JP2008526226A - Ｄｎａ分析のための生物学的サンプルの保管及び加工処理のための試薬並びに方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＰＣＲ及び他のＤＮＡ用途における直接的な使用のための生物学的サンプルの保管や加工処理のための試薬並びに方法について記載する。保管後、上記サンプル中の保存されたＤＮＡは次に加工処理されることができ、既知の方法（例えば、ＰＣＲ）により分析され得る。本発明は、一態様では、体液、各種溶液、細胞、植物、組織、プラスミドを含有する細菌細胞溶解産物等を包含するがこれらに限定されない各種供給源由来の核酸（例えば、ＤＮＡ）の簡素且つ迅速な保管や加工処理に関する方法を提供する。本発明は、生物学的サンプルを加工処理し、且つさらなるサンプル精製を伴わずに、ＤＮＡをＰＣＲで使用可能とするようにアルカリ性ｐＨでグリコールを用いる試薬及び方法をさらに含む。したがって、本発明は、一態様では、体液、各種溶液、細胞、植物、組織、プラスミドを含有する細菌細胞溶解産物等を包含するがこれらに限定されない各種供給源由来の核酸（例えば、ＤＮＡ）の簡素且つ迅速な加工処理に関する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

［発明の分野］
本発明は概して、多数の生物学的サンプルの簡素且つ有効な保存及び加工処理を可能にする試薬並びに方法に関する。より具体的には、本発明は、ＰＣＲ及び他のＤＮＡ用途における直接的な使用のための生物学的サンプルの保管や加工処理のための試薬並びに方法に関する。本発明はさらに、生物学的サンプルを加工処理して、且つサンプル精製を伴わずにＤＮＡをＰＣＲで使用可能とするための試薬並びに方法に関する。
［発明の背景］
分子診断学におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の高まる使用は、多数の生物学的サンプルの簡潔且つ有効な保存及び加工処理が可能な試薬並びに方法を開発することを望ましいものとしている。
伝統的なアルカリ溶解は、以下の工程、すなわち成長培地で希釈した細胞を濃縮又はペレット化する工程、遠心分離又はボルテックスする工程、細胞をアルカリ洗浄剤で溶解させる工程、溶解産物を振とうすることや攪拌する工程、中和緩衝液を添加する工程、凝集塊を除去するためにサンプルを濾過や操作する工程、固相キャリアを添加する工程、並びに結合緩衝液を添加する工程を必要とする。一般的に、次のようなさらなる精製工程が、洗浄剤及び塩を除去するのに必要とされる。すなわち、固相キャリアの添加及び結合緩衝液の添加がある。
ＤＮＡ診断において頻繁に使用される供給源は血液であるが、特に癌検査に関して、口腔ぬぐい液及び組織生検材料もまた使用される場合が多い。現在、組織サンプルは、凍結されて、ホルマリン固定されて又はパラフィン包埋されて保管及び保存される。ホルマリン固定されたサンプル又はパラフィン包埋されたサンプルの使用は、これらのサンプル由来のＤＮＡを、ＰＣＲに使用可能にさせるための多段階プロセスを要する。ＤＮＡ診断目的での血液保管は、冷蔵、凍結乾燥又は凍結を要する。或いは、血液サンプルは、ＦＴＡ ＣＡＲＤ(Invitrogen)のようなカードに塗布されて、室温で乾燥保管する。
Leal-Klevez他は、２０％エチレングリコール−プロピレングリコール水溶液中で−２０℃で血液及び組織サンプルを保管する方法を開発した。このプロトコルでは、ＤＮＡは、プロテイナーゼＫ−フェノール抽出手順により保管サンプルから抽出され得る。
米国特許第６，６０２，７１８号は、約２〜約１２のｐＨ範囲で、カオトロピック塩を含む添加剤を補充した陽イオン性洗浄剤の水溶液又は分散液を使用して生物学的サンプル中のＲＮＡ及びＤＮＡを安定化するための方法並びに試薬について記載している。
サンプル加工処理の各種方法が、ＰＣＲ分析のためにＤＮＡを調製するのに使用されている。ＤＮＡは通常、フェノールベースの方法、塩−アルコール沈殿法又はカラム上での吸着方法を使用して抽出される。これらの方法の概説は、Current Protocols. pp.2.0.1-2.4.5に提供されている。また、米国特許第５，３４６，９９４号及び同第５，９４５，５１５号は、ＤＮＡ単離に関する試薬及び方法について記載している。これらの試薬及び方法は、実質的に純粋なＤＮＡを提供する。しかしながら、これらは時間がかかり、自動化に容易に適合可能ではない。サンプルを９４℃で加熱すること(Mercier他)、マイクロ波照射(Ohhara他)及び好熱性プロテアーゼによる処理(Bellly他)等のＤＮＡの先立つ単離なしでサンプルに関してＰＣＲを実施する方法が開発されている。これらの方法の多くは、４０サイクルのＰＣＲ増幅につながる。４０サイクルのＰＣＲ増幅は、人為的結果をうけやすく、診断目的で確実に使用することはできない。
これまでに、アルカリ溶解を使用して、ＤＮＡの精製を伴わずにＰＣＲ用に直接的に血液及び他のサンプルを調製した。Rudbeck他は、０．２Ｍ ＮａＯＨを使用して、室温で全血、精液及び上皮細胞を溶解させた。溶解産物を中和して、ＰＣＲ用に直接使用した。２０ｍＭ ＮａＯＨは、ＰＣＲで使用可能なＤＮＡを放出するのに有効ではなかった。Ashen他は、遠心分離及び溶解によりまず血液白血球を単離することにより、このプロトコルを修飾した。単離された白血球は、室温で０．２Ｍ ＮａＯＨ中で溶解された。溶解産物を中和して、ＰＣＲに使用した。
Truett他は、２５ｍＭ ＮａＯＨ−０．２ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２）を使用して、９５℃で加熱することによりマウス組織サンプルを溶解させた。加熱後、サンプル溶解産物を中和して、ＰＣＲに使用した。この方法は、ＤＮＡフラグメントを増幅するための４０サイクルのＰＣＲを包含したため、あまり有効ではなかった。また、アルカリ性溶解産物の中和は、プロトコルに１工程を加えて、溶解産物中のｐＨの正確な確定に関する厳しい要件を課した。
Lin他は、最低２時間血液を凝結させることによりまず全血からヘモグロビンを除去し、続いて一晩の保管及び遠心分離による血液からのＤＮＡの調製について記載している。生じた血清は、３７℃で１８ｍＭ ＫＯＨ中で溶解させ、中和して、ＰＣＲに使用した。
また、ＰＣＲによるＤＮＡ分析に関する迅速なプロトコルは、細菌に関して詳述された。Sandhu他は、水中の細菌コロニーを煮沸した。Joshi他は、煮沸することなくＰＣＲに直接細菌を使用した。細菌細胞の保管及び加工処理に関するＦＴＡ ＣＡＲＤ法もまた報告されている（Rogers他）。
ここで、直接的なＰＣＲのための生物学的サンプルを加工処理するための試薬及び方法に適合可能な外気温保管のための信頼性が高く且つ貯蔵性のよい試薬並びに方法が必要とされる。予想外に、グリコールで構成される試薬は、生物学的サンプルのＤＮＡを保存し、且つその長期の外気温保管を保証することが見出された。
［発明の概要］
本発明は、ＰＣＲ及び他のＤＮＡ用途における直接的な使用のための生物学的サンプルの保管や加工処理に関する試薬並びに方法について記載する。保管後、サンプル中の保存されたＤＮＡは次に加工処理されることができ、既知の方法（例えば、ＰＣＲ）により分析され得る。
以下の方法では、核酸は、或る特定の濃度のポリアルキレングリコールの存在下で保存及び加工処理される。したがって、本発明は、一態様では、体液、各種溶液、細胞、植物、組織、プラスミドを含有する細菌細胞溶解産物等を包含するがこれらに限定されない各種供給源由来の核酸（例えば、ＤＮＡ）の簡素且つ迅速な保管や加工処理に関する方法を提供する。下記事項は、ＤＮＡにより例示されるような核酸に関する本発明の説明である。
本発明は、生物学的サンプルを加工処理し、且つさらなるサンプル精製を伴わずに、ＤＮＡをＰＣＲで使用可能とするようにアルカリ性ｐＨでグリコールを用いる試薬及び方法をさらに含む。したがって、本発明は、一態様では、体液、各種溶液、細胞、植物、組織、プラスミドを含有する細菌細胞溶解産物等を包含するがこれらに限定されない各種供給源由来の核酸（例えば、ＤＮＡ）の簡素且つ迅速な加工処理に関する方法を提供する。
概して、例えばポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールを含む様々なポリアルキレングリコールが本発明で有用である。一実施形態では、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。概して、ポリアルキレン濃度は、使用するポリアルキレンに依存する。使用するポリエチレングリコールの重量範囲に応じて、濃度が調節され得る。概して、ポリエチレングリコールが使用される方法に関して、保管試薬の濃度は、最終容積の約２５％〜約１００％に調節される。別の実施形態では、ポリエチレングリコールの濃度は、最終容積の約３０％である。
一実施形態では、ＤＮＡは、保管又は加工処理試薬を含有する溶液中に可溶性形態で留まる。
一実施形態では、ＰＥＧ及びＰＥＧ誘導体がＰＣＲミックスへ添加されて、ＰＣＲに対する不純物の影響を阻害する。一実施形態では、ＰＥＧの濃度は、約１５％未満である。別の実施形態では、ＰＥＧの量は、約０．１％〜約１０％である。
本発明で有用なグリコール化合物としては、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリグリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール及びグリコール誘導体（ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５）、オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）及びポリオキシエチレンセチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５２）を含む）が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、生物学的サンプルを有効に溶解させて、且つＰＣＲ阻害剤を不活性にするように、グリコール化合物及びアルカリ性ｐＨ（アルカリ）の組合せを提供する。これにより、精製を伴わずにＰＣＲのために直接的に、生じる溶解産物を使用することが可能となる。生物学的サンプルは、約０℃〜約１００℃の範囲の温度で、本発明の試薬及び方法により加工処理され得る。
一実施形態では、温度は、約１０℃〜４５℃の範囲の外気温である。別の実施形態では、温度は、約１５℃〜３５℃の範囲の外気温である。別の実施形態では、温度は、約１８℃〜３０℃の範囲の外気温である。本発明の試薬及び方法によりサンプルを加工処理するのに使用されるアルカリ性ｐＨは概して、約９〜約１４のｐＨである。一実施形態では、外気温でのサンプル加工処理のためのｐＨ範囲は、約１０〜約１３のｐＨである。別の実施形態では、外気温でのサンプル加工処理のためのｐＨは、約１１〜約１２．５のｐＨである。
生物学的サンプルは、生物学的起源の任意の材料から構成されるか、又は生物学的起源の任意の材料を含有する任意の材料であり得る。サンプルとしては、ヒト及び動物の組織、血液、骨、皮膚、毛、植物の葉、種子、芽及び茎、細菌及び細胞培養物、ホルマリン固定した組織、保存用紙又は固体マトリックス（例えば、Whatman製のＦＴＡ紙）上にスポッティングした血液等が挙げられ得るが、これらに限定されない。サンプルは、生物学的材料のみを含有する必要はない。サンプルはまた、一片の布地上の体液のしみ、一片の木材に包埋された一片の組織又は毛の断片を含有するわずかなほこりのような物理学的マトリックス上又は物理学的マトリックス中の生物学的材料から構成されてもよい。
本発明は、好適には自動化になじみやすい。本発明の方法を実施するのに要される様々な反応物及び構成成分は、キット形態で利便性よく供給され得る。かかるキットは、本発明のさらなる態様を表す。最も単純には、本発明のこの態様は、１つ又は複数のグリコールを含むサンプル由来の核酸の核酸の保管用のキットを提供する。本発明はまた、アルカリ及び１つ又は複数のグリコールを含むサンプル由来の核酸の加工処理用のキットを提供する。任意に、かかるキットには、緩衝液、塩、溶解剤（例えば、プロテイナーゼ）、キレート剤及び還元剤が含まれてもよい。
本発明はまた、上述の方法を実施する際に利用することができる、通常はキット形態での試薬系も意図する。上記系は、少なくとも１つの保管や加工処理に十分な量で、生物学的サンプル中の核酸の保管や加工処理用に個々にパッケージングされる試薬を包含する。パッケージングされる試薬の使用説明書もまた通常含まれる。
本発明の組成物は、長期安定性を有するという点で、保管や加工処理手順の自動化に使用することができ、したがって自動化機器において使用されてもよく、そこでは試薬が、保管や加工処理工程を実施するのに必要に応じて保管及び分配される。その場合、開示する安定な組成物を含有する生物学的サンプル由来のＤＮＡを保管や加工処理するための自動手順で有用な密封パッケージが提供され得る。
［発明の詳細な説明］
本発明は、サンプルの保管、及び生物学的サンプル由来のＤＮＡの保存のための組成物、方法及びキットを提供する。概して、試薬は、グリコール及び水溶性有機溶媒又は溶媒のミックスを含む。予期せぬことに、グリコール化合物単独は、外気温で数ヶ月間保管される生物学的サンプル中のＤＮＡを保存するのに十分である。本発明は、有毒な有機化学物質を必要とせずに、高い効率で生物学的サンプルからＤＮＡを抽出する新規の試薬を提供する。本発明はまた、新規の試薬を含むＤＮＡを精製するための方法及びキットも提供する。
水溶性有機溶媒は、低級アルコールを含む。アルコールは、アルコール、好ましくは炭素数１〜１０を有する低級アルコールに関して一般的に使用される専門用語の意味で意図される。一実施形態では、低級アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール又はｔ−ブタノール、並びにグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコール、並びにそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール及び２−プロパノールから成る群から選択される。別の実施形態では、アルコールは、エタノール、イソプロパノール或いはそれらの誘導体又は混合物から成る群から選択される。
本発明の方法における使用に適したアルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール）濃度（最終濃度）は、約２５％〜約７５％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、及び約５０％〜約５４％である。
適切なポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコールが挙げられる。適切なＰＥＧは、Spectrum Laboratory Products, Inc,（Gardena, CA）、分子量２００、カタログ番号ＰＯ１０７）から得ることができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量は、約２００〜約１００００の範囲であり得る。特定の実施形態では、約２００の分子量を有するＰＥＧが使用される。一実施形態では、ＰＥＧ濃度は、約０．５％〜約２０％である。他の実施形態では、ＰＥＧ濃度は、約０．１％〜約１０％、約２５％〜約１００％の範囲である。
本発明で有用な「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、２００〜１００００ダルトン、より好ましくは約２００〜３００ダルトンの分子量を有する市販のジオールである。他の分子量制約を有する（例えば、１００００ダルトンを超える）ＰＥＧの使用もまた、本発明の組成物及び方法における使用に関して意図されるが、おそらく高収率／品質の生成物を提供するのに有効ではない。
一実施形態では、本発明のグリコール化合物は、１，２−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，４−シクロヘキサンジメタノール、１，６−ヘキサンジオール、ブチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、エチレン及びプロピレングリコール（エチレン及びプロピレングリコールモノマー並びにポリマー、例えば低分子量（６００未満）のポリエチレングリコール及び低分子量（６００未満）のプロピレングリコールを含む）、グリセロール、長鎖ＰＥＧ ８０００（約１８０個のエチレンモノマー）、メチルプロパンジオール、メチルプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、オクチルフェノール−ポリエチレングリコールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）、ＰＥＧ−４〜ＰＥＧ−１００及びＰＰＧ−９〜ＰＰＧ−３４、ペンチレングリコール、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ ２００、約４個のエチレンモノマー）、ポリエチレングリコール、ポリグリコール、ポリオキシエチレンセチルエーテル及びオクチル−ポリエチレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５）、ポリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、トリエチレングリコール、トリメチルプロパンジオール、トリプロピレングリコールを含む。
別の実施形態では、本発明のグリコール化合物は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリコール及びグリコール誘導体（ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５）、オクチルフェノール−ポリエチレングリコールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）及びポリオキシエチレンセチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５２）を含む）を含む。本発明の好ましい有機溶媒は、ポリエチレングリコール及びグリコール誘導体である。最も好ましい溶媒は、ポリエチレングリコールである。
保管試薬
本発明の保管試薬は、約−８０℃〜約５０℃の範囲の温度で保管される生物学的サンプル中のＤＮＡを保存する。本発明における生物学的サンプルの優先的な保管は、外気温（１８〜２５℃）である。本発明の保管試薬は、生物学的サンプルを外気温で数ヶ月間保管することを可能にする。これらの試薬とともに使用される生物学的サンプルは、生物学的材料に由来するか、又は生物学的材料を含有する任意の固形物或いは流体であり得る。全血、生体液又は組織フラグメントは全て、本発明の保管試薬中で保管することができる。
本発明の保管条件下では、ＤＮＡは、数日以上〜数ヶ月以上の間、二本鎖又は一本鎖形態のいずれかで保存され得る。一実施形態では、組成物は、約２５℃で少なくとも３０日間安定である。一実施形態では、組成物は、約２５℃で少なくとも６０日間安定である。一実施形態では、組成物は、約２５℃で少なくとも９０日間安定である。
サンプル保管及びＤＮＡ保存に関して、保管試薬は、約２５％〜最大約１００％の範囲の試薬の最終濃度に匹敵するように固体又は流体生物学的サンプルへ添加され得る。保管試薬は、非水性試薬として、或いは水含有溶液又は分散液として使用することができる。
本発明の試薬単独では、室温で数ヶ月間、ＤＮＡを保存するのに十分である。さらに、本発明の試薬はまた、塩、キレート剤及び洗浄剤のような添加剤も含むことができ、それらは、ＤＮＡの可溶化及びＰＣＲ阻害剤の不活性化を促進する。これらの添加剤は、分散液或いは水溶液又は非水溶液のいずれかとして保管試薬に添加され得る。
保管試薬はまた、アルカリ性添加剤も含むことができる。アルカリ性添加剤は、約ｐＨ８、９、１０、１１、１２又は１３より高い（最高約ｐＨ１３．８で）保管サンプルのｐＨを保証するのに十分な量で存在し得る。アルカリ性添加剤は、保管試薬中でのＤＮＡの溶解度を促進する。
本発明の予期せぬ特徴は、ＤＮＡが、最大約７５％の有機溶媒の濃度を有するアルカリ性保管試薬中で実質的に可溶性であることである。低級アルコール及びポリエチレングリコールは、ＤＮＡ及びＲＮＡを沈殿させるのに使用されている。本発明の試薬中でのＤＮＡの溶解度は、必要であれば、サンプルの分取量を採取して、続く分析用に残りを保管することを可能にする。従来特許'７１８号の試薬及び方法は、保管サンプル中のＤＮＡの沈殿につながる。これは、分取量を採取することを困難とさせ、ＤＮＡ分析のためのサンプル全体の加工処理を要する。
一実施形態では、ＤＮＡは、保管溶液中で実質的に可溶性形態で留まる。一実施形態では、ＤＮＡは、保管溶液中で安定な実質的に可溶性形態で留まり、ここで保管溶液は、高ＰＥＧ濃度を含有する。
本明細書中で使用する場合、「実質的に可溶性形態」は、核酸が安定な形態で存続することを意味し、ここで少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上が沈殿することなく溶液中に存続する。
ｐＨ１０又はそれ以上で、アルカリ性添加剤は、タンパク質を変性及び不活性化させて、タンパク質−ＤＮＡ複合体を解離させて、ＲＮＡを加水分解して、したがってＤＮＡの分析に使用される生体液の感染性を減少又は根絶させる。有機塩基又は無機塩基或いは塩基のミックスが、本発明においてアルカリ性添加剤として使用され得る。例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、テトラメチルグアニジン及びトリオクチルアミンが挙げられる。これらの塩基に代わって、他の強力な塩基を使用してもよいことは、当業者に理解されよう。サンプルが１０以下のｐＨで保管試薬を用いて保管される場合、ＤＮＡは、二本鎖形態で保存される。約１０より高いｐＨでは、ＤＮＡは、一本鎖形態へ解離される。
一実施形態では、本明細書で調製される混合物中のアルカリの最終濃度は、約１０〜約９０ｍＭの範囲である。一実施形態では、上記方法は、１容量部の血清又は血漿と、約４容量部の約２０ｍＭアルカリの保管溶液との混合物を形成することを包含する。
保管試薬は、塩又は塩のミックスをさらに含むことができる。請求項１の保管試薬は、約１ｍＭ〜約０．８Ｍの範囲の濃度で塩又は塩のミックスをさらに含む。
概して、塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム及びアンモニウムの酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、エチレンジアミン、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩並びに塩化物塩を含有する群から選択される。一実施形態では、適切な塩としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化バリウム（ＢａＣｌ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４ＳＯ４）及び塩化セシウム（ＣｓＣｌ）の１つ又は複数が挙げられる。一実施形態では、塩化ナトリウムが使用される。一般的に、塩の存在は、核酸分子の負の電荷の反発を最低限に抑えるように機能する。上記方法における使用に適した広範囲の塩により、多くの他の塩もまた使用することができることが示され、適切なレベルは、当業者により実験的に確定することができる。塩濃度は、約０．１Ｍ〜約５Ｍ、約０．１５Ｍ〜約４Ｍ、及び約０．２Ｍ〜約１Ｍであり得る。
保管試薬は、非イオン性作用物質をさらに含むことができる。一実施形態では、非イオン性作用物質は、Ｂｒｉｊ界面活性剤、オレイル界面活性剤、Ｉｇｅｐａｌ ＣＯ−９９０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８、コレステロールＰＥＧ ９００、ポリオキシエチレンエーテル Ｗ−１、Ｓｐａｎ ２０、Ｓｐａｎ ４０、Ｓｐａｎ ８５、アゾン及びそれらの混合物から成る群から選択される。別の実施形態では、非イオン性作用物質は、Ｂｒｉｊ ３０、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ３６、Ｂｒｉｊ ５２、Ｂｒｉｊ ５６、Ｂｒｉｊ ５８、Ｂｒｉｊ ７２、Ｂｒｉｊ ７６、Ｂｒｉｊ ７８、Ｂｒｉｊ ９２、Ｂｒｉｊ ９６、Ｂｒｉｊ ９７、Ｂｒｉｊ ９８、Ｂｒｉｊ ９８／９９、及びそれらの組合せから成る群から選択されるＢｒｉｊ界面活性剤である。別の実施形態では、非イオン性作用物質は、Ｂｒｉｊ ３５又はＢｒｉｊ ５２のＢｒｉｊ界面活性剤である。
さらに、保管溶液の実施形態で、他の成分が包含され得ること、例えば５０ｍＭ〜６Ｍ、好ましくは２００ｍＭ〜４００ｍＭの濃度でのカオトロピック塩が溶液中に包含され得ることが想定される。
保管試薬中の塩又は塩のミックスは、ｐＨ約２〜ｐＨ約１３．８の範囲で試薬のｐＨを維持する緩衝液を構成し得る。概して、塩の添加は、ＤＮＡを安定化して、ＤＮＡの二本鎖構造を維持するのを助長する。
本発明の試薬及び方法は、ヒト、動物、植物、真菌、酵母及び細菌起源のサンプルを含む固体並びに流体生物学的サンプル中のＤＮＡを保管及び保存するのに使用することができる。保存されるＤＮＡは、医学的目的、薬学的目的、法医学的目的、診断目的又は科学的目的を含む様々なＤＮＡ分析で使用され得る。保管後の分析としては、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、一本鎖コンホメーション多型、制限フラグメント長多型及びＤＮＡシーケンシングが挙げられる。
これらの方法の際の条件は、重要ではない。混合は、例えばかき混ぜること又はボルテックスすることによる単純な攪拌を含む任意の利便性のよい手段により実施することができる。また、望ましい場合、より高温又はより低温を使用してもよいが、必須ではない。
加工処理試薬
本発明はまた、精製することなく直接的にＰＣＲで使用するための生物学的サンプルを加工処理するための試薬及び方法を提供する。これらの加工処理試薬及び方法は、本発明の保管試薬及び方法に適合可能である。予期せぬことに、生物学的サンプルと加工処理試薬との短い３〜５分の外気温インキュベーションは、精製することなくＰＣＲのために直接的にサンプルの分取量を使用するのに十分なサンプルの溶解、ＤＮＡの放出及びＰＣＲ阻害剤の不活性化をもたらす。サンプルによっては、約８０℃〜約１００℃の範囲の温度で３〜１０分の加熱を要するものもある。
本発明のサンプル加工処理試薬及び方法は、グリコール又はグリコール誘導体の存在下で実施されるサンプルのアルカリ性溶解を用いる。本発明で使用されるグリコール及びグリコール誘導体は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリコール及びグリコール誘導体（ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５）、オクチルフェノール−ポリエチレングリコールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）及びポリオキシエチレンセチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５２）を含む）を含む。本発明の好ましい加工処理試薬は、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール誘導体である。最も好ましい加工処理試薬は、ポリエチレングリコールである。
加工処理試薬中のグリコールの濃度は、約２５％〜約１００％の範囲である。一実施形態では、加工処理試薬中のグリコールの濃度は、約５０％〜約７０％である。
生物学的サンプルは、約０℃〜約１００℃の範囲の温度で、本発明の試薬及び方法によりＰＣＲにおける使用のために加工処理され得る。一実施形態では、温度は、約１０℃〜４５℃の範囲の外気温である。別の実施形態では、温度は、約１５℃〜３５℃の範囲の外気温である。別の実施形態では、温度は、約１８℃〜３０℃の範囲の外気温である。別の実施形態では、温度は、約１８℃〜２５℃の範囲の外気温である。
本発明の試薬及び方法によりサンプルを加工処理するのに使用されるアルカリ性ｐＨは概して、約９〜約１３．８のｐＨである。一実施形態では、外気温でのサンプル加工処理のためのｐＨ範囲は、約１０〜約１３．５のｐＨである。別の実施形態では、外気温でのサンプル加工処理のためのｐＨ範囲は、約１１〜約１３のｐＨである。
加工処理試薬は、比較的低濃度の塩基（例えば、水酸化アルカリ金属、水酸化アルカリ土類金属又は水酸化アンモニウム）の存在により強力に塩基性である。これらの塩基に代わって、他の強塩基が使用され得ることは、当業者に理解されよう。塩基は通常、約１０ｍＭ／Ｌ〜約０．５Ｍ／Ｌの最終濃度で存在する。一実施形態では、塩基は、約１０ｍＭ／Ｌ〜約０．３Ｍ／Ｌの最終濃度で存在する。別の実施形態では、塩基は、約１０ｍＭ／Ｌ〜約３５ｍＭ／Ｌの最終濃度で存在する。一実施形態では、アルカリの量は、約ｐＨ９を超えるサンプル加工処理試薬混合物のアルカリ度を維持するのに十分である。別の実施形態では、アルカリの量は、約ｐＨ１０を超えるサンプル加工処理試薬混合物のアルカリ度を維持するのに十分である。別の実施形態では、アルカリの量は、約ｐＨ１１を超えるサンプル加工処理試薬混合物のアルカリ度を維持するのに十分である。別の実施形態では、アルカリの量は、約ｐＨ１１．５を超えるサンプル加工処理試薬混合物のアルカリ度を維持するのに十分である。別の実施形態では、アルカリの量は、約ｐＨ１２を超えるサンプル加工処理試薬混合物のアルカリ度を維持するのに十分である。
本発明による典型的な溶液では、塩基は、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの水酸化ナトリウムである。本発明の状況では、高度に塩基性の溶液は、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２又は少なくとも約１３のｐＨを有する溶液である。
このｐＨ範囲では、ほとんどのサンプルが、室温で最低約１〜３分間のグリコール試薬とのインキュベーションにより有効に加工処理される。幾つかのサンプルを用いる場合、例えば乾燥血液又はグラム陰性菌を伴うカードを用いる場合、約２５℃〜最大約１００℃の範囲の高温でのインキュベーションを要する。別の実施形態では、インキュベーション温度は、約５０℃〜約９０℃である。別の実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃〜約９０℃である。本発明の試薬を用いて加工処理した後、サンプル溶解産物は、任意のさらなる工程を伴わずにＰＣＲにおいて使用する準備が整っている。サンプル溶解産物の分取量は、ＰＣＲミックスへ添加されて、所望のＤＮＡフラグメント（複数可）を増幅させる。ほとんどのサンプルにおいて、アルカリ性サンプル溶解産物のｐＨ調節は、本発明の方法では必要でない。これは、ＰＣＲ及び他のＤＮＡ用途における使用のためのサンプルの加工処理を簡素化する。
いかなる場合でも理論により拘束されることを望まないが、本発明のサンプル加工処理方法におけるｐＨ調節の必要性がないことは、グリコールの予期せぬ特性の結果であると考えられる。ここでは、アルカリ性水溶液中で、グリコールは塩基のように作用し、溶液のアルカリ度に有意に寄与することが開示される。グリコールのアルカリ性効果は、プロピレングリコール及びグリコールポリマーで観察され、エチレングリコールモノマーでは観察されない。トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ ２００、約４個のエチレンオキシドモノマー）、長鎖ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ ８０００、約１８０個のエチレンオキシドモノマー）、ポリオキシエチレンセチルエーテル、セチルフェノール−ポリエチレングリコールエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルは全て、アルカリ性効果を示す。
２０ｍＭ ＫＯＨのみを含有する水溶液は、ｐＨ１２．３を有するのに対して、２０ｍＭ ＫＯＨ及び６０％ＰＥＧ ２００を含有する溶液は、ｐＨ１３．３を有する。同様に、３０ｍＭ ＫＯＨは、ｐＨ１２．４を有し、３０ｍＭ ＫＯＨ及び６０％ ＰＥＧ ２００を含有する溶液は、ｐＨ１３．５を有する。したがって、６０％ＰＥＧ ２００は、ＯＨイオンの濃度の約１０倍の増加を引き起こす。このアルカリ性効果は、様々な程度で、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリコール、Ｂｒｉｊ ３５、ＢＲＩＪ ５８及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むグリコールで観察される。ＯＨ濃度の最も顕著な増加は、ポリエチレングリコールで観察される。
ポリエチレングリコールのアルカリ性効果は、水溶液のｐＨが約９を超える場合に有意となり、一般的に約１１を超えるｐＨで増加する。ポリエチレングリコールのアルカリ性効果はまた、濃度依存的である。有意なｐＨ増加に関して、ポリエチレングリコール濃度は、約１０％を超えるべきである。これらの特性が、ポリエチレングリコールを、本発明のサンプル保管及び加工処理のための好ましい試薬とする。
ポリエチレングリコール−サンプル溶解産物の分取量は、例えばＰＣＲミックスの最終容量の０．１容量又はそれ未満を構成する。１０倍希釈により、ポリエチレングリコール濃度が１０％以下へ減少され、そのアルカリ性効果は、非常に減少する。したがって、生じるＰＣＲ反応混合物は、ＰＣＲ緩衝液の緩衝範囲内であり、ｐＨ調節は必要でない。
ＰＣＲミックス中のサンプル溶解産物の量は、サンプル中のＤＮＡの量に応じて様々であり得る。通常、ＰＣＲに使用されるサンプル溶解産物は、約０．０１ｎｇ〜２００ｎｇを含む。ＤＮＡの好ましい量は、約１ｎｇ〜約２０ｎｇの範囲である。
アルカリ性効果は、グリコールモノマーであるエチレングリコールでは観察されない。アルカリ性ｐＨでは、エチレングリコールは、酸として作用し、本発明のサンプル加工処理方法において有益ではない。ペンタンジオール及びポリアルコール（例えば、グリセリン）は、アルカリ性効果を示さない。
ＰＣＲ中のポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルの存在は、ＤＮＡ増幅をＰＣＲ阻害剤に対して感受性を低くさせ、所望のＤＮＡフラグメントの増幅の有意な増加をもたらすことが、本発明でさらに開示される。ＰＣＲミックス中のポリエチレングリコールの好ましい濃度は、約２％〜約１０％であり、ポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンセチルエーテルの好ましい濃度は、約０．５％〜約２％である。
一般的な手順
サンプルに一定容量の保管試薬を添加する。サンプルを攪拌して、その結果、実質的に全てのサンプルが、保管試薬と接触する。保管試薬中のサンプルは、即座にＤＮＡ加工処理に使用され得るか、或いは少なくとも１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日又はそれ以上の日数の間、外気温で保管され得る。
保管後に、１〜５０容量の加工処理試薬を、サンプルを含有する保管試薬に添加して、溶液を完全に混合する。ＤＮＡ抽出に関して、加工処理溶液は、ＤＮＡの加工処理のための最適ｐＨ及び塩条件を提供する。
或いは、生物学的サンプルは、加工処理試薬中に直接浸浸させることでき、ＰＣＲ又は他のＤＮＡ分析に使用することができる。
本明細書中に記載する試薬及び方法の結果として、細胞由来のゲノム核酸を保管及び加工処理する迅速且つ容易に自動化可能な方法が現在利用可能である。開示される方法により加工処理された核酸は、核酸を要する分子生物学用途、例えばＤＮＡシーケンシング鋳型の調製、マイクロインジェクション、哺乳類細胞のトランスフェクション又は形質転換、ＲＮＡｉヘアピンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成、逆転写クローニング、ｃＤＮＡライブラリー構築、ＰＣＲ増幅及び遺伝子療法研究に、並びに形質転換、制限エンドヌクレアーゼ又はマイクロアレイ分析、選択的ＲＮＡ沈殿、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位、マルチプレックスＰＣＲ増幅産物の分離、ＤＮＡプローブ及びプライマーの調製、及び脱鋳型(detemplating)プロトコルを含むがこれらに限定されない他の用途に使用することができる。
本明細書中に記載する試薬及び方法は、米国特許第５，７０５，６２８号及び同第５，８９８，０７１号、並びにＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／５８６６４号（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含む様々な核酸精製技法とともに使用することができる。
ヒト、動物、植物、酵母、真菌、細菌及びウイルス起源のサンプルを包含する生物学的サンプル（固体又は流体）は、保管や加工処理のために本発明の試薬と混合され得る。血液を含む生物学的流体は、真空下で、保管や加工処理用の本発明の試薬を含有するチューブへ収集され得る。
本発明の試薬及び方法は、Invitrogen(Carlsbad. CA)製のＰｌａｔｉｎｉｕｍ（登録商標）及びＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）ポリメラーゼ、Sigma(St Louis, MO)製のＳｉｇｍａ Ｔａｑ、並びにタカラバイオ株式会社(日本国瀬田)製のＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）を含む様々なＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡフラグメントを増幅するために直接的なＰＣＲに使用することができる。
一実施形態では、１つ又は複数のさらなる構成成分が試薬へ添加されてもよい。一実施形態では、１つ又は複数のさらなる構成成分が保管試薬へ添加されてもよい。一実施形態では、１つ又は複数の緩衝液、塩、安定剤、溶解剤、キレート剤や還元剤が、試薬ミックスへ添加される。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム）並びに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤もまた組成物中に存在し得る。
許容可能な酸化防止剤の例としては、水溶性酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等）、油溶性酸化防止剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等）、及び金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等）が挙げられる。
キレート剤は、金属イオンをキレートするのに有効な任意の組成物であり得る。キレート剤はまた、ＤＮＡアーゼ阻害剤として機能を果たすという利点を提供する。本発明における使用に適したキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩(5-methoxysalicytate)及びホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる。他のキレート剤が、単独で或いは組み合わせて使用され得ることが当業者に理解されよう。キレート剤は、１〜５００ｍＭ、通常１〜１００ｍＭ、好適には約２５ｍＭの濃度で存在し得る。
安定剤は、例えば、メタケイ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、セスキケイ酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、フルオロケイ酸ナトリウムであってもよく、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、通常１〜１００ｍＭ、好適には約２５ｍＭの濃度で存在し得る。
任意に存在する緩衝液は、ｐＨ緩衝液として作用し得る任意の作用物質であり得る。かかる作用物質は、当該技術分野で既知であり、ピロリン酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム、カルボン酸ナトリウム、ニトリロ三酢酸三ナトリウム、フルオロホウ酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム及び三リン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝液は、０〜５００ｍＭ、通常１〜２００ｍＭ、好適には約２５〜１５０ｍＭの濃度で存在し得る。
任意に、別の実施形態では、少なくとも１つの酸化防止剤が、本発明の溶液へ添加され得る。一実施形態では、酸化防止剤は、ＢＨＡ、ＢＨＴ、没食子酸オクチル又は没食子酸ドデシル、ＳＯ２（例えば、亜硫酸ナトリウム又はチオ亜硫酸ナトリウムの形態で）、乳酸、クエン酸、酒石酸やその塩、ビタミンＣ、ビタミンＥ並びに尿酸及びその塩から成る群から選択される。尿酸及びその塩は、約０．０１〜約１重量％の濃度で添加されることが好ましく、ビタミンＣは、約０．０１〜２重量％の濃度で添加されることが好ましく、ビタミンＥは、約０．０１〜約０．１重量％の濃度で添加されることが好ましい。
使用される防腐剤は、サリチル酸塩（好ましくは約０．０１〜約０．５重量％）、ＰＢＨエステル（好ましくは約０．０５〜約０．６重量％）、イミダゾリジニル尿素誘導体（好ましくは約０．０１〜約０．６重量％）、クロロヘキシジン、ＮＩＰＡ−ＥＳＴＥＲ（登録商標）又は抗生物質であり得る。
上記方法では、ＤＮＡは、アルコール沈殿され得るか、或いは酸沈殿されてもよく、当該技術分野で既知の溶液で洗浄して、他の状況ではＤＮＡとともに同時精製される特異的な混入物を除去し得る。かかる混入物の例は、ＲＮＡ、エンドトキシン、植物樹脂及びポリフェノール系化合物である。洗浄溶液は通常、低濃度のカオトロピック剤及びアルコール（例えば、エタノール又はイソプロパノール）を含む。例えば、洗浄溶液は、１Ｍの塩酸グアニジン及び６０％エタノールを含んでもよい（ｐＨ７．０）。このインキュベーション後、ＤＮＡは、遠心分離、真空、ポンピング又は当該技術分野で既知の他の方法により回収される。
上記で付与される手順は、多くの変形がＤＮＡの精製の当業者により成され得るように可能であるため、限定的であると意図されない。このようにして包括的に記載される本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解され、以下の実施例は、説明の目的で提供されるものであり、本発明を限定するものであると意図されない。
試薬キット
本発明はまた、上述の方法を実施する際に利用することができる、通常はキット形態での試薬系を意図する。上記系は、少なくとも１つの保管や加工処理に十分な量で、生物学的サンプル中の核酸の保管や加工処理用の個々にパッケージングされる試薬を包含する。パッケージングされる試薬の使用説明書もまた通常含まれる。
本明細書中で使用する場合、「パッケージ」という用語は、定められた限度で、本発明の試薬を保持することが可能な固体マトリックス又は材料（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔等を指す。「使用説明書」は通常、試薬濃度、或いは少なくとも１つのアッセイ法パラメータ（例えば、混合されるべき試薬及びサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物に関する維持期間、温度、緩衝液条件等）について記載する明白な表現を包含する。診断系に関して本明細書中で論述されるパッケージング材料は、診断系で通例利用されるものである。かかる材料としては、ガラス及びプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）瓶、バイアル、プラスチック及びプラスチック箔積層エンベロープ等が挙げられる。
具体的には、本発明は、１つ又は複数の容器を、緊密に閉じ込めた中に収容するための区分されたキットを提供する。この容器には、（ａ）本発明の保管試薬又は本発明の加工処理試薬を含む第１の容器、及び（ｂ）以下の：緩衝液試薬、塩、アルカリ、防腐剤、中和緩衝液、アルコール、サンプル収集チューブ及び説明書、の１つ又は複数を含む１つ又は複数の他の容器を含む。
一実施形態では、本発明は、１つ又は複数の容器を、緊密に閉じ込めた中に収容するための区分されたキットを提供する。この容器には、（ａ）本発明の保管試薬を含む第１の容器、（ｂ）本発明の加工処理試薬を含む第２の容器、（ｃ）緩衝液試薬、塩、アルカリ、防腐剤、中和緩衝液、アルコール、サンプル収集チューブ及び説明書、の中から１つ又は複数を含む１つ又は複数の他の容器を含む。
幾つかのキットでは、細胞の培養で使用される複数のチューブ、例えばＬｉｄ−Ｂａｃチューブ（米国特許第５，９５８，７７８号及び同第６，５０３，４５５号（参照により本明細書に援用される）もまた包含され得ることが規定される。これらのチューブにより、標的細胞の培養、並びにこれら同じ細胞の保管、加工処理及び可溶化は、本発明の試薬及び方法を使用して、全てを単一のチューブで達成することが可能となる。
溶液構成成分は、ほぼ任意の生物学的サンプル由来のＤＮＡの最適な保管及び抽出を達成するように、種々の組合せで、また種々の濃度で組み合わせてもよいことは当業者に理解されよう。また、これらの添加剤に関して上述した塩（例えばナトリウム）は、他の適切な対イオンを含有する塩（例えばカリウム又はリチウム）で置き換えることができることも当業者に理解されよう。
上記説明は、排他的ではなく説明的であることが当業者に理解されよう。実際に、様々な処理レジメンにおける本明細書中に記載される特定の組成物を使用するのに適した投薬及び処理レジメンの発展であるように、多くのさらなる配合物技法並びに薬学的に許容可能な賦形剤及びキャリア溶液が当業者に既知である。
別記しない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同義を有する。本明細書中に記載するものに類似又は等価な任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験で使用することができ、好ましい方法及び材料がここで記載されている。言及した刊行物は全て、参照により本明細書に援用される。別記しない限り、本明細書中で使用又は意図される技法は、当業者に既知の標準的な方法論である。材料、方法及び実施例は、単なる説明であり、限定的ではない。
ヒト全血を、Ｋ２ＥＤＴＡ １０．８ｍｇを含有する５ｍｌのＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）へ収集する。全血分取量０．４ｍｌを、ＰＥＧ２００を含有する保管試薬０．８ｍｌと混合して、混合物は室温（１８℃〜２３℃）で保管する。
保管の１７７日後に、血液−ＰＥＧ混合物の５μｌ分取量を収集して、６０％ＰＥＧ２００及び２０ｍＭ ＫＯＨを含有する加工処理試薬５０μｌへ添加する。得られた血液溶解産物を、室温（２４℃）で３分間インキュベートして、２μｌ分取量を、ＰＣＲミックス２０μｌへ添加する。ＰＣＲは、６２６ｂｐ（ＧＡＰＤＨ遺伝子）及び４３４ｂｐ（ＧＡＰＤＨ偽遺伝子）ＤＮＡフラグメントを包含するｈＧＡＰＤＨプライマーを使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼキット(Invitrogen, Carsbad CA)を用いて実施する。増幅は、６０℃で３０サイクル行われる。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、６２６及び４３４ｂｐ ｈＧＡＰＤＨ ＤＮＡフラグメントの存在が明らかとなる。
ヒト全血を、５ｍｌの血液Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒへ収集する。血液５μｌを、実施例１と同様に保管試薬と混合する。得られた溶解産物を、室温で５分間インキュベートする。インキュベートした溶解産物２μｌを、ＰＣＲミックス２０μｌへ添加して、ＰＣＲは、ヒトベータ−グロビン遺伝子の５ｋｂフラグメントを包含するプライマーを使用して、Ｔａｋａｒａポリメラーゼを用いて実施する。増幅は、６５℃で３５サイクル行われる。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、５ｋｂ ｈＧＡＰＤＨ ＤＮＡフラグメントの存在が明らかとなる。
ヒト唾液の０．１ｍｌサンプルを、６０％ＰＥＧ ２００及び２０ｍＭ ＫＯＨを含有する加工処理試薬２ｍｌと混合して、室温で保管する。保管の７０日後に、２μｌ分取量を、ＰＣＲミックス２０μｌへ添加する。ＰＣＲは、２２１ｂｐフラグメントを包含するｈＧＡＰＤＨプライマーを使用して、Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼキット(Sigma St.Louis, MO)を用いて実施する。増幅は、６０℃で３５サイクル行われる。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、２２１ｂｐ ｈＧＡＰＤＨフラグメントの存在が明らかとなる。
さらに、ラットの肝臓フラグメント５６ｍｇを、ＰＥＧ２００を含有する保管試薬０．５ｍｌ中に浸浸させる。室温での保管の５週後、フラグメントを、６０％ＰＥＧ２００及び１６ｍＭ ＫＯＨを含有する加工処理試薬０．５６ｍｌ中にピペットチップを用いて分散させて、８０℃で５分間インキュベートする。得られた溶解産物の２μｌ分取量を、ＰＣＲミックス２０μｌへ添加する。ＰＣＲは、２２１ｂｐフラグメントを包含するラットＧＡＰＤＨプライマーを使用して、Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼキット(Sigma St. Loius, MO)を用いて実施する。増幅は、６０℃で３５サイクル行われる。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、２２１ｂｐ ｈＧＡＰＤＨフラグメントの存在が明らかとなる。
ルテウス菌(Micrococcus luteus)の培養物を、５０％ＰＥＧ２００及び１６ｍＭ ＮａＯＨを含有する加工処理試薬中に懸濁させる。細菌ＤＮＡ０．４ｎｇを含有する懸濁液の５μｌ分取量をＰＣＲミックスへ添加する。ＰＣＲは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７００〜８００ＤＮＡフラグメントを包含するプライマーを使用して、６０℃での３５回増幅サイクルで、Ｓｉｇｍａ Ｔａｑポリメラーゼを用いて実施する。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、７００〜８００ｂｐ ＤＮＡフラグメントの存在が明らかとなる。
ヒトの指の爪の０．１ｍｇサンプルを、５０％ＰＥＧ２００、１６ｍＭ ＫＯＨ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する加工処理試薬とともに、８８℃で１５分間インキュベートする。インキュベーション混合物２．５μｌをＰＣＲミックスへ添加する。ＰＣＲは、６２６及び４３４ｂｐフラグメントを包含するｈＧＡＰＤＨプライマーを使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼを用いて実施する。増幅は、６０℃で３５サイクル行われる。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、６２６及び４３４ｂｐ ｈＧＡＰＤＨフラグメントの存在が明らかとなる。
ニワトリ肝臓（１１ｍｇ）及びニワトリ羽先を、５０％ＰＥＧ２００及び１６ｍＭ ＫＯＨを含有する加工処理試薬０．１ｍｌ中で８６℃で１５分間、個々にインキュベートする。肝臓溶解産物０．０５μｌに相当する希釈分取量及び羽溶解産物の５μｌ分取量を、別個のＰＣＲミックスへ添加する。ＰＣＲは、２０２ｂｐフラグメントを包含するニワトリベータ−アクチンプライマーを使用して、Ｓｉｇｍａ Ｔａｑポリメラーゼを用いて実施する。３５回の増幅サイクルは、６０℃で行われる。増幅したＤＮＡは、１％アガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色により、加工処理したサンプルの両方において、２０２ｂｐベータ−アクチンフラグメントの存在が明らかとなる。
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Claims (64)

  1. 約−８０℃〜約５０℃の範囲の温度でＤＮＡを有効に保存することが可能な量のグリコール、アルコール及びそれらの混合物を含む群から選択される有機溶媒を含むＤＮＡを含有する、一生物学的サンプルを保管するための試薬。
  2. 前記有機溶媒は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリコール及びグリコール誘導体並びにそれらの混合物から成る群から選択されるグリコールである、請求項１に記載の保管試薬。
  3. 前記グリコールは、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ３５）、オクチルフェノール−ポリエチレングリコールエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）及びポリオキシエチレンセチルエーテル（ＢＲＩＪ５２）並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１に記載の保管試薬。
  4. 前記グリコールは、プロピレングリコール、トリエチレングリコール、約２個〜約４個のエチレンモノマーを有するポリエチレングリコール２００、約１８０個のエチレンモノマーを有する長鎖ＰＥＧ８０００、ポリオキシエチレンセチルエーテル、オクチル−ポリエチレングリコールエーテル及びそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１に記載の保管試薬。
  5. 前記有機溶媒は低級アルコールである、請求項１に記載の保管試薬。
  6. 前記有機溶媒は、エタノール、イソプロパノール、２−プロパノール及びそれらの混合物から成る群から選択される低級アルコールである、請求項１に記載の保管試薬。
  7. 前記有機溶媒は、グリコール及びアルコールの混合物である、請求項１に記載の保管試薬。
  8. 前記有機溶媒の濃度は、非水性組成物又は水性組成物中で約２５％〜約１００％である、請求項１に記載の保管試薬。
  9. 前記有機溶媒の濃度は、非水性組成物又は水性組成物中で約２５％〜約７５％である、請求項１に記載の保管試薬。
  10. 前記有機溶媒の濃度は、非水性組成物又は水性組成物中で、低級アルコール約１％〜約１５％、グリコール約１５％〜約８５％である、請求項１に記載の保管試薬。
  11. 非イオン性作用物質、緩衝液、塩、安定剤、溶解剤、キレート剤、還元剤、湿潤剤、乳化剤、防腐剤及び酸化防止剤から成る群から選択される１つ又は複数の有機添加剤或いは無機添加剤をさらに含む、請求項１に記載の保管試薬。
  12. 前記有機溶媒の濃度は、非水性組成物又は水性組成物中で、低級アルコール約１％〜約１５％、グリコール約１５％〜約８５％、及び非イオン性作用物質約０．０５％〜約１０％である、請求項１に記載の保管試薬。
  13. 前記非イオン性作用物質は、Ｂｒｉｊ界面活性剤、オレイル界面活性剤、Ｉｇｅｐａｌ ＣＯ−９９０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８、コレステロールＰＥＧ ９００、ポリオキシエチレンエーテル Ｗ−１、Ｓｐａｎ ２０、Ｓｐａｎ ４０、Ｓｐａｎ ８５、アゾン及びそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１２に記載の保管試薬。
  14. 約１ｍＭ〜約０．８Ｍの最終濃度で塩をさらに含む、請求項１に記載の保管試薬。
  15. 前記塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム及びアンモニウムの酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、エチレンジアミン、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩並びに塩化物塩、並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１４に記載の保管試薬。
  16. 前記塩又は塩のミックスは、ｐＨ約２〜ｐＨ約１３．８の範囲で前記試薬のｐＨを維持する緩衝液を構成する、請求項１４に記載の保管試薬。
  17. 前記塩又は塩のミックスは、ｐＨ約１０〜ｐＨ約１３．８の範囲で前記試薬のｐＨを維持する緩衝液を構成する、請求項１４に記載の保管試薬。
  18. 水をさらに含む、請求項１に記載の保管試薬。
  19. アルカリをさらに含む、請求項１に記載の保管試薬。
  20. 前記アルカリは、約ｐＨ１０〜約ｐＨ１３．８の前記試薬のｐＨを維持することが可能な有機アルカリ及び無機アルカリの群から選択される、請求項１９に記載の保管試薬。
  21. 前記アルカリ又はアルカリのミックスは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、トリオクチルアミン、水酸化テトラメチルアンモニウム及び水酸化トリエチルフェニルアンモニウムを含有する群から選択される、請求項２０に記載の保管試薬。
  22. 請求項１に記載の保管試薬を含有する生物学的サンプル由来の核酸の保管のための自動手順で有用な密封パッケージ。
  23. 各種供給源由来の核酸を保管するのに適した濃度で請求項１に記載の保管試薬を含む、核酸の保管用のキット。
  24. 前記保管試薬は、約２５％〜約７５％の最終濃度でグリコールを含む、請求項２３に記載の核酸の保管用のキット。
  25. 約２５％〜約７５％の最終濃度で低級アルコールをさらに含む、請求項２３に記載の核酸の保管用のキット。
  26. 塩をさらに含む、請求項２３に記載の保管用のキット。
  27. アルカリをさらに含む、請求項２３に記載の保管用のキット。
  28. 生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法であって、以下の：
    ａ）ＤＮＡを含む生物学的サンプルを得る工程と、
    ｂ）前記生物学的サンプルを、該サンプルの前記ＤＮＡを保存するのに有効な量の請求項１に記載の保管試薬と混合する工程と、
    ｃ）約−８０℃〜約５０℃の範囲の温度で、生じる混合物を保管する工程と
    を含む、生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法。
  29. 前記保管試薬の最終濃度は、約２５％〜約１００％の範囲である、請求項２８に記載の生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法。
  30. 前記保存されるＤＮＡは、医学的目的、薬学的目的、法医学的目的、診断目的又は科学的目的を含むＤＮＡ分析で使用され得る、請求項２８に記載の生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法。
  31. ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、一本鎖コンホメーション多型、制限フラグメント長多型及びＤＮＡシーケンシングから成る群から選択される分析方法により、前記保管されるＤＮＡを分析するさらなる工程を含む、請求項２８に記載の生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法。
  32. 前記保存されるＤＮＡは、約２５℃での少なくとも３０日間の保管に対して実質的に安定である、請求項２８に記載の生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法。
  33. 前記保存されるＤＮＡは、約２５℃での少なくとも３０日間の保管に関して二重鎖形態で維持される、請求項２８に記載の生物学的サンプルを保管して、ＤＮＡを保存する方法。
  34. ＤＮＡ分析における使用のためにＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬であって、有効に該サンプルを溶解させて、前記ＤＮＡを放出させて、且つ外気温でＰＣＲ阻害剤を不活性化させることが可能な量のアルカリ及びグリコールを含む、ＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  35. 前記グリコール又はグリコールのミックスは、約２５％〜約１００％の範囲の濃度であり、前記グリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリコール及びグリコール誘導体並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項３４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  36. 前記アルカリ又はアルカリのミックスは、約１１．５を上回るｐＨで溶解産物を維持するのに十分な濃度であり、前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、トリオクチルアミン、水酸化テトラメチルアンモニウム及び水酸化トリエチルフェニルアンモニウムを含有する群から選択される、請求項３４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  37. 洗浄剤又は洗浄剤のミックスをさらに含む、請求項３４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  38. 前記洗浄剤は、Ｂｒｉｊ界面活性剤、オレイル界面活性剤、Ｉｇｅｐａｌ ＣＯ−９９０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８、コレステロールＰＥＧ ９００、ポリオキシエチレンエーテル Ｗ−１、Ｓｐａｎ ２０、Ｓｐａｎ ４０、Ｓｐａｎ ８５、アゾン及びそれらの混合物から成る群から選択される非イオン性作用物質である、請求項３７に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  39. 約１ｍＭ〜約０．８Ｍの最終濃度で塩をさらに含む、請求項３４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  40. 前記塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム及びアンモニウムの酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、エチレンジアミン、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩並びに塩化物塩、並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項３９に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  41. 前記塩は、約１０のｐＨよりも大きいｐＨで前記試薬のｐＨを維持する緩衝液を構成する、請求項３９に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  42. 前記塩は、約１１．５のｐＨよりも大きいｐＨで前記試薬のｐＨを維持する緩衝液を構成する、請求項３９に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  43. 水をさらに含む、請求項３４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  44. 有機溶媒又は溶媒のミックスをさらに含む、請求項３４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  45. 前記グリコールの濃度は、非水性組成物又は水性組成物中で、低級アルコール約１０％〜約８０％、及びグリコール約１０％〜約７５％である、請求項４４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  46. 前記有機溶媒の濃度は、非水性組成物又は水性組成物中で、低級アルコール約１０％〜約８０％、グリコール約２０％〜約７５％、及び非イオン性作用物質約０．０５％〜約１０％である、請求項４４に記載のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを加工処理するための試薬。
  47. ＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法であって、以下の：
    ａ）ＤＮＡを含む生物学的サンプルを得る工程と、
    ｂ）前記生物学的サンプルを、該生物学的サンプルを溶解させて、該サンプルのＤＮＡを放出させるのに有効な量の請求項３４に記載の試薬と接触させる工程と、
    ｃ）ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、一本鎖コンホメーション多型、制限フラグメント長多型及びＤＮＡシーケンシングから成る群から選択される分析方法により、前記ＤＮＡを分析する工程と
    を含み、前記分析はさらなる精製を伴わずに実施される、ＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  48. 工程（ｃ）に先立って、アルカリ化した生物学的サンプルを、外気温で約１分を上回る時間インキュベートするというさらなる工程を含む、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  49. 工程（ｃ）に先立って、アルカリ化した生物学的サンプルを、約２５〜約１１０℃の温度で約５分を上回る時間インキュベートするというさらなる工程を含む、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  50. 工程（ｃ）に先立って、アルカリ化した生物学的サンプルを、約７０〜約１１０℃の温度まで約５分を上回る時間加熱するというさらなる工程を含む、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  51. 前記有効な量の試薬は、サンプル１容量当たり約１００容量〜約０．１容量の前記試薬の範囲であり、インキュベーション時間は、最小限で１〜３分である、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  52. 前記生物学的サンプルは、請求項１に記載の保管試薬中に予め保管されている、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  53. 前記生物学的サンプルは、請求項２８に記載の方法により予め保管されている、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  54. 前記生物学的サンプルは、ヒト、動物、植物、真菌、細菌及びウイルスの流体或いは固体サンプルを含む、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  55. 前記ＤＮＡ分析は、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシーケンシング及びＤＮＡハイブリダイゼーションを含む、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  56. 前記試薬混合物又は前記混合物の分取量は、希釈または中和されて、該希釈または中和された混合物又は前記混合物の分取量が、ＤＮＡ分析又は他のＤＮＡ用途に使用される、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  57. 前記試薬混合物は、中和されて、沈降又は濾過されて、生じる上清又は濾液が、ＤＮＡ分析に使用される、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  58. 前記生物学的サンプルは、ヒト又は動物の血液であり、前記サンプルは、約１２．５を上回るｐＨを有する混合物を得るのに有効な量の試薬と混合され、生じる混合物は、外気温で少なくとも１分間インキュベートされる、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理する方法。
  59. 前記反応ミックスは、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ５２又はそれらの混合物をさらに含む、請求項４７に記載のＤＮＡ分析のための生物学的サンプルを加工処理のための方法。
  60. 請求項３４に記載の試薬を含有する生物学的サンプル由来の核酸の加工処理のための自動手順で有用な密封パッケージ。
  61. 分析用の各種供給源由来の核酸を加工処理するのに適した濃度で請求項３４に記載の試薬を含む、核酸の保管用のキット。
  62. 前記試薬は、約２０％〜約７５％の最終濃度でグリコールを含む、請求項６１に記載の核酸の保管用のキット。
  63. 約１％〜約２５％の最終濃度で低級アルコールをさらに含む、請求項６１に記載の核酸の保管用のキット。
  64. 塩をさらに含む、請求項６１に記載の核酸の保管用のキット。
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