JP2021153393A - 核酸増幅反応用組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】 高効率に核酸増幅反応を行うことを可能にする手法を提供すること。【解決手段】 一般式（Ｉ）：ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ・・・（Ｉ） （ここで式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）で表される非イオン界面活性剤を含むように核酸増幅反応用組成物を調製する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が、０．００１〜１容量％となるようにして調製される。本発明の前記核酸増幅反応用組成物は、ヘパリンなどの多糖類を更に含有することが好ましい。【選択図】 なし
Description
本発明は、核酸増幅効率や検出感度を向上させ、効率的な核酸増幅を行うことができる、核酸増幅反応用の組成物及びキット、並びに核酸増幅方法等に関する。
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
また、近年では、ＰＣＲの中でも、リアルタイムＰＣＲ法が広く実施されるようになってきた。リアルタイムＰＣＲ法は、増幅された核酸を経時的に解析することができ、高い定量性を確保し、高感度の検出を行うことができる。このようなリアルタイムＰＣＲを行う際には、核酸増幅効率を向上させることで、定量性と検出感度を高めることが重要である。
これまでにも、前記核酸増幅法の効率や感度を向上させるために、核酸増幅反応液中に様々な試薬を添加する方法が報告されている。
例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン誘導体、イオン性液体などの融解温度調整剤が核酸増幅効率を向上させる方法として報告されている。これらはいずれも核酸の融解温度を低下させることで、核酸の増幅効率を向上させることが知られている（特許文献１〜３）。また、特許文献４、５では、グリコール類を核酸増幅反応中に添加することによって、核酸の融解温度を低下させ、非特異増幅を抑制する方法が記載されている。
しかしながら、上記の方法を用いても、増幅効率、検出感度が十分でない場合があり、更なる有用な核酸増幅方法が求められていた。特に、標的核酸のコピー数が極めて少ない場合であっても高効率で核酸増幅反応を行う手法の開発が望まれている。
更に近年では、遺伝子診断用途や遺伝子検査用途において、マルチプレックスＰＣＲ法を用いた解析が行われている。マルチプレックスＰＣＲ法とは、数組のプライマー対を、一つのＰＣＲアッセイで同時に用いる方法である。一つの反応混合液中で複数のＤＮＡ領域を同時に増幅するこの方法は、サンプルの取り扱いが最小限で済むので、労力や時間、費用が節約でき、またクロスコンタミネーションの危険性を減らすことができるが、一方で、複数のプライマーを添加することによりプライマーダイマー等が形成されやすく、非特異増幅を生じさせ易い。このような非特異増幅の発生は、目的とする標的核酸の増幅効率にも影響を与えることになる。
加えて、マルチプレックスＰＣＲ法において、反応混合液中で同時に増幅されるＤＮＡ領域の各増幅鎖長が異なる場合、増幅産物の長さの違いによって増幅効率のバラつきが発生することが懸念される。それに伴い、正確な定量結果が得られないといった問題や、標的ＤＮＡの検出感度の低下といった問題が生じる恐れがある。
ところで、核酸増幅反応に用いられる試薬には一般に、種々の成分が配合されており、界面活性剤等の添加物が配合されることもある。例えば、特許文献１では、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及びＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（オクチルフェニル−ポリエチレングリコール）等の非イオン性界面活性剤、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテル（ＰＮＳＥ）等の陰イオン性界面活性剤、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、及びコカミドプロピルベタイン等の両性界面活性剤を含むことを特徴とする核酸増幅用組成物を用いることで、インターカレーティング色素によるＰＣＲの阻害の阻害を軽減することが記載されている。しかしながら、特許文献１において、上記のような界面活性剤を使用することで核酸増幅反応の増幅効率を高めることについては一切記載されていない。
核酸増幅法において、核酸増幅効率及び検出感度を向上させる核酸増幅方法の検討が進められてきた。しかしながら、増幅する核酸配列によっては増幅効率や感度の低下が認められる場合があり、更なる改善が求められている。また、標的核酸のコピー数が極めて少ない場合やマルチプレックスＰＣＲを行う場合においても、増幅効率や検出感度が低下してしまう場合があることが問題となっていた。
そこで、本発明は核酸増幅法において、高効率に増幅可能な核酸増幅反応組成物やキット等をを提供することを目的とする。さらに本発明の他の目的として、標的核酸のコピー数が極めて少ない場合及び／又はマルチプレックスＰＣＲを行う場合においても、高効率な増幅を維持できる核酸増幅反応組成物やキット等の提供を目的とする。
本発明者は、上記課題に取り組み、鋭意研究の結果、特定の構造を有する非イオン界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことで、高効率に核酸増幅反応を実施することが可能であることを見出した。更に、本発明者は検討を重ね、ヘパリン等の多糖類及び／又はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせることで、標的核酸のコピー数が極めて少ない場合においても、又はマルチプレックスＰＣＲにおいても、高効率な核酸増幅を維持できることを見出し、本発明を成すに至った。
即ち、本発明の概要は以下の通りである。
［項１］ 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含む核酸増幅反応用キット。
［項２］ 核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が０．００１〜１容量％となるように調整された試薬を含む、項１に記載の核酸増幅反応用キット。
［項３］ 核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が０．０１〜０．１容量％となるように調整された試薬を含む、項１又は２に記載の核酸増幅反応用キット。
［項４］ 一般式（Ｉ）においてｎ＝８〜１０である非イオン界面活性剤を含む、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項５］ 更にＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを含む項１から４のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項６］ 更に多糖類を含む項１から５のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項７］ 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、項６に記載の核酸増幅反応用キット。
［項８］ 前記多糖類が、ヘパリンおよびその塩である項６又は７に記載の核酸増幅反応用キット。
［項９］ 核酸増幅反応時の反応液中における前記多糖類の濃度が０．２ｎｇ／μＬ以上４ｎｇ／μＬ以下となるように調整されている項６から８のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１０］ 核酸増幅反応がリアルタイムＰＣＲ反応である、項１から９のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１１］ 核酸増幅反応がマルチプレックスＰＣＲ反応である、項１から１０のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１２］ 検出対象の標的核酸の検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブを含む項１から１１のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１３］ 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含む、核酸増幅反応用組成物。
［項１４］ 更に、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つを含む、項１３に記載の核酸増幅反応用組成物。
［項１５］ 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、項１４に記載の核酸増幅反応用組成物。
［項１６］ 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤の存在下において核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸増幅効率の向上方法。
［項１７］ 前記非イオン界面活性剤と、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つとの存在下で核酸増幅反応を行う、項１６に記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項１８］ 前記多糖類がヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、項１７に記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項１９］ 核酸増幅反応がリアルタイムＰＣＲ反応である、項１６から１８のいずれかに記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項２０］ 核酸増幅反応がマルチプレックスＰＣＲ反応である、項１６から１９のいずれかに記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項１］ 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含む核酸増幅反応用キット。
［項２］ 核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が０．００１〜１容量％となるように調整された試薬を含む、項１に記載の核酸増幅反応用キット。
［項３］ 核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が０．０１〜０．１容量％となるように調整された試薬を含む、項１又は２に記載の核酸増幅反応用キット。
［項４］ 一般式（Ｉ）においてｎ＝８〜１０である非イオン界面活性剤を含む、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項５］ 更にＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを含む項１から４のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項６］ 更に多糖類を含む項１から５のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項７］ 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、項６に記載の核酸増幅反応用キット。
［項８］ 前記多糖類が、ヘパリンおよびその塩である項６又は７に記載の核酸増幅反応用キット。
［項９］ 核酸増幅反応時の反応液中における前記多糖類の濃度が０．２ｎｇ／μＬ以上４ｎｇ／μＬ以下となるように調整されている項６から８のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１０］ 核酸増幅反応がリアルタイムＰＣＲ反応である、項１から９のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１１］ 核酸増幅反応がマルチプレックスＰＣＲ反応である、項１から１０のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１２］ 検出対象の標的核酸の検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブを含む項１から１１のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
［項１３］ 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含む、核酸増幅反応用組成物。
［項１４］ 更に、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つを含む、項１３に記載の核酸増幅反応用組成物。
［項１５］ 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、項１４に記載の核酸増幅反応用組成物。
［項１６］ 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤の存在下において核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸増幅効率の向上方法。
［項１７］ 前記非イオン界面活性剤と、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つとの存在下で核酸増幅反応を行う、項１６に記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項１８］ 前記多糖類がヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、項１７に記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項１９］ 核酸増幅反応がリアルタイムＰＣＲ反応である、項１６から１８のいずれかに記載の核酸増幅効率の向上方法。
［項２０］ 核酸増幅反応がマルチプレックスＰＣＲ反応である、項１６から１９のいずれかに記載の核酸増幅効率の向上方法。
本発明により、高効率に核酸増幅を行うことが可能となる。本発明は、特にリアルタイムＰＣＲにおいて有効であり、なかでも従来高効率な増幅が難しいマルチプレックスＰＣＲにおいて本効果は顕著なものである。また、本発明によれば、標的核酸のコピー数が極めて少量（例えば、１〜５コピー程度）であることが予想される被験サンプルから核酸増幅を行う場合にも、高効率での核酸増幅が可能となり得るという利点がある。
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明について詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明は一つの態様として、以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする核酸増幅反応用キットを提供する。本明細書において核酸増幅反応用キットは、１又は複数の核酸増幅反応用組成物を含むように構成されたものであり得る。さらにここでいう、核酸増幅反応用組成物は、例えば、核酸増幅反応用試薬として提供されるものであり得る。核酸増幅用反応組成物は、予め調製されて核酸増幅反応時にそのまま使用することができる試薬の状態であってもよいし、核酸増幅反応前に用時調製される状態の試薬であってもよい。例えば、本発明の核酸増幅反応用組成物は、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ試薬、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用試薬などの態様で提供することができる。また、本発明の核酸増幅反応用組成物は、核酸増幅反応用試薬を調製するための原料である組成物であってもよい。
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする核酸増幅反応用キットを提供する。本明細書において核酸増幅反応用キットは、１又は複数の核酸増幅反応用組成物を含むように構成されたものであり得る。さらにここでいう、核酸増幅反応用組成物は、例えば、核酸増幅反応用試薬として提供されるものであり得る。核酸増幅用反応組成物は、予め調製されて核酸増幅反応時にそのまま使用することができる試薬の状態であってもよいし、核酸増幅反応前に用時調製される状態の試薬であってもよい。例えば、本発明の核酸増幅反応用組成物は、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ試薬、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用試薬などの態様で提供することができる。また、本発明の核酸増幅反応用組成物は、核酸増幅反応用試薬を調製するための原料である組成物であってもよい。
本明細書において、核酸増幅反応とは、鋳型の核酸に対し、相補的な配列を持つ核酸を配列依存的に合成する反応を指し、その様式は特に限定されないが、より具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法などの特定の標的配列を指数関数的に増幅する方法をいう。本発明は、そのいずれの核酸増幅反応にも用いられ得るが、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた方法に用いられる。
ＰＣＲ法としては、通常のＰＣＲ法のみならず、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ ＰＣＲ）、競合的ＰＣＲ、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｒｅｄ ＰＣＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ、シャトルＰＣＲ、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃａｌｍｐ法、ストレッチＰＣＲ、Ａｌｕ ＰＣＲ、メガプライマーＰＣＲ、Ｉｍｍｕｎｏ ＰＣＲ、などの種々のＰＣＲ法が当該分野で公知である。本発明は、当該分野で公知の任意のＰＣＲ法に用いられ得るが、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ法に用いられる。
上記のようなＰＣＲ法は通常、熱変性、アニーリング及び伸長の各反応ステップを繰り返すことによって進行する。熱変性とは二本鎖ＤＮＡを乖離させるためのステップであり、アニーリングは乖離したＤＮＡにプライマーをアニーリングするステップであり、伸長はＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成するステップを指す。本発明で行われるＰＣＲ法では、アニーリング温度と伸長温度とは異なる温度であってもよいし、同一温度であってもよい。本発明において、アニーリング温度と伸長温度とを同一温度で行う場合は、アニーリング反応を行う時間と伸長反応を行う時間とを合わせた保持時間を伸長反応保持時間とする。伸長反応保持時間は特に限定されないが、例えば６０秒以下、好ましくは５０秒以下、より好ましくは４０秒以下、更に好ましくは３０秒以下であり得る。伸長反応保持時間の下限は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として１秒以上、好ましくは５秒以上、より好ましくは１０秒以上であり得る。ここで、保持時間は全てのサイクルで同一時間であっても良いし、異なっていてもよい。
本発明では、以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を核酸増幅反応に用いることを一つの特徴とする。このような非イオン界面活性剤の存在下で核酸増幅反応を行うことで、例えばリアルタイムＰＣＲ反応において高いＰＣＲ効率で核酸増幅を行うことができる。本発明には、上記一般式（Ｉ）で示される任意の非イオン界面活性剤を使用することができるが、好ましくは、前記一般式（Ｉ）においてｎ＝７〜１１である非イオン界面活性剤であることが好ましく、ｎ＝８〜１０である非イオン界面活性剤であることがより好ましく、ｎ＝９である非イオン界面活性剤が特に好ましい。前記一般式（Ｉ）でｎ＝９である非イオン界面活性剤は、ポリドカノール、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル等とも呼ばれる場合がある。これらの非イオン界面活性剤は１種類のみを用いてもよいし、２種類を組み合わせて用いたとしても本発明の効果を奏する。
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を核酸増幅反応に用いることを一つの特徴とする。このような非イオン界面活性剤の存在下で核酸増幅反応を行うことで、例えばリアルタイムＰＣＲ反応において高いＰＣＲ効率で核酸増幅を行うことができる。本発明には、上記一般式（Ｉ）で示される任意の非イオン界面活性剤を使用することができるが、好ましくは、前記一般式（Ｉ）においてｎ＝７〜１１である非イオン界面活性剤であることが好ましく、ｎ＝８〜１０である非イオン界面活性剤であることがより好ましく、ｎ＝９である非イオン界面活性剤が特に好ましい。前記一般式（Ｉ）でｎ＝９である非イオン界面活性剤は、ポリドカノール、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル等とも呼ばれる場合がある。これらの非イオン界面活性剤は１種類のみを用いてもよいし、２種類を組み合わせて用いたとしても本発明の効果を奏する。
核酸増幅反応時の反応液中における前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤の濃度は、反応液全体に対して、０．００１〜１容量％が好ましく、０．０１〜０．１容量％であることがより好ましい。反応液中におけるこれらの非イオン界面活性剤の濃度が０．００１容量％未満では、増幅効率や検出感度を向上させる効果が少ない傾向がある。また１容量％より高い濃度の場合、効果の大きさに比べて、ハンドリングが悪くなるというデメリットが大きくなる。従って、本発明の核酸増幅反応用組成物（例えば、核酸増幅反応用キットに含まれる試薬）は、核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤化合物の濃度が上記範囲内となるようにして調製されることが好ましい。
本発明における核酸増幅反応用組成物は、例えば保存用のために濃縮状態の核酸増幅反応用試薬として調製されることもできる。このような核酸増幅用反応用組成物は、例えば２〜１０倍の濃縮状態とすることができる。その場合では、核酸増幅反応の反応溶液中における終濃度が好ましい濃度となるよう、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤を反応溶液における終濃度の２〜１０倍濃度で含有させておけばよい。
近年、作業性を向上させる目的で、２倍濃度（またはそれ以上の高濃度）のプレミック試薬が好適に使用されている。プレミックス試薬とは反応バッファー、反応基質（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウムイオン、ポリメラーゼ等をあらかじめ混合した試薬である。上記のような濃縮状態で調製された核酸増幅反応用組成物は、このようなプレミックス試薬として提供される場合に好適である。また、プレミックス試薬は種々の成分を予め混合した状態で長期保存されるため安定性に劣る場合があるが、本発明の核酸増幅反応用組成物は、混合液状態で長期間（例えば、１ヶ月以上）保存しても安定であることが分かっている。
本発明では、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤と共に多糖類が存在する条件下で、核酸増幅反応を行うことが好ましい。このように多糖類を組み合わせることによって、例えば、標的核酸のコピー数が極めて少ない場合（例えば、１〜５コピー程度）であっても高効率で核酸増幅反応を行うことが可能となり得る。このような多糖類としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、代表的な多糖類として、例えばアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ペクチン、キシログルカン、グルコマンナン、デキストリン、シクロデキストリン、デキストラン、及びこれらの塩が挙げられる。より一層効果的に非特異増幅を抑制できるという観点から、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類を用いることが好ましい。より好ましくは、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びこれらの塩からなる群より選択される酸性ムコ多糖類が望ましく、ヘパリン及び／又はその塩が特に好ましい。多糖類の塩の形態としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等を挙げることができる。具体的に、ヘパリンの塩を用いる場合は、例えば、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、ヘパリンカルシウムなどのヘパリン塩を核酸増幅反応組成物中に含まれればよい。
特定の好ましい実施形態では、上記のような多糖類を、核酸増幅反応組成物中の終濃度が０．２ｎｇ/μＬ以上５ｎｇ／μＬ以下となるように調製することが望ましい。多糖類は、好ましくは、反応液中終濃度が０．２ｎｇ/μＬ以上５ｎｇ/μＬ以下となるように、より好ましくは反応液中終濃度が０．４ｎｇ/μＬ以上３ｎｇ/μＬ以下となるように、更に好ましくは反応液中終濃度が０．４ｎｇ/μＬ以上２．５ｎｇ/μＬ以下となるように調整することがよい。上記のような濃度で多糖類を用いることにより、前記のような効果をより一層確実に得ることが可能となる。
本発明における核酸増幅反応用組成物を、例えば保存用のために濃縮状態の核酸増幅反応用試薬として調製する場合には、上述のように、例えば２〜１０倍の濃縮状態とすることができる。その場合では、核酸増幅反応の反応溶液中における終濃度が好ましい濃度となるよう、多糖類を反応溶液における終濃度の２〜１０倍濃度で含有させておけばよい。
本発明において、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤と、多糖類との配合比は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として、多糖類が２ｎｇ/μｌの場合に、前記非イオン界面活性剤が０．００１〜１容量％であることが好ましく、０．０１〜１容量％であることがより好ましい。このような比率で、両成分を含むことで、より一層効果的に核酸増幅効率を向上させることができる。
核酸増幅反応を実施するために、本発明の核酸増幅反応用組成物は、前記非イオン界面活性剤及び多糖類に加えて、さらに鋳型となる核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーとなるオリゴヌクレオチド、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応バッファー、金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）等を実施する核酸増幅方法により必要に応じて含むことができる。一例として、ＰＣＲ法を用いた核酸増幅方法においては、ＤＮＡポリメラーゼを更に含むことが好ましく、鋳型核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、及びｄＮＴＰｓを含むことがより好ましく、鋳型核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、及び反応バッファーを含むことが更に好ましい。
本発明の核酸増幅反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼとは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから直接得られたＤＮＡポリメラーゼに限定されず、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの変異株から直接得られたＤＮＡポリメラーゼであってもよいし、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又はその変異体から得られたＤＮＡポリメラーゼの配列情報を元に遺伝子工学的又は化学的等の方法で改変を加え、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼと実質的に同等の活性を有するＤＮＡポリメラーゼであってもよい。前記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから直接抽出したものでもよいし、さらにそれを適当な発現系で組換え生産したものでもよい。
本発明の核酸増幅反応用組成物は、リアルタイムＰＣＲを行うために用いられる場合には、核酸増幅を経時的に確認するために蛍光色素又は蛍光標識したハイブリダイゼーションプローブを更に含むことが好ましい。このような蛍光色素又は蛍光標識したハイブリダイゼーションプローブは、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や、蛍光標識をしたハイブリダイゼーションプローブを含むことが好ましい。ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。
本発明の核酸増幅反応用組成物は、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うために用いられる場合には、検出対象となるＲＮＡを効率的にＤＮＡに変換するために、逆転写酵素を更に含むことが好ましい。
本発明の核酸増幅反応用組成物は、ホットスタートＰＣＲ法を実施するために用いられる場合には、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含むことが好ましい。ここでいう抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体は、単一種のモノクローナル抗体であってもよいし、複数のモノクローナル抗体を組合せて用いてもよいし、ポリクローナル抗体を用いてもよい。
本発明の別の態様は、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤を備えた、核酸増幅反応用キットである。好ましくは、本発明の前記核酸増幅反応用キットは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つを更に含むキットであり、より好ましくは多糖類を更に含むキットである。このような本発明の核酸増幅反応用キットは、例えば、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤と、ヘパリン又はその塩等に代表される多糖類とを、同一の容器に含む状態で提供されてもよいし、別々の容器に含む状態で提供され、使用前に混合して用いる態様であってもよい。別々の容器に含む状態で提供される場合、任意に含んでもよい他の成分（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ）は、前記非イオン界面活性剤と同一の容器に含まれていてもよいし、前記多糖類と同一の容器に含まれていてもよいし、前記非イオン界面活性剤及び前記ヘパリン及びその塩とは更に別の容器に含まれていてもよい。より簡便に使用することが可能であるという観点からは、同一の容器に前記非イオン界面活性剤及び多糖類を含むことが好ましく、同一の容器に、前記非イオン界面活性剤、多糖類、及び更に任意に含んでもよい他の成分（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ）を含むことがより好ましい。
上記のような本発明のキットにおいて使用される前記非イオン界面活性剤や多糖類の濃度や種類等は、上記核酸増幅反応用組成物で説明したものと同じであり得る。
上記のような本発明のキットにおいて使用される前記非イオン界面活性剤や多糖類の濃度や種類等は、上記核酸増幅反応用組成物で説明したものと同じであり得る。
本発明の更に別の態様は、核酸増幅反応を、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤の存在下において行うことを特徴とする核酸増幅方法である。好ましくは、本発明の前記核酸増幅方法は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つが更に存在する条件下で核酸増幅反応を行うことを特徴とし、より好ましくは多糖類が更に存在する条件下で核酸増幅反応を行うことを特徴とする。更に別の観点から、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤の存在下において、又は前記一般式（Ｉ）で表される非イオン界面活性剤と、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つ（なかでも好ましくは多糖類）との存在下において核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸増幅効率の向上方法ということもできる。これらの本発明の方法は、試薬やキットなどのような態様で前記非イオン界面活性剤及び多糖類を含む状態で市販品として流通するものに限定されず、自家調製によるもの等を含み、形態を問わない。
上記のような本発明の方法において使用される前記非イオン界面活性剤や多糖類の濃度や種類等は、上記核酸増幅反応用組成物又は上記核酸増幅反応用キットで説明したものと同じであり得る。
上記のような本発明の方法において使用される前記非イオン界面活性剤や多糖類の濃度や種類等は、上記核酸増幅反応用組成物又は上記核酸増幅反応用キットで説明したものと同じであり得る。
特定の態様において、リアルタイムＰＣＲ法における増幅の効率性（核酸増幅効率）を評価する指標としてＰＣＲ効率（ＰＣＲ増幅効率）を評価する手法が用いられる。ＰＣＲ効率とは検量線の傾き（ｓｌｏｐｅ）から求められる値であり、Ｘ軸に初期鋳型濃度（Ｌｏｇ１０）を、Ｙ軸にＣｔ値を取った場合に以下のような数式で求められることが公知の値である
ＰＣＲ効率Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１
このＰＣＲ効率は１００％に近い方が理想とされるが、ＰＣＲ阻害物やプライマーの設計により変動する。そのため、８０％〜１２０％が適正値といわれており、満たない場合は実験系の見直しが通常必要と言われている。本発明によれば、このＰＣＲ効率を高めることができ、一例として、ＰＣＲ効率を８０％〜１２０％とすることができ、好ましくは８５％〜１１５％とすることができる
ＰＣＲ効率Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１
このＰＣＲ効率は１００％に近い方が理想とされるが、ＰＣＲ阻害物やプライマーの設計により変動する。そのため、８０％〜１２０％が適正値といわれており、満たない場合は実験系の見直しが通常必要と言われている。本発明によれば、このＰＣＲ効率を高めることができ、一例として、ＰＣＲ効率を８０％〜１２０％とすることができ、好ましくは８５％〜１１５％とすることができる
リアルタイムＰＣＲ法では未知試料の絶対定量方法として、スタンダードサンプルの希釈系列により得られた検量線を使用する。この場合、スタンダードサンプルと未知試料におけるＰＣＲ効率が一致していなければならず、一致していない場合は、誤った結果を与えてしまうことにつながる点に留意しなければならない。
本発明によれば、数組のプライマー対を、一つのＰＣＲアッセイで同時に用いるマルチプレックスＰＣＲ法においても、ＰＣＲ効率、検出感度を改善することができる。複数プライマーを含むことによる増幅効率のバラつきが改善され、正確な結果を得ることが可能になり、標的ＤＮＡの検出感度低下を抑制することが可能となり得る。
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
実施例１ ポリドカノールの評価
リアルタイムＰＣＲ反応におけるポリドカノールの効果を検証するため、下記（２）ＰＣＲ反応用試薬に、ポリドカノール〔ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨ〕を無添加、または０．１容量％を添加しリアルタイムＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ効率の評価を行った。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてHela Total RNA（タカラバイオ社）をReverTra Ace qPCR RT Kit(ＴＯＹＯＢＯ)を用いて逆転写して調製したｃDNAを使用した。ｃDNAを５ｎｇから０．０７８ｎｇまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
そして、ＩＬ−１β遺伝子を増幅する各々のプライマー（配列番号１及び２）、Ｔａｑｍａｎプローブ（配列番号３）を使用し、リアルタイムＰＣＲ反応によってＰＣＲ効率を測定した。
（２）ＰＣＲ反応用試薬の調製
本実施例で使用するＰＣＲ反応用試薬は、以下の処方に従って調製した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
４０ｍＭ 酢酸カリウム
３ｍＭ 硫酸マグネシウム
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．３μＭ フォワードプライマー
０．３μＭ リバースプライマー
０．２μＭ Ｔａｑｍａｎプローブ
０．０５Ｕ／μＬ ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．４μｇ 抗Ｔｔｈ抗体（ＴＯＹＯＢＯ）
（３）リアルタイムＰＣＲ反応
リアルタイムＰＣＲ反応はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システムを使用し、反応条件は初期変性９５℃３０秒、ＰＣＲサイクル９５℃５秒−６０℃ ３０秒で５０サイクル行った。
（４）結果
その結果を図１に示す。図１は、各条件で二回実施したＣｔ値と、ＰＣＲ効率Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１によって求められるＰＣＲ効率（％）の値を示す。ここで、Ct値は値が小さいほど増幅効率が高いことを示し、ＰＣＲ効率の値が１００％に近いほどＰＣＲ効率が高いことを示す。ポリドカノールの添加により、ＰＣＲ効率、Ct値が改善されることが確認された。
リアルタイムＰＣＲ反応におけるポリドカノールの効果を検証するため、下記（２）ＰＣＲ反応用試薬に、ポリドカノール〔ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨ〕を無添加、または０．１容量％を添加しリアルタイムＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ効率の評価を行った。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてHela Total RNA（タカラバイオ社）をReverTra Ace qPCR RT Kit(ＴＯＹＯＢＯ)を用いて逆転写して調製したｃDNAを使用した。ｃDNAを５ｎｇから０．０７８ｎｇまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
そして、ＩＬ−１β遺伝子を増幅する各々のプライマー（配列番号１及び２）、Ｔａｑｍａｎプローブ（配列番号３）を使用し、リアルタイムＰＣＲ反応によってＰＣＲ効率を測定した。
（２）ＰＣＲ反応用試薬の調製
本実施例で使用するＰＣＲ反応用試薬は、以下の処方に従って調製した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
４０ｍＭ 酢酸カリウム
３ｍＭ 硫酸マグネシウム
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．３μＭ フォワードプライマー
０．３μＭ リバースプライマー
０．２μＭ Ｔａｑｍａｎプローブ
０．０５Ｕ／μＬ ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．４μｇ 抗Ｔｔｈ抗体（ＴＯＹＯＢＯ）
（３）リアルタイムＰＣＲ反応
リアルタイムＰＣＲ反応はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システムを使用し、反応条件は初期変性９５℃３０秒、ＰＣＲサイクル９５℃５秒−６０℃ ３０秒で５０サイクル行った。
（４）結果
その結果を図１に示す。図１は、各条件で二回実施したＣｔ値と、ＰＣＲ効率Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１によって求められるＰＣＲ効率（％）の値を示す。ここで、Ct値は値が小さいほど増幅効率が高いことを示し、ＰＣＲ効率の値が１００％に近いほどＰＣＲ効率が高いことを示す。ポリドカノールの添加により、ＰＣＲ効率、Ct値が改善されることが確認された。
実施例２ 種々の界面活性剤の比較
下記に示すＰＣＲ反応用試薬に、４種類の界面活性剤（ポリドカノール、MEGA−１０〔ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン〕、Tween20〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕、CHAPS〔３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸〕）をそれぞれ０．１容量％添加した場合と、無添加の場合のマルチプレックスＰＣＲの増幅効率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検証した。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてSALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005（ZeptoMetrix Corporation社）を使用した。SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005を表示値よりコピー数を計算し、１０００コピーから１０コピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
そして、腸内細菌遺伝子検出キット−プローブ検出−（TOYOBO）付属の10×Primer Mix、10×Probe Mixを使用し、リアルタイムＰＣＲ反応によってＰＣＲ効率を測定した。
・ＰＣＲ反応用試薬の調製
本実施例で使用するＰＣＲ反応用試薬は、以下の処方に従って調製した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
４０ｍＭ 酢酸カリウム
３ｍＭ 硫酸マグネシウム
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０×Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ
１０×Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ
０．０５Ｕ／μＬ ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．４μｇ 抗Ｔｔｈ抗体（ＴＯＹＯＢＯ）
（２）リアルタイムＰＣＲ反応
リアルタイムＰＣＲ反応はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システムを使用し、反応条件は初期変性９５℃３０秒、ＰＣＲサイクル９５℃５秒−６０℃ ３０秒で６０サイクル行った。
（３）結果
その結果を図２に示す。ポリドカノールを添加した条件において、他の条件よりＰＣＲ効率が高いことが確認された（ＰＣＲ効率：９８．１％）すなわち、マルチプレックスＰＣＲにおいて、他の界面活性剤よりも、ポリドカノールは優れた核酸増幅効率を示すことが確認された。
下記に示すＰＣＲ反応用試薬に、４種類の界面活性剤（ポリドカノール、MEGA−１０〔ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン〕、Tween20〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕、CHAPS〔３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸〕）をそれぞれ０．１容量％添加した場合と、無添加の場合のマルチプレックスＰＣＲの増幅効率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検証した。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてSALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005（ZeptoMetrix Corporation社）を使用した。SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005を表示値よりコピー数を計算し、１０００コピーから１０コピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
そして、腸内細菌遺伝子検出キット−プローブ検出−（TOYOBO）付属の10×Primer Mix、10×Probe Mixを使用し、リアルタイムＰＣＲ反応によってＰＣＲ効率を測定した。
・ＰＣＲ反応用試薬の調製
本実施例で使用するＰＣＲ反応用試薬は、以下の処方に従って調製した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
４０ｍＭ 酢酸カリウム
３ｍＭ 硫酸マグネシウム
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０×Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ
１０×Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ
０．０５Ｕ／μＬ ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
０．４μｇ 抗Ｔｔｈ抗体（ＴＯＹＯＢＯ）
（２）リアルタイムＰＣＲ反応
リアルタイムＰＣＲ反応はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システムを使用し、反応条件は初期変性９５℃３０秒、ＰＣＲサイクル９５℃５秒−６０℃ ３０秒で６０サイクル行った。
（３）結果
その結果を図２に示す。ポリドカノールを添加した条件において、他の条件よりＰＣＲ効率が高いことが確認された（ＰＣＲ効率：９８．１％）すなわち、マルチプレックスＰＣＲにおいて、他の界面活性剤よりも、ポリドカノールは優れた核酸増幅効率を示すことが確認された。
実施例３ ポリドカノールとノナエチレングリコールモノドデシルエーテルの評価
前記実施例２で使用したものと同じＰＣＲ反応用試薬に、式（Ｉ）：ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨで表されるポリドカノール(シグマアルドリッチ社製）とノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（シグマアルドリッチ社製）を０．１容量％添加した場合又は無添加の場合にマルチプレックスＰＣＲを行った際の増幅効率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてShigella sonnei Z004,Genomic DNA（ZeptoMetrix Corporation社）を使用した。Shigella sonnei Z004,Genomic DNAを表示値よりコピー数を計算し、５０００コピーから７８．１２５コピーまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
ＰＣＲ反応調製試薬は実施例２で使用したものと同様とした。
（２）リアルタイムＰＣＲ反応
リアルタイムＰＣＲ反応はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システムを使用し、反応条件は初期変性９５℃３０秒、ＰＣＲサイクル９５℃５秒−６０℃ ３０秒で５０サイクル行った。
前記実施例２で使用したものと同じＰＣＲ反応用試薬に、式（Ｉ）：ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨで表されるポリドカノール(シグマアルドリッチ社製）とノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（シグマアルドリッチ社製）を０．１容量％添加した場合又は無添加の場合にマルチプレックスＰＣＲを行った際の増幅効率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてShigella sonnei Z004,Genomic DNA（ZeptoMetrix Corporation社）を使用した。Shigella sonnei Z004,Genomic DNAを表示値よりコピー数を計算し、５０００コピーから７８．１２５コピーまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
ＰＣＲ反応調製試薬は実施例２で使用したものと同様とした。
（２）リアルタイムＰＣＲ反応
リアルタイムＰＣＲ反応はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システムを使用し、反応条件は初期変性９５℃３０秒、ＰＣＲサイクル９５℃５秒−６０℃ ３０秒で５０サイクル行った。
その結果を図３に示す。ポリドカノールとノナエチレングリコールモノドデシルエーテルを添加した場合には、７８．１２５コピーまで検出が確認され、ＰＣＲ効率も理想値の範囲であった。マルチプレックスＰＣＲにおいて、これらの非イオン界面活性剤を加えることで、検出感度が向上することを見出した。
実施例４ ポリドカノールとヘパリンの組み合わせの評価
前記実施例２使用したものと同じＰＣＲ反応用試薬に、ポリドカノール〔ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨ〕を０．１容量％で添加すると共に、ヘパリンを無添加又は１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌ添加とする条件下で、ゲノム１コピー相当に対する検出率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてSALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005（ZeptoMetrix Corporation社）を使用した。SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005を表示値よりコピー数を計算し、１コピー（N=16）を鋳型として使用した。ＰＣＲ反応試薬とリアルタイムＰＣＲ反応の条件は実施例３と同様とした。
前記実施例２使用したものと同じＰＣＲ反応用試薬に、ポリドカノール〔ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨ〕を０．１容量％で添加すると共に、ヘパリンを無添加又は１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌ添加とする条件下で、ゲノム１コピー相当に対する検出率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
（１）ＤＮＡサンプル
ＤＮＡサンプルとしてSALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005（ZeptoMetrix Corporation社）を使用した。SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM Z005を表示値よりコピー数を計算し、１コピー（N=16）を鋳型として使用した。ＰＣＲ反応試薬とリアルタイムＰＣＲ反応の条件は実施例３と同様とした。
その結果を図４に示す。ヘパリンを添加した場合、無添加よりも１コピー相当の検出率が高いことが確認された。一般に、１コピー相当のサンプルからの核酸増幅は非常に困難とされるが、ポリドカノールとヘパリンを組み合わせることで、標的核酸のコピー数が極めて少ない場合であっても検出感度が向上することを見出した。
実施例５ ポリドカノール濃度の評価
前記実施例２使用したものと同じＰＣＲ反応用試薬に、ポリドカノール〔ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨ〕を各濃度（０．０１、０．１、１容量％）で添加した場合又は無添加の場合に、マルチプレックスＰＣＲを行った際の増幅効率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
（１）ＤＮＡサンプルとしてHela Total RNA（タカラバイオ社）をReverTra Ace qPCR RT Kit(ＴＯＹＯＢＯ)を用いて逆転写して調製したｃDNAを使用した。ｃDNAを２ｎｇから０．００２ｎｇまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
そして、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅する各々のプライマー（配列番号４及び５）、Ｔａｑｍａｎプローブ（配列番号６）と３対のプライマー（配列番号７，８，９，１０，１１，１２）を使用し、リアルタイムＰＣＲ反応によってＰＣＲ効率を測定した。
前記実施例２使用したものと同じＰＣＲ反応用試薬に、ポリドカノール〔ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）９ＯＨ〕を各濃度（０．０１、０．１、１容量％）で添加した場合又は無添加の場合に、マルチプレックスＰＣＲを行った際の増幅効率をリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
（１）ＤＮＡサンプルとしてHela Total RNA（タカラバイオ社）をReverTra Ace qPCR RT Kit(ＴＯＹＯＢＯ)を用いて逆転写して調製したｃDNAを使用した。ｃDNAを２ｎｇから０．００２ｎｇまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
そして、β−Ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅する各々のプライマー（配列番号４及び５）、Ｔａｑｍａｎプローブ（配列番号６）と３対のプライマー（配列番号７，８，９，１０，１１，１２）を使用し、リアルタイムＰＣＲ反応によってＰＣＲ効率を測定した。
その結果を図５に示す。いずれのポリドカノールの濃度においても、無添加の場合よりも、高い増幅効率（ＰＣＲ効率）を示した。この結果から、０．０１容量％〜１容量％のポリドカノールを添加した場合に、同等の効果が得られることを見出した。
なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。
本発明は、核酸増幅反応の増幅効率や検出感度を高めることができ、例えば、複数プライマー対を１反応液中に添加するマルチプレックスＰＣＲにおいても効果的に核酸増幅させることを可能とできる。従って、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、食品や館共通の微生物検査等において有用である。
Claims (20)
- 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含む核酸増幅反応用キット。 - 核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が０．００１〜１容量％となるように調整された試薬を含む、請求項１に記載の核酸増幅反応用キット。
- 核酸増幅反応時の反応液中における前記非イオン界面活性剤の濃度が０．０１〜０．１容量％となるように調整された試薬を含む、請求項１又は２に記載の核酸増幅反応用キット。
- 一般式（Ｉ）においてｎ＝８〜１０である非イオン界面活性剤を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 更にＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 更に多糖類を含む請求項１から５のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、請求項６に記載の核酸増幅反応用キット。
- 前記多糖類が、ヘパリンおよびその塩である請求項６又は７に記載の核酸増幅反応用キット。
- 核酸増幅反応時の反応液中における前記多糖類の濃度が０．２ｎｇ／μＬ以上４ｎｇ／μＬ以下となるように調整されている請求項６から８のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 核酸増幅反応がリアルタイムＰＣＲ反応である、請求項１から９のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 核酸増幅反応がマルチプレックスＰＣＲ反応である、請求項１から１０のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 検出対象の標的核酸の検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブを含む請求項１から１１のいずれかに記載の核酸増幅反応用キット。
- 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤を含む、核酸増幅反応用組成物。 - 更に、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の核酸増幅反応用組成物。
- 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、請求項１４に記載の核酸増幅反応用組成物。
- 以下の一般式（Ｉ）：
ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ ・・・（Ｉ）
（式中、ｎは平均付加モル数であり、ｎ＝６〜１２の範囲内の数を示す）
で表される非イオン界面活性剤の存在下において核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸増幅効率の向上方法。 - 前記非イオン界面活性剤と、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、多糖類、及びハイブリダイゼーションプローブからなる群より選択される少なくとも１つとの存在下で核酸増幅反応を行う、請求項１６に記載の核酸増幅効率の向上方法。
- 前記多糖類がヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の酸性多糖類である、請求項１７に記載の核酸増幅効率の向上方法。
- 核酸増幅反応がリアルタイムＰＣＲ反応である、請求項１６から１８のいずれかに記載の核酸増幅効率の向上方法。
- 核酸増幅反応がマルチプレックスＰＣＲ反応である、請求項１６から１９のいずれかに記載の核酸増幅効率の向上方法。
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|---|---|---|---|---|
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