico de al menos 10^{2} consta de la utilización de
una concentración de DNA polimerasa final de al menos 0,25
unidades/\mul combinada con una técnica de inicio en caliente
arbitraria.
Por consiguiente, la presente invención también
va dirigida a un método para la cuantificación de al menos un
primer y un segundo ácido nucleico de una muestra mediante PCR, cuya
característica es que la concentración inicial del primer ácido
nucleico de la muestra es superior en un factor mayor de 100 a la
concentración inicial del segundo ácido nucleico y consta de: la
adición de un primer par de cebadores para la amplificación del
primer ácido nucleico; la adición de un segundo par de cebadores
para la amplificación del segundo ácido nucleico; la amplificación
de dos ácidos nucleicos mediante una DNA polimerasa termoestable,
donde dicha DNA polimerasa termoestable está presente en una
concentración de al menos 0,25 unidades/\mul de reacción, y donde
la amplificación del segundo ácido nucleico no se inhibe en menos de
un 10% en comparación con la amplificación del segundo ácido
nucleico mediante el segundo par de cebadores en ausencia de dicho
primer par de cebadores; y donde se lleva a cabo una PCR de inicio
en caliente.
Por lo tanto, la formación de dímeros de
cebadores se puede inhibir mediante varios métodos ya conocidos en
el campo.
Por ejemplo, se inactiva la DNA polimerasa de
forma reversible como resultado de una modificación química. Más
exactamente, los grupos de bloqueo lábiles al calor se introducen en
la Taq DNA polimerasa provocando la inactivación de la enzima a
temperatura ambiente. Estos grupos de bloqueo se eliminan a una
temperatura elevada durante un paso previo a la PCR de tal modo que
la enzima se vuelve activa. Una modificación lábil al calor como
esta se puede obtener, por ejemplo, mediante el acoplamiento de
anhídrido citracónico o anhídrido aconítico a los residuos de lisina
de la enzima (US 5.677.152). Las enzimas que llevan estas
modificaciones de momento se comercializan como Amplitaq Gold
(Moretti, T., et al., Biotechniques 25 (1998)
716-22) o como FastStart DNA Polymerase (Roche
Molecular Biochemicals).
De forma alternativa, se ha demostrado que la
elongación de los cebadores hibridados de forma no específica es
inhibida por la adición de fragmentos cortos de DNA de doble cadena
(Kainz, P., et al., Biotechniques 28 (2000)
278-82). En este caso, la elongación de los
cebadores se inhibe a temperaturas inferiores al punto de fusión
del fragmento corto de DNA de doble cadena, pero independiente de la
secuencia del propio DNA competidor. Aún más específicamente, se
pueden utilizar aptámeros de oligonucleótidos con una secuencia
específica que da lugar a una estructura secundaria definida. Dichos
aptámeros se han seleccionado utilizando la tecnología SELEX para
una alta afinidad por la DNA polimerasa (US 5.693.502), (Lin, Y.
Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997) 100-11). La
presencia de dichos aptámeros dentro de la mezcla de amplificación
previamente al propio proceso de termociclado, da lugar de nuevo a
una unión a la DNA polimerasa de gran afinidad y por consiguiente
una inhibición lábil al calor de su actividad.
Otro enfoque para conseguir la inhibición lábil
al calor de la Taq DNA polimerasa es la adición de anticuerpos
monoclonales generados frente a la enzima purificada (Kellogg, D.
E., et al., Biotechniques 16 (1994) 1134-7;
Sharkey, D. J., et al., Biotechnology (NY) 12 (1994)
506-9). Del mismo modo que los aptámeros de
oligonucleótidos, el anticuerpo se une a la Taq DNA polimerasa con
una gran afinidad a temperatura ambiente de forma inhibidora. El
complejo se disocia en un paso de precalentamiento anterior al
propio proceso de termociclado. Esto lleva a una prolongación
considerable del tiempo de amplificación en su conjunto,
especialmente si se aplican los protocolos para el termociclado
rápido (WO 97/46706).
\newpage
A pesar de todo, tanto si la técnica de inicio
en caliente se aplica como si no, el método innovador se puede
aplicar especialmente si se hace el seguimiento en tiempo real de la
amplificación por PCR dando como resultado un formato de detección
homogéneo. Así, los productos de amplificación obtenidos se detectan
preferiblemente mediante al menos una sonda de hibridación marcada
con fluorescencia. La base instrumental para dicho seguimiento en
tiempo real la proporcionan instrumentos comercializados como el
Roche Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals), el ABI Prism 7700
(Perkin Elmer) o el iCycler (BioRad).
Tal y como ya se ha indicado, las sondas de
hibridación marcadas por fluorescencia se pueden utilizar para el
seguimiento en tiempo real. Las sondas de hibridación utilizadas
para el método innovador según la invención son, normalmente, ácidos
nucleicos de cadena única como por ejemplo DNA o RNA de cadena única
o derivados de los mismos, o, de forma alternativa, PNA que hibridan
con el ácido nucleico diana a la temperatura de hibridación de la
reacción de amplificación. Estos oligonucleótidos normalmente tienen
una longitud de 20 a 100 nucleó-
tidos.
tidos.
El marcaje se puede introducir en cualquier
ribosa o grupo fosfato del oligonucleótido dependiendo del formato
de detección empleado. Se prefiere el marcaje en los extremos 5' y
3' de la molécula de ácido nucleico.
El tipo de marcador se debe detectar en el modo
de tiempo real de la reacción de amplificación. Esto no solo es
posible para las sondas marcadas con fluorescencia sino que también
es posible con la ayuda de marcadores que se pueden detectar
mediante NMR. Sin embargo, en concreto se prefieren los métodos en
los que los ácidos nucleicos se detectan con la ayuda de al menos
una sonda de hibridación marcada con fluorescencia.
Se pueden realizar varios procedimientos de
prueba. Los tres formatos de detección siguientes han demostrado
ser especialmente útiles en relación con la presente invención, pero
no se deben entender como un límite del alcance de la
invención.
Para este formato de prueba se utilizan de forma
simultánea dos sondas de hibridación de cadena única complementarias
a sitios adyacentes de la misma cadena del ácido nucleico diana
amplificado. Las dos sondas están marcadas con distintos componentes
fluorescentes. Cuando se excitan con una luz de longitud de onda
adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al
segundo componente de acuerdo con el principio de transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia, de tal modo que se puede
medir una emisión de fluorescencia del segundo componente cuando
ambas sondas de hibridación se unen a las posiciones adyacentes de
la molécula diana a detectar.
Considerando todos los formatos de detección
posibles dentro del alcance de la presente invención, se ha
demostrado que esta "sonda de hibridación-FRET"
es altamente sensible, exacta y fiable.
De forma alternativa, también es posible
utilizar un cebador marcado con fluorescencia y solo una sonda
oligonucleotídica marcada (Bernard, P. S., et al., Anal
Biochem 255 (1998) 101-7.).
Una sonda de hibridación de cadena única se
marcador con dos componentes. Cuando se excita el primer componente
con una luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida
se transfiere al segundo componente, el denominado desactivador de
fluorescencia, según el principio de transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia. Durante el paso de hibridación de la
reacción de PCR, la sonda de hibridación se une al DNA diana y es
degradada por la actividad exonucleasa 5'-3' de la
Taq polimerasa durante la siguiente fase de elongación. Por
consiguiente, el componente fluorescente excitado y el desactivador
de fluorescencia se separan espacialmente el uno del otro y así se
puede medir la emisión de fluorescencia del primer componente.
Estas sondas de hibridación también se marcan
con un primer componente y un desactivador de fluorescencia,
preferiblemente los marcadores se sitúan en los dos extremos de la
sonda. Debido a la estructura secundaria de la sonda, ambos
componentes se encuentran próximos en el espacio cuando están en
forma diluida. Después de la hibridación con los ácidos nucleicos
ambos componentes se separan de tal modo que después de la
excitación con una luz de una longitud de onda adecuada se puede
medir la emisión de fluorescencia del primer componente (US
5.118.801).
También entra dentro del alcance de la invención
si la PCR en tiempo real se realiza utilizando una fracción de
unión a ácidos nucleicos de doble cadena. Por ejemplo, el producto
de amplificación respectivo también se puede detectar, según la
invención, mediante un colorante fluorescente de unión a DNA que
emite, tras la excitación con una luz de una longitud de onda
adecuada, una señal de fluorescencia correspondiente cuando tiene
lugar la interacción con el ácido nucleico de doble cadena. Se ha
demostrado que los colorantes SybrGreen y SybrGold (Molecular
Probes) son particularmente adecuados para esta aplicación. De forma
alternativa se pueden utilizar colorantes intercalables. Sin
embargo, en este formato, para poder distinguir los distintos
productos de amplificación, es necesario realizar un análisis de la
curva de fusión correspondiente (US 6.174.670).
En otra realización preferida, que también puede
incluir el seguimiento en tiempo real, las reacciones de
amplificación se realizan por medio del termociclado rápido, donde
un ciclo es inferior a un minuto. La base instrumental para dicho
termociclado rápido la proporciona por ejemplo el LightCycler (Roche
Molecular Biochemicals) y está descrita en WO 97/46707 y WO
97/46712. Según la presente invención, en la amplificación
cuantitativa de los ácidos nucleicos que solo están presentes en la
muestra con poca abundancia la hibridación de los cebadores no
constituye el paso limitador de velocidad. Por lo tanto, no es
necesario modificar los parámetros temporales de un protocolo de
termociclado multiplex correspondiente para poder amplificar los
parámetros de poca abundancia, en comparación con cualquiera de los
diferentes protocolos de termociclado conocidos en el campo.
En otro aspecto, la invención está dirigida a
equipos que constan de reactivos para llevar a cabo el
método(s) innovador(es). Más específicamente, dicho
equipo puede estar formado por una master mix que se puede
utilizar para la amplificación de tal modo que solo sea necesario
añadir previamente a la propia reacción de termociclado la muestra a
analizar, los cebadores adecuados y un poco de agua para ajustar el
volumen de reacción.
De acuerdo con la invención, la master
mix está formada por una DNA polimerasa termoestable en una
concentración suficiente para proporcionar una concentración final
de dicha DNA polimerasa termoestable de al menos 0,5
unidades/\mul. Los equipos específicos de los parámetros pueden
también contener cebadores con las secuencias respectivas. Estos
oligonucleótidos incluso se pueden incluir en la master
mix.
Además, dicho equipo puede estar formado por
reactivos adecuados para una detección homogénea de los productos
generados por la PCR en tiempo real, por ejemplo sondas de
hibridación marcadas con fluorescencia o fracciones de unión a DNA
de doble cadena. Del mismo modo que los cebadores respectivos, en
algunos casos también se pueden incluir en la master mix.
Alternativamente, un equipo innovador puede
estar formado por una master mix para las PCR de inicio en
caliente. Dicha mezcla incluiría una DNA polimerasa termoestable en
una concentración suficiente para proporcionar una concentración
final de dicha DNA polimerasa termoestable de al menos 0,25
unidades/\mul, y un compuesto adicional para permitir la PCR de
inicio en caliente. Dicho compuesto que inactivaría la actividad de
la polimerasa a temperatura ambiente, sería por ejemplo un
anticuerpo anti-polimerasa o un aptámero de ácido
nucleico de unión a la
polimerasa.
polimerasa.
En otra realización más, el equipo innovador
puede estar formado por una master mix para las PCR de inicio
en caliente que incluye una DNA polimerasa termoestable en una
concentración suficiente para proporcionar una concentración final
de dicha DNA polimerasa termoestable de al menos 0,25
unidades/\mul, la cual se modifica químicamente y por lo tanto es
inactiva a temperatura ambiente a no ser que se caliente la
polimerasa para eliminar la modificación química.
También se ha demostrado que es ventajoso si el
equipo contiene, o bien una cantidad conocida de DNA estándar para
generar una serie de diluciones para una curva estándar, o bien una
muestra de calibrador que se puede utilizar para determinar la
eficiencia de un cierto tipo de reacción de amplificación.
Figura 1: amplificación monoplex
Se amplificaron cada uno de los 10^{2},
10^{4} y 10^{6} números de copia de la CK20 con 0,0825
U/\mul; 0,165 U/\mul; 0,33 U/\mul o 0,66 U/\mul de
polimerasa.
Figura 2: amplificación monoplex y multiplex de
varias proporciones de CK20 y PBGD con 0,0825 U/\mul de Taq DNA
polimerasa.
Fig. 2a: amplificación de CK20 - ensayo monoplex
y preparación del multiplex.
Fig. 2b: amplificación de PBGD - ensayo monoplex
y preparación del multiplex.
Figura 3: amplificación multiplex de CK20/PBGD
con cantidades crecientes de Taq polimerasa.
Fig. 3a: CK20
Fig. 3b: PBGD
Figura 4: amplificación multiplex con y sin PCR
de inicio en caliente utilizando cantidades crecientes de
polimerasa.
Fig. 4a: Taq DNA polimerasa.
Fig. 4b: FastStart DNA polimerasa.
Figura 5: ampliación del intervalo dinámico que
se puede obtener con un exceso de polimerasa de inicio en
caliente.
Fig. 5a: amplificación de números variables de
copias de CK20 con un fondo de 100 copias de PBGD.
Fig. 5b: amplificación de 100 copias de PBGD con
un fondo de números variables de copias de CK20.
Fig. 5c: análisis de regresión de la
amplificación de CK20.
Una PCR en tiempo real de DNA plasmídico de CK20
y PBGD.
Para demostrar la validez de la invención se
escogieron como dianas de amplificación el gen CK20 (de la
citoqueratina 20), un gen estudiado para la detección de células
tumorales diseminadas, y el gen PBGD (de la porforinbilinógeno
desaminasa) habitualmente utilizado como gen de mantenimiento.
Se clonaron fragmentos parciales de los genes de
la citoqueratina 20 (CK20) y de la porforinbilinógeno desaminasa
(PBGD) en distintos plásmidos pT3T7 vectores (Roche Molecular
Biochemicals). Se hizo una estimación mediante espectrofotometría de
los números de copia del DNA plasmídico linealizado con la
suposición de que 1 mol es equivalente a 6x10^{23} copias. Las
mezclas del DNA plasmídico del CK20 y del PBGD se prepararon
mediante diluciones utilizando un diluyente formado por MS2 RNA (10
ng/\mul) en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5.
Se llevó a cabo una PCR cinética en un
instrumento LightCycler (Roche Molecular Biochemicals). El ensayo
mediante una PCR convencional estuvo formado por 1 \mul de DNA, 1
x mezcla de detección, 1 x tampón de reacción, 4 mM de cloruro de
magnesio y cantidades variables de Taq polimerasa (todo de Roche
Diagnostics, Mannheim, Alemania) ajustado con agua hasta un volumen
de 10 \mul en un capilar de reacción.
Para las PCR monoplex y multiplex
convencionales, se utilizó el tampón de reacción y la Taq polimerasa
no modificada del equipo Light Cycler -DNA Master Hybridization
Probes Kit (Roche Molecular Biochemical, Núm. Cat.2 015 102).
Cada una de las 10 x mezclas de detección para
CK20 y PBGD estaban formadas por 5 \muM de cada cebador (directo e
inverso), 2 \muM de cada sonda de hibridación (marcadas con
fluoresceína y LC-Red640 o fluoresceína y Lcred705),
0,05% de Brij-35 en un tampón
Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Para la PCR multiplex, se
incluyó una 1 x mezcla de detección adicional en el capilar de
reacción.
Se utilizaron las siguientes secuencias de
cebadores y de sondas de hibridación:
\vskip1.000000\baselineskip
CK20, cebador directo:
| 5'-ATCAAGCAGTGGTACGAAAC-3' | (Seq. Id. No: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
CK20, cebador inverso:
| 5'-AGGACACACCGAGCATTT-3' | (Seq. Id. No: 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
CK20, sonda 1:
| 5'-ATTACAGACAAATTGAAGAGCTGCG-fluorescein-3' | (Seq. Id. No: 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
CK20, sonda 2:
| 5'-LCRed640AGTCAGATTAAGGATGCTCAACTGTphosphate-3' | (Seq. Id. No: 4) |
\vskip1.000000\baselineskip
PBGD, cebador directo:
| 5'-GCGGAGCCATGTCTGGTAA-3' | (Seq. Id. No: 5) |
\vskip1.000000\baselineskip
PBGD, cebador inverso:
| 5'-CCAGGGTACGAGGCTTTCAA-3' | (Seq. Id. No: 6) |
\vskip1.000000\baselineskip
PBGD, sonda 1:
| 5'-GAGAGTGATTCGCGTGGGTACCCG.fluorescein-3' | (Seq. Id. No: 7) |
\vskip1.000000\baselineskip
PBGD, sonda 2:
| 5'-LCRed705.AGAGCCAGCTTGCTCGCATACAGAC.phosphate-3' | (Seq. Id. No: 8) |
\vskip1.000000\baselineskip
El marcaje de una sonda de hibridación destinada
a la PCR para CK20 con LCRed640 y a la PCR para PBGD con LCRed705
permitió un seguimiento simultáneo de cada reacción en canales
diferentes. Las interferencias de fluorescencia entre los canales 2
(LCRed640) y 3 (LCRed705) se compensaron mediante el uso del
LightCycler-Color Compensation Set (Roche Molecular
Biochemicals).
Las condiciones normales de ciclado de la PCR
consistieron en una incubación inicial a 94ºC durante 1 minuto
seguidas de 50 ciclos de 94ºC durante 0 segundos, 55ºC durante 10
segundos y 72ºC durante 10 segundos y se finalizó a 40ºC durante 30
segundos.
Los puntos de corte para cada reacción se
determinaron con el soporte informático LightCycler Analysis
mediante el uso de la segunda función máxima derivada con un ajuste
basal aritmético.
Se llevó a cabo una PCR en tiempo real de
10^{2}, 10^{4} y 10^{6} copias de CK20 en una estructura
monoplex según el ejemplo 1, con cantidades crecientes de de Fast
Start polymerase (Roche Molecular Biochemicals): 0,0825 U/\mul,
0,165 U/\mul, 0,33 U/\mul o 0,66 U/\mul. La figura 1 muestra
los resultados. Tal y como se puede observar, un incremento de la
concentración de enzima no provoca un menor valor de Cp, ya que las
curvas de señal de fluorescencia para cada número de copias
identificado eran básicamente idénticas, a pesar de la concentración
de enzima utilizada (izquierda: 10^{6} copias; medio: 10^{4}
copias; derecha: 10^{2} copias). Hay que llegar a la conclusión de
que para una PCR monoplex, es decir, para la amplificación de un
solo ácido nucleico diana, la reacción de amplificación no se mejora
con un exceso de polimerasa, incluso si desde un inicio el ácido
nucleico diana está presente en un elevado número de
copias.
copias.
La figura 2 muestra los resultados habituales de
las PCR monoplex para CK20 y PBDG respectivamente, de acuerdo con el
ejemplo 1, en comparación con un enfoque multiplex simplemente
mediante la combinación de los conjuntos de cebadores y los
conjuntos de sondas fluorescentes para una PCR cinética de dos PCR
individuales en una única PCR (PCR multiplex) de acuerdo con el
ejemplo 1 utilizando 0,0825 U/ml de Taq polimerasa.
Los distintos ácidos nucleicos molde para las
reacciones incluyen tres mezclas de plásmidos que contienen
10^{2}/10^{4}, 10^{4}/10^{4} y 10^{6}/10^{4} copias de
CK20/PBGD, respectivamente. En la misma serie de PCR, la eficiencia
de reacción de la amplificación de CK20 en una PCR individual sin
ninguna reacción competitiva (Fig. 2a), y en una PCR multiplex con
una PCR para PBGD anterior que se da en el mismo recipiente de
reacción, se controla en el canal 2 (Figura 2a). De manera
simultánea, la eficiencia de reacción de la amplificación de PBGD en
una PCR individual y una multiplex se controla en el canal 3 (Figura
2b).
Los resultados muestran una reducción importante
en el gradiente de la curva en la fase exponencial de la PCR diana
en una PCR multiplex en comparación con una PCR individual,
especialmente cuando los números de copias del molde para la
reacción de fondo sobrepasan 100 veces a los de la reacción diana. A
saber, esto es la amplificación de 10^{2} copias de CK20 en
presencia de 10^{4} copias de PBGD en amplificación y 10^{4}
copias de PBGD en presencia de 10^{6} copias de CK20 en
amplificación.
Estos resultados obtenidos de acuerdo con los
métodos conocidos en el campo sugieren que bajo las condiciones
convencionales de PCR conocidas en el campo, el intervalo dinámico
es inequívocamente menor que un factor de
100.
100.
Se realizó un ensayo de acuerdo con el ejemplo 1
con concentraciones crecientes de polimerasa. Se cuantificaron tanto
10^{2} copias de CK20 con una PCR de fondo de 10^{4} copias de
PBGD (fig. 3a) como 10^{4} copias de PBGD con una PCR de fondo de
10^{6} copias de CK20 (fig. 3b).
Como se muestra en las figuras, un incremento de
la concentración de polimerasa da como resultado un incremento del
gradiente en la fase exponencial de una PCR multiplex.
Sorprendentemente, esto contrasta con lo observado anteriormente en
una estructura monoplex comparable (véase el ejemplo 2 más
arriba).
Además, los resultados muestran que una
concentración de polimerasa de 0,33 unidades/\mul aún no es
suficiente para equiparar el gradiente en la fase exponencial de una
PCR multiplex al de una PCR individual. En este experimento, solo
con una cantidad "en exceso" de 0,66 unidades/\mul de
polimerasa se puede obtener una función comparable al control
monoplex.
Otros experimentos, referentes al refinamiento
de la concentración de polimerasa bona fide general (datos no
mostrados) revelaron que es necesaria una concentración de
polimerasa de al menos unos 0,5 unidades/\mul de volumen de
reacción para que el gradiente de la curva de la PCR multiplex sea
equivalente al de la PCR individual (datos no mostrados).
El ciclado de la PCR de inicio en caliente se
realizó de acuerdo con el ejemplo 1 con la excepción de que para la
PCR monoplex y para la PCR multiplex, se utilizó el tampón de
reacción y la Taq polimerasa modificada provenientes del LightCycler
- FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit (Roche Molecular
Biochemicals, Núm. Cat. 3 003 248) para poder comparar. La
amplificación de 10^{4} copias de PBGD se analizó con una PCR de
fondo de 10^{6} copias de CK20 para las concentraciones de
polimerasa 0,0825 U/\mul, 0,165 U/\mul, 0,33 U/\mul o 0,66
U/\mul (concentración final). El protocolo de termociclado se
modificó mediante un calentamiento inicial de 94ºC durante 10
minutos y, durante el ciclado, a 94ºC durante 10 segundos.
La figura 4 muestra una comparación de la
cantidad de enzima que necesita una polimerasa de inicio en caliente
en comparación con una polimerasa convencional bajo condiciones de
valoración idénticas, con la excepción de la enzima y de su tampón
correspondiente. Mientras que 0,66 unidades/\mul de volumen de
reacción de una polimerasa convencional proporcionan un gradiente en
la fase exponencial de una PCR multiplex equivalente al de una PCR
individual (fig. 4a), la utilización de una polimerasa de inicio en
caliente reduce la cantidad de enzima necesaria según un factor de
aproximadamente 2 (fig. 4b).
La figura 5 muestra un experimento multiplex de
acuerdo con el ejemplo 1 utilizando una FastStart polimerasa. La
amplificación mediante PCR de 10^{2} copias de PBGD se realizó con
un fondo respectivo de 10^{2}, 10^{4}, 10^{6} y 10^{8}
copias de CK20 y un exceso de 0,55 unidades/\mul de volumen de
reacción de FastStart polimerasa. Como se puede ver en la figura,
los gradientes de la curva en fase exponencial de la PCR para PBGD
(fig. 5b) y los puntos de corte son similares entre ellos a pesar de
la PCR para CK20 de fondo (fig. 5a). Para la amplificación de la PCR
para CK20, se mantiene la relación lineal entre el punto de corte y
el logaritmo de la concentración, esencial para una cuantificación
precisa mediante PCR (R^{2}=-1) (fig. 5c).
Así, estos datos muestran que, para una
amplificación multiplex de PBGD y CK20 según la invención, se
obtiene un intervalo dinámico de 10^{6} con la realización de
inicio en caliente.
En un experimento similar con Her2/neu y
betaglobina como dianas de amplificación diferentes se han obtenido
resultados idénticos. Las condiciones de amplificación eran
básicamente idénticas a las del ejemplo 1. Sin embargo, en este
caso, la PCR se ha realizado utilizando 1 U de Klentaq polimerasa
(Clontech, correspondiente a 6 U de polimerasa estándar) combinada
con anticuerpo KlenTaq (Clontech) bajo las condiciones sugeridas por
el proveedor como medio para la amplificación de inicio en caliente
según las instrucciones del fabricante.
\newpage
Se han utilizado los siguientes cebadores según
los Id. de Sec. Núm. 9-10 para Her2/neu y los Id. de
Sec. Núm. 11-12 para la beta globina.
\vskip1.000000\baselineskip
Her2/neu, cebador directo:
| 5'-CCTCTGACGTCCATCGTCTC-3' | (Seq. Id. No: 9) |
\vskip1.000000\baselineskip
Her2/neu, cebador inverso:
| 5'-CGGATCTTCTGCTGCCGTCG-3' | (Seq. Id. No: 10) |
\vskip1.000000\baselineskip
\beta-globina, cebador
directo:
| 5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3' | (Seq. Id. No: 11) |
\vskip1.000000\baselineskip
\beta-globina, cebador
inverso:
| 5'-CAACCTCATCCACGTTCACC-3' | (Seq. Id. No: 12) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas de hibridación para Her2/neu eran
oligonucleótidos formados por secuencias según el Id. de Sec. Núm.
13, marcados en la posición 5' con LC-Red 640, y
secuencias según el Id. de Sec. Núm. 14 marcados en la posición 2'
con fluoresceína. Las sondas de hibridación para la betaglobina eran
oligonucleótidos formados por secuencias según el Id. de Sec. Núm.
15, marcados en la posición 5' con LC-Red 705, y
secuencias según el Id. de Sec. Núm. 16, marcados en la posición 3'
con fluoresceína:
\vskip1.000000\baselineskip
Her2neu:
| 5'-Red 640-ACCAGCAGAATGCCAACCA-Phosphate-3' | (Seq. Id. No: 13) |
| 5'-CTTGATGAGGATCCCAAAGACCACCCCCAAGACCAC-Fluorecein-3' | (Seq. Id. No: 14) |
\vskip1.000000\baselineskip
\beta-globina:
| 5'-Red 705-AGACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCACCATG-phosphate-3' | (Seq. Id. No: 15) |
| 5'-CCACAGGGCAGTAACGG-Fluorecein-3 | (Seq. Id. No: 16) |
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento se podían amplificar 10
copias de DNA plasmídico de Her2/neu con una eficiencia idéntica a
pesar de un fondo de 10 - 10^{7} copias de DNA plasmídico de
betaglobina, correspondiente a un intervalo dinámico de
10^{6}.
Para poder valorar las capacidades de la PCR de
inicio en caliente multiplex con polimerasa en exceso, y además,
para descartar una posible dependencia del intervalo dinámico
respecto de las concentraciones diana absolutas, se realizó un
experimento siguiendo básicamente las condiciones expuestas en el
ejemplo 1 con algunas alteraciones menores:
Más específicamente, se amplificaron 10^{2}
copias de PBGD con una PCR de fondo de 10^{2}, 10^{4},
10^{6} y 10^{8} copias de CK20 con cantidades variables de
FastStart polimerasa y se analizaron bajo las mismas
condiciones.
Como un indicador para la amplificación
cuantitativa de PBDG, se determinaron los puntos de corte (valores
de cp) utilizando el denominado "algoritmo de la segunda
derivada" (US 6.303.305) según el manual de RocheLightCycler
(Roche Molecular Biochemicals). Mediante el uso del algoritmo
procesador de los datos de la segunda derivada, dentro de una
tolerancia estadística esperada, se obtuvieron valores de punto de
corte idénticos para una concentración diana dada independientemente
del exceso añadido de CK20, siempre que se utilizara una
concentración de enzimas de acuerdo con la invención.
Los valores de punto de corte obtenidos para
PBDG están indicados en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
| 10^{2} copias de PBGD | 10^{2} copias de PBGD | 10^{2} copias de PBGD | 10^{2} copias de PBGD | |
| 0,0412 unidades/\mul | 0,0825 unidades/\mul | 0,1650 unidades/\mul | 0,3300 unidades/\mul | |
| 10^{2} copias de CK20 | Cp: 31,44 | Cp: 31,98 | Cp: 32,12 | Cp: 33,16 |
| 10^{4} copias de CK20 | Cp: 31,23 | Cp: 32,02 | Cp: 31,53 | Cp: 31,89 |
| 10^{6} copias de CK20 | Cp: - | Cp: >46 | Cp: 34,35 | Cp: 32,12 |
| 10^{8} copias de CK20 | Cp: - | Cp: - | Cp: 38,88 | Cp: 32,65 |
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estos resultados, es razonable sacar
las siguientes conclusiones:
Primero, los datos obtenidos para una
concentración de enzima según la invención (tabla 1, columna
derecha, 0,3300 U/\mul) demuestran que en este caso una PCR
multiplex de acuerdo con la invención da como resultado un
intervalo dinámico global de 10^{6}, siempre que los ácidos
nucleicos diana a amplificar dentro del ensayo multiplex estén
presentes en unos números de copias comprendidos entre 10^{2} y
10^{8}.
Segundo, es irrelevante el hecho de que bajo las
condiciones experimentales idénticas, 10^{4} copias de PBDG se
habrían amplificado con la misma eficiencia de amplificación que en
el caso de 10^{2} copias de PBDG. Entonces, si el resultado de la
amplificación de 10^{2} copias de PBDG con un fondo de 10^{6}
copias de CK20 se compara con una amplificación de 10^{4} copias
con un fondo de 10^{8} copias de CK20 (no mostrado), también se
puede llegar a la conclusión de que el efecto del incremento del
intervalo dinámico sobre el uso innovador de las cantidades en
exceso de polimerasa es independiente de los números absolutos de
copias del DNA diana presente originariamente en la muestra.
Bernard, P. S., et al., Anal
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US 6.174.670
US 6.303.305
WO 97/46706
WO 97/46707
WO 97/46712
<110> TABITI, KARIM
\hskip1cmBETZL, GISELA
\hskip1cmSOONG, RICHIE
\hskip1cmRASMUSSEN, RANDY P.
\hskip1cmDESILVA, DEEPIKA MARINE
\hskip1cmWARD, JOHN G.
\hskip1cmMILLWARD, HALIEGH PAGE
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PCR multiplex cuantitativa con
intervalo dinámico elevado
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21027 US
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<150>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo de CK20
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaagcagt ggtacgaaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inverso de CK20
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggacacacc gagcattt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda 1 de CK20
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattacagaca aattgaagag ctgcg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda 2 de CK20
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcagatta aggatgctca actgc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo de PBGD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggagccat gtctggtaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inverso de PBGD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagggtacg aggctttcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda 1 de PBGD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagtgatt cgcgtgggta cccg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda 2 de PBGD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagccagct tgctcgcata cagac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo de Her2/neu
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctgacgt ccatcgtctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inverso de Her2/neu
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggatcttct gctgccgtcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo de \beta-globina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacaactgt gttcactagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inverso de \beta-globina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacctcatc cacgttcacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccagcagaa tgccaacca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgatgagg atcccaaaga ccacccccaa gaccac
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagacttctcc tcaggagtca ggtgcaccat g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de hibridación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacagggca gtaacgg
\hfill17
Claims (7)
1. Un método para una PCR multiplex cuantitativa
con un intervalo dinámico de al menos 10^{2}, preferiblemente de
10^{3} y más preferiblemente de 10^{4}, donde se utiliza una DNA
polimerasa termoestable con una concentración final de al menos 0,5
unidades/\mul.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
para la cuantificación de al menos un primer y un segundo ácido
nucleico en una muestra por medio de una PCR, cuya
característica es que la concentración inicial del primer
ácido nucleico de la muestra está en un exceso según un factor de
más de 100 en comparación con la concentración inicial del segundo
ácido nucleico, que comprende la adición de un primer par de
cebadores para la amplificación del primer ácido nucleico, la
adición de un segundo par de cebadores para la amplificación del
segundo ácido nucleico, y la amplificación de los dos ácidos
nucleicos mediante una DNA polimerasa termoestable; donde dicha DNA
polimerasa termoestable está presente en una concentración de al
menos 0,5 unidades/\mul de reacción, y donde la amplificación del
segundo ácido nucleico no se inhibe hasta menos de un 10% en
comparación con la amplificación del segundo ácido nucleico mediante
el segundo par de cebadores en ausencia de dicho primer par de
cebadores.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
para la cuantificación de al menos un primer y un segundo ácido
nucleico de una muestra por medio de una PCR de inicio en caliente,
cuya característica es que la concentración inicial del
primer ácido nucleico de la muestra está en un exceso según un
factor de más de 100 en comparación con la concentración inicial
del segundo ácido nucleico, formado por la adición de un primer par
de cebadores para la amplificación del primer ácido nucleico, la
adición de un segundo par de cebadores para la amplificación del
segundo ácido nucleico y la amplificación de los dos ácidos
nucleicos mediante una DNA polimerasa termoestable; donde dicha DNA
polimerasa está presente en una concentración de al menos 0,25
unidades/\mul de reacción, y donde la amplificación del segundo
ácido nucleico no se inhibe hasta menos del 10% en comparación con
la amplificación del segundo ácido nucleico mediante el segundo par
de cebadores en ausencia de dicho primer par de cebadores.
4. Un método de acuerdo con las reivindicaciones
de la 1 a la 3, en el que se hace el seguimiento en tiempo real de
dicha amplificación.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que los productos de amplificación obtenidos a partir de
dicha amplificación de los dos ácidos nucleicos se detectan, cada
uno de ellos, mediante al menos una sonda de hibridación marcada con
fluorescencia.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que se utilizan para cada ácido nucleico diana dos sondas que
hibridan de forma adyacente, y cada sonda se marcador adecuadamente
con una fracción fluorescente y dichas fracciones tienen la
capacidad de realizar una transferencia de energía por resonancia
de fluorescencia durante la hibridación (sondas de hibridación
FRET).
7. Un método de acuerdo con las reivindicaciones
de la 1 a la 6, en el que un ciclo de amplificación dura menos de
un minuto.
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