ES2614247T3 - Estabilización de muestras biológicas - Google Patents

Abstract

Un método para estabilizar una muestra biológica que contiene células, poniendo en contacto la muestra con al menos un compuesto según la fórmula 1**Fórmula** en la que R1 es un resto hidrógeno o un resto alquilo, R2 y R3 son restos hidrocarburo iguales o diferentes con una longitud de la cadena de carbonos de 1-20 átomos dispuestos de una manera lineal o ramificada, y R4 es un resto oxígeno, azufre o selenio, y en el que dicho compuesto según la fórmula 1 es una N,N-dialquilpropanamida.

Description

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sangre recolectadas de un donante hacia tubos con EDTA. Las partes alícuotas de sangre se sometieron a FACS empleando un anticuerpo anti-CD3 conjugado con PE de muestras que no fueron incubadas después de la recolección de sangre (0 h) y muestras después de uno y tres días de incubación a TA (24 h, 72 h). Se contó el número de células marcadas con fluorescencia y se cuantificó la intensidad de la señal de fluorescencia por acontecimiento. La intensidad (eje x) y el número de señales de fluorescencia (eje y) se muestran en forma de histogramas. Se definen umbrales para diferenciar las señales de fluorescencia débiles no específicas (-) de las señales de fluorescencia específicas más intensas provocadas por el anticuerpo anti-CD3 unido específicamente a las células (+). Los umbrales se muestran como líneas verticales discontinuas en cada gráfica.

Control de FACS (-) (EDTA) = Partes alícuotas de sangre recogida en tubos con EDTA que se mantuvieron sin tratar con el estabilizante y que no fueron incubadas con anticuerpo (muestras no teñidas) para actuar como controles negativos del análisis FACS. Las señales débiles detectadas son provocadas por la autofluorescencia y los anticuerpos unidos no específicamente (tinción de fondo).

Control de FACS (+) (EDTA) = Partes alícuotas de sangre recogida en tubos con EDTA que se mantuvieron sin tratar con el estabilizante y que se incubaron anticuerpo (muestras teñidas) para actuar como controles positivos del análisis FACS. Además de las señales débiles que también aparecen en el control de FACS (-), se detectaron señales intensas que son provocadas exclusivamente por los anticuerpos que se unen específicamente a las células.

Disolución de ensayo de DMPA al 5% en v/v = Parte alícuotas de sangre recolectada en tubos con EDTA y mezclada con el estabilizante (concentración final de Ν,Ν-dimetilpropionamida al 5% en v/v, 5x tampón MOPS, pH 5,5), seguido de una incubación con anticuerpo (muestras teñidas).

Control de FACS (+)/Disolución de ensayo = Histogramas combinados de control de FACS (+) (EDTA) [área gris] y muestra de ensayo [línea negra].

Las figuras 6-7: Influencia de la Ν,Ν-dimetilpropanamida sin inhibidor de caspasa sobre el aumento en ARNr 18S (ejemplo 2).

Las figuras 8-6: Influencia de diferentes concentraciones de Ν,Ν-dimetilpropanamida en combinación con un inhibidor de caspasa sobre el aumento en ARNr 18S (ejemplos 3-5).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a métodos, composiciones y dispositivos y, por tanto, a las tecnologías adecuadas para la estabilización de una población de ácidos nucleicos extracelulares comprendida en una muestra biológica que contiene células y/o el perfil de transcripción génica de las células contenidas. Las tecnologías de estabilización descritas en la presente, por ejemplo, reducen el riesgo de que la población de ácidos nucleicos extracelulares se vea contaminada por ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que se originan, por ejemplo, son liberados por células dañadas o moribundas contenidas en la muestra. Además, las tecnologías de estabilización descritas en la presente sustancialmente conservan el perfil de transcripción génica de las células contenidas, permitiendo con ello un análisis fiable de los perfiles de expresión génica. Además, la estabilización descrita en la presente evita las contaminaciones de ácidos nucleicos extracelulares por ácidos nucleicos intracelulares y viceversa, lo cual permite un análisis separado de la población de ácidos nucleicos extracelulares y los ácidos nucleicos intracelulares de la misma muestra que contiene células estabilizadas. Por tanto, la presente invención logra la estabilización de la muestra y, por tanto, la estabilización de la población de ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en ella sin la lisis de las células contenidas. Por el contrario, las células contenidas en la muestra son estabilizadas, evitando o reduciendo con ello sustancialmente la liberación de ácidos nucleicos intracelulares. Además, tal como se muestra en los ejemplos, el perfil de transcripción génica de las células contenidas se conserva sustancialmente, mediante la inhibición de los cambios y, por tanto, de las alteraciones en los niveles de transcripciones. Además, las células pueden recuperarse de las muestras estabilizadas y resultan adecuadas para diferentes análisis, por ejemplo, pueden analizarse las características de morfología celular y/o de la superficie celular de las células contenidas si se desea. Además, la muestra estabilizada puede analizarse para la presencia o la ausencia de células específicas, tales como, por ejemplo, células tumorales, por ejemplo, células tumorales en circulación presentes en muestras de sangre completa. La notable estabilización de los ácidos nucleicos que se logra con los métodos y las composiciones de la presente invención permite la conservación y/o la manipulación de la muestra estabilizada durante un periodo de tiempo prolongado a temperatura ambiente sin poner en peligro la calidad de la muestra, respectivamente los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en ella. Puesto que la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares y el transcriptoma intracelular están estabilizados y, por tanto, sustancialmente conservados en el momento de obtener la muestra empleando las indicaciones de la presente invención, el momento entre la recolección de la muestra y la extracción de los ácidos nucleicos puede variar sin afectar significativamente a la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares. Esto permite la homologación, por ejemplo, de análisis de ácidos nucleicos extracelulares de diagnóstico o prognosis, porque las variaciones en la manipulación/conservación de las muestras influyen menos en la calidad, respectivamente la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares, proporcionando con ello una ventaja importante frente a los métodos de la técnica anterior. Por tanto, las muestras, respectivamente los

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ácidos nucleicos extracelulares obtenidos de las muestras respectivamente estabilizadas pueden compararse mejor. Además, la estabilización lograda del perfil de transcripción génica de las células contenidas permite un análisis fiable de la expresión génica incluso después de la conservación prolongada de las muestras estabilizadas. Además, de modo ventajoso, las indicaciones de la presente invención obvian la necesidad de separar directamente las células contenidas en la muestra de la porción sin células de la muestra para evitar, respectivamente reducir las contaminaciones de los ácidos nucleicos extracelulares con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que, por lo demás, se libera de las células en descomposición. Esta ventaja simplifica considerablemente la manipulación de las muestras, en particular la manipulación de las muestras de sangre completa, por ejemplo, las muestras de sangre completa obtenidas en una clínica y estabilizadas según las indicaciones de la presente invención pueden transportarse a temperatura ambiente, y el plasma que contiene los ácidos nucleicos extracelulares puede separarse de modo conveniente de las células contenidas en el laboratorio clínico de recepción. Sin embargo, las indicaciones de la invención también resultan ventajosas cuando se procesan muestras biológicas depuradas de células, o muestras que se denominan habitualmente "exentas de células", tales como, por ejemplo, plasma o suero sanguíneo. Las respectivas muestras biológicas depuradas de células o "exentas de células" todavía pueden comprender (dependiendo también del proceso de separación utilizado) células residuales, en particular leucocitos que comprenden ADN genómico que, por consiguiente, suponen un riesgo de que la población de ácidos nucleicos extracelulares se contamine cada vez más con ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, si las células (potencialmente) remanentes están dañadas o mueren durante el transporte del proceso de conservación. Este riesgo se reduce considerablemente cuando se emplea el método de estabilización indicado en la presente invención. Debido a que la tecnología de la presente invención permite conservar de modo eficaz a la población de ácidos nucleicos extracelulares de la muestra y el perfil de expresión génica de las células contenidas en el momento de recolección de la muestra y el contacto con los agentes estabilizantes, dichas muestras pueden tratarse de modo adecuado en las instalaciones receptoras para aislar los ácidos nucleicos extracelulares de dichas muestras, mientras que, al mismo tiemplo, se evita sustancialmente la contaminación, respectivamente se reduce la contaminación de la población de ácidos nucleicos extracelulares con ácidos nucleicos intracelulares. Los ácidos nucleicos intracelulares pueden aislarse de las células estabilizadas y pueden utilizarse, por ejemplo, para la determinación de los perfiles de expresión génica. Las instalaciones que reciban las muestras, tales como, por ejemplo, laboratorios, generalmente también poseen el equipo necesario, tal como, por ejemplo, centrífugas de alta velocidad (u otros medios, véase también a continuación) para retirar de modo eficaz las células comprendidas en las muestras, que incluyen las células residuales que puedan estar presentes en las muestras depuradas de células, tales como, por ejemplo en el plasma sanguíneo. Este equipo a menudo no está presente en las instalaciones en las que se obtiene la muestra. Así, la presente invención presenta muchas ventajas cuando estabiliza muestras biológicas que comprenden una gran cantidad de células, tales como, por ejemplo, muestras de sangre completa, pero también presenta ventajas importantes cuando estabilizan muestras biológicas que comprenden solo una pequeña cantidad de células, o que pueden ser sospechosas de contener células, tales como, por ejemplo, plasma, suero, orina, saliva, fluidos sinoviales, fluido amniótico, fluido lagrimal, icores, fluido cerebroespinal y similares.

Según un primer aspecto, se proporciona un método para estabilizar una muestra que contiene células, preferiblemente una muestra de sangre, mediante el contacto de la muestra con al menos un compuesto según la fórmula 1

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Fórmula 1

en la que R1 es un resto hidrógeno o un resto alquilo, R2 y R3 son restos hidrocarburo iguales o diferentes con una longitud de la cadena de carbonos de 1-20 átomos dispuestos de una manera lineal o ramificada, y R4 es un resto oxígeno, azufre o selenio, y en el que dicho compuesto según la fórmula 1 es una N,N-dialquilpropanamida.

Por consiguiente, en un primer aspecto se proporciona un método para estabilizar una muestra biológica que contiene células, poniendo en contacto la muestra con al menos una N,N-dialquilpropanamida. Una N,Ndialquilpropanamida es un compuesto según la fórmula 1, en la que R1 e un resto alquilo C2, R2 y R3 son restos alquilo iguales o diferentes, y R4 es oxígeno.

Tal como muestran los ejemplos proporcionados, estos compuestos son eficaces, entre otras cuestiones, para lograr un notable efecto estabilizante sobre la muestra que contiene células, por ejemplo, pueden conservar sustancialmente la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares en la muestra estabilizada. Por tanto, se reduce el riesgo de que la población de ácidos nucleicos extracelulares se vea contaminada por ácidos

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nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que se originan de las células contenidas, por ejemplo, de células dañadas o moribundas y/o la degradación de los ácidos nucleicos presentes en la muestra se reduce, respectivamente se inhibe. Esto provoca el efecto de que la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares contenida en dicha muestra sustancialmente se conserva, respectivamente se estabiliza. Además puede emplearse una mezcla de uno o más compuestos según la fórmula 1 para la estabilización.

Las expresiones "ácidos nucleicos extracelulares" o "ácido nucleico extracelular", tal como se emplean en la presente, se refieren en particular a los ácidos nucleicos que no están contenidos en células. Los respectivos ácidos nucleicos extracelulares a menudo se denominan ácidos nucleicos sin células o exentos de células. Estas expresiones se emplean como sinónimos en la presente. Por tanto, los ácidos nucleicos extracelulares están presentes fuera de una célula o fuera de una pluralidad de células dentro de una muestra. La expresión "ácidos nucleicos extracelulares" se refiere, por ejemplo, al ARN extracelular, así como al ADN extracelular. Los ejemplos de ácidos nucleicos extracelulares típicos que se encuentran en la fracción sin células (respectivamente, porción) de muestras biológicas, tales como fluidos corporales, tales como, por ejemplo, plasma sanguíneo, incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos extracelulares de mamífero, tales como, por ejemplo, ADN y/o ARN extracelular asociado a tumores o derivado de tumores, otros ADN y/o ARN extracelulares relacionados con enfermedades, ADN epigenéticamente modificado, ADN y/o ARN fetal, ARN interferente pequeño, tal como, por ejemplo, ARNmi y ARNsi, y ácidos nucleicos extracelulares que no son de mamífero, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos víricos, ácidos nucleicos de patógenos liberados hacia la población de ácidos nucleicos extracelulares, por ejemplo, procedentes de procariotas (por ejemplo, bacterias), virus, parásitos eucariotas u hongos. La población de ácidos nucleicos extracelulares habitualmente comprende cierta cantidad de ácidos nucleicos intracelulares que han sido liberados de células dañadas o moribundas, por ejemplo, la población de ácidos nucleicos extracelulares presente en la sangre habitualmente comprende ARNm de globina intracelular que ha sido liberado de células dañadas o moribundas. Este es un proceso natural que se produce in vivo. Estos ácidos nucleicos intracelulares presentes en la población de ácidos nucleicos extracelulares incluso pueden servir como control para un posterior método de detección de ácidos nucleicos. El método de estabilización descrito en la presente, en particular, reduce el riesgo de que la cantidad de ácidos nucleicos intracelulares, tales como ADN genómico, que están incluidos en la población de ácidos nucleicos extracelulares aumente significativamente después de recolectar la muestra que contiene células debido a la manipulación ex vivo de la muestra. Así, las alteraciones de la población de ácidos nucleicos extracelulares debido a la manipulación ex vivo se reducen e incluso pueden evitarse. Según una realización, el ácido nucleico extracelular se obtiene de una muestra biológica que contiene células de un fluido corporal que contiene respectivamente el ácido nucleico, tal como, por ejemplo, sangre, plasma, suero, saliva, orina, licor, fluido cerebroespinal, esputo, fluido lagrimal, sudor, fluido amniótico o linfático. En la presente, los ácidos nucleicos extracelulares que se obtienen de fluidos corporales en circulación se denominan ácidos nucleicos sin células en circulación o extracelulares en circulación. Según una realización, la expresión ácido nucleico extracelular se refiere, en particular, a ácidos nucleicos extracelulares de mamífero. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos extracelulares asociados con enfermedades o derivados de enfermedades, tales como ácidos nucleicos extracelulares asociados a tumores o derivados de tumores, ácidos nucleicos extracelulares liberados debido a inflamaciones o lesiones, en particular, traumatismos, ácidos nucleicos extracelulares relacionados y/o liberados debido a otras enfermedades, o ácidos nucleicos extracelulares derivados de un feto. Las expresiones "ácidos nucleicos extracelulares" o "ácido nucleico extracelular", tal como se emplean en la presente, se refieren también a los ácidos nucleicos extracelulares obtenidos de otras muestras, en particular de muestras biológicas distintas de los fluidos corporales. Habitualmente en la muestra está incluido más de un ácido nucleico extracelular. Habitualmente, una muestra comprende más de un tipo de ácido nucleico extracelular. La expresión "población de ácidos nucleicos extracelulares”, tal como se emplea en la presente, se refiere al colectivo de diferentes ácidos nucleicos extracelulares que están contenidos en una muestra que contiene células. Una muestra que contiene células habitualmente comprende una población de ácidos nucleicos extracelulares característica y, por tanto, exclusiva. Así, el tipo y/o la cantidad de dichos uno o más ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en la población de ácidos nucleicos extracelulares de una muestra específica son importantes características de la muestra. Tal como se analizó anteriormente, es, por tanto, importante estabilizar y así conservar sustancialmente dicha población de ácidos nucleicos extracelulares, puesto que su composición y/o la cantidad de dichos uno o más ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en la población de ácidos nucleicos extracelulares de una muestra puede proporcionar información valiosa en el campo médico, de prognosis o de diagnóstico. Por tanto, resulta ventajoso estabilizar de modo eficaz el perfil de la población de ácidos nucleicos extracelulares. En particular, es importante reducir la contaminación y, por tanto, la dilución de la población de ácidos nucleicos extracelulares por ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico, después de recoger la muestra. La conservación sustancial de la población de ácidos nucleicos extracelulares que puede lograrse mediante las tecnologías de estabilización según la invención permite que la población de ácidos nucleicos extracelulares dentro de una muestra se mantenga sustancialmente sin cambios a lo largo de un periodo de estabilización, comparado con la población de ácidos nucleicos extracelulares en el momento de la estabilización de la muestra. Al menos, los cambios en la población de ácidos nucleicos extracelulares con respecto a la cantidad, la calidad y/o la composición de los ácidos nucleicos extracelulares incluidos, en particular los cambios atribuibles a un aumento del ADN genómico liberado, se reducen significativamente a lo largo del periodo de estabilización (preferiblemente en al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95%), comparado con una muestra no estabilizada o una correspondiente muestra que, por ejemplo, se estabiliza con EDTA en el caso de una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre.

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Según una realización, la muestra que contiene células es una muestra de sangre, en la que los leucocitos son estabilizados. Esto permite separar los leucocitos de la muestra estabilizada. Los leucocitos están estabilizados si al menos un tipo de las células sanguíneas contenidas se estabiliza durante el periodo de estabilización, que preferiblemente es de al menos 48 h. Según una realización, los linfocitos y/o monocitos contenidos en la muestra de sangre son estabilizados. La estabilización descrita en la presente no induce ni estimula la lisis de células nucleadas contenidas en la muestra que contiene células. Así, la estabilización no se basa en la lisis celular. Preferiblemente, cuando la muestra que contiene células es sangre y el ácido nucleico de interés es un ácido nucleico extracelular, en particular ARN extracelular, la estabilización empleada en la presente evita la hemolisis. La mayoría de las causas de hemolisis in vitro están relacionadas con la recolección del espécimen. Sin embargo, la hemolisis in vitro habitualmente también aparece en una muestra de sangre durante la conservación ex vivo si no se emplea un método de estabilización adecuado. Dependiendo del ácido nucleico extracelular de interés, la hemolisis puede ser un problema importante. Si el ácido nucleico extracelular de interés es ADN, la hemolisis no es tan problemática, porque los eritrocitos no contienen núcleo y, por consiguiente, no contienen ADN genómico. Por tanto, no se libera ADN intracelular de los eritrocitos durante la hemolisis. Cuando el ácido nucleico extracelular de interés es ADN, en particular la lisis o descomposición de los leucocitos sí es un problema, porque en este caso, se libera ADN genómico además del ARN intracelular. Por tanto, cuando el ácido nucleico extracelular de interés es ADN extracelular, la lisis de los leucocitos debe evitarse en particular. Los leucocitos pueden diferenciarse entre sí por sus características de estabilidad. Así, algunos tipos de leucocitos son más estables que otros. Sin embargo, en general, los leucocitos son significativamente más estables que los eritrocitos. Por tanto, la lisis de los eritrocitos no indica necesariamente que los leucocitos se han lisado. La diferente susceptibilidad de los leucocitos y los eritrocitos a la lisis también se emplea en la técnica, por ejemplo, para lisar específicamente los eritrocitos, conservando al mismo tiempo a los leucocitos para, por ejemplo, la recolección de los leucocitos. Sin embargo, si el ácido nucleico extracelular de interés es ARN, la hemolisis y, por tanto, la lisis de los eritrocitos no constituye un problema. Aunque los eritrocitos maduros tampoco contienen ARN, sus precursores (reticulocitos) sí lo contienen. Los reticulocitos constituyen de aproximadamente 0,5% al 1% de los eritrocitos y contienen gran cantidad de ARN de globina. Por tanto, en particular, cuando el ácido nucleico extracelular de interés es ARN, debe evitarse/reducirse la lisis de los eritrocitos y, por tanto, de los reticulocitos durante la conservación para reducir la dilución de la población de ácidos nucleicos extracelulares, en particular de la población de ARN extracelular, con ARNm de globina. Además, tal como se describió anteriormente, es importante mantener la composición y, por tanto, el perfil de la población de ácidos nucleicos extracelulares, lo cual se logra empleando los métodos de estabilización descritos en la presente, puesto que esto resulta importante para muchas aplicaciones de diagnóstico. La hemolisis puede evitarse/reducirse de modo eficaz empleando el método de estabilización según la presente invención. Con ello, la población de ácidos nucleicos extracelulares se conserva sustancialmente y, además, la muestra de sangre estabilizada, en particular el plasma o el suero obtenido de la muestra de sangre estabilizada, debido a la prevención de la hemolisis y de la lisis celular en general, también es adecuada para otros análisis de laboratorio convencionales.

Según una realización, se conserva la morfología de las células durante el periodo de estabilización, que preferiblemente es de al menos 48 h. Esto permite analizar y opcionalmente caracterizar las células contenidas basándose en su morfología. Según una realización, se conserva la morfología de las células nucleadas. Según una realización, se conserva la morfología de los linfocitos contenidos en la muestra de sangre durante la estabilización.

Según una realización, se conservan los epitopos de la superficie celular. Según una realización, se conservan las proteínas de la superficie celular, tales como las proteínas CD. Tal como se muestra en los ejemplos, la estabilización empleando una Ν,Ν-dialquilpropanamida según la fórmula 1 conserva los epitopos de la superficie celular y las proteínas de la superficie celular. Esto es una ventaja, puesto que permite caracterizar y/o aislar las células contenidas basándose en estas características de la superficie celular. En particular, permite el análisis de los marcadores tumorales presentes sobre la superficie celular.

Según una realización, el método de estabilización comprende poner en contacto una muestra de sangre con una Ν,Ν-dialquilpropanamida y un anticoagulante, en el que los niveles de transcripciones en las células contenidas se estabilizan. Además, tal como se muestra en los ejemplos, la población de ácidos nucleicos extracelulares también se estabiliza. Esto es una ventaja, puesto que permite analizar a la población de ácidos nucleicos extracelulares por separado de la población de ácidos nucleicos intracelulares de la misma muestra estabilizada.

Los restos hidrocarbono R2 y/o R3 pueden seleccionarse independientemente entre sí del grupo que comprende alquilo, que incluye alquilo de cadena corta y alquilo de cadena larga. Preferiblemente, se emplean los siguientes grupos dentro de los grupos descritos en general dentro del alcance de la presente invención:

alquilo: preferiblemente alquilos de cadena corta, en particular alquilos C1-C5 lineales o ramificados, o alquilos de cadena larga: alquilos C5-C20 lineales y ramificados.

La longitud de la cadena n de R2 y/o R3 puede tener, en particular, los valores 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20. R2 y R3 pueden tener una longitud de la cadena de carbonos de 1-10. En este caso, la longitud de la cadena n puede tener, en particular, los valores 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, y 10. Preferiblemente, R2 y R3 tienen una longitud de la cadena de carbonos de 1-5 y, en este caso, la longitud de la cadena puede tener, en particular, los valores 1, 2, 3, 4 y 5. Se prefiere en particular una longitud de cadena de 1 o 2 para R2 y R3. Tal como se describió anteriormente, el compuesto según la fórmula 1 empleado en la presente invención es una N,N

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agentes quelantes. Según una realización, la combinación de agentes estabilizantes comprende un inhibidor de caspasa y un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante, tal como EDTA. Las respectivas combinaciones pueden utilizarse de modo ventajoso en un método para estabilizar una población de ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en una muestra que contiene células, según el primer aspecto. El efecto estabilizante observado con combinaciones de agentes estabilizantes es más fuerte que el efecto observado para cualquiera de los agentes estabilizantes individuales cuando se emplean solos y/o permite emplear concentraciones más bajas, haciendo con ello que el uso combinado de agentes estabilizantes sea una opción atractiva. Las realizaciones adecuadas y preferidas del inhibidor de la apoptosis y el compuesto según la fórmula 1 definido anteriormente, en particular Ν,Νdimetilpropanamida, así como las concentraciones adecuadas y preferidas de los respectivos agentes adecuados para lograr una estabilización eficaz de la muestra se describieron con detalle anteriormente en conjunción.

Tal como se ha analizado en los antecedentes de la invención, los ácidos nucleicos extracelulares habitualmente no están presentes de forma "desnuda" en la muestra sino que, por ejemplo, están estabilizados hasta cierto punto al ser liberados en forma protegida en complejos o al estar contenidos en vesículas y similares. Esto tiene el efecto de que los ácidos nucleicos extracelulares ya están estabilizados hasta cierto punto en la naturaleza y, por tanto, habitualmente no son degradados con rapidez por las nucleasas en las muestras que contienen células, tales como sangre completa, plasma o suero. Así, cuando se quieren estabilizar ácidos nucleicos extracelulares que están comprendidos en una muestra biológica, uno de los principales problemas es la dilución, respectivamente la contaminación de la población de ácidos nucleicos extracelulares por ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico fragmentado, que se originan de las células dañadas o moribundas que están contenidas en la muestra. Esto también supone un problema cuando se procesan muestras depuradas de células, tales como plasma

o suero (que a veces también se describen como "exentas de células", aunque puedan comprender cantidades pequeñas de células). La tecnología de estabilización según la presente invención resulta particularmente ventajosa a este respecto, porque no solo conserva sustancialmente los ácidos nucleicos extracelulares presentes en la muestra y, por ejemplo, inhibe la degradación de los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos (preferiblemente al menos en 60%, al menos en 70%, al menos en 75%, al menos en 80%, al menos en 85%, al menos en 90% o lo más preferiblemente al menos en 95% a lo largo del periodo de estabilización, comparado con una muestra no estabilizada o una muestra estabilizada con EDTA), sino que, además, reduce de modo eficaz la liberación de ADN genómico de las células contenidas en la muestra y/o reduce la fragmentación del respectivo ADN genómico. Según una realización, el uso del compuesto según la fórmula 1, según se definió anteriormente, y opcionalmente un inhibidor de la apoptosis para estabilizar la muestra que contiene células según las indicaciones de la presente invención tiene el efecto de que se reduce el aumento en el ADN que resulta de la liberación de ADN de las células contenidas en la muestra, comparado con una muestra no estabilizada. Según una realización, dicha liberación de ADN genómico se reduce en al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 20 veces a lo largo del periodo de estabilización, comparado con la muestra no estabilizada o una correspondiente muestra que se estabiliza con EDTA (en particular en el caso de una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre, tal como plasma o suero). Según una realización, dicha liberación de ADN genómico se reduce en al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% a lo largo del periodo de estabilización, comparado con la muestra no estabilizada o una correspondiente muestra que se estabiliza con EDTA (en particular en el caso de una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre, tal como plasma o suero). La liberación de ADN puede determinarse, por ejemplo, cuantificando el ADN ribosómico 18S, tal como se describe en la presente en la sección de ejemplos. Así, la población de ácidos nucleicos extracelulares contenida en la muestra se estabiliza considerablemente, comparada con muestras estabilizadas en tubos de EDTA convencionales. Así, según una realización, el efecto de estabilización que logra el compuesto según la fórmula 1, según indica la presente invención, que puede utilizarse en combinación con un inhibidor de la apoptosis, da como resultado que la liberación de ADN de las células contenidas en la muestra se reduce al menos hasta un máximo de 10 veces, preferiblemente 7 veces, más preferiblemente 5 veces, y lo más preferiblemente se reduce al menos hasta un máximo de 4 veces, tal como puede determinarse, por ejemplo, con el ensayo de ADN 18S descrito en los ejemplos. Tal como se muestra en los ejemplos, puede lograrse una estabilización eficaz de la población de ácidos nucleicos extracelulares durante un periodo de al menos hasta 6 días. Durante una conservación más corta de las muestras, por ejemplo, hasta tres días, la liberación de ADN puede reducirse al menos hasta un máximo de dos veces, tal como puede determinarse, por ejemplo, con el ensayo de ADN 18S descrito en los ejemplos. Así, la liberación de ADN puede reducirse en 2 o menos veces durante hasta tres días de conservación cuando se emplean los métodos estabilizantes según la presente invención. Esto constituye una mejora notable en la estabilización de la población de ácidos nucleicos extracelulares, comparado con los métodos de la técnica anterior. Esto aumenta significativamente la precisión de cualquier ensayo posterior. En ciertos casos, por ejemplo, si el material de muestra debe transportarse a larga distancia o conservarse durante periodos largos, por ejemplo, a temperatura ambiente (tal como puede ser el caso, por ejemplo, de ciertos países), el proceso según la invención permite, por primera vez, que puedan realizarse ensayos después de este periodo de tiempo. Sin embargo, por supuesto, las muestras también pueden procesarse antes, si se desea. No es necesario esperar el periodo de estabilización más largo que se puede conseguir. La estabilización que se logra con la presente invención reduce las variaciones en la población de ácidos nucleicos extracelulares que puedan producirse por una manipulación/procesamiento diferente de las muestras (por ejemplo, condiciones y periodos de conservación) después de ser recolectadas. Esto mejora en gran medida la homologación de la manipulación y los análisis moleculares.

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Pueden emplearse otros aditivos además del compuesto según la fórmula 1, tal como se definió anteriormente, para estabilizar aún más la muestra que contiene células. Esto puede emplearse además o como alternativa al inhibidor de la apoptosis. La selección de aditivos adecuados que también puedan contribuir al efecto de estabilización también puede depender del tipo de muestra que contiene células que se va a estabilizar, por ejemplo, cuando se procesa sangre completa como la muestra biológica que contiene células, resulta ventajoso, y también habitual, incluir un anticoagulante, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en heparina, ácido etilendiaminotetraacético, citrato, oxalato, y cualquiera de sus combinaciones. En una realización ventajosa, el anticoagulante es un agente quelantes. Un agente quelante es un compuesto orgánico que es capaz de formar enlaces coordinados con metales a través de dos o más átomos del compuesto orgánico. Los agentes quelantes según la presente invención incluyen, pero no se limitan a ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido etilendinitrilotetraacético (EDTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) y N,N-bis(carboximetil)glicina (NTA). Según una realización preferida, se emplea EDTA. Tal como se emplea en la presente, el término "EDTA" indica, entre otros, la porción de EDTA de un compuesto de EDTA, tal como, por ejemplo, K2EDTA, K3EDTA o Na2EDTA. El empleo de un agente quelante, tal como EDTA, también tiene el efecto ventajoso de que se inhiben las nucleasas, tales como las ADNasas, evitando con ello, por ejemplo la degradación del ADN extracelular por las ADNasas. Además, se ha descubierto que el EDTA utilizado/añadido a concentraciones más altas es capaz de reducir la liberación de los ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico, de las células, reforzando con ello el efecto estabilizante que se logra con dicho al menos un compuesto según la fórmula 1. Sin embargo, el EDTA solo no es capaz de inhibir de modo eficaz la fragmentación, por ejemplo, del ADN genómico que es liberado de las células contenidas en la muestra. Así, el EDTA no logra un efecto de estabilización suficiente, pero empleado en combinación con las indicaciones de la presente invención, en particular en combinación con el inhibidor de la apoptosis, en particular el inhibidor de caspasa, puede mejorar aún más la estabilización por las razones analizadas anteriormente. Además, también parece aumentar la estabilidad química del ARN. Según una realización, la concentración del agente quelante, preferiblemente EDTA, en la muestra biológica que se mezcla con uno o más de los compuestos estabilizantes descritos anteriormente está en el intervalo seleccionado del grupo que consiste en 0,05 mM a 100 mM, 0,05 mM a 50 mM, 0,1 mM a 30 mM, 1 mM a 20 mM, y 2 mM a 15 mM después de la etapa de contacto. Las respectivas concentraciones son particularmente eficaces cuando se estabilizan muestras de sangre, plasma y/o suero, en particular muestras de 10 ml de sangre.

También pueden emplearse otros aditivos para reforzar aún más la estabilización de la muestra que contiene células, respectivamente para reforzar la conservación de la población de ácidos nucleicos extracelulares. Los ejemplos de los respectivos aditivos incluyen, pero no se limitan a inhibidores de nucleasas, en particular compuestos inhibidores de ARNasas y ADNasas. Los ejemplos de inhibidores de ARNasas incluyen, pero no se limitan a anticuerpos antinucleasa o complejos de ribonucleósido-vanadilo. Cuando se elige un respectivo aditivo adicional, se debe tener cuidado de no comprometer y/o contrarrestar el efecto estabilizante del compuesto según la fórmula 1 que es una Ν,Ν-dialquilpropanamida. Así, no deben emplearse aditivos en concentraciones que produzcan

o refuercen la lisis y/o la degradación de las células contenidas en la muestra biológica y/o que refuercen la degradación de los ácidos nucleicos contenidos en la fracción sin células de la muestra biológica. Además, tampoco deben utilizarse los aditivos a una concentración que contrarreste y anule el efecto estabilizante del transcriptoma de la N,N-dialquilpropanamida que se emplea para la estabilización.

En una realización ventajosa de la presente invención, la muestra biológica que contiene células, que preferiblemente es una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre, tal como, por ejemplo, plasma o suero, se pone en contacto con:

a) al menos un compuesto según la fórmula 1, según se definió anteriormente, que es una N,N-dialquilpropanamida, preferiblemente Ν,Ν-dimetilpropanamida (las concentraciones preferidas se describieron anteriormente); y

b) al menos un inhibidor de caspasa como inhibidor de la apoptosis, preferiblemente con Q-VD-OPh, preferiblemente en un intervalo de concentración de 1 μΜ a 30 μΜ; y

c) otro aditivo, preferiblemente un agente quelante preferiblemente en un intervalo de concentración de 4 mM a 50 mM, preferiblemente de 4 mM a 20 mM, lo más preferiblemente EDTA.

Los componentes de la composición estabilizante pueden comprender, respectivamente pueden estar disueltos en un tampón, por ejemplo un tampón biológico, tal como MOPS, TRIS, PBS y similares. Además, pueden disolverse en agua o cualquier otro disolvente adecuado. Según una realización, la composición estabilizante comprende un disolvente aprótico, tal como DMSO.

El compuesto según la fórmula 1, tal como se definió anteriormente, concretamente la N,N-dialquilpropanamida que preferiblemente es N,N-dimetilpropanamida, así como los otros aditivos opcionalmente presentes, pueden estar presentes, por ejemplo, en un dispositivo, preferiblemente un recipiente, para recolectar la muestra, o pueden añadirse a un respectivo dispositivo de recolección inmediatamente antes de la recolección de la muestra biológica,

o pueden añadirse al dispositivo de recolección inmediatamente después de que la muestra haya sido recolectada en su interior. Dentro del alcance de la presente invención también se puede añadir el agente o agentes estabilizantes y, opcionalmente, el otro u otros aditivos por separado a la muestra biológica que contiene células. Sin embargo, para facilitar la manipulación, se prefiere que dichos uno o más agentes estabilizantes y, opcionalmente,

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el método según la presente invención incluyen, pero no se limitan a muestras biológicas de suspensiones celulares, cultivos celulares, sobrenadantes de cultivos celulares y similares, que comprendan ácidos nucleicos extracelulares.

Tal como se describió anteriormente y se demuestra en los ejemplos, el empleo de los métodos de la presente invención permite estabilizar la muestra que contiene células sin refrigeración ni congelación durante un periodo de tiempo prolongado. Así, las muestras pueden mantenerse a temperatura ambiente o incluso a temperaturas elevadas, por ejemplo, de hasta 30 ºC o hasta 40 ºC. Según una realización, se logra un efecto de estabilización durante al menos dos días, preferiblemente al menos tres días, más preferiblemente de al menos un día a seis días, lo más preferiblemente durante al menos un día hasta al menos siete días a temperatura ambiente. Tal como se muestra en los ejemplos, las muestras que se estabilizaron según el método de la presente invención no resultaron sustancialmente comprometidas cuando se conservaron durante 3 días a temperatura ambiente. Incluso durante una conservación más larga de hasta 6 o incluso 7 días a temperatura ambiente, la población de ácidos nucleicos extracelulares resultó sustancialmente más estabilizada cuando se comparó con muestras no estabilizadas o, por ejemplo, cuando se comparó con muestras que se estabilizaron empleando un método convencional, tal como un tratamiento con EDTA. Aunque el efecto de estabilización pueda disminuir a lo largo del tiempo, aún es suficiente para conservar la composición de la población de ácidos nucleicos extracelulares para permitir el análisis y/o el posterior procesamiento. Así, las muestras que se estabilizaron según los métodos de la presente invención aún fueron adecuadas para aislar y opcionalmente analizar los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en ellas incluso después de un periodo de conservación más largo a temperatura ambiente. Además, el transcriptoma fue estabilizado de modo eficaz. Así, puesto que las muestras no están comprometidas, en particular cuando se emplea la combinación preferida de agentes de estabilización, pueden considerarse unos tiempos de conservación/transporte aún más largos. Sin embargo, normalmente no son necesarios unos periodos de tiempo más largos, puesto que la conservación habitual y, por ejemplo, el tiempo de transporte hasta el laboratorio en el que se realiza el aislamiento y opcionalmente el análisis de los ácidos nucleicos normalmente no excede de 6 o 7 días, e incluso habitualmente se completa después de dos o tres días. Tal como se muestra en los ejemplos, la eficacia de estabilización es particularmente buena durante este periodo de tiempo. Sin embargo, los tiempos de estabilización extraordinariamente largos y las eficacias de estabilización que pueden conseguirse con el método según la presente invención proporcionan un importante factor de seguridad.

Los métodos y también las composiciones posteriormente descritas según la presente invención permiten además la estabilización de grandes volúmenes de muestras biológicas con pequeños volúmenes de sustancias añadidas, porque los aditivos que se emplean según las indicaciones de la presente invención son muy activos. Esto constituye una ventaja importante, porque el tamaño/volumen de la muestra plantea considerables restricciones sobre el posterior procedimiento de aislamiento, en particular cuando se quieren emplear procesos automáticos para aislar los ácidos nucleicos extracelulares contenidos en las muestras. Además, se ha de considerar que los ácidos nucleicos extracelulares a menudo están contenidos solo en pequeñas cantidades en la muestra. Así, el procesamiento de volúmenes más grandes de una muestra que contiene células, tal como, por ejemplo, una muestra de sangre, tiene la ventaja de que pueden aislarse más ácidos nucleicos en circulación de la muestra y, por tanto, que estén disponibles para un posterior análisis.

A la estabilización de la muestra biológica le puede seguir directamente la aplicación de técnicas para analizar ácidos nucleicos, o los ácidos nucleicos pueden purificarse de la muestra. Por tanto, la muestra que se estabilice según el método de la presente invención puede analizarse con un método de detección y/o analítico de ácidos nucleicos o puede procesarse aún más, por ejemplo, el ácido nucleico extracelular puede aislarse a partir de la muestra estabilizada y después puede analizarse con un método de detección y/o analítico de ácidos nucleicos o puede procesarse aún más. Además, las células puede retirarse de la muestra estabilizada y analizarse y/o los ácidos nucleicos pueden aislarse de las células obtenidas. Además, las células pueden analizarse para su morfología o características de la superficie celular. Esto permite, por ejemplo, identificar células tumorales. Según una realización, se aísla y analiza el ARN intracelular. Según una realización, el método comprende realizar un análisis cualitativo o cuantitativo de una o más transcripciones génicas.

Además, según un segundo aspecto, se proporciona un método para aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica, que comprende las etapas de:

a) estabilizar una muestra que contiene células según el método según el primer aspecto;

b) aislar ácidos nucleicos de la muestra estabilizada.

Según una realización, dicho método comprende:

a) estabilizar una muestra que contiene células según el método según el primer aspecto;

b) aislar los ácidos nucleicos intracelulares de la muestra estabilizada.

Según una realización, se proporciona que dicho método sea para aislar ácidos nucleicos extracelulares de una muestra biológica que contiene células, en el que dicho método comprende las etapas de:

a) estabilizar la población de ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en una muestra que contiene células,

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según el método definido en el primer aspecto de la presente invención;

b) aislar los ácidos nucleicos extracelulares.

Tal como se analizó anteriormente, la estabilización según la presente invención tiene el efecto de que la población de ácidos nucleicos extracelulares contenida en la muestra se conserve sustancialmente en el estado que presentaba en el momento de obtener la muestra biológica, respectivamente extraída. En particular, el gran aumento que se observa habitualmente en los ácidos nucleicos que resulta de los ácidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genómico, más específicamente ADN genómico fragmentado, liberados de células dañadas o moribundas se reduce de modo eficaz, según se demuestra en los ejemplos. Por tanto, los ácidos nucleicos extracelulares obtenidos de una muestra respectivamente estabilizada comprenden menos contaminaciones por ácidos nucleicos intracelulares que se originan de células degradadas o moribundas comprendidas en la muestra y, en particular, comprenden menos cantidad de ADN genómico fragmentado, comparado con muestras no estabilizadas. Además, la etapa de estabilización exclusiva permite aumentar la cantidad de ácidos nucleicos extracelulares recuperables. El método de estabilización según la invención puede realizarse sin el entrecruzamiento de la muestra. Esta es una ventaja importante frente al uso de agentes de entrecruzamiento, tales como formaldehído o liberadores de formaldehído, puesto que estos reactivos podrían reducir la cantidad recuperable de ácidos nucleicos extracelulares debido al entrecruzamiento. Así, el método según la presente invención mejora la capacidad de diagnóstico y prognóstico de los ácidos nucleicos extracelulares. Además, dicha estabilización permite conservar y/o manipular la muestra, por ejemplo, transportarse (incluso a temperatura ambiente) durante un periodo de tiempo prolongado antes de separar las células contenidas en la muestra y/o antes de aislar los ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en ella en la etapa b). Con respecto a los detalles de la estabilización, se remite a la anterior descripción, que también se aplica en este punto.

Según una realización, la muestra biológica que contiene células, tal como, por ejemplo, una muestra de sangre completa, se estabiliza en la etapa a) según se describió con detalle anteriormente empleando al menos un compuesto según la fórmula 1, tal como se describió anteriormente, concretamente una N,N-dialquilpropanamida y, opcionalmente, otros aditivos. Las realizaciones adecuadas y preferidas se describieron anteriormente. Se prefiere en particular el uso adicional de un inhibidor de la caspasa en combinación con un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante tal como se describió anteriormente, para estabilizar muestras de sangre completa.

Si la muestra comprende una gran cantidad de células, como es el caso, por ejemplo, de la sangre completa, las células se separan del resto de la muestra para obtener una fracción sin células, respectivamente una fracción con menor cantidad de células o depurada de células, de la muestra, que comprende los ácidos nucleicos extracelulares. Así, según una realización, las células se retiran de la muestra que contiene células entre la etapa a) y la etapa b). Esta etapa intermedia solo es opcional y, por ejemplo, puede resultar obsoleta si las muestras que se procesan solamente comprenden cantidades muy pequeñas de células residuales, tales como, por ejemplo, plasma o suero. Sin embargo, para mejorar los resultados se prefiere que también se retiren las respectivas células remanentes (o células potencialmente remanentes), puesto que podrían contaminar a la población de ácidos nucleicos extracelulares durante el aislamiento. Dependiendo del tipo de muestra, las células, incluyendo las células residuales, pueden separarse y retirarse, por ejemplo, mediante centrifugación, preferiblemente centrifugación a alta velocidad, o empleando medios distintos de la centrifugación, tales como, por ejemplo, filtración, sedimentación o unión a superficies de partículas (opcionalmente magnéticas), si se quiere evitar una etapa de centrifugación. Las respectivas etapas de retirada de células también pueden incluirse con facilidad en un protocolo de preparación de muestras automático. Las células respectivamente retiradas también pueden procesarse después. Las células, por ejemplo, pueden conservarse y/o pueden aislarse biomoléculas, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, de las células retiradas. Además, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención otras etapas intermedias para tratar la muestra.

Los ácidos nucleicos extracelulares después se aíslan en la etapa b), por ejemplo, a partir de la fracción sin células, respectivamente depurada de células, por ejemplo, a partir de los sobrenadantes, de plasma y/o de suero. Para aislar los ácidos nucleicos extracelulares puede emplearse cualquier método para el aislamiento de ácidos nucleicos que sea adecuado para aislar ácidos nucleicos de la respectiva muestra, respectivamente la muestra depurada de células. Los ejemplos de los respectivos métodos de purificación incluyen, pero no se limitan a extracción, extracción en fase sólida, purificación basada en sílice, purificación basada en partículas magnéticas, extracción con fenolcloroformo, cromatografía, cromatografía de intercambio aniónico (empleado superficies de intercambio aniónico), electroforesis, filtración, precipitación, inmunoprecipitación con cromatina y sus combinaciones. También se incluye dentro del alcance de la presente invención el aislamiento específico de ácidos nucleicos extracelulares diana específicos, por ejemplo, empleando sondas apropiadas que permitan la unión de una secuencia específica y que están acopladas a un soporte sólido. Además también puede utilizarse cualquier otra técnica de aislamiento de ácidos nucleicos conocida por los expertos en la técnica. Según una realización, los ácidos nucleicos se aíslan empleando un agente caotrópico y/o alcohol. Preferiblemente, los ácidos nucleicos se aíslan uniéndolos a una fase sólida, preferiblemente una fase sólida que comprende sílice o grupos funcionales de intercambio aniónico. Los métodos y kits adecuados también están disponibles en el mercado, tales como QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit (QIAGEN), Chemagic Circulating NA Kit (Chemagen), NucleoSpin Plasma XS Kit (Macherey-Nagel), Plasma/Serum Circulating DNA Purification Kit (Norgen Biotek), Plasma/Serum Circulating RNA Purification Kit (Norgen Biotek), High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit (Roche) y otros kits disponibles en el mercado

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intracelular puede aislarse y, por ejemplo, emplearse en métodos que analizan la expresión génica y puede utilizarse para la determinación de los perfiles de expresión génica. Preferiblemente, la composición de estabilización se pone en contacto con la muestra inmediatamente después o durante la recolección de la muestra. La composición de estabilización puede comprender además otros agentes estabilizantes, tal como se describió en la presente, por ejemplo, un inhibidor de la apoptosis, que preferiblemente es un inhibidor de caspasa.

Las realizaciones adecuadas y preferidas del compuesto según la fórmula 1 y el inhibidor de la apoptosis, así como las concentraciones adecuadas y preferidas de los respectivos compuestos se han descrito en detalle anteriormente, junto con el método de estabilización. Se indica en la anterior descripción, lo cual también se aplica con respecto a la composición de estabilización. Según una realización, el compuesto según la fórmula 1 es N,N-dimetilpropanamida. Dicho compuesto también se puede utilizar en combinación con un inhibidor de la apoptosis, preferiblemente un inhibidor de la caspasa (las realizaciones preferidas se describieron anteriormente, indicadas en la anterior descripción).

Además, se prefiere que la composición de estabilización comprenda otros aditivos, por ejemplo, un anticoagulante, tal como un agente quelante, en particular si la composición se emplea para estabilizar sangre completa, plasma o suero.

Según una realización, la composición estabilizante consiste fundamentalmente en los estabilizantes y aditivos opcionales mencionados y, opcionalmente, agentes tamponantes. La composición estabilizante estabiliza la muestra y, por tanto, no estimula la lisis y/o la alteración de las células contenidas en la muestra. La composición estabilizante puede reducir el daño a las células comprendidas en la muestra, tal como puede determinarse, por ejemplo, por medio de los métodos de ensayo descritos en la sección de ejemplos.

La composición puede proporcionarse en forma sólida. Esta es una opción adecuada, por ejemplo, si la muestra biológica que se va a estabilizar contiene un líquido para disolver el sólido (tal como, por ejemplo, fluidos corporales que contienen células, células en un medio, orina), o si se añade un líquido, por ejemplo, agua a la muestra para disolver el sólido. La ventaja de utilizar una composición estabilizante sólida es que los sólidos habitualmente son más estables desde el punto de vista químico. Sin embargo, también puede emplearse una composición líquida. Las composiciones líquidas a menudo tienen la ventaja de que la mezcla con la muestra que se va a estabilizar puede lograrse rápidamente, proporcionando básicamente con ello un efecto estabilizante inmediato en cuanto la muestra se pone en contacto con la composición estabilizante líquida. Preferiblemente, el agente o agentes estabilizantes presentes en la composición estabilizante líquida permanecen estables en la disolución y no son necesarios pretratamientos (tales como, por ejemplo, la disolución de los precipitados de solubilidad limitada) por parte del usuario, puesto que los pretratamientos de este tipo suponen el riesgo de introducir variaciones en la eficacia estabilizante.

También se proporciona una mezcla que comprende la composición estabilizante según la presente invención mezclada con una muestra biológica. Los ejemplos adecuados y preferidos de muestras biológicas, así como las concentraciones adecuadas de agente o agentes estabilizantes cuando se mezclan con la muestra biológica se describieron anteriormente junto con el método de estabilización. Se indica en la anterior descripción, lo cual también se aplica en este punto. Preferiblemente, la composición estabilizantes se precarga en un dispositivo de recolección de muestras de modo que la muestra se estabiliza inmediatamente durante la recolección. Según una realización, la composición estabilizante se pone en contacto con la muestra biológica en una proporción volumétrica seleccionada de 10:1 a 1:20, de 5:1 a 1:15, de 1:1 a 1:10, y de 1:2 a 1:5. Una ventaja particular de la composición estabilizante de la presente invención es que puede lograrse la estabilización de un gran volumen de muestra con un pequeño volumen de composición estabilizante. Por tanto, preferiblemente, la proporción de composición estabilizante a muestra se encuentra en el intervalo de 1:2 a 1:7, más preferiblemente de 1:3 a 1:5.

La composición estabilizante según el tercer aspecto de la presente invención puede emplearse para estabilizar la población de ácidos nucleicos extracelulares comprendidos en una muestra que contiene células. Además, la composición estabilizante según el tercer aspecto de la presente invención puede emplearse también para estabilizar las células contenidas en una muestra. Tal como se describió anteriormente, la composición estabilizante, entre otras cuestiones, reduce la liberación de ADN genómico de las células que surge de las células en descomposición. Así, este respectivo uso también es ventajoso y es proporcionado por las indicaciones según la presente invención. Además, la composición estabilizante según el tercer aspecto de la presente invención puede emplearse también para estabilizar los niveles de transcripciones en las células contenidas.

También se proporciona un método para fabricar una composición según el tercer aspecto de la presente invención, en el que los componentes de la composición se mezclan, preferiblemente se mezclan en una disolución acuosa.

La composición de la presente invención también puede incorporarse en un dispositivo de recolección de muestras, en particular un instrumento de recolección de sangre, proporcionando con ello una versión nueva y útil de dicho dispositivo. Estos dispositivos generalmente incluyen un recipiente que tiene un extremo abierto y otro cerrado. El recipiente es preferiblemente un tubo de recolección de sangre. El tipo de recipiente depende también de la muestra que se va a recolectar; otros formatos adecuados se describen a continuación.

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Además, la presente invención proporciona un recipiente para recolectar una muestra biológica que contiene células, preferiblemente una muestra de sangre, en el que el recipiente comprende una composición estabilizante según la presente invención. El suministro de un respectivo recipiente, por ejemplo, un tubo de recolección de muestras que comprende la composición estabilizante según la presente invención, tiene la ventaja de que la muestra se estabiliza con rapidez cuando la muestra se recolecta en el respectivo recipiente. Los detalles con respecto a la composición estabilizante se describieron anteriormente, se indican en la anterior descripción y también se aplican en este punto.

Según una realización, se proporciona un recipiente de recolección para recibir y recolectar una muestra biológica, en el que el recipiente comprende:

a) al menos un compuesto según la fórmula 1, según se definió anteriormente, de modo que cuando la muestra se recolecta, el compuesto según la fórmula 1 está comprendido en una concentración de al menos at 0,1%, al menos 0,5%, al menos 0,75%, al menos 1%, al menos 1,25% o al menos 1,5%, o en el que dicho compuesto está comprendido en un intervalo de concentración seleccionado de 0,1% hasta 50%, de 0,1% hasta 30%, de 1% hasta 20%, de 1% hasta 10%, de 1% hasta 7,5%, y de 1% hasta 5%; y/o

b) opcionalmente al menos otro aditivo, preferiblemente un agente anticoagulante, tal como un agente quelante, preferiblemente EDTA si el recipiente es para recolectar sangre o un producto sanguíneo. Las concentraciones adecuadas se describieron anteriormente y se encuentran preferiblemente en el intervalo de 4 mM a 50 mM, más preferiblemente de 4 mM a 20 mM.

Las concentraciones adecuadas también se describieron anteriormente junto con el método, y se indican en la anterior descripción. Según una realización, el recipiente comprende además al menos un inhibidor de la apoptosis, de modo que cuando la muestra se recolecta, la concentración del inhibidor de la apoptosis o de una combinación de dos o más inhibidores de la apoptosis en la mezcla resultante se selecciona de al menos 0,01 μΜ, al menos 0,05 μΜ, al menos 0,1 μΜ, al menos 0,5 μΜ, al menos 1 μΜ, al menos 2,5 μΜ o al menos 3,5 μΜ, y preferiblemente está presente en un intervalo de concentración seleccionado de 0,01 μΜ a 100 μΜ, de 0,05 μΜ a 100 μΜ, de 0,1 μΜ a 50 μΜ, de 1 μΜ a 40 μΜ, de 1,0 μΜ a 30 μΜ, o de 2,5 μΜ a 25 μΜ.

Los componentes precargados pueden proporcionarse en un líquido o en una forma seca. Preferiblemente, los componentes estabilizantes se proporcionan como una composición estabilizante. Una forma seca es, por ejemplo, una opción adecuada si la muestra biológica que se va a estabilizar contiene un líquido para disolver el sólido (tal como, por ejemplo, fluidos corporales que contienen células, células en un medio, orina), o si se añade un líquido, por ejemplo, agua a la muestra para disolver el sólido. La ventaja de utilizar una composición estabilizante sólida es que los sólidos habitualmente son más estables desde el punto de vista químico. Según una realización, la pared interna del recipiente se trata/cubre con una composición estabilizante según la presente invención. Dicha composición puede aplicarse a las paredes internas empleando, por ejemplo, un método de pulverización en seco. Pueden aplicarse técnicas de eliminación de líquidos a la composición estabilizante para obtener una composición protectora sustancialmente en estado sólido. Las condiciones de eliminación de líquidos pueden ser tales que se obtenga la eliminación de al menos aproximadamente 50% en peso, al menos aproximadamente 75% en peso, y al menos aproximadamente 85% en peso de la cantidad original de la composición estabilizante líquida dispensada. Las condiciones de eliminación de líquidos pueden ser tales que se obtenga la eliminación del líquido suficiente para que la composición resultante esté en forma de una película, gel u otra capa sustancialmente sólida o altamente viscosa. Por ejemplo, puede obtenerse un revestimiento sustancialmente inmóvil (preferiblemente un revestimiento que pueda redisolverse o dispersarse de otro modo tras ponerlo en contacto con la muestra que contiene células, que preferiblemente es una muestra de producto sanguíneo). Es posible emplear la liofilización u otras técnicas para obtener una forma sustancialmente sólida del agente protector (por ejemplo, en forma de uno o más gránulos). Por tanto, las condiciones de eliminación de líquidos pueden ser de tal forma que se obtenga un material en el que, tras el contacto con la muestra concreta (por ejemplo, una muestra de sangre completa), el agente protector se dispersará en la muestra y sustancialmente conservará a los componentes (por ejemplo, ácidos nucleicos extracelulares) en la muestra. Las condiciones de eliminación de líquidos pueden ser de tal forma que el resto de la composición esté sustancialmente libre de cristalinidad, tenga una viscosidad que sea lo suficientemente alta para que el resto de la composición sea sustancialmente inmóvil a temperatura ambiente, o ambas.

Sin embargo, también puede emplearse una composición líquida. Las composiciones líquidas a menudo tienen la ventaja de que la mezcla con la muestra que se va a estabilizar puede lograrse rápidamente, proporcionando básicamente con ello un efecto estabilizante inmediato en cuanto la muestra se pone en contacto con la composición estabilizante líquida. Preferiblemente, el agente o agentes estabilizantes presentes en la composición estabilizante líquida permanecen estables en la disolución y no son necesarios pretratamientos (tales como, por ejemplo, la disolución de los precipitados de solubilidad limitada) por parte del usuario, puesto que los pretratamientos de este tipo suponen el riesgo de introducir variaciones en la eficacia estabilizante.

La composición estabilizante está comprendida en el recipiente en una cantidad eficaz para proporcionar la estabilización de la cantidad de la muestra que se va a recolectar en dicho recipiente. Según una realización, la composición estabilizante líquida se pone en contacto con la muestra biológica en una proporción volumétrica seleccionada de 10:1 a 1:20, de 5:1 a 1:15, de 1:1 a 1:10, y de 1:2 a 1:5. Una ventaja particular de la composición estabilizante de la presente invención es que puede lograrse la estabilización de un gran volumen de muestra con un

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Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Péptido inhibidor de Bax, V5 Secuencia peptídica: H-Val-Pro-Met-Leu-Lys-OH

Un pentapéptido permeable a células basado en el dominio inhibidor de Bax-Ku70 que ofrece citoprotección. Actúa con tanta eficacia como el inhibidor de caspasa VI (Z-VAD-FMK; n.º de catálogo 219007) para la apoptosis mediada por Bax (aprox. 50200 μΜ). También bloquea de modo eficaz la muerte celular necrótica independiente de caspasa. Se ha demostrado que es competitivo con Ku70, interacciona con Bax, evita su cambio conformacional y la translocación mitocondrial. Muestra una estabilidad duradera en medio de cultivo (aprox. 3 días).

Bcl-xL BH44-23, humano, permeable a células

Un péptido permeable a células que evita la muestra celular apoptótica uniéndose directamente al canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC) y bloqueando su actividad. Conduce a la inhibición de la liberación de citocromo c y a la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). Contiene el dominio de homología N-terminal conservado (BH4) de Bcl-xL (aminoácidos 423), que se ha demostrado que es fundamental para inhibir la actividad VDAC en liposomas y en mitocondrias aisladas. El dominio BH4 está unido a un péptido vehículo, una secuencia HIV-TAT48-57 de 10 aminoácidos con un resto β-alanina como espaciador para una flexibilidad máxima. Después de su captación, fundamentalmente se localiza en las mitocondrias.

Ácido bongkréquico, sal de triamonio

Actúa como ligando del translocador del nucleótido adenina. Un potente inhibidor del megacanal mitocondrial (poro de transición de permeabilidad). Reduce significativamente las señales de la apoptosis inducida por el óxido nítrico. Evita la alteración apoptótica del potencia transmembrana mitocondrial interno (ΔΨm), así como una serie de otros fenómenos relacionados con la apoptosis.

Daunorubicina, clorhidrato

Potente agente anticáncer permeable a células cuyo sitio diana potencial puede ser la citocromo c oxidasa mitocondrial. Se ha demostrado que inhibe la síntesis de ARN y ADN. Inhibe las topoisomerasas I y II de eucariotas. Induce la ruptura de ADN monocatenario. También induce la apoptosis en células tumorales HeLa S3. Según una realización, dicho compuesto no se emplea como estabilizante según la presente invención.

Humanina, humana, sintética

Un péptido antiapoptótico de 24 restos que, cuando se expresa de modo intracelular, ofrece protección frente a la apoptosis neuronal inducida por presenilina y mutantes de APP (proteína precursora de amiloide) asociados con la enfermedad de Alzheimer familiar (AD). Se ha demostrado que reduce la liberación del citocromo c in vitro uniéndose directamente a Bax (proteína X asociada a Bcl-2; Kd aprox. 2 nM) y evitando su asociación con mitocondrias aisladas.

Forbol-12-miristato-13-acetato

El éster de forbol que se emplea con más frecuencia. Activa la proteína quinasa C in vivo e in vitro, incluso a concentraciones nM. Activa la Ca2+-ATPasa y potencia la formación de AMPc inducida por forskolina. Inhibe la apoptosis inducida por el antígeno Fas, pero induce la apoptosis en células de leucemia promielocítica HL-60.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Pifitrina-

Un inhibidor químico permeable a células de p53. Inhibe de modo reversible la transactivación dependiente de p53 de genes que responden a p53 y bloquea de modo reversible la apoptosis mediada por p53. Inhibe la detención del crecimiento dependiente de p53 de fibroblastos diploides humanos en respuesta a daños en el ADN, pero no afecta a los fibroblastos deficientes en p53. Protege a los tejidos normales frente a los efectos secundarios perjudiciales de la quimioterapia. Se ha indicado que protege a las neuronas frente al péptido β-amiloide y a la apoptosis inducida por glutamato.

Pifitrina-μ

Una sulfonamida permeable a células que bloquea la interacción de p53 con las proteínas Bcl-xL y Bcl-2 e inhibe selectivamente la translocación de p53 a las mitocondrias sin afectar a la función de transactivación de p53. Protege de modo eficaz frente a la muerte celular inducida por radiación γ in vitro y a la letalidad animal in vivo. Debido a que la pifitrina-μ se dirige solo a la rama mitocondrial de la vía de p53 sin afectar a las importantes funciones transcripcionales de p53, es mejor que la pifitrina- en estudios in vivo. Se ha demostrado que interacciona selectivamente con HSP70 inducible y altera sus funciones.

Pifitrina-, cíclica

Un análogo permeable a células y muy estable de la pifitrina-α, con una función biológica similar, pero con citotoxicidad reducida. Un inhibidor químico de p53. Inhibe de modo reversible la transactivación dependiente de p53 de genes que responden a p53; también bloquea de modo reversible la apoptosis mediada por p53. Actúa como un modulador de P-gp cambiando la especificidad de sustrato relativa del transportador. Se ha indicado que este compuesto es un potente inhibidor transcripcional de STAT6.

Pifitrina-, p-nitro

Un inhibidor de p53 permeable a células que actúa como la forma de profármaco de la pifitrina-α, p-nitro, cíclica. Aunque su eficacia in vitro (ED50 = 0,3 μΜ para proteger frente a la muerte de neuronas corticales inducida por etopósido) es similar a la de la pifitrina-α, es 100 veces más potente que la pifitrina-α cuando se administra a ratas in vivo debido a su conversión continúa a largo plazo a la correspondiente forma cíclica del compuesto activo en sistemas biológicos (t1 /2 = 8 h en un medio de cultivo de neuronas a 37 °C).

Pifitrina-, p-nitro, cíclica

Un inhibidor de p53 permeable a células que muestra una potencia 10 veces mayor (ED50 = 30 nM para proteger frente a la muerte de neuronas corticales inducida por etopósido) y una semivida 50% más larga (t1 /2 = 6 h en un medio de cultivo de neuronas a 37 °C) que la pifitrina-α. Ha demostrado eficacia in vitro.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Péptido inhibidor de STAT3 Secuencia peptídica: Ac-Pro-Tyr(PO3H2)-Leu-LysThr-Lys-OH

Un fosfopéptido de unión al dominio Stat3-SH2 que actúa como inhibidor selectivo de Stat3 (transductores de señales y activadores de la transcripción 3) que señalizan con una DB50 de 235 μΜ (concentración de péptido en la que la actividad de unión a ADN se inhibe en 50%). Disminuye significativamente la actividad de unión a ADN de Stat3 formando un complejo de Stat3:péptido inactivo y reduce los niveles de los dímeros Stat3:Stat3 activos que pueden unirse al ADN. Muestra una mayor afinidad por Stat3, y en menor grado por Statl, frente a Stat5. Se suministra como una sal trifluoroacetato.

Péptido inhibidor de STAT3, permeable a células Secuencia peptídica: Ac-Pro-Tyr(PO3H2)-Leu-LysThr-Lys-OH

Un análogo permeable a células del fosfopéptido de unión al dominio Stat3-SH2 que contiene una mts ("membrane translocating sequence", secuencia de translocación de membrana) C-terminal y actúa como un bloqueante potente y muy selectivo de la activación de Stat3. También reprime la Stat-3 constitutiva dependiente de la transformación de Src y no afecta a la transformación de Ras independiente de Stat-3. También está disponible el péptido control inactivo no fosforilado. Se suministra como una sal trifluoroacetato.

CAY10500, 6,7-dimetil-3-{[metil-[1-(3-

Inhibidor del factor de necrosis tumoral a (TNF) que

trifluorometilfenil)-1H-indol-3

evita la unión al receptor 1 de TNF (TNFR1). Se une al

ilmetil]amino}etil)amino]metil}-cromen-4-ona

trímero de TNF biológicamente activo y estimula el desplazamiento acelerado de una única subunidad para inactivar con rapidez la citoquina. En un ensayo basado en células, el compuesto inhibe la estimulación mediada por TNF de la degradación de 1KB.

Amida gambógica

Un agonista selectivo para TrkA que imita las acciones de NGF. Este compuesto posee una robusta actividad neurotrófica, al mismo tiempo que evita la muerte celular neuronal 1.

Ácido maslínico

Un triterpeno pentacíclico con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Se ha demostrado que bloquea la generación de óxido nítrico e inhibe la secreción de IL-6 y TNF- inducida por lipopolisacáridos.

Hidrato de naringina

Un bioflavonoide cítrico que se ha descubierto que inhibe la actividad citocromo P450 monooxigenasa en hígado de ratón. Evita la alteración del citoesqueleto inducida por toxinas y la muerte de hepatocitos apoptótica.

Necrostatina-1

Un inhibidor de la necroptosis, una vía de muerte celular no apoptótica. No afecta a la apoptosis desencadenada por Fas/TNFR. Según una realización, dicho compuesto no se emplea como estabilizante según la presente invención.

Hidrato de NSC348884, hidrato de N1,N2-bis((3-

Este producto es una fosfoproteína nucleolar que

imino-6-metil-3H-indol-2-il)metil)-N1,N2-bis((6-metil

muestra diversas actividades biológicas en la

1H-benzo[d]imidazol-2-il)metil)etan-1,2-diamina

biogénesis de ribosomas, la proliferación celular, el transporte de lanzaderas citoplásmicas/nucleares, la unión de ácidos nucleicos, la ruptura ribonucleica, la duplicación del centrosoma y la actividad de chaperona molecular, y se ha descubierto en niveles mayores en células tumorales. Se ha demostrado que la sobreexpresión conduce a la inhibición de la apoptosis. NSC34884 sobrerregula a p53.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Ácido orselínico

Ácido benzoico. Bloquea la apoptosis neuronal mediada por PAF. Demuestra una actividad captadora de radicales libres.

Ácido tetrametilnordihidroguaiarético

Un derivado sintético de NDGA y un inhibidor de lipoxigenasa no selectivo. Inhibe la unión del factor de transcripción Sp1 en el promotor de repetición terminal larga de HIV y en el promotor de -ICP4 (un gen fundamental para la replicación del HSV).

GW 4869, 3,3'-(1,4-fenilen)bis[N-[4-(4,5-dihidro-1H-

Un compuesto de dihidroimidazoloamida simétrico

imidazol-2-il)fenil]clorhidrato-2-propenamida

permeable a células que actúa como un potente inhibidor específico no competitivo de la N-SMasa (esfingomielinasa neutra) [IC50 = aprox. 1 μΜ, cerebro de rata; Km para la esfingomielina de aprox. 13 μΜ]. No inhibe la A-SMasa humana (esfingomielinasa ácida) incluso a 150 μΜ. Inhibe débilmente la actividad de la proteína fosfatasa 2A bovina y la liso-PAF PLC de mamífero, mientras que no se observa inhibición para la PLC específica de fosfatidilcolina bacteriana. Se ha indicado que ofrece una protección completa frente a la muestra celular inducida por TNF- o diamina en células de cáncer de mama MCF7 a 20 μΜ. No modifica los niveles de glutatión intracelular ni interfiere con los efectos de señalización mediados por TNF- o diamina.

SP 600125, 1,9-pirazoloantrona, antrapirazolona

SP600125 es un inhibidor de JNK (IC50 = 40 nM para JNK-1 y JNK-2, y 90 nM para JNK-3). Este agente muestra una selectividad mayor que 300 veces por el JNK frente a las MAP quinasas relacionadas ERK1 y p38-2, y la serina treonina quinasa PKA. SP600125 es un inhibidor competitivo de ATP reversible.

Mdivi-1,3-(2,4-dicloro-5-metoxifenil)-2,3-dihidro-2

Mdivi-1 es un inhibidor selectivo de la división

tioxo-4(1H)-quinazolinona, 3-(2,4-dicloro-5

mitocondrial en levaduras y en células de mamífero,

metoxifenil)-2-sulfanil-4(3H)-quinazolinona

que actúa inhibiendo la dinamina de la división mitocondrial. En las células, Mdivi-1 inhibe la apoptosis inhibiendo la permeabilización de la membrana externa mitocondrial.

Minociclina, clorhidrato

Un derivado de la tetraciclina con actividad antimicrobiana. Es un inhibidor de la angiogénesis, la apoptosis y la poli(ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1 ). Es antiinflamatorio y neuroprotector.

Ro 08-2750 (C13H10N4O3)

Inhibidor de la apoptosis inducida por NGF.

RKTS-33 (C7H8O4)

Inhibición selectiva solo de la vía dependiente de ligando de Fas.

2. Ácidos nucleicos

3,4-dicloroisocumarina

Inhibidor de serina proteasas -> granzima B y bloquea la ruptura del ADN internucleosómico apoptótico en timocitos sin la implicación de endonucleasas. No afecta a las tiol proteasas ni metaloproteasas.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Actinomicina D, Streptomyces sp.

También actúa como un inhibidor competitivo de las serina proteasas; fármaco antineoplásico clásico. Inductor citotóxico de la apoptosis frente a células tumorales. Un inhibidor dependiente de ADN de la síntesis de ARN, la actinomicina estimula la inducción de la apoptosis por algunos estímulos específicos, por ejemplo, TRAIL y Fas (CD95). La actinomicina D también puede aliviar o bloquear el proceso apoptótico y disminuir la citotoxicidad inducida por diversos estímulos, tales como el inhibidor de la dihidrofolato reductasa aminopterina y el derivado de prostaglandina 15-desoxi-D12,14-prostaglandina J2 y, por tanto, puede tener actividades pro-y antiapoptóticas en algunos sistemas. Según una realización, dicho compuesto no se emplea como estabilizante según la presente invención.

Ácido aurintricarboxílico

Inhibidor de la ADN topoisomerasa II.

Baicaleína

Una flavona permeable a células que inhibe la actividad de la 12-lipoxigenasa (IC50 = 120 nM) y la transcriptasa inversa. Protege a las neuronas corticales frente a la toxicidad inducida por el β-amiloide. Reduce la biosíntesis de leucotrienos e inhibe la liberación de enzimas lisosómicas. También inhibe la captación y la movilización de Ca2+ celular y la artritis inducida por adyuvantes. Se ha indicado que inhibe la peroxidación de lípidos microsómicos mediante la formación de un complejo de hierro-baicaleína. Inhibe la topoisomerasa II e induce la muerte celular en líneas de células de carcinoma hepatocelular. Potencia las respuestas contráctiles a la estimulación nerviosa. Inhibe la proteína tirosina quinasa y la proteína quinasa C estimulada por PMA.

Camptotecina, Camptotheca acuminate

Un inhibidor de la ADN topoisomerasa I permeable a células. Muestra propiedades antileucémicas y antitumorales. Induce la apoptosis en células HL-60 y en timocitos de ratón. Detiene a las células en la fase G2/M. Según una realización, dicho compuesto no se emplea.

Diisopropilfluorofosfato

Inhibidor de serina proteasas.

Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)

Inhibidor irreversible de serina proteasas. Su mecanismo de acción es análogo al del diisopropilfluorofosfato. El PMSF provoca la sulfonilación de restos serina en sitios activos. También se ha indicado que inhibe la fragmentación del ADN internucleosómico en timocitos inmaduros. Para un inhibidor relacionado más estable, véase AEBSF.

(-)-Huperzina A

Un inhibidor de AChE. Antagonista de los receptores de NMDA. Protege frente a la excitotoxicidad mediada por glutamato.

Razoxano

Inhibe la topoisomerasa II sin inducir rupturas en la cadena de ADN (inhibidor catalítico de topo II).

Suptopina-2

Supresor de la inhibición de la topoisomerasa II. Revierte la detención del ciclo celular; sortea la función de punto de control. Tiene fluorescencia inherente y una ventaja diferenciada para la identificación de dianas moleculares; concentración eficaz en el intervalo de M.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

3. Enzimas

3.1. Caspasas

Inhibidor de la apoptosis; 2-(p-metoxibencil)-3,4pirrolidindiol-3-acetato

Los efectos son atribuibles a la inhibición de la activación de la caspasa-3.

cIAP-1, humana, recombinante, E. coli

cIAP-1 humana recombinante (aminoácidos 1-618) condensada con la secuencia peptídica MATVIDH10SSNG en el N-terminal y expresada en E. coli. cIAP es un miembro de la familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis que inhibe la actividad proteolítica de las caspasas maduras mediante la interacción del dominio BIR con la caspasa activa.

CrmA, recombinante

El CrmA (modificador A de la respuesta de citoquina serpina del virus de la viruela bovina) se purifica de E. coli transformado con una construcción que contiene la región codificadora de longitud completa del gen CrmA y 7 aminoácidos adicionales que no afectan a la actividad. CrmA es un inhibidor natural de la caspasa-1 humana y la granzima B, enzimas que están implicadas en la apoptosis.

Inhibidor I de caspasas del grupo III Secuencia peptídica: Ac-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO, AcIEPD-CHO, inhibidor III de caspasa-8

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de caspasas del grupo III (caspasas-6, -8, -9, y -10), aunque es más eficaz hacia las caspasas-6 y -8. También inhibe la caspasa-1 y la caspasa-3. Cuando se emplea con una enzima nativa o recombinante, se requiere un pretratamiento con una esterasa.

Campferol

Un fitoestrógeno permeable a células que inhibe el reacoplamiento del ADN catalizado por la topoisomerasa-I en células HL-60. Ofrece protección frente a la muestra celular inducida por Aβ25-35 en neuronas corticales neonatales. Sus efectos protectores son comparables a los del estradiol. Bloquea la activación inducida por Aβ de la caspasa-2, -3, -8, y -9, y reduce la apoptosis neuronal inducida por NMDA. Se ha indicado que es un potente inhibidor de las monoamina oxidasas. Actúa como un inhibidor de la actividad COX-1 (IC50 = 180 M), y de la activación transcripcional de COX-2 (IC50 < 15 M).

Q-VD-OPH

General, pancaspasas

Boc-D(OMe)-FMK

General, pancaspasas

Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK

Caspasa 3, 7

Z-LE(OMe)TD(OMe)-FMK

Caspasa 8

Z-YVAD(OMe)-FMK

Caspasa 1, 4

Z-FA-FMK

Inhibe la catepsina B

Z-FF-FMK

Catepsina B, L

Mu-PheHphe-FMK

Catepsina B, L

Z-AE(OMe)VD(OMe)-FMK

Caspasa 10

Z-ATAD(OMe)-FMK

Caspasa 12

Z-VK(biotina)-D(OMe)-FMK

Caspasas en general

Z-LE(OMe)VD(OMe)-FMK

Caspasa 4

Z-VAM-FMK

Inhibidor de péptidos antivíricos, inhibe HRV2 y HRV14

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

4’-azidocitidina

Inhibidor de HCV

Inhibidor I de caspasa-13 Secuencia peptídica: Ac-Leu-Glu-Glu-Asp-CHO

Un potente inhibidor reversible de la caspasa-13 (ERICE).

Inhibidor II de caspasa-13

Un inhibidor irreversible permeable a células de la

Secuencia peptídica: Z-Leu-Glu(OMe)-Glu(OMe)

caspasa-13. Cuando se emplea con una enzima nativa

Asp(OMe)-FMK

o recombinante, se requiere un pretratamiento con una esterasa.

Inhibidor I de caspasa-1 Secuencia peptídica: Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO

Un potente inhibidor reversible específico de la caspasa-1 (Ki = 200 pM para la caspasa-1 humana recombinante), la caspasa-4, y la caspasa-5. Inhibe fuertemente la apoptosis inducida por anti-APO-1 en células L929-APO-1.

Inhibidor I de caspasa-1, permeable a células Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO

Un inhibidor permeable a células de la caspasa-1 (ICE; enzima convertidora de interleuquina-1β), la caspasa-4, y la caspasa-5. La secuencia YVAD-CHO C-terminal de este péptido es un potente inhibidor reversible y muy específico de la caspasa-1 (Ki = 1 nM). La secuencia Nterminal (restos aminoácidos 1-16) se corresponde con la región hidrófoba (región h) del péptido señal del factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi (K-FGF) y confiere permeabilidad a las células frente al péptido.

Inhibidor II de caspasa-1

Un inhibidor irreversible y permeable a células de la

Secuencia peptídica: Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CMK

caspasa-1 (Ki = 760 pM), la caspasa-4, y la caspasa-5. Inhibe la apoptosis mediada por Fas y la activación de la esfingomielinasa ácida.

Inhibidor IV de caspasa-1 Secuencia peptídica: Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-AOM (AOM = 2,6-dimetilbenzoiloximetil cetona)

Un inhibidor irreversible, permeable a células, competitivo y muy selectivo de la caspasa-1, la caspasa-4, y la caspasa-5. Inactiva la enzima con una velocidad limitada por la difusión y es relativamente inerte hacia otro bionucleófilos, tales como el glutatión, haciendo que sea un candidato excelente para los estudios in vivo de la inhibición enzimática.

Inhibidor V de caspasa-1

Un potente inhibidor de las proteasas similares a la

Secuencia peptídica: ZAsp-CH2-DCB

caspasa-1. Bloquea la muerte celular apoptótica en células U937 de leucemia mieloide humana y bloquea la fragmentación del ADN inducida por etopósido.

Inhibidor VI de caspasa-1 Secuencia peptídica: Z-Tyr-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F*

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células de la caspasa-1 (ICE), la caspasa-4, y la caspasa-5.

Inhibidor I de caspasa-2 Secuencia peptídica: Z-Val-Asp(OMe)-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F*

Un inhibidor irreversible, permeable a células de la caspasa-2 (ICH-1).

Inhibidor II de caspasa-2 Secuencia peptídica: Ac-Leu-Asp-Glu-Ser-Asp-CHO

Un inhibidor reversible de la caspasa-2 y la caspasa-3.

Inhibidor I de caspasa-3/7 Secuencia peptídica: 5-[(S)-(+)-2(metoximetil)pirrolidino]sulfonilisatina

Un potente inhibidor reversible, permeable a células y específico de la caspasa-3 (Ki = 60 nM) y la caspasa-7 (Ki = 170 nM).

Inhibidor I de caspasa-3 Secuencia peptídica: Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO

Un inhibidor muy potente, específico y reversible de la caspasa-3 (IC50 = 200 pM), la caspasa-6, la caspasa-7, la caspasa-8, y la caspasa-10.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Inhibidor I de caspasa-3, permeable a células Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Asp-Glu-Val-Asp-CHO

Un inhibidor permeable a células de la caspasa-3, así como de la caspasa-6, la caspasa-7, la caspasa-8, y la caspasa-10. La secuencia DEVD-CHO C-terminal de este péptido es un potente inhibidor muy específico, reversible y potente de la caspasa-3 (Ki < 1 nM) que también ha demostrado inhibir fuertemente la ruptura de PARP en extractos de células de osteosarcoma humano cultivadas (IC50 = 200 pM). La secuencia Nterminal (restos aminoácidos 1-16) se corresponde con la región hidrófoba (h-región) del péptido señal del factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi (K-FGF) y confiere permeabilidad a las células frente al péptido. También está disponible una disolución 5 mM (1 mg/100 l) del inhibidor I de caspasa-3, permeable a células (n.º de catálogo 235427), en DMSO.

Inhibidor II de caspasa-3 Secuencia peptídica: 2-Asp(OCH3)-Glu(OCH3)-Val-Asp(OCH3)-FMK

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la caspasa-3, así como de la caspasa-6, la caspasa7, la caspasa-8, y la caspasa-10. Cuando se emplea con una enzima nativa o recombinante, se requiere un pretratamiento con una esterasa. También está disponible una disolución 5 mM (250 g/75 l) de Z-DEVDFMK (n.º de catálogo 264156) en DMSO.

Inhibidor III de caspasa-3 Secuencia peptídica: Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CMK

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la caspasa-3, así como de la caspasa-6, la caspasa7, la caspasa-8, y la caspasa-10.

Inhibidor IV de caspasa-3 Secuencia peptídica: Ac-Asp-Met-Gln-Asp-CHO

Un inhibidor específico de la caspasa-3. Este tetrapéptido inhibidor se ha empleado con el inhibidor de caspasa-6 Ac-VEID-CHO para analizar la vía de activación de la caspasa en células Jurkat estimuladas con Fas.

Inhibidor V de caspasa-3

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células,

Secuencia peptídica: Z-Asp(OMe)-Gln-Met

de la caspasa-3, también reconoce a la caspasa-1.

Asp(OMe)-CH2F*

Cuando se emplea con una enzima nativa o recombinante, se requiere un pretratamiento con una esterasa.

Inhibidor VII de caspasa-3

Un compuesto de pirroloquinolina no peptidílico,

Secuencia peptídica: acetato de 2-(4-metil-8-(morfolin

permeable a células, que actúa como un potente

4-ilsulfonil)-1,3-dioxo-1,3-dihidro-2H-pirrolo[3,4

inhibidor reversible y no competitivo de la caspasa-3

c]quinolin-2-il)etilo

(IC50 = 23 nM) con una selectividad de 10-100 veces mayor. Se ha demostrado que muestra una mayor actividad antiapoptótica que Z-VAD-FMK (n.º de catálogo. 627610) en un modelo de apoptosis inducida por estaurosporina (n.º de catálogo. 569397) en células T de Jurkat humanas.

Inhibidor I de caspasa-4 Secuencia peptídica: Ac-Leu-Glu-Val-Asp-CHO

Un inhibidor reversible de la caspasa-4.

Inhibidor I de caspasa-4, permeable a células

Un potente inhibidor reversible, permeable a células, de

Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro

la caspasa-4. La secuencia N-terminal (restos

Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Leu-Glu-Val

aminoácidos 1-16) se corresponde con la región

Asp-CHO

hidrófoba del péptido señal del factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi y confiere permeabilidad a las células frente al péptido.

Inhibidor I de caspasa-5 Secuencia peptídica: Z-Trp-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-CH2F*

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la caspasa-5. Inhibe fuertemente a la caspasa-1. También inhibe a la caspasa-4 y la caspasa-8.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Inhibidor I de caspasa-6

Un inhibidor irreversible, permeable a células, de la

Secuencia peptídica: Z-Val-Glu(OMe)-lle-Asp(OMe)

caspasa-6. Cuando se emplea con una enzima

CH2F*

recombinante o nativa purificada, se requiere un pretratamiento con esterasa.

Inhibidor II de caspasa-6, permeable a células

Un potente inhibidor reversible, permeable a células, de

Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu

la caspasa-6. La secuencia N-terminal permeable

Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Val-Glu-lle

(aminoácidos 1-16) se corresponde con la región

Asp-CHO

hidrófoba del péptido señal del factor del crecimiento de fibroblastos de Kaposi y confiere permeabilidad a la células hacia el péptido.

Inhibidor I de caspasa-8, permeable a células

Un potente inhibidor reversible, permeable a células, de

Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro

la caspasa-8 y granzima B. La secuencia N-terminal

Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-lle-Glu-Thr-Asp

(aminoácidos 1-16) se corresponde con la región

CHO

hidrófoba del péptido señal del factor del crecimiento de fibroblastos de Kaposi y confiere permeabilidad a la células hacia el péptido.

Inhibidor II de caspasa-8 Secuencia peptídica: Z-lle-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-CH2F*

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la caspasa-8 y granzima B. Inhibe de modo eficaz la apoptosis inducida por el virus de la gripe en células HeLa. También inhibe la granzima B. Cuando se emplea con una enzima recombinante o nativa, se requiere un pretratamiento con esterasa. También está disponible una disolución 5 mM (250 μg/76 μΙ) de ZIETD-FMK (n.º de catálogo 218840) en DMSO.

Inhibidor I de caspasa-9 Secuencia peptídica: Z-Leu-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-CH2F*

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la caspasa-9. También puede inhibir la caspasa-4 y la caspasa-5. Cuando se emplea con una enzima recombinante o nativa, se requiere un pretratamiento con esterasa. También está disponible una disolución 5 mM (250 μg/72 μΙ) de Z-LEHD-FMK (n.º de catálogo 218841 ) en DMSO.

Inhibidor II de caspasa-9, permeable a células Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Leu-Glu-His-Asp-CHO

Un potente inhibidor reversible, permeable a células, de la caspasa-9. También puede inhibir la caspasa-4 y la caspasa-5. La secuencia N-terminal (aminoácidos 1-16) se corresponde con la región hidrófoba del péptido señal del factor del crecimiento de fibroblastos de Kaposi y confiere permeabilidad a la células hacia el péptido.

Inhibidor III de caspasa-9 Secuencia peptídica: Ac-Leu-Glu-His-Asp-CMK

Un potente inhibidor irreversible de la caspasa-9. Se ha indicado que reduce el tamaño del infarto de miocardio durante la reperfusión (aprox. 70 nM).

Inhibidor I de caspasa Secuencia peptídica: Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F*

Un inhibidor de pancaspasas irreversible, permeable a células. Inhibe la apoptosis mediada por Fas en células Jurkat y la muerte celular inducida por estaurosporina en células epiteliales corneales. Cuando se emplea con una enzima recombinante o nativa purificada, se requiere un pretratamiento con esterasa.

Inhibidor II de caspasa Secuencia peptídica: Ac-Val-Ala-Asp-CHO

Un inhibidor de pancaspasas potente y reversible.

Inhibidor II de caspasa, permeable a células Secuencia peptídica: Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Val-Ata-Asp-CHO

Un inhibidor de pancaspasas reversible, permeable a células, producido por la unión de la secuencia Nterminal (aminoácidos 1-16) del péptido señal del factor del crecimiento de fibroblastos de Kaposi y confiere permeabilidad a la células hacia el péptido VAD.

Inhibidor III de caspasa Secuencia peptídica: Boc-Asp(OMe)-CH2F"

Un inhibidor de caspasa irreversible, permeable a células, de amplio espectro.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Inhibidor IV de caspasa Secuencia peptídica: Boc-Asp(OBzl)-CMK

Un inhibidor de caspasa irreversible general.

Inhibidor VI de caspasa Secuencia peptídica: Z-Val-Ala-Asp-CH2F*

Un inhibidor de caspasa irreversible general. Es útil para estudios que implican a enzimas caspasas recombinantes, aisladas y purificadas. A diferencia del inhibidor I de caspasa (n.º de catálogo 627610), este inhibidor no requiere un pretratamiento con esterasa para los estudios in vitro. También está disponible una disolución 10 mM (1 mg/221 l) del inhibidor VI de caspasa (n.º de catálogo 219011) en DMSO.

Inhibidor VIII de caspasa Secuencia peptídica: Ac-Val-Asp-Val-Ala-Asp-CHO

Un potente inhibidor reversible de la caspasa-2 (Ki = 3,5 nM), la caspasa-3 (Ki = 1 nM) y la caspasa-7 (Ki = 7,5 nM). También actúa como inhibidor de DRONC (caspasa de Drosophila), una glutamato/aspartato proteasa.

Inhibidor X de caspasa

Un compuesto de tiazolo 2,4-disustituido que contiene

Secuencia peptídica: BI-9B12

benzodioxano que actúa como un inhibidor selectivo, reversible y competitivo de caspasas (Ki = 4,3 M, 6,2 M y 2,7 M para las caspasas-3, -7 y -8, respectivamente). Se ha demostrado que el resto benzodioxano se ajusta en el “orificio de aspartato” de las caspasas y probablemente altere la ruptura apoyada por la caspasa-8 de BID, una proteína proapoptótica. Afecta débilmente a la actividad del factor letal del ántrax, una metaloproteasa, a aprox. 20 M.

Inhibidores de caspasa-1

Incluyen pero no se limitan a Ac-N-Me-Tyr-Val-Ala-Aspaldehído (seudoácido), Ac-Trp-Glu-His-Asp-aldehído (seudoácido), Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-aldehído (seudoácido) Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-clorometilcetona, AcTyr-Val-Ala-Asp-2,6-dimetilbenzoiloximetilcetona, AcTyr-Val-Ala-Asp(OtBu)-aldehído dimetil acetal, Ac-TyrVal-Lys-Asp-aldehído (seudoácido), Ac-Tyr-ValLys(biotinil)-Asp-2,6-dimetilbenzoiloximetilcetona, biotinil-Tyr-Val-Ala-Asp-clorometilcetona, biotinil-ValAla-DLAsp-fluorometilcetona, fluoresceín-6-carbonilTyr-Val-Ala-DLAsp(OMe)-fluorometilcetona, fluoresceín6-carbonil-Val-Ala-DLAsp(OMe)-fluorometilcetona, ZAsp-2,6-diclorobenzoiloximetilcenoa, Z-Tyr-Val-Ala-Aspclorometilcetona, Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona, Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona.

Inhibidores de caspasa-2

Incluyen pero no se limitan a Ac-Val-Asp-Val-Ala-Aspaldehído (seudoácido), fuoresceí-6-carboni-ValAsp(OMe)-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona, ZVal-Asp(OMe)-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona.

Inhibidores de proteasas precursoras de caspasa-3

Incluyen pero no se limitan a Ac-Glu-Ser-Met-Aspaldehído (seudoácido), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-aldehído (seudoácido).

Inhibidores de caspasa-3

Incluyen pero no se limitan a Ac-Asp-Glu-Val-Aspaldehído (seudoácido), Ac-Asp-Met-Gln-Asp-aldehído (seudoácido), biotinil-Asp-Glu-Val-Asp-aldehído (seudoácido), inhibidor II de caspasa-3/7, fluorescein-6carbonil-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-DL-Asp(OMe)fluorometilcetona, ZAsp(OMe)-Gln-Met-DL-Asp(OMe)fluorometilcetona, Z-Asp-Glu-Val-Asp-clorometilcetona, Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-DLAsp(OMe)fluorometilcetona.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Inhibidores de caspasa-4

Incluyen pero no se limitan a Ac-Leu-Glu-Val-Aspaldehído (seudoácido), Z-Tyr-Val-Ala-DL-Aspfluorometilcetona.

Inhibidores de caspasa-6

Incluyen pero no se limitan a Ac-Val-Glu-Ile-Aspaldehído (seudoácido), fluoresceín-6-carbonil-ValGlu(OMe)-Ile-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona, Z-ValGlu(OMe)-Ile-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona.

Inhibidores de caspasa-8

Incluyen pero no se limitan a Ac-Ile-Glu-Pro-Aspaldehído (seudoácido), Boc-Ala-Glu-Val-Asp-aldehído (seudoácido), fluoresceín-6-carbonil-Ile-Glu(OMe)-ThrDL-Asp(OMe)-fluorometilcetona, fluoresceín-6-carbonilLeu-Glu(OMe)-Thr-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona, ZIle-Glu(OMe)-Thr-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona, ZLeu-Glu(OMe)-Thr-DL-Asp(OMe)-fluorometilcetona, ZLE(OMe)TD(OMe)-FMK.

Inhibidores de caspasa-9

Incluyen pero no se limitan a Ac-Leu-Glu-His-Aspaldehído (seudoácido), Ac-Leu-Glu-His-Aspclorometilcetona, fluoresceín-6-carbonil-Leu-Glu(OMe)His-DLAsp(OMe)-fluorometilcetona.

Inhibidores de caspasa-10

Incluyen pero no se limitan a fluoresceín-6-carbonil-AlaGlu(OMe)-Val-DLAsp(OMe)-fluorometilcetona, Z-AlaGlu-Val-DL-Asp-fluorometilcetona.

3.2. Calpaína

Inhibidor III de calpaína Secuencia peptídica: Z-Val-Phe-CHO

Un potente inhibidor, permeable a células, de la calpaína I y II (Ki = 8 nM). Reduce la muerte celular mediada por capsaicina en ganglios de la raíz dorsal cultivados. Se ha indicado que bloquea la supresión, inducida por A23187, del crecimiento de las neuritas en neuronas piramidales de hipocampo aisladas. Muestra un efecto neuroprotector en la toxicidad inducida por glutamato.

Inhibidor IV de calpaína Secuencia peptídica: Z-Leu-Leu-Tyr-CH2F

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la calpaína II (k2 = 28.900 M-1s-1). También actúa como inhibidor de la catepsina L (k2 = 680.000 M-1s-1).

Inhibidor V de calpaína Secuencia peptídica: Mu-Val-HPh-CH2F (Mu = morfolinoureidilo; HPh = homofenilalanilo)

Un potente inhibidor irreversible, permeable a células, de la calpaína.

Ac-Leu-Leu-Nle-al

Un inhibidor de aldehído peptídico, permeable a células, de la calpaína I (Ki = 190 nM), la calpaína II (Ki = 150 nM), la catepsina L (Ki = 0,5 nM) y otras cisteína proteasas neutras. Inhibe el avance del ciclo celular en G1/S y la metafase/anafase en células CHO mediante la inhibición de la degradación de la ciclina B. También estimula la transcripción de la HMG-CoA sintasa mediante la inhibición de la degradación de la SREBP-1 (proteína 1 de unión al elemento regulador de esterol) activa. Protege frente a los daños provocados por la hipoxia y la isquemia. Inhibe la apoptosis en timocitos y metamielocitos. También evita la producción de óxido nítrico por los macrófagos activados interfiriendo con la transcripción de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS; NOS II). Inhibe la degradación proteolítica de IkBalfa and IkBβ en macrófagos RAW inducida con LPS. También prolonga la asociación de las moléculas de MHC de clase I con los transportadores asociados con el procesamiento de antígenos.

Z-LLY-FMK

Calpaína

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

N-acetil-Leu-Leu-Met

Calpaína I

N-acetil-Leu-Leu-Nle-CHO

Calpaína I

3.3. Otros

BAPTA/AM

Forma permeable a membrana de BAPTA. Puede cargarse en una amplia diversidad de células, en donde es hidrolizada por las esterasas citosólicas y es atrapada de modo intracelular como el quelante activo de BAPTA. Evita las fibrilaciones ventriculares inducidas por la cocaína. Abole el aumento, inducido por vitamina D3, del Ca2+ intracelular. Induce la inactivación de la proteína quinasa C. También inhibe la apoptosis inducida por tapsigargina en timocitos de rata.

Inhibidor I de granzima B Secuencia peptídica: Z-Ala-Ala-Asp-CH2Cl

Un inhibidor débil de la granzima B humana y murina. También inhibe la fragmentación del ADN relacionada con la apoptosis en linfocitos por la fragmentina 2, una proteasa de gránulos de linfocitos de rata homóloga con la granzima B (ID50 = 300 nM).

Inhibidor II de granzima B Secuencia peptídica: Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-CHO

Un potente inhibidor reversible de la granzima B y la caspasa-8 (Ki = 1 nM). También inhibe la caspasa-1 (<6 nM), la caspasa-6 (5,6 nM), y la caspasa-10 (27 nM).

Inhibidor IV de granzima B Secuencia peptídica: Ac-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO

Un inhibidor reversible de la granzima B y la caspasa-8.

Leupeptina, hemisulfato, microbiana

Un inhibidor reversible de proteasas similares a tripsina y cisteína proteasas. También se sabe que inhibe la muerte celular programada inducida por activación para restablecer las respuestas inmunológicas defectuosas de donantes of HIV+.

N-etilmaleimida

Reactivo alquilante de sulfhidrilo que inhibe la H+-ATPasa y reprime la corriente de cortocircuito (IC50 = 22 μΜ) en células del conducto pancreático. Inactiva la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP. También es un potente inhibidor de la fragmentación del ADN estimulada por Mg2+ y por Ca2+/Mg2+ en núcleos de hígado de rata. Estimula la liberación del ácido araquidónico a través de la activación de PLA2 en células endoteliales.

Να-tosil-Lys clorometil cetona, clorhidrato (TLCK)

Inhibe las serina proteinasas similares a tripsina. Inactiva de modo irreversible la tripsina sin afectar a la quimotripsina. Evita la producción de óxido nítrico por los macrófagos activados mediante su interferencia con la transcripción del gen iNOS. Bloquea la adhesión célula-célula y la unión del virus HIV-1 a las células diana. En macrófagos, bloquea la óxido nítrico sintasa inducida por el interferón-γ y lipopolisacáridos (EC50 = 80 μΜ). Evita la endonucleolisis que acompaña a la muerte apoptótica de células de leucemia HL-60 y timocitos normales.

Inhibidor de la apoptosis

Descripción

Inhibidor de Omi/HtrA2 proteasa, Ucf-101

Un compuesto de ácido furfurilidin-tiobarbitúrico permeable a células que actúa como un potente inhibidor específico, competitivo y reversible de la serina proteasa proapoptótica termoinducible mitocondrial Omi/HtrA2 (IC50 = 9,5 μΜ para HisOmi134-458). Muestra muy poca actividad contra diversas otras serina proteasas ensayadas (IC50  200 μΜ). Se ha indicado que bloquea la muerte celular inducida por Omi/HtrA2 en fibroblastos sin caspasa-9 (/-).

Óxido de fenilarsina

Un inhibidor de proteína tirosina fosfatasa permeable a membranas (IC50 = 18 μΜ). Estimula el transporte de 2-desoxiglucosa en el músculo esquelético humano resistente a la insulina y activa la proteína tirosina quinasa p56lck. Bloquea la activación dependiente de TNF- de NF-κΒ en células ML-1a mieloides humanas. PAO inhibe las actividades proteasa de las caspasas humanas recombinantes, así como de las caspasas endógenas que son activas en extractos de células DU249 de pollo preapoptóticas (extractos S/M).

Forbol-12,13-dibutirato

Activa la proteína quinasa C. Estimula la fosforilación de Na+,K+-ATPasa, inhibiendo con ello su actividad. Estimula la expresión de NOS inducible en hepatocitos cultivados.

Hipericina

Inhibe PKC, CKII, MAP quinasa, insulina R, EGFR, PI-3 quinasa y también se ha indicado que posee actividad antivírica.

Butirolactona I

Un inhibidor permeable a células y muy selectivo de las proteína quinasas dependientes de ciclina (Cdk) que inhibe el avance del ciclo celular en las transiciones G1/S y G2/M. Inhibe la p34cdk1/ciclina B (Cdk1; IC50 = 680 nM). También inhibe selectivamente las Cdk2 y Cdk5 quinasas. Tiene poco efecto sobre la caseína quinasa I, caseína quinasa II, receptor de EGF quinasa, MAP quinasa, PKA, y PKC. Se ha demostrado que evita la fosforilación de la proteína de retinoblastoma y la histona H1. También bloquea la apoptosis mediada por Fas en células HL-60 y muestra efectos antitumorales en líneas de células de cáncer de pulmón.

Nilotinib

Inhibidor de BCR-ABL-tirosin quinasa específico.

Quercetina (soforetina)

La quercetina es un inhibidor de PI3K y PKC con una IC50 de 3,8 μΜ y 15 g/ml. Abroga potentemente las PI3K y Src quinasas, inhibe suavemente la Akt1/2, y afecta ligeramente a PKC, p38 y ERK1/2. [1][2] La quercetina es un inhibidor del transporte de auxina polar natural con una IC50 de 0,8, 16,7, 6,1, 11,36 μΜ para la inhibición de la liberación de LDH%, la inhibición de la adhesión de PMN-EC inducida por TNF, la inhibición inducida por TNF de la síntesis de ADN y la proliferación.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos se proporcionan materiales y métodos de la presente invención. Debe entenderse que estos ejemplos solo tienen un fin ilustrativo y no deben considerarse limitantes de esta invención de ninguna manera.

I. Propiedades estabilizantes de células y del nivel de transcripciones de la N,N-dialquilpropanamidas Ejemplo 1: Uso de la Ν,Ν-dimetilpropanamida para estabilizar muestras de sangre

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Claims (1)

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