JP2015530092A - 生物学的試料の安定化 - Google Patents
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Abstract
Description
a)本発明の第1の態様において規定される方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
b)核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む方法が提供される。
a)上記で規定した、式1による少なくとも1つの化合物と、
b)少なくとも1つの抗凝血剤、好ましくは、キレート剤と
を含む組成物が提供される。
a)N,N−ジアルキルプロパンアミド、好ましくは、N,N−ジメチルプロパンアミドである、上記で規定した、式1による少なくとも1つの化合物(好ましい濃度は、上記で記載されている)、および
b)好ましくは、Q−VD−OPhを、好ましくは、1μM〜30μMの濃度範囲で伴うアポトーシス阻害剤としての、少なくとも1つのカスパーゼ阻害剤、および
c)さらなる添加剤、好ましくは、4mM〜50mM、好ましくは、4mM〜20mMの濃度範囲の、好ましくは、キレート剤、最も好ましくは、EDTA
と接触させる。
a)第1の態様による方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
b)核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む方法が提供される。
a)第1の態様による方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
b)細胞内核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む。
a)本発明の第1の態様で規定した方法に従って細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるステップと、
b)細胞外核酸を単離するステップと
を含む方法である。
a)上記で規定した、式1による少なくとも1つの化合物と、
b)少なくとも1つの抗凝血剤、好ましくは、キレート剤と
を含む組成物が提供される。
a)試料を回収したときに、式1による化合物が、少なくとも0.1%、少なくとも0.5%、少なくとも0.75%、少なくとも1%、少なくとも1.25%、もしくは少なくとも1.5%の濃度で含まれるような、上記で規定した、式1による少なくとも1つの化合物、または0.1%〜50%、0.1〜30%、1%〜20%、1%〜10%、1%〜7.5%、および1%〜5%から選択される濃度範囲で含まれる、上記で規定した、式1による少なくとも1つの化合物;ならびに/あるいは
b)任意選択で、少なくとも1つのさらなる添加剤、好ましくは、容器が、血液または血液生成物を回収するための容器である場合、キレート剤などの抗凝血剤、好ましくは、EDTA
を含む容器が提供される。適切な濃度は、上記で記載されており、好ましくは、4mM〜50mM、より好ましくは4mM〜20mMの範囲内にある。
a)細胞の形態を保存すること、
b)有核細胞の形態を保存すること、
c)試料は、血液試料であり、含有されるリンパ球および/もしくは単球を安定化させること、
d)細胞表面エピトープを保存すること、ならびに/または
e)細胞表面タンパク質を保存すること
のうちの1または複数を有する。
一実施形態によれば、方法は、以下の特徴:
a)安定化が、細胞含有試料中に含有される有核細胞の溶解を促進しないこと、
b)安定化法が、試料の架橋を伴わずに実施されること、ならびに/または
c)安定化が、核酸−核酸間、タンパク質−核酸間、および/もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤の使用を伴わないこと
のうちの1または複数を有する。
一実施形態によれば、核酸を、安定化試料から単離する。特に、方法は、以下の特徴:
a)安定化組成物中にN,N−ジアルキルプロパンアミドおよび任意選択でさらなる添加剤が含まれ、細胞含有試料の指定容量に対する安定化組成物の容量比が、10:1〜1:20、5:1〜1:15、1:1〜1:10、および1:2〜1:5から選択されること、
b)安定化細胞含有試料を、核酸解析法および/もしくは核酸検出法に供すること、
c)細胞内および/もしくは細胞外核酸を安定化試料から単離し、単離核酸を解析および/もしくは検出すること、
d)安定化試料中に含まれる細胞を除去すること、ならびに/または
e)(i)細胞含有生物学的試料、(ii)細胞を除去した安定化試料、および/もしくは(iii)試料から除去した細胞を保存すること
のうちの1または複数を有する。
a)本発明の第1の態様による方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
b)核酸を安定化試料から単離するステップと
を含む方法に関する。
i)修飾し、
ii)少なくとも1つの酵素と接触させ、
iii)増幅し、
iv)逆転写させ、
v)クローニングし、
vi)配列決定し、
vii)プローブと接触させ、
viii)検出し、
ix)定量化し、
ix)同定し、そして/または
x)遺伝子発現プロファイリングについて解析する。
a)式1
b)少なくとも1つの抗凝血剤と
を含む組成物に関する。
a)細胞を安定化させ、細胞含有生物学的試料中に含有される細胞から試料のうちの無細胞部分へのゲノムDNAの放出を低減することが可能であること、
b)生物学的試料中に含まれる細胞外DNA集団の、安定化試料中に含有される細胞に由来するゲノムDNAによる希釈を低減することが可能であること、
c)生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団の、安定化試料中に含有される細胞に由来する細胞内核酸による希釈を低減することが可能であること、
d)安定化組成物が、細胞の溶解を誘導または促進する濃度で添加剤を含まないこと、
e)安定化組成物が、タンパク質−DNA間および/もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤を含まないこと、
f)安定化組成物が、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、もしくはホルムアルデヒド放出剤を含まないこと、
g)安定化組成物が、毒性作用物質を含まないこと、ならびに/または
h)安定化組成物が、細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも2日間〜3日間、少なくとも2日間〜6日間、および/もしくは少なくとも2日間〜7日間から選択される期間、安定化させることが可能であること
のうちの1または複数を有する。
a)細胞外核酸を含むこと、
b)全血液であること
のうちの1または複数を有する。
(実施例1)
血液試料を安定化させるためのN,N−ジメチルプロパンアミドの使用
選択される遺伝子(c−fos、IL−1ベータ、IL−8、p53)からの一定の転写レベルにより指し示される、遺伝子転写物の安定化能を有する試薬組成物の同定を可能とする試験系および研究設定を確立した。先行研究では、これらの転写物は、保存時の、血液回収後数分間以内に、誘導または下方制御(転写物の増大および喪失)される、極めて不安定的な転写物として同定され、したがって、スクリーニングの目的では「ワーストケース」マーカーとして選択された。
材料および方法
単独であるかまたはカスパーゼ阻害剤と組み合わせた、N,N−ジメチルプロパンアミド(DMPA)を、細胞含有生物学的試料、本明細書では、全血液試料を安定化させるその能力について調べた。下記の実施例から見ることができる通り、DMPAは、血液試料を効率的に安定化させ、特に、安定化血液試料中に含まれる細胞からのゲノムDNAの放出を阻害することが見出された。したがって、N,N−ジアルキルプロパンアミドは、細胞外核酸集団を安定化させることが可能である。さらに、カスパーゼ阻害剤と組み合わせたN,N−ジアルキルプロパンアミドが、安定化効果の達成を改善するのに有利であることも判明した。それぞれの組合せは、安定化効果の延長を結果としてもたらし、さらに、異なるドナーから得られる血液試料について達成される安定化効果の変動の減少も示した。これは、細胞外核酸集団を保存する血液試料について均一で信頼できる安定化法をもたらすので、重要な利点である。
ドナーから得られた血液を、10mlのK2 EDTAチューブ(BD)へと回収した。回収された4.5mlずつの血液を、0.9mlの異なる安定化溶液(被験安定化溶液の詳細についての下記の実施例を参照されたい)と混合した。
血漿は、血液を含有するチューブを4回にわたり反転させることにより、安定化血液試料および非安定化(EDTA)血液試料から作り出した。次いで、チューブを、4℃、1900×gで10分間にわたり遠心分離した。2.5mlの血漿画分を、未使用の15mlのfalconチューブへと移し、4℃、16,000×gで10分間にわたり遠心分離した。製造元の指示書に従って、QIAamp循環核酸キット(QIAGEN)を使用して、細胞外核酸を単離するために清澄化した2mlずつの血漿を使用した。
18SリボソームDNA:66bpの単位複製配列
18SリボソームDNA:500bpの単位複製配列
をターゲティングする2つの異なるqPCRアッセイを使用して、単離細胞外DNAを解析した。
後出で記載される例に対応する結果を示す図は、異なる単位複製配列長の18S rRNA遺伝子を使用する、異なる安定化溶液による、時点0に照らしたDNAの増大(倍数変化)を示す。バーは、条件および試験時点についての3連試料の平均を指し示す。
カスパーゼ阻害剤を伴わずにN,N−ジメチルプロパンアミドを使用する安定化
実施例2では、異なる濃度のN,N−ジメチルプロパンアミド(DMPA)を、異なるドナーから得られる血液試料を安定化させるために使用した。解析の焦点は、18S rDNAの増大を解析することにより決定される、細胞外核酸集団の安定化であった。試料の安定化および処理は、IIの下の「材料および方法」において記載した通りに実施した。
N,N−ジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
2例の異なるドナー由来の血液を、10mlのK2 EDTAチューブ(BD)へと回収した。それぞれ回収された4.5mlずつの血液を、N,N−ジメチルプロパンアミド、EDTA、およびカスパーゼ阻害剤を含む0.9mlの安定化溶液と混合した。これにより、血液/安定化混合物中に以下の最終濃度:
7.2mgのK2 EDTA、1μMのQuinoline−Val−Asp−CH2−OPH(カスパーゼ阻害剤)、および2.5%、5%、または7.5%(v/v)のN,N−ジメチルプロパンアミド、または5%(v/v)のDMAAのそれぞれが得られた。
N,N−ジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
2例の異なるドナー由来の血液を、10mlのK2 EDTAチューブ(BD)へと回収した。それぞれ回収された4.5mlずつの血液を、K2 EDTA、Quinoline−Val−Asp−CH2−OPH(カスパーゼ阻害剤:DMSO中に溶存させた)、および異なる濃度のN,N−ジメチルプロパンアミド(DMPA)またはDMAAを含有する、0.9mlの安定化溶液と混合した。試料の安定化および処理は、IIの下の「材料および方法」において記載した通りに実施した。
1ml当たり7.2mgのK2 EDTA、1μMのQuinoline−Val−Asp−CH2−OPH(カスパーゼ阻害剤)、および異なる濃度のN,N−ジメチルプロパンアミド(N,N dimethylporpanamide)(2.5%、5%、または7.5%)、または5%のDMAA
を得た。
N,N−ジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
実施例5では、血液試料を安定化させるために、異なる濃度のDMPAを、カスパーゼ阻害剤と組み合わせて使用した。解析の焦点は、18S rDNAの増大を解析することにより決定される、細胞外核酸集団の安定化であった。試料の安定化および処理は、IIの下の「材料および方法」において記載した通りに実施した。
1ml当たり7.2mgのK2 EDTA、1μMのQuinoline−Val−Asp−CH2−OPH(カスパーゼ阻害剤)、および異なる濃度のDMPA(詳細については、図を参照されたい)
を得た。
Claims (17)
- 式1による前記化合物が、N,N−ジメチルプロパンアミドである、請求項1に記載の方法。
- 以下の特徴:
a)前記試料中に存在する核酸の分解を、前記安定化により低減すること、
b)含有される細胞のトランスクリプトームおよび/または転写レベルを安定化させること、
c)c−fos、IL−1ベータ、IL−8、およびp53から選択される1または複数のマーカー遺伝子の前記転写レベルを、安定化の際少なくとも48時間にわたり安定化させること、
d)前記細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させるのに適すること、
e)前記試料中に含有される細胞から前記試料のうちの無細胞部分へのゲノムDNAの放出を低減すること、および/または
f)前記細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞を安定化させること
のうちの1または複数を有する、請求項1または2に記載の方法。 - 血液試料を、N,N−ジアルキルプロパンアミドおよび抗凝血剤と接触させるステップを含み、含有される細胞内の転写レベルを安定化させる、前記血液試料を安定化させるための、請求項1から3の一項または複数項に記載の方法。
- 以下の特徴:
a)前記安定化が、前記細胞含有試料中に含有される有核細胞の溶解を促進しないこと、
b)前記安定化法が、前記試料の架橋を伴わずに実施されること、ならびに/または
c)前記安定化が、核酸−核酸間、タンパク質−核酸間、および/もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤の使用を伴わないこと
のうちの1または複数を有する、請求項1から4の一項または複数項に記載の方法。 - 前記細胞含有試料を、カスパーゼ阻害剤、好ましくは、汎カスパーゼ阻害剤とさらに接触させる、請求項1から5の一項または複数項に記載の方法。
- 以下の特徴:
a)安定化組成物中にN,N−ジアルキルプロパンアミド、および必要に応じてさらなる添加剤が含まれ、前記細胞含有試料の特定の容量に対する該安定化組成物の容量比が、10:1〜1:20、5:1〜1:15、1:1〜1:10、および1:2〜1:5から選択されること、
b)前記安定化細胞含有試料を、核酸解析法および/もしくは核酸検出法に供すること、
c)細胞内核酸および/もしくは細胞外核酸を、前記安定化試料から単離し、該単離核酸を解析および/もしくは検出すること、
d)前記安定化試料中に含まれる細胞を、除去すること、ならびに/または
e)(i)前記安定化細胞含有生物学的試料、(ii)細胞を除去した安定化試料、および/もしくは(iii)前記試料から除去した細胞を保存すること、
f)核酸を、前記安定化試料から単離すること
のうちの1または複数を有する、請求項1から6の一項または複数項に記載の方法。 - 前記除去された細胞を解析し、そして/または核酸またはタンパク質などの生体分子を、前記除去された細胞から単離する、請求項7に記載の方法。
- 核酸を生物学的試料から単離するための方法であって、
a)請求項1から8の一項または複数項に記載の方法に従って細胞含有試料を安定化させるステップと、
b)核酸を前記安定化試料から単離するステップと
を含む方法。 - ステップb)が、細胞内核酸、好ましくは、細胞内RNAを単離するステップを含む、請求項9に記載の方法。
- ステップb)が、細胞外核酸を単離するステップを含む、請求項9または10に記載の方法。
- 前記試料が血液であり、細胞を残りの試料から分離し、細胞外核酸を前記残りの試料から単離する、請求項9から11の一項または複数項に記載の方法。
- 前記単離核酸を、さらなるステップc)において、処理および/または解析し、好ましくは、
i)修飾し、
ii)少なくとも1つの酵素と接触させ、
iii)増幅し、
iv)逆転写させ、
v)クローニングし、
vi)配列決定し、
vii)プローブと接触させ、
viii)検出し、
ix)定量化し、
ix)同定し、そして/または
x)遺伝子発現プロファイリングについて解析する、請求項9から12の一項または複数項に記載の方法。 - 前記N,N−ジアルキルプロパンアミドが、N,N−ジメチルプロパンアミドであり、前記抗凝血剤が、キレート剤である、請求項14に記載の組成物。
- 前記組成物が、アポトーシス阻害剤を含む、請求項14または15に記載の組成物。
- 以下の特徴:
a)細胞を安定化させ、前記細胞含有生物学的試料中に含有される細胞から前記試料のうちの無細胞部分へのゲノムDNAの放出を低減することが可能であること、
b)前記生物学的試料中に含まれる前記細胞外DNA集団の、前記安定化試料中に含有される細胞に由来するゲノムDNAによる希釈を低減することが可能であること、
c)前記生物学的試料中に含まれる前記細胞外核酸集団の、前記安定化試料中に含有される細胞に由来する細胞内核酸による希釈を低減することが可能であること、
d)前記安定化組成物が、細胞の溶解を誘導または促進する濃度で添加剤を含まないこと、
e)前記安定化組成物が、タンパク質−DNA間および/もしくはタンパク質−タンパク質間の架橋を誘導する架橋剤を含まないこと、
f)前記安定化組成物が、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、もしくはホルムアルデヒド放出剤を含まないこと、
g)前記安定化組成物が、毒性作用物質を含まないこと、ならびに/または
h)前記安定化組成物が、前記細胞含有生物学的試料中に含まれる細胞外核酸集団を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも2日間〜3日間、少なくとも2日間〜6日間、および/もしくは少なくとも2日間〜7日間から選択される期間、安定化させることが可能であること、
i)前記組成物が、含有される細胞の遺伝子転写プロファイルを安定化させることが可能であり、かつ/もしくは細胞含有試料中に含まれる細胞外核酸集団を安定化させることが可能であること、ならびに/または
j)前記安定化組成物が、血液試料との混合物として提供されること
のうちの1または複数を有する、請求項14から16の一項または複数項に記載の組成物。
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