ES2693672T3 - Método rápido para aislar ácidos nucleicos extracelulares - Google Patents

Abstract

Método para aislar ácidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra uniendo los ácidos nucleicos extracelulares a una fase sólida que porta grupos de intercambio aniónico, en el que dicho método comprende las siguientes etapas: a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de unión y unir los ácidos nucleicos extracelulares a la fase sólida en una mezcla de unión que tiene un primer pH de <= 6,5 que permite la unión de los ácidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio aniónico de la fase sólida, en el que la fase sólida está dotada de partículas magnéticas; b. separar la fase sólida con los ácidos nucleicos extracelulares unidos; c. opcionalmente lavar los ácidos nucleicos extracelulares; d. eluir los ácidos nucleicos extracelulares de la fase sólida, en el que la elución se produce a un segundo pH que se encuentra en el intervalo de >= 8 a <= 14; en el que la muestra es una muestra libre de células o reducida en células que se obtuvo a partir de un líquido corporal eliminando las células mediante separación y en el que los ácidos nucleicos extracelulares son ADN extracelular.

Description

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DESCRIPCION

Metodo rapido para aislar acidos nucleicos extracelulares

El trabajo que condujo a esta invencion ha recibido financiacion del Septimo programa marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013) con el contrato de concesion n.° 222916.

Campo de la invencion

La invencion dada a conocer en el presente documento se refiere a metodos para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra, en particular plasma o suero, y a las tecnologfas asociadas.

Antecedentes

Se han identificado acidos nucleicos extracelulares en plasma, suero y otros lfquidos corporales. Los acidos nucleicos extracelulares que se encuentran en muestras respectivas son hasta cierto punto resistentes a la degradacion debido al hecho de que estan protegidos frente a las nucleasas (por ejemplo debido a que se secretean en forma de un complejo de proteolfpido, estan asociados con protemas o estan contenidos en vesfculas). La presencia de niveles elevados de acidos nucleicos extracelulares tales como ADN y/o ARN en muchos estados medicos, tumores malignos y procesos infecciosos es de interes entre otros el examen, el diagnostico, el pronostico, la vigilancia del progreso de una enfermedad, para identificar posibles dianas terapeuticas y para monitorizar la respuesta al tratamiento. Adicionalmente, esta usandose ADN/ARN fetal elevado en la sangre materna para determinar por ejemplo la identidad de genero, evaluar anomalfas cromosomicas y monitorizar complicaciones asociadas con el embarazo. Ademas de acidos nucleicos extracelulares de mairnfero que se derivan por ejemplo de celulas tumorales o del feto, las muestras que comprenden acidos nucleicos extracelulares tambien pueden comprender otros acidos nucleicos de interes que no estan comprendidos en celulas. Un ejemplo importante, no limitativo son acidos nucleicos patogenos tales como acidos nucleicos virales. El aislamiento eficaz de acidos nucleicos virales a partir de muestras tales como en particular muestras de sangre o muestras derivadas de la sangre es tambien importante para muchas aplicaciones de diagnostico. Por tanto, los acidos nucleicos extracelulares son en particular utiles en el pronostico y diagnostico no invasivos y pueden usarse, por ejemplo, como marcadores de diagnostico en muchos campos de aplicacion, tales como pruebas geneticas prenatales no invasivas, oncologfa, medicina de trasplantes o muchas otras enfermedades y, por tanto, son de relevancia para el diagnostico (por ejemplo acidos nucleicos derivados de feto o tumor). Sin embargo, tambien se encuentran acidos nucleicos extracelulares en seres humanos sanos. Se describen por ejemplo metodos de analisis y aplicaciones comunes de acidos nucleicos extracelulares en los documentos WO97/035589, WO97/34015, Swarup et al, FEBS Letters 581 (2007) 795-799, Fleischhacker Ann. N.Y. Acad. Sci. 1075: 40-49 (2006), Fleischhacker y Schmidt, Biochmica et Biophysica Acta 1775 (2007) 191-232, Hromadnikova et al (2006) ADN y Cell biology, volumen 25, numero 11 pags. 635-640; Fan et al (2010) Clinical Chemistry 56:8.

Por tanto, el aislamiento eficaz de acidos nucleicos extracelulares es de gran importancia con el fin de permitir un analisis fiable. Sin embargo, los acidos nucleicos extracelulares estan comprendidos a menudo solo en una concentracion baja en las muestras. Por ejemplo estan presentes acidos nucleicos circulantes libres en plasma en una concentracion de 1-100 ng/ml de plasma. Ademas, los acidos nucleicos extracelulares a menudo circulan como fragmentos de un tamano de 500 nt, 300 nt (cuando se indica el tamano y por tanto la longitud de cadena el termino “nt” tambien incluye “pb” en el caso de ADN) o incluso menos (nucleosomas circulantes). Adicionalmente, el acido nucleico extracelular diana real que se supone que va a identificarse para fines de diagnostico normalmente tambien representa solo una pequena fraccion entre los acidos nucleicos extracelulares totales. Por ejemplo, fragmentos de aDn espedficos de tumor son muy poco comunes y a menudo estan comprendidos en una concentracion que es 1000 veces menor que el fondo de acido nucleico extracelular “normal”. Por tanto, se desea procesar grandes volumenes de muestra con el fin de obtener cantidades suficientes de acidos nucleicos extracelulares y en particular cantidades suficientes de las moleculas diana poco comunes contenidas en la misma para los ensayos posteriores.

Se conocen varios metodos en la tecnica anterior para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de muestras, tales como en particular muestras de plasma. En este caso, tambien estan disponibles comercialmente varios kits. Sin embargo, aun cuando estos kits proporcionan resultados utiles, tienen desventajas que necesitan mejora.

Por ejemplo, el kit de acido nucleico circulante QIAamp permite procesar un tamano de muestra de hasta 5 ml para aislar los acidos nucleicos extracelulares. Sin embargo, requiere una extraccion manual de los acidos nucleicos. La automatizacion de una preparacion de muestra de gran volumen respectiva es diffcil de implementar porque el kit respectivo necesita manipular un volumen de proceso global de hasta 25 ml debido a la qmmica usada (tampones de lisis y union). Sin embargo, los sistemas roboticos convencionales pueden procesar solo un volumen de hasta 3 ml. Ademas, el kit respectivo tambien requiere varias etapas de metodo. Por tanto, sena ventajoso un metodo que tambien permitiera el procesamiento de grandes volumenes de muestra pero al mismo tiempo permitiera automatizar el proceso de aislamiento. Otros kits disponibles comercialmente que tienen como objetivo el aislamiento de por ejemplo acidos nucleicos virales a partir de muestras libres de celulas tales como plasma, solo pueden procesar volumenes de muestra bastante pequenos (vease por ejemplo el kit viral ChargeSwitch® EasyPlex™). En este caso, el procesamiento de volumenes de muestra mas grandes sena ventajoso, porque esto permitina aumentar el

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rendimiento de acido nucleico.

Por tanto, los metodos de la tecnica anterior tienen varias desventajas. Para superar las desventajas de la tecnica anterior, se desea proporcionar un metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de grandes volumenes de muestra. Esto garantizana que se afslan suficientes acidos nucleicos extracelulares para las aplicaciones posteriores. Si no se cumple este requisito, existe el riesgo de que por ejemplo incluso metodos sensibles no puedan detectar las moleculas diana contenidas en la poblacion de acidos nucleicos extracelulares aislados. Ademas, los metodos de la tecnica anterior a menudo requieren mucho tiempo y por tanto requieren varias etapas de manipulacion y por tanto tiempo invertido. En este caso, se desea proporcionar un metodo sencillo y rapido que requiera solo unas pocas etapas para aislar los acidos nucleicos extracelulares. Esto reducina tambien posibles errores debidos a fallos en la manipulacion durante la preparacion. Ademas, se desea proporcionar un metodo que sea adecuado para la automatizacion. Una vez que se ha establecido una diana de diagnostico para pruebas de rutina, los clientes requieren automatizacion para gestionar rendimientos superiores por ejemplo en laboratorios. Un protocolo de aislamiento automatizado tendna ventajas significativas en el campo del diagnostico porque reducina los riesgos de resultados erroneos debido a errores que se producen durante el aislamiento manual de acido nucleico. Sin embargo, los robots que estan disenados para realizar tales procesos de aislamiento de acido nucleico automatizados estan limitados por el volumen de muestra maximo que pueden manipular (vease anteriormente). El aumento del volumen mediante la adicion de reactivos necesarios para realizar el proceso de aislamiento reduce por tanto directamente la cantidad de muestra que puede procesarse y por tanto la cantidad de acido nucleico que puede obtenerse mediante una unica ronda del proceso de aislamiento automatizado. Finalmente, los kits de la tecnica anterior requieren habitualmente etapas para lisar la muestra. Las etapas de lisis respectivas, que se realizan comunmente en la tecnica anterior, no solo se requieren para por ejemplo liberar los acidos nucleicos de las celulas. Las etapas de lisis respectivas se realizan tambien habitualmente cuando se afslan acidos nucleicos a partir de las denominadas muestras libres de celulas tales como plasma con el fin de desnaturalizar y/o digerir contaminaciones proteicas u otras sustancias contaminantes que podnan interferir, por ejemplo, con la union del acido nucleico a la fase solida y/o podnan conducir a una purificacion inapropiada. Para realizar la etapa de lisis respectiva, a menudo se anaden grandes volumenes de reactivos de lisis tales como por ejemplo agentes caotropicos. La necesidad de realizar una etapa de lisis de volumen creciente respectiva es una desventaja, porque el volumen de la muestra real que puede procesarse por ejemplo en un sistema automatizado se reduce.

El documento US 2005/0106602 describe metodos de aislamiento de acidos nucleicos a partir de muestras de material celular. No se realiza lisis qmmica. En su lugar, se usan grupos de union a acido nucleico, que sirven para un fin doble, concretamente unirse a los acidos nucleicos y soportar la lisis de las celulas. El documento WO2006/036243 describe un metodo similar.

Melkonyan et al. Transrenal nucleic acids: “From proof of principle to clinical tests”, 2008, describen el aislamiento de acidos nucleicos extracelulares a partir de orina. La muestra se pone en contacto con una matriz de intercambio anionico de Q-Sepharose para unirse a los acidos nucleicos que despues de eso se lavan y se eluyen. Los detalles del protocolo de aislamiento usado se describen en Shekhtman et al. “Optimization of transrenal DNA analysis: Detection of fetal DNA in maternal urine” (Clinical Chemistry 55:4 paginas 723-729 (2009). Shekhtman et al. ensenan la dilucion masiva de la orina antes de unir los acidos nucleicos a la fase solida. Se diluyen 10 ml de orina con 10 ml de agua y la muestra diluida resultante se pone en contacto con la Q-Sepharose. Se describe un metodo similar en el documento WO2008/45505 que tambien describe un metodo basado en columna para aislar acidos nucleicos libres de celulas a partir de orina o plasma sangumeo.

El documento WO02/48164 describe un metodo de aislamiento de acidos nucleicos usando una resina de intercambio anionico y un procedimiento de carga-cambio. A un primer pH, la muestra se pone en contacto con un material que comprende un grupo ionizable, en el que el material tiene una carga positiva a su primer pH, de manera que los acidos nucleicos se unen en el material. Los acidos nucleicos se liberan a un segundo pH superior al que la carga del material es negativa, neutra o menos positiva. El aislamiento de acidos nucleicos circulantes, tales como acido nucleico extracelular derivado de tumor no se describe.

El documento DE 10 2008 063 003 describe un metodo para aislar acidos nucleicos usando superficies de intercambio anionico. El aislamiento de de acidos nucleicos extracelulares usando un gran volumen de muestra no se describe. El documento WO2010/072821 es la solicitud PCT correspondiente y describe asimismo un metodo para aislar acidos nucleicos usando superficies de intercambio anionico. El documento DE 10 2008 063 001 tambien da a conocer un metodo para aislar acidos nucleicos usando grupos de intercambio anionico y fases solidas disenadas espedficamente para unir acidos nucleicos.

Kirsch et al.: An improved method for the isolation of free-circulating plasma DNA and cell-free DNA from other body fluids, 2008, describe un metodo para aislar acidos nucleicos libres de celulas usando el kit NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel). No se usa una superficie de intercambio anionico para unir los acidos nucleicos.

Ivancic-Jelecki et al, J Chromatography, 2009, vol. 1216(13): pags. 2717-2724 describen el aislamiento de ADN libre de celulas a partir de plasma mediante cromatograffa sobre columnas monolfticas cortas.

El documento WO2009/102632 describe un metodo para aislar acidos nucleicos libres de celulas uniendolos a un

ligando tal como en particular un anticuerpo de union a ADN.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra que contiene acidos nucleicos extracelulares, que evita al menos una de las desventajas de la tecnica anterior comentadas anteriormente. En una realizacion espedfica un objeto de la presente invencion es proporcionar 5 un metodo sencillo y rapido para aislar acidos nucleicos extracelulares que es adecuado para la automatizacion y permite procesar grandes volumenes de muestra.

Sumario de la invencion

La invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Segun la reivindicacion 1, se proporciona un metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra uniendo los acidos nucleicos extracelulares a una 10 fase solida que porta grupos de intercambio anionico, en el que dicho metodo comprende las siguientes etapas:

a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH de < 6,5 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas;

15 b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida, en el que la elucion se produce a un segundo pH que se encuentra en el intervalo de > 8 a < 14;

en el que la muestra es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo a partir de un lfquido 20 corporal eliminando las celulas mediante separacion y en el que los acidos nucleicos extracelulares son ADN extracelular.

La presente invencion se basa en el hallazgo de que pueden aislarse eficazmente acidos nucleicos extracelulares a partir de diversas muestras diferentes usando un protocolo especial que implica el uso de un material de intercambio anionico que se une a los acidos nucleicos extracelulares.

25 El metodo de aislamiento segun la presente invencion tiene ventajas notables con respecto a los metodos usados en la tecnica anterior porque es rapido, permite el procesamiento de grandes volumenes de muestra, requiere etapas de manipulacion mmimas, proporciona una alta tasa de recuperacion de acidos nucleicos extracelulares y puede automatizarse. Todo lo que se requiere para el aislamiento eficaz de los acidos nucleicos extracelulares es la acidificacion de la muestra para establecer las condiciones de union, unir los acidos nucleicos extracelulares a la 30 fase solida y separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos de la muestra restante. Sorprendentemente, no son obligatorias etapas de lisis para preparar la muestra para el aislamiento de acidos nucleicos. Ademas, tampoco hay necesidad de anadir grandes volumenes de reactivos o agentes diluyentes para preparar la muestra para el aislamiento de acidos nucleicos y por ejemplo para establecer las condiciones de union. Por tanto, el metodo tiene la ventaja de que la mezcla de union puede consistir predominantemente en el material de 35 muestra. Esto es una ventaja importante con respecto a metodos de purificacion convencionales, tales como por ejemplo metodos que se basan en el uso de una fase solida de poli(acido silfcico) y poli(acido silfcico) y agentes caotropicos, en la que casi el 50% de la mezcla de union consiste en la qmmica que tiene que anadirse para lisar y/o preparar la muestra para la union. La acidificacion que se realiza segun la presente invencion para establecer las condiciones de union contribuye poco solo al volumen de la mezcla de union (habitualmente menos del 10% o 40 incluso menos del 5%). Por tanto, ya que no hay necesidad de anadir grandes volumenes de reactivos para establecer las condiciones de union, la cantidad de muestra que puede procesarse por ejemplo en un sistema automatizado se aumenta hasta un maximo. Esto es una ventaja importante cuando se usan sistemas automatizados que estan restringidos con respecto al volumen de muestra que pueden manipular. Al permitir el procesamiento de grandes volumenes de muestra cuando se usan procesos automatizados, la cantidad de acidos 45 nucleicos extracelulares aislados puede aumentarse mediante el metodo segun la presente invencion. Esto, a su vez, permite la deteccion y/o el analisis sensible de moleculas diana de baja abundancia comprendidas en la poblacion de acidos nucleicos extracelulares.

Tambien se da a conocer un metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra, en el que dicha muestra se estabiliza opcionalmente, uniendo los acidos nucleicos extracelulares a una fase solida que porta 50 grupos de intercambio anionico, en el que dicho metodo comprende las siguientes etapas:

a. unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida a un primer pH que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida; en el que preferiblemente la muestra constituye al menos el 85% del volumen de la mezcla de union;

b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

d. opcionalmente eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida.

Tambien se da a conocer un metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra que es o se deriva de un Kquido corporal, preferiblemente seleccionado de sangre, plasma, suero u orina, y en el que dicha 5 muestra se estabiliza opcionalmente, en el que para el aislamiento los acidos nucleicos extracelulares se unen a una fase solida que porta grupos de intercambio anionico, en el que dicho metodo comprende las siguientes etapas:

a. unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union a un primer pH < 6 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida;

b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

10 c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida preferiblemente a un segundo pH que es mayor que el primer pH que se uso para unir el acido nucleico extracelular a la fase solida;

e. aislar los acidos nucleicos extracelulares del eluato.

El metodo respectivo permite concentrar acidos nucleicos extracelulares desde un volumen de muestra grande hasta 15 un volumen de muestra mas pequeno que, por ejemplo, puede manipularse facilmente mediante sistemas automatizados convencionales. Los acidos nucleicos extracelulares aislados se purifican adicionalmente en la etapa

e. usando metodos de aislamiento adecuados, por ejemplo metodos de aislamiento establecidos que se realizan sobre sistemas automatizados. Concentrar los acidos nucleicos extracelulares desde un volumen de muestra grande hasta un volumen de muestra pequeno tiene la ventaja de que el rendimiento global de acidos nucleicos 20 extracelulares puede aumentarse ya que volumenes de muestra considerablemente mas grandes pueden procesarse mas convenientemente que con sistemas convencionales.

Ademas, se da a conocer un metodo para mejorar la recuperacion de acidos nucleicos pequenos cuando se usa una fase solida de union a acidos nucleicos. Cuando se afslan acidos nucleicos, en acidos nucleicos mas pequenos particulares tales como por ejemplo acidos nucleicos extracelulares, a menudo no se recuperan eficazmente acidos 25 nucleicos mas pequenos, aun cuando se unieron inicialmente a la fase solida de acidos nucleicos en la etapa de union. El pretratamiento de la fase solida de union a acidos nucleicos con un polfmero, preferiblemente poli(acido acnlico) antes de la union de los acidos nucleicos a la fase solida mejora sorprendentemente la tasa de recuperacion de acidos nucleicos mas pequenos. Por tanto, tambien se da a conocer una fase solida de union a acidos nucleicos que se ha pretratado con un polfmero, tal como por ejemplo poli(acido acnlico). Ademas se da a conocer un metodo 30 para producir una fase solida de union a acidos nucleicos respectiva, que comprende poner en contacto la fase solida de union a acidos nucleicos con un polfmero, uniendo de ese modo el polfmero a la fase solida. Tambien se da a conocer un metodo para aislar acidos nucleicos, preferiblemente acidos nucleicos extracelulares, en el que se usa una fase solida de union a acidos nucleicos que se ha pretratado con un polfmero. El pretratamiento de la fase solida con un polfmero tal como poli(acido acnlico) da como resultado que las caractensticas de union a acidos 35 nucleicos de la fase solida de acido nucleico mejoran porque la recuperacion de acidos nucleicos pequenos puede aumentarse.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Rendimiento porcentual de fragmentos de ADN usando tres tipos de perlas diferentes.

Figura 2: Enriquecimiento de ADNlcc (ensayo de PCR de duplex de ADN 18S): Control del exito de la union 40 analizando el sobrenadante tras la etapa de union y el eluato.

Figura 3: Comportamiento selectivo de tamano de las perlas magneticas (tipo II) usando dos etapas de elucion con dos tampones de elucion diferentes.

Figura 4: Enriquecimiento de ARNlcc, medido usando un ensayo de GAPDH.

Figura 5: Prueba de inhibicion para analizar si el concentrado es compatible con PCR o si tiene que realizarse un 45 protocolo de limpieza.

Figura 6: Enriquecimiento de virus usando tres tipos diferentes de perlas magneticas de intercambio anionico.

Figura 7: La mediana del rendimiento porcentual en comparacion con la referencia de todos los donantes individuales (en este caso se muestran los resultados de tres ensayos de ADN diferentes).

Figura 8: La mediana de la recuperacion tras el uso del ensayo de ADN de fragmento (control interno).

50 Figura 9: La eficacia de aislamiento usando diferentes concentraciones de acido nucleico.

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Figura 10: Recuperacion de ADNIcc (18S) - protocolo de enriquecimiento manual.

Figura 11: Recuperacion de ADN con adiciones conocidas - protocolo de enriquecimiento manual.

Figura 12: Enriquecimiento de ADN fetal, medido usando un ensayo de deteccion de 18S, ensayo de Dys14 y ensayo de RhD.

Figura 13: Enriquecimiento selectivo de tamano de fragmentos de ADN extracelular cortos, medidos mediante el ensayo de APP.

Figura 14: Deteccion de ADN diana en tampones con valor de pH basico, medido mediante el ensayo de ADN 18S duplex.

Figura 15: Recuperacion de bajo rendimiento de fragmentos de ADN mas largo en tampones de elucion de bajo contenido en sal.

Figura 16: Dependencia de la sal y seleccion por tamano, recuperacion de fragmentos de ADN mas largos en tampones de elucion de alto contenido en sal, medido mediante el ensayo de deteccion de 18S doble.

Figura 17: Compatibilidad con PCR, sin inhibicion de la PCR del tampon de elucion con adiciones conocidas con diferentes cantidades de ADN diana.

Figura 18: Elucion selectiva de tamano de fragmentos de ADN mas cortos a pH basico sin sal adicional, medido mediante deteccion de ADN 18S doble.

Figura 19: Enriquecimiento selectivo de tamano de ADNlcc usando tampones de elucion con concentracion de sal y pH variables.

Figura 20: Enriquecimiento dependiente de sal de fragmentos de ADN con un tamano definido, medido usando el ensayo de APP.

Figura 21: Extraccion completa de ADN fetal a partir de plasma materno, medido usando un ensayo de Dys14.

Figura 22: La adicion de PAA mejora la recuperacion de ADN, tal como se mide mediante el ensayo de ADN 18S duplex.

Figura 23: Eficacia de aislamiento de ADN usando diferentes volumenes de elucion.

Figura 24: Union y liberacion de ADN altamente eficaces en tampon de elucion, medido mediante el ensayo de deteccion de ADN 18S doble.

Figura 25: La deteccion por PCR de ADN aislado no se ve afectada por los componentes del tampon de elucion. Figura 26: Enriquecimiento de ADN dependiente del valor de pH y el volumen de perlas.

Figura 27: Enriquecimiento de ADN comparable usando perlas de tipo I o tipo II, medido usando el ensayo de deteccion de 18S.

Figura 28: Enriquecimiento de ADN a partir de suero.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra, en el que dicha muestra se estabiliza opcionalmente, uniendo los acidos nucleicos extracelulares a una fase solida que porta grupos de intercambio anionico, en el que dicho metodo comprende las siguientes etapas:

a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH de < 6,5 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas;

b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida, en el que la elucion se produce a un segundo pH que se encuentra en el intervalo de > 8 a < 14; en el que la muestra es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo a partir de un lfquido corporal eliminando las celulas mediante separacion y en el que los acidos nucleicos extracelulares son ADN extracelular.

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Las ventajas clave asociadas con dicho metodo se describieron anteriormente en el sumario de la invencion. Los presentes inventores han encontrado que pueden aislarse rapidamente acidos nucleicos extracelulares a partir de diversas muestras con alto rendimiento usando una fase solida que porta grupos de intercambio anionico que se unen inespedficamente (es decir, independientemente de la secuencia) a los acidos nucleicos extracelulares. El metodo permite procesar altos volumenes de muestra, porque basicamente todo lo que se requiere para establecer las condiciones de union es la acidificacion de la muestra. La acidificacion anade poco solo al volumen de muestra y por tanto al volumen de la mezcla de union, permitiendo de ese modo procesar volumenes de muestra mas grandes en comparacion con metodos convencionales que deben anadir grandes cantidades de reactivos de lisis y/o union con el fin de permitir el aislamiento de los acidos nucleicos. Tal como se muestra en los ejemplos, el metodo segun la presente invencion puede lograr, dependiendo de la fase solida usada, tasas de recuperacion de hasta el 100%. Por tanto, el procesamiento de volumenes de muestra mas grandes que es posible con el metodo segun la presente invencion da como resultado un aumento de rendimiento de acidos nucleicos extracelulares, lo que es una ventaja importante porque los acidos nucleicos extracelulares estan comprendidos habitualmente en las muestras en bajas concentraciones tales como por ejemplo <100 ng/ml de muestra. La posibilidad de procesar grandes volumenes de muestra usando un metodo sencillo de este tipo tambien permite realizar la presente invencion en sistemas automatizados que estan restringidos con respecto al volumen maximo de la disolucion que pueden manipular. Puesto que solo se anaden volumenes muy bajos de reactivos a la muestra inicial para establecer las condiciones de union de los acidos nucleicos, el volumen de manipulacion maximo de sistemas automatizados puede usarse eficazmente para tanto de la muestra inicial como sea posible. El metodo segun la presente invencion permite maximizar el rendimiento de acido nucleico al permitir procesar volumenes mas grandes y al lograr una alta tasa de recuperacion y por tanto, un alto rendimiento de acidos nucleicos extracelulares extrafdos. Por tanto, el metodo segun la presente invencion es especialmente adecuado para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de muestras biologicas tales como lfquidos corporales que comprenden acidos nucleicos extracelulares en bajas cantidades tales como por ejemplo <100 ng/ml de muestra. El metodo segun la presente invencion puede usarse para aislar acidos nucleicos extracelulares de modo que esten directamente disponibles para aplicaciones posteriores tales como por ejemplo metodos de analisis subsiguientes, por ejemplo con el fin de amplificar, identificar, cuantificar y/o detectar la presencia o ausencia de un determinado acido nucleico diana dentro de la poblacion de acidos nucleicos diana extracelulares extrafdos. Por tanto, a pesar del hecho de que el metodo segun la presente invencion es muy sencillo y rapido, los acidos nucleicos aislados son lo suficientemente puros como para usarse en aplicaciones posteriores convencionales tales como por ejemplo ensayos de analisis y deteccion tal como se muestra en los ejemplos.

Ademas, el metodo de aislamiento segun presente invencion puede usarse tambien como protocolo de pretratamiento para aislar y por tanto concentrar acidos nucleicos extracelulares a partir de grandes volumenes de muestra. Los acidos nucleicos extracelulares respectivamente concentrados pueden entonces opcionalmente purificarse adicionalmente usando un protocolo de aislamiento de acidos nucleicos convencional. La realizacion del metodo segun la presente invencion como un protocolo de concentracion para reducir el volumen de muestra para una etapa de purificacion subsiguiente tiene la ventaja de que pueden ahorrarse tiempo y costes y el rendimiento de acidos nucleicos extracelulares puede aumentarse porque pueden procesarse volumenes de muestra iniciales mas grandes. Por tanto, el presente metodo puede usarse tambien como protocolo de pretratamiento con el fin de concentrar acidos nucleicos extracelulares desde un volumen de muestra grande hasta un volumen de muestra mas pequeno que permite el uso de un aislamiento de acidos nucleicos convencional, respectivamente protocolos de purificacion que pueden realizarse por ejemplo sobre sistemas automatizados establecidos que tienen limitaciones con respecto al volumen de muestra que pueden manipular. La incorporacion de una respectiva extraccion previa, respectivamente etapa de concentracion tambien permite establecer, respectivamente mejorar las pruebas de rutina para acidos nucleicos extracelulares usando sistemas automatizados porque el resultado del aislamiento, en particular con respecto al rendimiento, se mejora.

El metodo segun la presente invencion puede realizarse manualmente, o usando sistemas automatizados. Los metodos manuales tienen la ventaja de que habitualmente pueden procesarse volumenes de muestra mas grandes (los sistemas automatizados tienen habitualmente, debido a su diseno, un determinado lfmite con respecto al volumen que pueden procesar). Los sistemas automatizados tienen la ventaja de que pueden procesarse muchas muestras al mismo tiempo y que los sistemas automatizados son menos propensos a errores, porque se evitan errores de manipulacion. Las limitaciones con respecto al volumen de muestra pueden superarse en un determinado grado dividiendo la muestra original, procesando las porciones de muestra en paralelo y reunificando o bien los eluatos o bien el material de intercambio anionico antes de la elucion. Segun una realizacion, los acidos nucleicos extracelulares comprendidos en una primera muestra se unen a la fase solida segun el metodo definido en la reivindicacion 1. Se usan partfculas magneticas como fase solida. Dicha fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos se pone en contacto entonces con la mezcla de union de una segunda muestra, en la que dicha segunda muestra es preferiblemente una porcion dividida de la misma muestra original, es decir la muestra original se dividio en la primera y la segunda muestra. De ese modo, la fase solida de la primera muestra se unifica con la fase solida de la segunda muestra y las fases solidas unificadas se procesan entonces adicionalmente. Esta division de la muestra y reunificacion de o bien los eluatos y/o bien las fases solidas permite procesar facilmente volumenes de muestra mas grandes usando un sistema automatizado que solo puede procesar un volumen limitado de muestra.

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Una ventaja adicional cuando se usa el presente metodo es que la tasa de recuperacion sigue siendo sustancialmente la misma, independientemente de la dilucion de los acidos nucleicos extracelulares en la muestra. Por tanto, el presente metodo permite aislar los acidos nucleicos extracelulares con basicamente el mismo rendimiento, respectivamente tasa de recuperacion (veanse los ejemplos), independientemente de si se encuentra la misma cantidad de acidos nucleicos en 1 ml, 5 ml, 10 ml o 25 ml de muestra. Esto es una ventaja particular cuando se afslan acidos nucleicos extracelulares en baja abundancia a partir de grandes volumenes de muestra ya que una baja concentracion no dificulta el aislamiento eficaz de acidos nucleicos cuando se usa el metodo segun la presente invencion.

El termino “acidos nucleicos extracelulares” o “acido nucleico extracelular” tal como se usa en el presente documento, en particular se refiere a acidos nucleicos que no estan contenidos en celulas. Los acidos nucleicos extracelulares respectivos tambien se denominan a menudo acidos nucleicos libres de celulas. Estos terminos se usan como sinonimos en el presente documento. Por tanto, estan presentes acidos nucleicos extracelulares habitualmente en el exterior de una celula o en el exterior de una pluralidad de celulas dentro de una muestra. El termino “acidos nucleicos extracelulares” se refiere por ejemplo a ARN extracelular asf como a ADN extracelular y mezclas de los mismos. Los ejemplos de acidos nucleicos extracelulares tfpicos que se encuentran en la fraccion libre de celulas (respectivamente porcion) de una muestra biologica tal como un lfquido corporal o una muestra derivada de un lfquido corporal tal como por ejemplo plasma sangumeo incluyen pero no se limitan a acidos nucleicos extracelulares de mairnfero tales como por ejemplo ADN y ARN extracelular asociado a tumor o derivado de tumor, otro ADN y/o ARN extracelular relacionado con una enfermedad, ADN modificado epigeneticamente, ADN y/o ARN fetal, ARN de interferencia pequeno tal como por ejemplo miARN y ARNip, y acidos nucleicos extracelulares que no son de mamffero tales como por ejemplo acidos nucleicos virales, acidos nucleicos patogenos liberados en la poblacion de acidos nucleicos extracelulares, por ejemplo de procariotas (por ejemplo bacterias), virus u hongos. Pueden obtenerse acidos nucleicos extracelulares a partir de un lfquido corporal o una muestra derivada de un lfquido corporal como muestra biologica tal como por ejemplo sangre, plasma, suero, saliva, orina, licor, lfquido cefalorraqmdeo, esputos, lfquido lagrimal, sudor, lfquido amniotico o linfatico. El metodo segun la reivindicacion 1 afsla ADN extracelular a partir de una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo a partir de un lfquido corporal eliminando las celulas mediante separacion. Los acidos nucleicos extracelulares se obtienen a partir de la porcion libre de celulas o reducida en celulas de las muestras anteriores, que se obtuvo eliminando las celulas mediante separacion. En el presente documento, se hace referencia a acidos nucleicos extracelulares que se obtienen a partir de un lfquido corporal circulante o una muestra derivada de un lfquido corporal circulante, en particular a partir de la porcion libre de celulas o reducida en celulas de un lfquido corporal circulante como acidos nucleicos extracelulares circulantes o libres de celulas circulantes (lcc). Segun una realizacion, el termino acido nucleico extracelular se refiere en particular a acidos nucleicos extracelulares de mamffero, preferiblemente acidos nucleicos extracelulares asociados a enfermedad o derivados de enfermedad tales como acidos nucleicos extracelulares asociados a tumor o derivados de tumor, acidos nucleicos extracelulares liberados debido a inflamaciones o lesiones, en particular traumatismo, acidos nucleicos extracelulares relacionados con y/o liberados debidos a otras enfermedades, o acidos nucleicos extracelulares derivados de un feto. El termino “acidos nucleicos extracelulares” o “acido nucleico extracelular” tal como se da a conocer en el presente documento tambien se refiere a acidos nucleicos extracelulares obtenidos de otras muestras, en particular muestras biologicas distintas de lfquidos corporales.

Tal como se comento anteriormente, el metodo segun la presente invencion es tambien util para aislar acidos nucleicos virales como una realizacion de acidos nucleicos extracelulares. La eficacia del presente metodo da como resultado una sensibilidad superior de los metodos de deteccion posteriores subsiguientes, de modo que pueden detectarse virus importantes en el diagnostico tales como VIH o VHC de manera mas fiable por ejemplo en donaciones de sangre. Ademas, la monitorizacion de la terapia antiviral puede mejorarse debido a un lfmite inferior de deteccion de virus. Cuando se tiene como objetivo el aislamiento de acidos nucleicos virales, se prefiere usar el presente metodo como protocolo de pretratamiento para concentrar los acidos nucleicos virales antes de realizar un protocolo de aislamiento de acidos nucleicos adicional tal como por ejemplo un protocolo de aislamiento de acidos nucleicos virales convencional.

El termino “mezcla de union” tal como se usa en el presente documento se refiere a la composicion que se prepara para la etapa de union y que permite unir los acidos nucleicos extracelulares comprendidos en la muestra a los grupos de intercambio anionico de la fase solida. Por tanto, la mezcla de union proporciona condiciones apropiadas para unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida. La mezcla de union comprende la muestra y los reactivos y/o compuestos que se anadieron a la muestra con el fin de preparar la muestra para la etapa de union. Por ejemplo pueden anadirse reactivos y/o compuestos de acidificacion a la muestra para establecer el primer valor de pH. Segun la presente invencion, preferiblemente al menos el 85% del volumen de la mezcla de union lo proporciona la muestra, respectivamente la muestra estabilizada si se procesa una muestra estabilizada, por ejemplo una muestra de plasma sangumeo o suero estabilizada. Preferiblemente, al menos el 90%, al menos el 92%, al menos el 94%, al menos el 95% y lo mas preferiblemente al menos el 97% del volumen de la mezcla de union lo proporciona la muestra, respectivamente la muestra opcionalmente estabilizada. Esto garantiza que la mezcla de union consista predominantemente en la muestra que contiene acido nucleico extracelular (que esta opcionalmente estabilizada). Esto permite procesar grandes volumenes de muestra (vease anteriormente). El termino “mezcla de union” tal como se usa en el presente documento no incluye la fase solida. Por tanto, la

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contribucion de volumen potencial de la fase solida no se considera en las especificaciones de volumen anteriores. Si una fase solida contribuye en absoluto al volumen de una mezcla de union tambien depende de la fase solida que se usa para la union de los acidos nucleicos extracelulares. Mas adelante se describen ejemplos adecuados de fases solidas.

La mezcla de union se prepara ajustando el pH de la muestra al primer pH. Esto puede lograrse anadiendo compuestos y/o reactivos de acidificacion. Los ejemplos adecuados de reactivos de acidificacion incluyen pero no se limitan a acidos, agentes tamponantes acidos tales como acidos carboxflicos, por ejemplo acido acetico, tampones de acetato de sodio/acido acetico, tampones de acido cftrico/citrato, acido maleico, acido malonico, acido tartarico, HCI, HCO4, HCO3, acido formico, acido borico, H2SO4, H2SO3, sistemas de tampon de acido fosforico/fosfato acidos, MES u otros acidos organicos o inorganicos solubles en agua. En una realizacion preferida, se anade una disolucion de acidificacion, preferiblemente un tampon de acidificacion a la muestra como compuesto y/o reactivo de acidificacion para establecer las condiciones de union en la mezcla de union. La disolucion de acidificacion puede contener una sustancia tamponante que puede ajustar el pH de la mezcla de union resultante al primer pH. Puede comprender adicionalmente una sal, preferiblemente en disolucion, en particular en una disolucion acuosa. Preferiblemente, la disolucion de acidificacion comprende una sustancia tamponante o una combinacion de diferentes sustancias tamponantes, preferiblemente disueltas en agua. Un ejemplo particularmente preferido de una disolucion de acidificacion es una disolucion acuosa de un tampon de acetato de sodio/acido acetico, preferiblemente en una concentracion de desde 0,5 hasta 5 M, mas preferiblemente de 0,5 a 4 M, de 0,5 a 3 M y mas preferiblemente de aproximadamente 1 a 2 M, preferiblemente que tiene un valor de pH en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, mas preferiblemente de aproximadamente 4. La disolucion de acidificacion se anade preferiblemente a la muestra en una razon (volumen (disolucion de acidificacion):volumen (muestra, respectivamente muestra estabilizada opcionalmente)) de desde aproximadamente 1:10 hasta aproximadamente 1:1000 en volumen, preferiblemente en una razon de desde aproximadamente 1:100 hasta 1:20 en volumen, mas preferiblemente en una razon de aproximadamente 1:30, lo mas preferiblemente en una razon de aproximadamente 1:40 en volumen. Otros sistemas de tampones adecuados incluyen por ejemplo acetato de potasio/acido acetico, citrato de sodio (o potasio)/acido cftrico y fosfato de sodio (o potasio)/acido fosforico. Las razones respectivas son en particular utiles cuando se procesan lfquidos corporales (o muestras derivadas de lfquidos corporales) como muestras, tales como por ejemplo sangre, plasma o suero.

Segun una realizacion, el primer pH esta por debajo del valor de pKa de un grupo protonable de los grupos de intercambio anionico que se proporcionan sobre la superficie de la fase solida. El primer pH usado para la union de los acidos nucleicos a la fase solida esta preferiblemente por debajo del valor de pKa del grupo protonable del grupo de intercambio anionico. Si el grupo de intercambio anionico comprende mas de un grupo protonable, el primer pH esta preferiblemente por debajo del pKa de al menos un grupo protonable. Preferiblemente, el primer pH esta al menos 0,5 unidades por debajo del valor de pKa, mas preferiblemente al menos 1 unidad, al menos 1,5 unidades, al menos 2 unidades, al menos 2,5 unidades y lo mas preferiblemente al menos 3 unidades por debajo de dicho valor de pKa. Preferiblemente, el pH esta por encima de 4.

El primer valor de pH que se usa respectivamente que es adecuado para unir los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida tambien depende de la naturaleza de los grupos de intercambio anionico y/o su densidad de los grupos de intercambio anionico sobre la superficie de la fase solida. Tambien la concentracion de sal usada puede influir en la union. El experto puede determinar valores de pH adecuados para el primer valor de pH. Segun una realizacion, el primer pH se encuentra en un intervalo seleccionado de desde 4 hasta 6,5; de 4,5 a 6,5; de 5 a 6,5 y de 5 a 6. Los valores de pH respectivos estan en particular optimizados para la union a ADN cuando se usan las partfculas de intercambio anionico descritas en los ejemplos. El pH de la mezcla de union es < 6,5 y preferiblemente < 6. Cuando se tiene como objetivo el aislamiento de ARN extracelular, puede usarse un primer valor de pH acido mas fuerte de < 5,5 o < 5 ya que esto podna aumentar el rendimiento de ARN. La acidificacion de la muestra establece el primer pH para unir los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida. La acidificacion ademas procesa la muestra y por tanto puede mejorar la union, por ejemplo liberando ADN nucleico extracelular que puede quedar atrapado por ejemplo en complejos de histonas.

La union se produce durante un tiempo suficiente como para permitir una union sustancial de los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida. El tiempo de incubacion adecuado, respectivamente necesario depende del tipo y la cantidad de fase solida y grupos de intercambio anionico usados, el volumen de muestra y la concentracion de acidos nucleicos extracelulares en la muestra. Por ejemplo pueden ser suficientes tiempo de incubacion mas cortos, si se usa una fase solida que tiene una alta densidad de grupos de intercambio anionico y, por tanto, se une fuertemente a los acidos nucleicos extracelulares. Tiempos de incubacion mas prolongados garantizan que los acidos nucleicos se unan de manera altamente eficaz a la fase solida, permitiendo de ese modo maximizar la recuperacion de acidos nucleicos extracelulares a partir de la muestra. Segun algunas realizaciones, el tiempo de incubacion se selecciona de al menos 1 min, al menos 2 min, al menos 5 min, al menos 10 min, al menos 15 min y mas preferiblemente al menos aproximadamente 20 min.

En la etapa (b) del metodo segun la presente invencion los acidos nucleicos extracelulares que se unen a la fase solida se separan de la muestra restante. Para este fin, puede usarse cualquier medio conocido en la tecnica. Los medios adecuados tambien dependen del tipo de la fase solida que se usa para la union e incluyen pero no se

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limitan a separacion magnetica si se usa una fase solida magnetica, centrifugacion por ejemplo si se usan partfculas no magneticas o una membrana, sedimentacion, la aplicacion de un vado, filtracion o cromatograffa. Mas adelante se describen fases solidas adecuadas y el experto esta familiarizado con la manipulacion de las respectivas fases solidas.

En realizaciones preferidas, todo el metodo para aislar acidos nucleicos se realiza a temperature ambiente.

La muestra, la fase solida y el/los compuesto(s) y/o reactivo(s) de acidificacion pueden ponerse en contacto en cualquier orden. Se anade al menos un compuesto y/o reactivo de acidificacion a la muestra con el fin de establecer el primer pH y por tanto las condiciones de union. La mezcla de union resultante se pone entonces en contacto con la fase solida para unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida. Opcionalmente, pueden hacerse ajustes de pH adicionales tras el contacto para optimizar las condiciones de union o para establecer el primer pH deseado. Sin embargo, tambien esta dentro del alcance de la presente invencion, tambien dependiendo del tipo de fase solida usada, proporcionar la fase solida en primer lugar y luego anadir la muestra y al menos un compuesto y/o reactivo de acidificacion en cualquier orden. Puede usarse cualquier orden de contacto adecuado que permita unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida. Tras la etapa (b), pueden realizarse opcionalmente una o mas etapas de lavado como etapa (c). Segun una realizacion, al menos una disolucion de lavado se pone en contacto con la fase solida que porta los acidos nucleicos extracelulares unidos. Con el fin de garantizar una recuperacion maxima de los acidos nucleicos unidos, las condiciones de lavado se eligen preferiblemente de manera que no se retira una cantidad significativa de acido nucleico unido a la matriz de union a acido nucleico de la misma durante el lavado. El tampon de lavado es preferiblemente una disolucion acuosa y puede contener un tensioactivo. Los tensioactivos adecuados incluyen pero no se limitan a tensioactivos no ionicos a base de polioxietileno, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en eteres de alcohol graso de polioxietileno, alquilfenil eteres de polioxietileno y copolfmeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno. Ejemplos preferidos son TritonX-100 o Brij58, por ejemplo a una concentracion de aproximadamente el 0,01% -1%. Tambien se conocen en la tecnica anterior disoluciones de lavado adecuadas y, por tanto, no es necesaria ninguna descripcion adicional en el presente documento. Se recomienda particularmente el lavado si se supone que los acidos nucleicos extracelulares aislados por ejemplo van a analizarse y/o detectarse directamente por ejemplo en un ensayo de diagnostico sin purificacion adicional. Si se supone que los acidos nucleicos extracelulares aislados van a analizarse directamente usando metodos que son por ejemplo sensibles a posibles impurezas (tales como por ejemplo metodos de PCR), se recomienda realizar al menos dos etapas de lavado. Segun una realizacion, se usan preferiblemente dos volumenes diferentes de disoluciones de lavado. En el presente documento, el volumen de la primera disolucion de lavado es preferiblemente mayor que el volumen de la segunda disolucion de lavado. Sin embargo, no es necesario un lavado si se usa posteriormente un metodo de deteccion y/o analisis que es bastante insensible a las impurezas. Ademas, si el metodo de aislamiento segun la presente invencion se usa para enriquecer y por tanto concentrar los acidos nucleicos extracelulares en un volumen de muestra pequeno como preparacion para un metodo de aislamiento de acidos nucleicos subsiguiente, respectivamente un protocolo de purificacion, el lavado tampoco es obligatorio. La realizacion de un protocolo de aislamiento subsiguiente respectivo se recomienda particularmente si, por ejemplo, acidos nucleicos virales son la diana principal dentro de la poblacion de acidos nucleicos extracelulares.

El metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares comprende ademas una etapa (d) de eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida.

Generalmente, puede usarse cualquier metodo de elucion adecuado. Preferiblemente, la elucion se logra cambiando el valor de pH. Por tanto, segun una realizacion, la elucion se produce a un segundo pH que es mayor que el primer pH que se uso para unir el acido nucleico extracelular a la fase solida. La eleccion del segundo valor de pH que es adecuado para eluir los acidos nucleicos extracelulares de los grupos de intercambio anionico depende entre otros de la naturaleza de los grupos de intercambio anionico presentes sobre la fase solida, la densidad de los grupos de intercambio anionico sobre la superficie de la fase solida y la fuerza ionica de la disolucion de elucion. El experto puede determinar valores de pH adecuados para el segundo pH. El segundo pH es preferiblemente al menos 0,5 unidades mayor que el primer pH, al menos 1 unidad mayor que el primer pH, mas preferiblemente al menos 1,5 unidades mayor o al menos 2 unidades mayor que el primer pH. El segundo pH puede estar por debajo, a o por encima del pKa de un grupo protonable del grupo de intercambio anionico. Sin embargo, preferiblemente, esta al menos 1 unidad por debajo del pKa, mas preferiblemente al menos 1,5 unidades por debajo del pKa o al menos 2 unidades por debajo de dicho pKa. Preferiblemente, la elucion se realiza a un segundo pH > 8. Preferiblemente, la elucion se produce a un intervalo de pH seleccionado del grupo que consiste en pH > 8 y < 14; pH > 8 y < 12,6; pH > 8 y < 12; > 8 y < 11; pH > 8 y < 10 y > 8 y < 9. El valor de pH que se usa para la elucion tambien puede depender de la aplicacion adicional prevista del eluato. Valores de pH de elucion inferiores pueden ser ventajosos porque un respectivo valor de pH inferior es mas compatible con muchas reacciones posteriores comunes (por ejemplo PCR). Por ejemplo pueden usarse valores de pH alcalino mas fuertes, tales como un valor de pH de al menos 12, y son ventajosos, por ejemplo si es necesario ADN monocatenario o tienen que reducirse las contaminaciones de ARN. Segun una realizacion, la elucion se logra usando una disolucion de hidroxido de sodio < 1 mol/l. Para determinadas aplicaciones, por ejemplo, el tratamiento posterior del ADN eluido con reactivos de bisulfito con el fin de analizar los patrones de metilacion del ADN, puede ser tambien beneficioso para eluir los acidos nucleicos a pH > 12 y < 14 con el fin de desnaturalizar el ADN eluido. Si la elucion se produce a un valor de pH superior (por ejemplo 10 o superior), el eluato que comprende los acidos nucleicos puede neutralizarse por ejemplo si un respectivo valor de pH neutro es

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beneficioso para las aplicaciones posteriores previstas. El ARN puede eluirse a valores de pH inferiores. Por ejemplo, cuando se usa una fase solida que porta grupos polietilenimina (veanse los ejemplos), el ARN podna eluirse eficazmente a un valor de pH de 8, en el que para ADN un valor de pH superior de mas de 12 era mas adecuado. Si se pretende tambien recuperar ARN en la etapa de elucion se prefiere no usar valores de pH altos porque el ARN podna danarse. Valores de pH altos por encima de pH 9 pueden evitarse por ejemplo aumentando la concentracion de sal en la disolucion de elucion si la fuerza de elucion proporcionada por el segundo pH no es suficiente para lograr una elucion eficaz.

La elucion se logra preferiblemente poniendo en contacto los acidos nucleicos extracelulares que se unen a la fase solida con una disolucion de elucion. La disolucion de elucion comprende preferiblemente una sustancia tamponante que puede ajustar el segundo pH. En particular, pueden usarse tampones biologicos. Un ejemplo adecuado es tris(hidroximetil)aminometano (Tris) en una concentracion de aproximadamente 1 mM a 1 M, preferiblemente de 10 mM a 500 mM, mas preferido de 50 mM a aproximadamente 250 mM, lo mas preferido de 75 mM a aproximadamente 150 mM, ajustado al pH deseado usando por ejemplo HCl. Sin embargo, segun una realizacion, se usa la base libre de la sustancia tamponante, por ejemplo Tris como base libre. Puede usarse en los intervalos de concentracion mencionados anteriormente. Segun una realizacion, se usa una disolucion de elucion que comprende Tris como base libre. El valor de pH de dicha disolucion de elucion que contiene la base libre puede estar, por ejemplo, en un intervalo de 10 a 10,5. Segun una realizacion, dicha disolucion de elucion no comprende sales, en particular no comprende sales alcalinas o sales alcalinoterreas. Tal como se muestra mediante los ejemplos, usar una disolucion de elucion respectiva que comprende Tris como base libre sin sales adicionales permite eluir selectivamente acidos nucleicos predominantemente pequenos que tienen una longitud de 300 nt o menos, preferiblemente 250 nt o menos, mas preferido 200 nt o menos, 150 nt o menos o incluso 100 nt o menos tal como se explicara posteriormente y tal como se muestra en los ejemplos. Por tanto, estas condiciones de elucion pueden usarse para enriquecer acidos nucleicos cortos respectivos en el eluato frente a acidos nucleicos mas largos. Anadiendo sal a la disolucion de elucion que comprende Tris como base libre tambien es posible eluir acidos nucleicos mas largos. La concentracion de sal puede ajustarse si acidos nucleicos mas largos son de interes, la concentracion dependena del valor de corte deseado. La disolucion de elucion es preferiblemente una disolucion acuosa que comprende la sustancia tamponante y ademas opcionalmente componentes tales como una sal, en particular una sal alcalina tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio, por ejemplo en una concentracion de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 M, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 M, mas preferiblemente de aproximadamente 0,16 M. La concentracion de sal usada tiene una influencia sobre la eficacia de elucion, en particular la eficacia de elucion de acidos nucleicos mas largos. Cuanto mas alta sea la concentracion de sal, mas eficaz es la elucion de acidos nucleicos mas largos. Por tanto, aumentar la concentracion de sal aumenta la eficacia de elucion para acidos nucleicos mas largos. Por tanto, controlando la concentracion de sal en el tampon de disolucion es posible controlar el tamano de los acidos nucleicos que van a eluirse. Por ejemplo, aumentar la concentracion de la sal, en particular de una sal alcalina tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio, en la disolucion de elucion hasta 75 mM o por encima, da como resultado que acidos nucleicos que tienen un tamano de al menos 500 nt se eluyan con una tasa de recuperacion por encima del 40%. Otros tampones posibles incluyen pero no se limitan a HEPES, Tris-borato y MOPS. Por tanto, la elucion tiene lugar preferiblemente a una condicion de bajo contenido en sal. Usar una baja concentracion de sal tiene la ventaja de que el eluato puede usarse directamente en un ensayo posterior tal como por ejemplo una reaccion PCR. Segun una realizacion, se usa una disolucion de elucion que comprende Tris-HCl 100 mM (que contiene el 0,5-1,5%, preferiblemente el 0,9% de cloruro de sodio, pH 9). Sin embargo, tambien esta dentro del alcance de la presente invencion usar concentraciones de sal mayores, en particular con el fin de aumentar la fuerza ionica para evitar valores de pH altos, por ejemplo, por encima de 10 o por encima 12 (vease anteriormente), por ejemplo, si tal valor alto de pH no es compatible con las reacciones posteriores previstas. Segun una realizacion, se usa una disolucion de elucion que comprende un hidroxido alcalino tal como hidroxido de sodio o hidroxido de potasio. Tal como se muestra mediante los ejemplos, variando la concentracion de hidroxido alcalino en la disolucion de elucion tambien es posible influir en el tamano de los acidos nucleicos que se eluyen predominantemente. Aumentar la concentracion de hidroxido alcalino en la disolucion de elucion aumenta el tamano de los acidos nucleicos que se eluyen. Preferiblemente, al menos el 50%, mas preferiblemente al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 98% del acido nucleico extracelular unido a la fase solida o de los acidos nucleicos extracelulares que tienen un intervalo de tamano deseado se eluye de la misma en la etapa (d). La elucion tambien puede ayudarse mediante calentamiento y/o agitacion.

Ademas, la eficacia de elucion puede aumentarse en particular para eluir acidos nucleicos mas largos incluyendo en la disolucion de elucion un compuesto anionico que comprende al menos dos grupos anionicos. Un compuesto anionico respectivo soporta la rotura del complejo de intercambio anionico/acido nucleico y, por tanto, soporta la elucion. Como compuesto anionico que comprende al menos dos grupos anionicos, por ejemplo, pueden usarse acidos carboxflicos tales como acido oxalico, acido melttico, acido piromelftico y acido cftrico. Ademas, tambien pueden usarse compuestos anionicos polimericos tales como por ejemplo poli(acido acnlico) (PAA), poli(acido metacnlico) (PMA), poli(acido glutamico) (PGA) y sulfato de dextrano. Tambien se describen compuestos anionicos respectivos en el documento WO 2011/037692. Tal como se muestra mediante los ejemplos, la eficacia de elucion puede potenciarse cuando se anade un compuesto anionico respectivo.

Se encontro que cuando se usa una resina de intercambio anionico para la union a acidos nucleicos, los acidos

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nucleicos unidos pueden eluirse de la matriz dependiendo de su tamano simplemente ajustando y variando respectivamente el pH de elucion. A un pH de elucion menor, solo eluiran moleculas de acido nucleico pequenas de la resina de intercambio anionico. Cuando se eleva el pH de elucion, tambien pueden eluirse acidos nucleicos mayores. Esto permite separar los acidos nucleicos extracelulares unidos por tamano. En particular, se encontro que solo son necesarios pequenos cambios en el pH de elucion para obtener este efecto de fraccionamiento por tamano.

Segun una realizacion, solo una parte, respectivamente porcion de los acidos nucleicos extracelulares se eluye de la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH, en la que la longitud promedio de los acidos nucleicos extracelulares eluidos de la fase solida es mas corta que la longitud promedio de los acidos nucleicos extracelulares que permanecen unidos a la fase solida. Segun una realizacion, el segundo pH esta en el intervalo de desde aproximadamente 7,5 hasta 10,5, preferiblemente desde aproximadamente 8 hasta 10, de 8,2 a 9,5, preferiblemente de aproximadamente 8,5 a 9. Tal como se muestra mediante los ejemplos, usar una disolucion de elucion que tiene un valor de pH respectivo permite lograr una elucion selectiva de tamano, en la que la longitud promedio de los acidos nucleicos extracelulares eluidos de la fase solida es mas corta que la longitud promedio de los acidos nucleicos extracelulares que permanecen unidos a la fase solida. El valor de corte puede ajustarse ajustando las condiciones de elucion. En particular, el valor de pH y la concentracion de sal de la disolucion de elucion son caractensticas decisivas que tienen una influencia sobre el valor de corte y, por tanto, sobre la longitud de los acidos nucleicos que se eluyen predominantemente.

Dependiendo de la distribucion de tamano de acidos nucleicos en una poblacion de acidos nucleicos, tal como por ejemplo los acidos nucleicos unidos o eluidos, la longitud promedio de los acidos nucleicos en una poblacion de moleculas de acido nucleico puede referirse a la longitud de acidos nucleicos a la que la mitad de las moleculas de acido nucleico en la poblacion tienen una longitud mas corta y la otra mitad de las moleculas de acido nucleico tienen una longitud mayor que la longitud promedio de los acidos nucleicos. Sin embargo, la longitud promedio de los acidos nucleicos en una poblacion de moleculas de acido nucleico tambien puede referirse a la longitud de acidos nucleicos que se produce lo mas frecuentemente en la respectiva poblacion de acidos nucleicos. Esta ultima opcion para determinar la longitud promedio de los acidos nucleicos sera habitualmente mas apropiada y, por tanto, preferida para poblaciones de acidos nucleicos sesgadas en las que prevalece un determinado tamano de acido nucleico o un determinado intervalo por tamano de acido nucleico. La longitud de los acidos nucleicos que se eluyen y la longitud de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la matriz de intercambio anionico puede controlarse y, por tanto, variarse ajustando las condiciones de elucion. Por tanto, es posible ajustar el tamano, respectivamente el intervalo de tamano de los acidos nucleicos eluidos y unidos permitiendo de ese modo obtener acidos nucleicos de un tamano diana preseleccionado, respectivamente intervalo de tamano diana preseleccionado. Preferiblemente, la diferencia entre la longitud promedio de los acidos nucleicos eluidos de la fase solida con dicho segundo pH y la longitud promedio de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida es de al menos aproximadamente 50 nt, al menos aproximadamente 75 nt, al menos aproximadamente 100 nt, al menos aproximadamente 150 nt, al menos aproximadamente 200 nt, al menos aproximadamente 250 nt, al menos aproximadamente 300 nt, al menos aproximadamente 350 nt o al menos aproximadamente 400 nt. Segun una realizacion, la longitud promedio de los acidos nucleicos extracelulares eluidos de la fase solida en la primera etapa de elucion en el segundo valor de pH esta en el intervalo de desde hasta aproximadamente 700 nt, hasta aproximadamente 600 nt, desde aproximadamente 10 nt hasta aproximadamente 500 nt, de 10 nt a aproximadamente 400 nt, de 15 nt a aproximadamente 300 nt, preferiblemente desde aproximadamente 20 nt hasta aproximadamente 250 nt, desde 20 nt hasta 200 nt o desde aproximadamente 50 nt hasta aproximadamente 150 nt. Ademas, la longitud promedio de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida en esta primera etapa de elucion es de al menos aproximadamente 200 nt, preferiblemente de al menos aproximadamente 250 nt, de al menos aproximadamente 300 nt, de al menos aproximadamente 400 nt, de al menos aproximadamente 500 nt, de al menos aproximadamente 600 nt, de al menos aproximadamente 700 nt, de al menos aproximadamente 1000 nt o de al menos aproximadamente 1500 nt. En realizaciones preferidas, acidos nucleicos extracelulares que tienen una longitud de hasta aproximadamente 1000 nt, hasta aproximadamente 700 nt, hasta aproximadamente 600 nt, hasta aproximadamente 500 nt, preferiblemente hasta aproximadamente 400 nt, hasta aproximadamente 300 nt, hasta aproximadamente 250 nt o hasta aproximadamente 200 nt se eluyen preferiblemente de la fase solida en la primera etapa de elucion al segundo pH y/o acidos nucleicos que tienen una longitud de aproximadamente 200 nt o mas, 300 nt o mas, 350 nt o mas, 400 nt o mas, 500 nt o mas, preferiblemente de aproximadamente 700 nt o mas, aproximadamente 800 nt o mas o aproximadamente 1000 nt o mas predominantemente permanecen unidos a la fase solida en dicha primera etapa de elucion. Tal como se describio anteriormente, se indica la longitud de los acidos nucleicos. Por tanto, si el acido nucleico extracelular es una molecula bicatenaria (por ejemplo, ADN) las indicaciones anteriores con respecto a la longitud de nt se refiere a pb. El termino “eluido predominantemente” a este respecto en particular se refiere a una elucion de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% del grupo designado de moleculas de acido nucleico de la matriz de union a acido nucleico. Asimismo, el termino “permanece unido predominantemente” a este respecto en particular se refiere a una elucion de menos del 50%, preferiblemente menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10% o menos del 5% del grupo designado de moleculas de acido nucleico de la matriz de union a acido nucleico.

La elucion selectiva de los acidos nucleicos cortos puede lograrse en la etapa (d) ajustando la concentracion de cargas positivas sobre la superficie de la fase solida de modo que solo las moleculas de acido nucleico mas largas

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permanecen unidas a la matriz durante la etapa (d) mientras que los acidos nucleicos mas pequenos se eluyen. El valor de corte puede controlarse mediante la eleccion del valor de pH que se usa durante la elucion. El ajuste de las cargas positivas puede controlarse mediante el pH usado durante la etapa de elucion. En particular, se realiza la elucion mediante la adicion de una disolucion de elucion que comprende una sustancia tamponante que puede proporcionar el segundo pH durante la etapa de elucion. En realizaciones preferidas, se realiza la elucion en condiciones de bajo contenido en sal. En particular, la disolucion de elucion no comprende mas de 0,5 M de sal, no mas de 0,3 M de sal, preferiblemente no mas de 0,27 M de sal, mas preferiblemente no mas de 0,25 M de sal.

En realizaciones espedficamente preferidas, se usa una fase solida que comprende grupos de intercambio anionico que comprenden grupos dietilamino, preferiblemente grupos dietilaminopropilo. Tal como se muestra en los ejemplos, una fase solida que comprende grupos de intercambio anionico respectivos tiene ventajas significativas. En primer lugar, se logran tasas de recuperacion excelentes que tambien son superiores a otras superficies de intercambio anionico. En segundo lugar, pueden usarse condiciones de elucion suaves en particular para eluir acidos nucleicos pequenos, lo que es ventajoso para muchas aplicaciones posteriores de los acidos nucleicos extracelulares aislados. En tercer lugar, fases solidas respectivamente funcionalizadas son particularmente muy adecuadas para enriquecer acidos nucleicos extracelulares cortos realizando una elucion selectiva de tamano. Una fase solida que comprende grupos de intercambio anionico que comprenden grupos dietilamino, preferiblemente grupos dietilaminopropilo, permite ventajosamente regular el tamano de los acidos nucleicos eluidos variando el valor de pH y/o la concentracion de sal. Tal como se muestra mediante los ejemplos, los valores de corte pueden ajustarse en un intervalo estrecho, lo que da como resultado una elucion selectiva de tamano y fiable. Segun una realizacion, el segundo pH en la realizacion en la que se usa una fase solida que comprende grupos de intercambio anionico que comprenden grupos dietilamino, preferiblemente grupos dietilaminopropilo, esta en el intervalo de desde aproximadamente 7,5 hasta 10,5, preferiblemente desde aproximadamente 7,5 hasta 9,5, desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 9,0, preferiblemente de aproximadamente 8,0 - 8,5. En particular, puede usarse una disolucion de elucion que comprende una sustancia tamponante para ajustar dicho valor de pH y opcionalmente una sal tal como cloruro de sodio, preferiblemente en una concentracion de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 0,2 M, mas preferiblemente de aproximadamente 0,16 M. Ademas, tal como se muestra mediante los ejemplos, el tamano de los acidos nucleicos eluidos tambien puede variarse y, por tanto, controlarse mediante la cantidad de sal comprendida en la disolucion de elucion. Una mayor cantidad de sal da como resultado una elucion de acidos nucleicos mayores.

Realizar una elucion selectiva de tamano tiene varias ventajas. En primer lugar, es posible eluir selectivamente acidos nucleicos extracelulares, ya que los acidos nucleicos extracelulares tienen predominantemente un tamano pequeno tal como se describe en la introduccion. Por tanto, pueden usarse condiciones de elucion, en las que no se recuperan acidos nucleicos de alto peso molecular tales como, por ejemplo, ADN genomico u otros acidos nucleicos intracelulares mas largos, mediante un procedimiento de elucion selectiva de tamano respectivo. Esta es una ventaja importante, ya que reduce o incluso evita una contaminacion de los acidos nucleicos extracelulares aislados por cantidades residuales de acidos nucleicos intracelulares tales como ADN genomico que pueden estar presentes incluso en muestras reducidas en celulas o libres de celulas, porque los acidos nucleicos intracelulares pueden liberarse, por ejemplo, mediante desintegracion o celulas rotas, lo que puede suceder durante el almacenamiento y/o durante el proceso de reduccion de celulas. El metodo segun la presente invencion permite eliminar contaminaciones de acido nucleico intracelular respectivas tales como, por ejemplo, ADN genomico en los acidos nucleicos aislados cuando se ajusta la condicion de elucion tal como se describe en el presente documento de modo que, predominantemente, acidos nucleicos que tienen un tamano de 1.500 nt o menos, preferiblemente 1.000 nt o menos, se eluyen y, por tanto, se recuperan. La posibilidad de eliminar ADN genomico ajustando las condiciones de elucion es una ventaja importante puesto que esto permite saltar la etapa de ultracentrifugacion que se realiza habitualmente a 16.000 g para limpiar adicionalmente el plasma con el fin de retirar contaminaciones de ADN genomico respectivas que podnan estar aun asociadas con residuos celulares comprendidos. Esto ahorra tiempo y equipo. Ademas, tal como se muestra mediante los ejemplos, ajustando el valor de pH y/o la concentracion de sal del tampon de elucion es incluso posible fraccionar acidos nucleicos extracelulares que tienen un tamano de 1.000 nt o menos por tamano. De ese modo, puede determinarse que poblacion de acidos nucleicos extracelulares pequenos que tienen un tamano de 1000 nt o menos se eluye y, por ejemplo, es posible eluir predominantemente y, por tanto, recuperar acidos nucleicos que tienen un tamano de 500 nt o menos, 400 nt o menos, 300 nt o menos, 200 nt o menos o incluso 150 nt o menos. Ademas, tal como se describe en el presente documento, tambien puede realizarse una segunda etapa de elucion, si, por ejemplo, tambien acidos nucleicos mas largos deben ser de interes pero se supone que se eluyen y, por tanto, se recuperan como una fraccion separada. En esta segunda etapa de elucion, se usan condiciones que permiten eluir acidos nucleicos mas largos. En el presente documento se describen condiciones adecuadas. Por tanto, puesto que el metodo segun la presente invencion proporciona la posibilidad de controlar el tamano de los acidos nucleicos eluidos variando las condiciones de elucion, es muy flexible. En los ejemplos tambien se describen condiciones de elucion particularmente adecuadas para aislar acidos nucleicos pequenos que tienen un tamano de 1.000 nt o menos, 700 nt o menos, 600 nt o menos, 500 nt o menos, 400 nt o menos, 300 nt o menos, 200 nt o menos o incluso 100 nt o menos. En particular, usar una disolucion de elucion que comprende una sustancia tamponante tal como Tris a un valor de pH que se encuentra en un intervalo de 8 a 10,5 permite eluir selectivamente acidos nucleicos que tienen un tamano de 1.000 nt o menos, preferiblemente 700 nt o menos o incluso 500 nt o menos. Por ejemplo, usar una disolucion de elucion que comprende Tris como base libre y un pH de aproximadamente 10 a 10,5 permite eluir selectivamente acidos

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nucleicos que tienen un tamano de menos de 500 nt, e incluso menos de 300 nt. Ademas, usar una disolucion de elucion que comprende hidroxido alcalino, por ejemplo hidroxido de sodio o hidroxido de potasio, permite eluir selectivamente acidos nucleicos pequenos que tienen un tamano de menos de 500 nt, preferiblemente menos de 300 nt. Tal como se muestra mediante los ejemplos, el valor de corte que se logra depende de la cantidad de hidroxido alcalino usado. Cuanto mayor sea la concentracion de hidroxido alcalino en la disolucion de elucion, mayor es el tamano de los acidos nucleicos extracelulares eluidos. Por tanto, ajustando la concentracion de hidroxido es posible ajustar el tamano de los acidos nucleicos eluidos. Cuando se usa Tris en forma de un tampon, se prefiere usar un valor de pH que se encuentra en un intervalo de 8 a 9,5, preferiblemente de 8,5 a 9. Tal como se muestra mediante los ejemplos, usar una disolucion de elucion respectiva permite eluir selectivamente acidos nucleicos pequenos. Tambien puede influirse en el valor de corte incorporando una sal en la disolucion de elucion, preferiblemente una sal de metal alcalino tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio. Tal como se muestra mediante los ejemplos, ajustar la concentracion de la sal en el tampon de elucion tiene una fuerte influencia sobre el tamano de los acidos nucleicos que se eluyen. Cuanto mayor sea la concentracion de sal, mas largos son los acidos nucleicos extracelulares que se eluyen de la fase solida. Por tanto, tal como se describe en el presente documento, una elucion selectiva de tamano es posible ajustando el valor de pH, la concentracion de sal y/o la incorporacion de aditivos adicionales que influyen en la eficacia de elucion. En este caso, el experto puede proporcionar una disolucion de elucion que tiene un valor de corte deseado siguiendo las ensenanzas y orientacion proporcionadas en la presente solicitud y en particular los ejemplos.

Cuando se realiza una elucion selectiva de tamano, se prefiere que la fase solida porte grupos de intercambio anionico, que comprenden grupo protonables, y el valor de pKa de los grupos protonables esta en el intervalo de desde 8 hasta 12, mas preferiblemente desde 9 hasta 11. Los grupos de intercambio anionico pueden comprender atomos de nitrogeno, preferiblemente los grupos de intercambio anionico se derivan de aminas. En particular, los grupos de intercambio anionico son grupos amino terciario, preferiblemente grupos dialquilamino, mas preferiblemente grupos dietilamino y de manera especialmente preferible grupos dietilaminopropilo. Tal como se muestra en los ejemplos, las respectivas aminas terciarias muestran buenas tasas de recuperacion particulares y, ademas, permiten una elucion selectiva de tamano fiable con valores de corte bien definidos. Por tanto, se prefiere usar grupos amino terciario, preferiblemente grupos dialquilamino, mas preferiblemente grupos dietilamino y de manera especialmente preferible grupos dietilaminopropilo cuando se pretende realizar una seleccion por tamano, respectivamente fraccionamiento por tamano, durante la elucion. En determinadas realizaciones, el material de fase solida tiene una superficie que contiene silicio tal como una superficie de poli(acido silfcico) y los grupos de intercambio anionico se acoplan a dicha superficie usando un grupo silano, es decir por medio de silanizacion. Por ejemplo, la fase solida puede comprender una superficie que contiene silicio, preferiblemente una superficie de poli(acido silfcico) y puede derivatizarse con un compuesto de silano que comprende los grupos de intercambio anionico, preferiblemente con dietilaminopropiltrimetoxisilano. Preferiblemente, la superficie de la fase solida no se derivatiza con otro compuesto de silano. Segun la reivindicacion 1, se usan partfculas magneticas como fase solida.

Segun una realizacion, la etapa de elucion de fraccionamiento por tamano comprende las siguientes etapas:

aa) al menos una porcion de los acidos nucleicos extracelulares unidos a la fase solida se eluye de la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH, en la que la longitud promedio de los acidos nucleicos eluidos de la fase solida en esta etapa es mas corta que la longitud promedio de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida;

bb) opcionalmente eluir los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida en la etapa aa) de la fase solida. En este caso, puede usarse cualquier metodo de elucion.

Preferiblemente, la elucion se logra en la etapa bb) usando un tercer pH que es mayor que el segundo pH. El tercer pH puede elegirse preferiblemente de modo que esencialmente todos los acidos nucleicos que permanecieron unidos a la fase solida en la etapa aa) se eluyen de la misma en la etapa bb). El termino “esencialmente todos” a este respecto en particular se refiere a al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 98% de los acidos nucleicos unidos. El tercer pH es preferiblemente de al menos 0,1 unidades, al menos 0,2 unidades, al menos 0,3 unidades, al menos 0,5 unidades, al menos 0,75 unidades, al menos 1 unidad, al menos 1,25 unidades, al menos 1,5 unidades, al menos 1,75 unidades o al menos 2 unidades mayor que el segundo pH. Ademas, la diferencia entre el segundo pH y el tercer pH es preferiblemente de 3 unidades o menos, mas preferiblemente 2 unidades o menos, 1,5 unidades o menos, 1 unidad o menos, 0,7 unidades o menos o 0,5 unidades o menos. Se encontro que pequenas diferencias tales como, por ejemplo, una diferencia en 0,5 unidades de pH ya es suficiente para una elucion selectiva de tamano.

Segun una realizacion, la concentracion de sal y/o la temperatura durante la etapa de elucion (bb) segun una realizacion no difiere significativamente y en particular no es significativamente mayor que durante la elucion de la etapa (aa). Preferiblemente, la concentracion de sal no difiere en mas de 100 mM, mas preferiblemente no mas de 50 mM y lo mas preferiblemente no mas de 25 mM. Ademas, la temperatura usada para la elucion segun una realizacion no difiere en mas de 10°C, mas preferiblemente no mas de 5°C o no mas de 2,5°C. Ademas, preferiblemente tambien las otras condiciones de elucion excepto el valor de pH son preferiblemente similares en la primera y segunda etapa de elucion.

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Pueden realizarse etapas de procesamiento adicionales en el metodo segun la presente invencion antes de la etapa (a) y/o entre las etapas (a) y (b) y cualesquiera etapas posteriores (c) y (d), (si se realiza la respectiva etapa opcional (c)). Segun una realizacion, no se realiza etapa de digestion de la muestra antes de la etapa (a), en la que se usan reactivos que aumentan el volumen de la muestra (que es opcionalmente una muestra estabilizada) en mas del 15%. Preferiblemente, no se realiza etapa de digestion de la muestra antes de la etapa (a), en la que se usan reactivos que aumentan el volumen de la muestra en mas del 10%, mas preferido en mas del 5%, lo mas preferido no se usan reactivos para digerir la muestra que aumentan el volumen en mas del 2,5%. De ese modo se garantiza que la mezcla de union consiste predominantemente en el material de muestra que comprende los acidos nucleicos extracelulares (que se estabiliza opcionalmente) garantizando de ese modo un rendimiento maximo de los acidos nucleicos extracelulares tal como se explico anteriormente.

Dependiendo del tipo de muestra que va a procesarse, se encontro que los resultados de aislamiento pueden variar debido a variaciones en la composicion de la muestra. La homogeneidad de los resultados de aislamiento puede mejorarse pretratando la muestra (que es opcionalmente una muestra estabilizada) con medios apropiados. Por tanto, esta dentro del alcance de la presente invencion realizar una etapa de pretratamiento de la muestra antes de la etapa (a). Sin embargo, dicha etapa de pretratamiento no debe suponer una adicion considerable al volumen de la muestra y, por tanto, al volumen de la mezcla de union. Preferiblemente, la contribucion de los reactivos usados durante una respectiva etapa de pretratamiento de la muestra al volumen de la mezcla de union es menor del 5%, preferiblemente menor del 2,5%, mas preferiblemente menor del 2%, menor del 1,5% o menor del 1%, si se usan en cualquier caso reactivos que aumentan el volumen (vease anteriormente). Las etapas de pretratamiento adecuadas incluyen pero no se limitan a acciones mecanicas, qmmicas, ffsicas o enzimaticas sobre la muestra. Los ejemplos de etapas de pretratamiento incluyen pero no se limitan a moler la muestra en un molino de perlas, la aplicacion de ultrasonidos, calentamiento, congelacion y descongelacion, la adicion de detergentes y/o la adicion de compuestos de degradacion de protemas tales como, por ejemplo, enzimas de degradacion de protemas, por ejemplo, hidrolasas o proteasas. Segun una realizacion, se realiza una etapa de pretratamiento antes de la etapa a), en la que al menos un compuesto de degradacion de protemas, preferiblemente una enzima proteolftica, preferiblemente una proteasa tal como a proteinasa, y/o un detergente se anaden a la muestra antes de la etapa a).

Segun una realizacion, hasta la etapa c) no se usan sales caotropicas para procesar la muestra.

Una muestra biologica que comprende acidos nucleicos extracelulares tal como se da a conocer en el presente documento puede seleccionarse por ejemplo de sangre completa, plasma, suero, esputos, lfquido lagrimal, lfquido linfatico, orina, sudor, licor, lfquido cefalorraqrndeo, ascitis, leche, deposiciones, lavado bronquial, saliva, lfquido amniotico, secreciones nasales, secreciones vaginales, semen/lfquido seminal, excreciones y secreciones de heridas, y sobrenadantes de cultivos celulares y sobrenadantes obtenidos de otras muestras de hisopo. Un lfquido corporal o una muestra que se deriva de un lfquido corporal que comprende acidos nucleicos extracelulares, lo mas preferiblemente es sangre completa, plasma o suero. La muestra procesada segun la reivindicacion 1 es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo de un lfquido corporal retirando celulas mediante separacion. La muestra comprende acidos nucleicos extracelulares y el metodo segun la reivindicacion 1 afsla ADN extracelular.

Segun la reivindicacion 1, la muestra que comprende los acidos nucleicos extracelulares es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo de un lfquido corporal eliminando las celulas mediante separacion. Puede obtenerse una muestra libre de celulas o reducida en celulas respectiva usando tecnologfas apropiadas para eliminar celulas. Un ejemplo tfpico es plasma sangumeo o suero sangumeo que puede obtenerse de sangre completa. Las celulas se separan de la muestra restante con el fin de obtener una fraccion libre de celulas, respectivamente reducida en celulas de la muestra que comprende los acidos nucleicos extracelulares. Por tanto, las celulas se eliminan de la muestra que contiene celulas, que es un lfquido corporal, para proporcionar la muestra libre de celulas o reducida en celulas que comprende los acidos nucleicos extracelulares y a partir de la cual los acidos nucleicos extracelulares se afslan usando el metodo segun la reivindicacion 1. Muestras que pueden comprender meramente cantidades minoritarias de celulas residuales son por ejemplo plasma o suero. Con el fin de mejorar los resultados se prefiere que tambien se retiren las respectivas celulas restantes (o celulas potencialmente restantes) ya que podnan contaminar la poblacion de acidos nucleicos extracelulares durante el aislamiento. Dependiendo del tipo de muestra, las celulas, incluyendo celulas residuales, pueden separarse y retirarse, por ejemplo, mediante centrifugacion, preferiblemente centrifugacion a alta velocidad, o usando medios distintos de centrifugacion, tales como por ejemplo filtracion, sedimentacion o union a superficie sobre partmulas (opcionalmente magneticas) si ha de evitarse una etapa de centrifugacion. Tambien pueden incluirse facilmente respectivas etapas de eliminacion de celulas en un protocolo de preparacion de muestras automatizado. Tambien pueden procesarse adicionalmente las respectivas celulas eliminadas por ejemplo con el fin de analizar los acidos nucleicos intracelulares. Las celulas pueden, por ejemplo, almacenarse y/o biomoleculas tales como, por ejemplo, acidos nucleicos o protemas pueden aislarse de las celulas eliminadas.

Segun una realizacion, la muestra a partir de la cual se afslan los acidos nucleicos extracelulares tal como se define en reivindicacion 1 es una muestra estabilizada. Muchas muestras tales como muestras de sangre o muestras derivadas de sangre tales como plasma o suero se estabilizan tras la recogida usando estabilizadores apropiados. Por ejemplo, sangre o muestras derivadas de sangre tales como plasma o suero, se estabilizan habitualmente anadiendo al menos un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante tal como EDTA o citrato de sodio. La

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estabilizacion usada puede ayudar a conservar la poblacion de acidos nucleicos extracelulares en la muestra. Se conocen varios metodos en la tecnica anterior que logran una estabilizacion de la muestra incluyendo una estabilizacion de la poblacion de acidos nucleicos extracelulares comprendida en la muestra. La estabilizacion evita la degradacion de los acidos nucleicos extracelulares y/o evita la contaminacion de los acidos nucleicos extracelulares por acidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genomico que se libera de celulas que estan contenidas en la muestra. Un metodo de estabilizacion comun emplea el uso de formaldehndo para estabilizar las membranas celulares, reduciendo de ese modo la lisis celular y, ademas, el formaldetndo inhibe las nucleasas. Se describen metodos respectivos, por ejemplo, en los documentos US 7.332.277 y US 7.442.506. Se describen metodos alternativos para estabilizar muestras de sangre, por ejemplo, en los documentos US 2010/0184069 y US 2010/0209930. Un metodo preferido para estabilizar una muestra se da a conocer en la solicitud de patente europea EP11182819.0, presentada el 26 de septiembre de 2011 y la solicitud de patente estadounidense 61/539.245 presentada el 26 de septiembre de 2011, y en la correspondiente solicitud PCT que reivindica las prioridades de las solicitudes EP y US mencionadas anteriormente.

Segun una realizacion, la muestra es una muestra estabilizada que se estabilizo poniendo en contacto la muestra con

a) al menos un inhibidor de la apoptosis,

b) al menos un agente hipertonico, que estabiliza las celulas comprendidas en la muestra, y/o

c) al menos un compuesto segun la formula 1

R4

imagen1

R2

formula 1

en la que R1 es un residuo de hidrogeno o un residuo de alquilo, preferiblemente un residuo de alquilo C1-C5, mas preferido un residuo de metilo, R2 y R3 son residuos de hidrocarburo identicos o diferentes con una longitud de la cadena de carbono de 1 - 20 atomos dispuestos de manera lineal o ramificada, y R4 es un residuo de oxfgeno, azufre o selenio.

El termino “inhibidor de la apoptosis” tal como se usa en el presente documento en particular se refiere a un compuesto cuya presencia en una muestra biologica que contiene celulas proporciona una reduccion, prevencion y/o inhibicion de procesos apoptoticos en las celulas y/o hace que las celulas sean mas resistentes a estfmulos apoptoticos. Preferiblemente, el al menos un inhibidor de la apoptosis que se usa para estabilizar la muestra se selecciona del grupo que consiste en inhibidores metabolicos, inhibidores de caspasa e inhibidores de calpama. Preferiblemente, el inhibidor de apoptosis es permeable a las celulas. Preferiblemente, el inhibidor de apoptosis es un inhibidor de caspasa que tiene una o mas de las siguientes caractensticas: a) es un inhibidor de pancaspasa y, por tanto, es un inhibidor de caspasa de amplio espectro; b) comprende un peptido espedfico de caspasa modificado, en el que, preferiblemente, dicho peptido espedfico de caspasa se modifica mediante un compuesto de aldehndo, nitrilo o cetona; c) comprende un peptido espedfico de caspasa modificado que se modifica preferiblemente en el extremo carboxilo terminal con un grupo O-fenoxilo o una fluorometil cetona (FMK); y/o d) se selecciona del grupo que consiste en Q-VD-OPh y Z-VAD(OMe)-FMK. Los intervalos de concentracion adecuados para el/los inhibidor(es) de la apoptosis en la muestra estabilizada incluyen pero no se limitan a de 0,01 |iM a 100 |iM, de 0,05 |iM a 100 |iM, de 0,1 |iM a 50 |iM, de 0,5 |iM a 50 |iM, de 1 |iM a 40 |iM, mas preferiblemente de 1 |iM a 30 |iM o de 2,5 |iM a 25 |iM. Segun una realizacion, se usa un inhibidor de caspasa en combinacion con un anticoagulante con el fin de estabilizar una muestra de sangre.

El al menos un agente hipertonico que puede estar comprendido en la muestra estabilizada se usa preferiblemente en combinacion con el inhibidor de la apoptosis, que es preferiblemente un inhibidor de caspasa. El agente hipertonico induce contraccion celular mediante efectos hipertonicos leves (osmosis), aumentando de ese modo la estabilidad celular. El agente hipertonico presente en la muestra estabilizada en particular estabiliza celulas contenidas en la muestra, reduciendo de ese modo la cantidad de acidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genomico que puede liberarse de celulas danadas. De ese modo, la poblacion de acidos nucleicos extracelulares se conserva sustancialmente y el riesgo de contaminar diluyendo respectivamente los acidos nucleicos extracelulares con acidos nucleicos intracelulares, en particular ADN genomico, se reduce. Preferiblemente, el agente hipertonico tiene una o mas de las siguientes caractensticas:

a) no esta cargado;

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b) es un compuesto organico hidroxilado y, por consiguiente, porta al menos uno, preferiblemente al menos dos grupos hidroxilo;

c) es un poliol, que comprende preferiblemente de 2 a 10 grupos hidroxilo, preferiblemente de 3 a 8 grupos hidroxilo;

d) es un compuesto de hidrocarbonilo y, por tanto, un compuesto que presenta uno o mas grupos hidroxilo (OH) y uno o mas grupos carbonilo;

e) se selecciona del grupo de compuestos de cetona hidroxilados, hidratos de carbono o compuestos derivados de los mismos;

f) se selecciona del grupo que consiste en polialcoholes, alcoholes de azucar, hidratos de carbono, glucosa, rafinosa, sacarosa, fructosa, alfa-d-lactosa monohidratada, dihidroxiacetona, alcoholes, glicerol, eritritol, manitol, sorbitol, volemitol;

g) es soluble en agua y no toxico para las celulas; y/o

h) no induce ni soporta la lisis de las celulas contenidas en la muestra biologica y, por consiguiente, preferiblemente no actua como detergente o como agente de disolucion de membranas celulares.

La muestra estabilizada puede comprender el al menos un agente hipertonico o mezcla de agentes hipertonicos en un intervalo de concentracion seleccionado de 0,05 M a 2 M, de 0,1 M a 1,5 M, de 0,15 M a 0,8 M, de 0,2 M a 0,7 M o de 0,1 M a 0,6 M. Las respectivas concentraciones son particularmente adecuadas cuando se usa un compuesto organico hidroxilado, por ejemplo un hidrato de carbono tal como dihidroxiacetona como agente hipertonico para la estabilizacion.

Tal como se comento anteriormente, la muestra estabilizada puede comprender un compuesto segun la formula 1 que es eficaz para lograr un efecto de estabilizacion notable y para conservar sustancialmente la composicion de la poblacion de acidos nucleicos extracelulares en la muestra estabilizada. Ademas, puede usarse una mezcla de uno o mas compuestos segun la formula 1 para la estabilizacion. Dicho compuesto tambien puede usarse en combinacion con el inhibidor de la apoptosis y/o el agente hipertonico descrito anteriormente. Los residuos de hidrocarburo R2 y/o R3 pueden seleccionarse independientemente entre sf del grupo que comprende alquilo, incluyendo alquilo de cadena corta y alquilo de cadena larga, alquenilo, alcoxilo, alcoxilo de cadena larga, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, alquilsililo, alquilsililoxilo, alquileno, alquendiilo, arileno, carboxilatos y carbonilo. La longitud de cadena n de R2 y/o R3 puede tener en particular los valores 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20. Preferiblemente R2 y R3 tienen una longitud de la cadena de carbono de 1-10. Preferiblemente, R2 y R3 tienen una longitud de la cadena de carbono de 1 -5. Particularmente preferida es una longitud de cadena de 1 o 2 para R2 y R3. La longitud de cadena n de R1 tiene preferiblemente el valor 1, 2 ,3 ,4 o 5. Particularmente

preferida es una longitud de cadena de 1 o 2 para R1. r4 es preferiblemente oxfgeno. Segun una realizacion

preferida, el compuesto segun la formula 1 es una amida de acido N,N-dialquilcarboxflico. Segun una realizacion, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N,N-dimetilacetamida; N,N-dietilacetamida; N,N-

dimetilformamida y N,N-dietilformamida. Preferiblemente, la sustancia segun la formula 1 es N,N-dimetlilacetamida (DMAA). La muestra estabilizada puede comprender dicho compuesto segun la formula 1 o mezcla de compuestos respectivos en un intervalo de concentracion del 0,1% hasta el 50%. Los intervalos de concentracion preferidos pueden seleccionarse del grupo que consiste en del 0,1% al 30%, del 1% al 20%, del 1,25% al 15%, del 1,5% al 10%, del 1,5% al 7,5% y del 1,5% al 5%. Las concentraciones respectivas son particularmente adecuadas cuando se usa una amida de acido N,N-dialquil-carboxflico, por ejemplo N,N-dimetilacetamida, N,N-dietilacetamida, N,N- dietilformamida o N,N-diemetilformamida como agente estabilizante. Ademas, puede usarse N,N-

dimetilpropanamida.

Tambien puede usarse un anticoagulante, preferiblemente un agente quelante ademas de los estabilizadores mencionados anteriormente.

El termino “muestra” tal como se da a conocer en el presente documento se refiere preferiblemente a una muestra natural, por ejemplo tal como se obtiene de un ser humano o animal, que, sin embargo, puede haberse estabilizado opcionalmente mediante agentes apropiados. Tambien se abarcan muestras estabilizadas mediante el termino “muestra” y tambien mediante el termino “muestra natural” tal como se da a conocer en el presente documento. Ademas, las celulas pueden haberse eliminado de la muestra original. Tambien estan abarcadas las respectivas muestras celulas reducidas en celulas o libres de celulas mediante el termino “muestra” y tambien mediante el termino “muestra natural” tal como se da a conocer en el presente documento. Ejemplos tfpicos de muestras naturales respectivas son lfquidos corporales tales como sangre y muestras derivadas de un lfquido corporal, en particular muestras que se derivan de un lfquido corporal eliminando celulas del lfquido corporal. La muestra procesada segun la reivindicacion 1 es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo de un ifquido corporal eliminando celulas mediante separacion. Se obtiene sangre del ser humano o animal y habitualmente se estabiliza inmediatamente, por ejemplo, en EDTA u otras composiciones de estabilizacion adecuadas (vease anteriormente). Ademas, se eliminan celulas de la muestra de sangre para obtener plasma sangumeo y/o suero sangumeo. Muestras respectivas que se han estabilizado opcionalmente y de las que se han eliminado celulas tambien estan abarcadas por el termino “muestra” asf como por el termino “muestra natural” tal

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como se da a conocer en el presente documento. Tambien se describen anteriormente muestras adecuadas. El termino “muestra natural” tal como se da a conocer en el presente documento preferiblemente no se refiere a y, por tanto, no incluye muestras procesadas a las que se han anadido reactivos de union, reactivos de lisis o sales caotropicas que aumentan el volumen de la muestra natural en mas del 10%, mas del 5%, mas del 2,5%, mas del 2% o mas del 1%. Segun una realizacion, no se anadieron reactivos respectivos. Tal como se comento anteriormente, la muestra natural tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender agentes estabilizantes. Para evitar dudas, los respectivos agentes estabilizantes y/o composiciones estabilizantes que se anadieron cuando se obtiene el lfquido corporal no estan abarcados en la determinacion de la contribucion de volumen de reactivos que se anadieron para procesar la muestra. Esto en particular se aplica si dichos agentes estabilizantes no inducen y/o promueven lisis celular. Si se usan agentes estabilizantes que inducen y/o promueven lisis, segun una realizacion, estan abarcados en la determinacion de la contribucion de volumen de reactivos que se anadieron para procesar la muestra. Sin embargo, habitualmente no se usan los respectivos agentes como estabilizadores para estabilizar acidos nucleicos libres de celulas, porque si inducen lisis de las celulas, no estabilizan la poblacion de acidos nucleicos extracelulares sino que promueven su contaminacion con acidos nucleicos intracelulares.

La fase solida que se usa en el metodo segun la presente invencion porta grupos de intercambio anionico. Los grupos de intercambio anionico comprenden preferiblemente al menos un grupo protonable. Puede usarse cualquier fase solida adecuada para cromatograffa de intercambio anionico, incluyendo pero sin limitarse a materiales que contienen silicio tales como materiales de sflice y poli(acido silfcico), borosilicatos, silicatos, vidrios anorganicos, polfmeros organicos tales como poli(met)acrilatos, poliuretanos, poliestireno, agarosa, polisacaridos tales como celulosa, oxidos de metal tales como oxido de aluminio, oxido de magnesio, oxido de titanio y oxido de zirconio, metales tales como oro o platino, sephadex, sepharose, poliacrilamida, polfmeros de divinilbenceno, polfmeros de estireno-divinilbenceno, dextranos, y derivados de los mismos; superficies de vidrio o sflice. La fase solida esta hecha preferiblemente de o contiene material mineral o polimerico tal como sflice, vidrio, cuarzo, polietileno, polipropileno, poli(fluoruro de vinildeno), poliacrilonitrilo, poli(cloruro de vinilo), poliacrilato, metacrilato o metacrilato de metilo. Preferiblemente, al menos la superficie que porta los grupos de intercambio anionico esta compuesta por uno de estos materiales o una mezcla de los mismos, preferiblemente materiales de sflice y/o vidrio.

Como fase solida, se usan partfculas magneticas que comprenden material magnetico. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a partfculas magneticas (por ejemplo, paramagneticas, superparamagneticas, ferromagneticas o ferrimagneticas), incluyendo pero sin limitarse a poliestireno, agarosa, poliacrilamida, dextrano, y/o materiales de sflice y poli(acido silfcico) que tienen un material magnetico incorporado en los mismos o asociado con los mismos. El material magnetico puede ser ferrimagnetico, ferromagnetico, paramagnetico o superparamagnetico y preferiblemente es superparamagnetico o ferromagnetico. Preferiblemente el material magnetico esta completamente encapsulado, por ejemplo, por el material de sflice, poli(acido silfcico), vidrio o polimerico. En determinadas realizaciones preferidas, la matriz de union a acido nucleico es una partfcula que contiene silicio, preferiblemente una partfcula de poli(acido silfcico), preferiblemente una partfcula magnetica de poli(acido silfcico) que porta grupos de intercambio anionico. Como se usan partfculas magneticas, la separacion puede lograrse mediante la ayuda de un iman. Segun una realizacion, la matriz de union a acido nucleico que porta el acido nucleico se une magneticamente a la parte inferior o a una pared del recipiente de reaccion que contiene la mezcla de reaccion y entonces se retira la mezcla de reaccion restante del recipiente de reaccion, por ejemplo mediante succion o decantacion, o las partfculas magneticas se retiran del recipiente de reaccion metiendo un iman en el recipiente de reaccion y retirando las partfculas magneticas de la muestra restante.

Para funcionalizar una superficie con grupos de intercambio anionico, son factibles varios metodos. Los grupos de intercambio anionico pueden unirse directamente a la superficie, o bien de manera covalente o bien no covalente, electroestaticamente y/o pueden formar parte de un polfmero u otra composicion que forma un recubrimiento de superficie o que se proporciona en la superficie de la fase solida. Los grupos de intercambio anionico tambien pueden precipitarse en la fase solida. Segun una realizacion, los grupos de intercambio anionico se aplican en forma de un recubrimiento sobre la fase solida.

Los grupos de intercambio anionico se unen preferiblemente a la superficie de un material de fase solida tal como se describio anteriormente, en particular mediante acoplamiento covalente. Por tanto, la fase solida puede funcionalizarse para la union de los grupos de intercambio anionico, por ejemplo con funcionalidades tales como Si- O-Si, Si-OH, alcohol, diol o poliol, carboxilato, amina, fosfato o fosfonato. Los grupos de intercambio anionico pueden unirse a la fase solida, por ejemplo, usando epoxidos, acidos carboxflicos (activados), silanos, anfudridos de acido, cloruros de acido, grupos formilo, grupos tresilo o grupos pentafluorofenilo. Los grupos funcionales pueden unirse directamente a la fase solida o por medio de grupos espaciadores (lineales o ramificados), por ejemplo hidrocarburos tales como grupos -(CH2V, hidratos de carbono, polietilenglicoles y polipropilenglicoles. Alternativamente, tambien puede usarse un polfmero compuesto por monomeros que comprenden el grupo de intercambio anionico tal como un grupo amino funcional como material de intercambio anionico. En determinadas realizaciones, el material de fase solida tiene una superficie que contiene silicio tal como una superficie de poli(acido silfcico) y los grupos de intercambio anionico se acoplan a dicha superficie usando un grupo silano.

Los materiales de intercambio anionico que pueden usarse en el contexto de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, materiales modificados con grupos de intercambio anionico. Ejemplos de tales grupos de intercambio

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anionico son monoaminas, diaminas, poliaminas y grupos heterodclicos alifaticos o aromaticos que contienen nitrogeno. Preferiblemente, el grupo de intercambio anionico comprende al menos un grupo amino primario, secundario o terciario. En realizaciones preferidas, el grupo de intercambio anionico comprende un grupo seleccionado del grupo que consiste en aminas primarias, secundarias y terciarias de formula

R3N, R2NH, RNH2 y/o X-(CH2)n-Y

en la que

X es R2N, RNH o NH2,

Y es R2N, RNH o NH2,

R es independientemente entre sf un sustituyente alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo lineal, ramificado o dclico que puede comprender uno o mas heteroatomos, preferiblemente seleccionados de O, N, S y P, y

n es un numero entero en el intervalo de desde 0 hasta 20, preferiblemente de 0 a 18.

Por tanto, los grupos de intercambio anionico pueden tener un grupo protonable y opcionalmente pueden tener mas de un grupo protonable que puede ser el mismo o diferente entre st Un grupo protonable es preferiblemente un grupo qrnmico que es neutro o no esta cargado a un valor de pH alto y esta protonado a un valor de pH bajo, teniendo de ese modo una carga positiva. En particular, el grupo protonable esta cargado positivamente al primer pH en los metodos segun la presente invencion en los que se produce la union del acido nucleico a la fase solida. Preferiblemente, el valor de pKa del grupo protonable (protonado) esta en el intervalo de desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 13, mas preferiblemente desde aproximadamente 8,5 hasta aproximadamente 12 o desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11.

Por tanto, ejemplos de grupos de intercambio anionico adecuados son en particular grupos amino tales como grupos amino primario, secundario y terciario asf como aminas dclicas, aminas aromaticas y aminas heterodclicas, preferiblemente grupos amino terciario. Los grupos amino portan preferiblemente sustituyentes alquilo, alquenilo, alquinilo y/o aromaticos, incluyendo sustituyentes dclicos y sustituyentes que junto con el atomo de nitrogeno forman un anillo heterodclico o heteroaromatico. Los sustituyentes comprenden preferiblemente de 1 a 20 atomos de carbono, mas preferiblemente de 1 a 12, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o 1 o 2 atomos de carbono. Pueden ser lineales o ramificados y pueden comprender heteroatomos tales como atomos de oxfgeno, nitrogeno, azufre, silicio y halogeno (por ejemplo fluor, cloro, bromo). Preferiblemente, los sustituyentes comprenden no mas de 4, mas preferiblemente no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 heteroatomo.

En una realizacion el grupo de intercambio anionico porta preferiblemente de 1 a 10 grupos amino. Mas preferiblemente los grupos de intercambio anionico portan de 2 a 8, y particularmente el grupo de intercambio anionico porta de 2 a 6 grupos amino.

Ejemplos particulares de funciones amina son aminas primarias tales como aminometilo (AM), aminoetilo (AE), aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo tal como dietilaminoetilo (DEAE), etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetraamina, tetraetilenpentaamina, pentaetilenhexaamina, trimetilamino (TMA), trietilaminoetilo (TEAE), polietilenimina lineal o ramificada (PEI), polietilenimina carboxilada o hidroxialquilada, jeffamine, espermina, espermidina, 3-(propilamino)propilamina, dendnmeros de poliamidoamina (PAMAM), polialilamina, polivinilamina, N-morfolinoetilo, polilisina y tetraazacicloalcanos. Grupos protonables preferidos unidos a los ligandos de union a acido nucleico son grupos dialquilamino, especialmente grupos dietilamino. Tal como se muestra mediante los ejemplos, estos grupos son favorables con respecto a su eficacia de union y sus ventajas cuando se realiza una elucion selectiva de tamano.

El grupo de intercambio anionico se une preferiblemente a la fase solida por medio de un grupo de union. Por tanto, el grupo de intercambio anionico en particular comprende un grupo protonable unido a un grupo de union. El grupo de union es preferiblemente un grupo alquileno, alquenileno o alquinileno lineal, ramificado o dclico que comprende preferiblemente de 1 a 20 atomos de carbono, mas preferiblemente de 1 a 12, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o 1 o 2 atomos de carbono. Puede comprender ademas heteroatomos tales como atomos de oxfgeno, nitrogeno, azufre, silicio y halogeno (por ejemplo fluor, cloro, bromo), preferiblemente no mas de 4, mas preferiblemente no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 heteroatomo. En realizaciones preferidas, el grupo de union es un grupo alquileno, en particular un grupo propileno.

En determinadas realizaciones, la fase solida comprende ademas ligandos inertes. Preferiblemente, los ligandos inertes no estan implicados significativamente en la union a acido nucleico y/o no se unen fuertemente a acidos nucleicos. En particular, los ligandos inertes son neutros o no estan cargados y preferiblemente son hidrofilos. Los ligandos inertes pueden unirse a la matriz de union a acido nucleico tal como se describe en el presente documento para los ligandos de union a acido nucleico. Preferiblemente, los ligandos inertes son restos organicos, en particular restos alquilo, alquenilo, alquinilo o aromaticos que pueden ser lineales, ramificados o dclicos y que comprenden preferiblemente al menos un heteroatomo tal como atomos de oxfgeno, nitrogeno, azufre, silicio y halogeno (por ejemplo fluor, cloro, bromo). El ligando inerte comprende preferiblemente de 1 a 20 atomos de carbono, mas

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preferiblemente de 1 a 12, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o 1 o 2 atomos de carbono, y hasta 4, mas preferiblemente hasta 3, hasta 2 o hasta 1 heteroatomo. Se prefieren particularmente ligandos inertes que comprenden al menos un grupo hidroxilo, en particular al menos 2 grupos hidroxilo, tales como ligandos que comprenden un grupo 2,3-dihidroxipropilo. Un ejemplo espedfico de los ligandos inertes es un grupo (2,3- dihidroxipropil)oxipropilo.

Los ligandos inertes pueden usarse para reducir la cantidad de grupos de intercambio anionico de union a acido nucleico que se uniran a la fase solida durante el acoplamiento de los grupos de intercambio anionico. Por tanto, la densidad de los grupos de intercambio anionico sobre la superficie de la fase solida puede controlarse y ajustarse a la posterior aplicacion de la fase solida. En particular, la fase solida puede comprender grupos de intercambio anionico y ligandos inertes en una razon en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:10, preferiblemente desde aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 1:5, mas preferiblemente de aproximadamente 1:3. Usar una fase solida tal como partfculas magneticas que comprenden adicionalmente ligandos inertes tal como se describio, tiene la ventaja de que pueden usarse condiciones de elucion muy suaves, lo que es ventajoso para muchas aplicaciones posteriores.

En otra realizacion, la fase solida no comprende tales ligandos inertes. Preferiblemente, la fase solida solo comprende los grupos de intercambio anionico y no comprende ningun otro ligando. Segun una realizacion, la fase solida comprende una superficie que contiene silicio, preferiblemente una superficie de poli(acido silfcico) y se derivatiza con un compuesto de silano que comprende los grupos de intercambio anionico y no se derivatiza con otro compuesto de silano.

Se describen ejemplos de fases solidas de union a acidos nucleicos, grupos de intercambio anionico, grupo protonables y ligandos inertes adecuados en los documentos WO 2010/072834 A1, DE10 2008 063 001A1, WO002010072821 A1 y DE 10 2008 063 003.

Pueden aislarse acidos nucleicos totales de la muestra y los acidos nucleicos extracelulares estan comprendidos como una porcion en la misma. Puesto que la muestra es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo de un lfquido corporal eliminado celulas mediante separacion, los acidos nucleicos totales aislados de la misma comprenderan predominantemente o incluso consistiran en acidos nucleicos extracelulares.

Tambien es posible aislar al menos predominantemente un acido nucleico diana espedfico. Un acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un determinado tipo de acido nucleico, por ejemplo ARN o ADN, incluyendo ARNm, microARN, otros acidos nucleicos no codificantes, acidos nucleicos modificados epigeneticamente, y otros acidos nucleicos que estan contenidos en la poblacion de acidos nucleicos extracelulares. Segun la reivindicacion 1, se afsla ADN extracelular. Tambien esta dentro del alcance de la presente invencion, por ejemplo, digerir el acido nucleico no diana usando nucleasas tras el aislamiento. El termino acido nucleico diana tambien puede referirse a un tipo espedfico de acido nucleico, por ejemplo un acido nucleico extracelular que se sabe que es un marcador de enfermedad determinado o un acido nucleico viral. Tal como se comento anteriormente, el aislamiento de acidos nucleicos extracelulares tambien puede comprender el aislamiento espedfico de un respectivo acido nucleico diana por ejemplo usando sondas de captura apropiadas. El termino “un acido nucleico diana” tambien se refiere a un acido nucleico que tiene una determinada longitud, por ejemplo un acido nucleico que tiene una longitud de 2000 nt o menos, 1000 nt o menos o 500 nt o menos (tal como se comento anteriormente, la longitud de cadena indicada por “nt” se refiere a pb en caso de ADN bicatenario). Aislar respectivos acidos nucleicos diana mas pequenos puede ser ventajoso porque se sabe que los acidos nucleicos extracelulares habitualmente tienen un tamano mas pequeno de menos de 2000 nt, habitualmente menos de 1000 nt y a menudo incluso menos de 500 nt. Centrandose en el aislamiento, respectivamente la purificacion, en los respectivos acidos nucleicos pequenos puede aumentar la porcion de acidos nucleicos extracelulares obtenida en los acidos nucleicos aislados. Medios adecuados tales como una elucion selectiva se dieron a conocer anteriormente.

Los acidos nucleicos aislados pueden analizarse directamente y/o procesarse adicionalmente usando metodos de ensayo y/o analtticos adecuados. Si se pretende un respectivo uso directo, se prefiere que una o mas de las etapas de lavado descritas anteriormente se realice en el metodo segun la presente invencion en particular si se usan ensayos posteriores que son sensibles a impurezas.

Los acidos nucleicos extracelulares aislados y/o un acido nucleico extracelular diana espedfico comprendidos o que se sospecha que estan comprendidos en los mismos pueden identificarse, cuantificarse, modificarse, ponerse en contacto con al menos una enzima, amplificarse, transcribirse de manera inversa, clonarse, secuenciarse, ponerse en contacto con una sonda y/o detectarse. En la tecnica anterior se conocen bien metodos respectivos y se aplican comunmente en el campo medico, de diagnostico y/o pronostico con el fin de analizar acidos nucleicos extracelulares (vease tambien la descripcion detallada en los antecedentes de la presente invencion). Por tanto, despues de que se aislaran acidos nucleicos extracelulares, opcionalmente como parte de ADN total y/o de acido nucleico total (vease anteriormente), pueden analizarse para identificar la presencia, ausencia o gravedad de un estado patologico incluyendo pero sin limitarse a una multitud de enfermedades neoplasicas, en particular tumores premalignos y tumores malignos tales como diferentes formas de canceres. Por ejemplo los acidos nucleicos extracelulares aislados pueden analizarse con el fin de detectar marcadores de diagnostico y/o pronostico (por ejemplo, acidos nucleicos extracelulares derivados de feto o tumor) en muchos campos de aplicacion, incluyendo

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pero sin limitarse a pruebas geneticas prenatales no invasivas respectivamente cribado, cribado de enfermedades, oncolog^a, cribado de cancer, cribado de cancer en estadio temprano, monitorizacion de terapia contra el cancer, pruebas geneticas (genotipado), pruebas de enfermedades infecciosas, pruebas de patogenos, diagnostico de lesion, diagnostico de traumatismo, medicina de trasplantes o muchas otras enfermedades y, por tanto, son de relevancia para el diagnostico y/o pronostico. Los acidos nucleicos extracelulares aislados pueden aislarse para identificar y/o caracterizar una infeccion patologica o una caractenstica fetal. Por tanto, tal como se comento anteriormente, el metodo de aislamiento descrito en el presente documento puede comprender ademas una etapa de analisis y/o procesamiento de acidos nucleicos. El analisis/procesamiento adicional de los acidos nucleicos puede realizarse usando cualquier metodo de analisis/procesamiento de acidos nucleicos incluyendo, pero sin limitarse a tecnologfas de amplificacion, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion isotermica, reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR), PCR digital, electroforesis en gel, electroforesis capilar, espectrometna de masas, deteccion de fluorescencia, espectrometna ultravioleta, ensayos de hibridacion, secuenciacion de ADN, analisis de restriccion, transcripcion inversa, NASBA, reaccion en cadena de la polimerasa espedfica de alelos, ensamblaje de ciclado de la polimerasa (PCA), reaccion en cadena de la polimerasa asimetrica, lineal despues de la reaccion en cadena de la polimerasa exponencial (LATE-PCR), amplificacion dependiente de helicasa (HDA), reaccion en cadena de la polimerasa de inicio en caliente, reaccion en cadena de la polimerasa espedfica de secuencias internas (ISSR), reaccion en cadena de la polimerasa inversa, reaccion en cadena de la polimerasa mediada por ligasa, reaccion en cadena de la polimerasa espedfica de metilacion (MSP), reaccion en cadena de la polimerasa multiplex, reaccion en cadena de la polimerasa anidada, reaccion en cadena de la polimerasa en fase solida, o cualquier combinacion de las mismas. El experto conoce bien las respectivas tecnologfas y, por tanto, no se requiere descripcion adicional en este caso.

Los acidos nucleicos extracelulares aislados pueden analizarse para identificar, detectar, cribar, monitorizar o excluir una enfermedad, una infeccion y/o al menos una caractenstica fetal.

Ademas, tal como se comento anteriormente, el metodo de aislamiento segun la presente invencion tambien puede usarse como protocolo de pretratamiento con el fin de concentrar los acidos nucleicos extracelulares de una muestra para un posterior protocolo de purificacion de acidos nucleicos. Esta realizacion tiene la ventaja de que los acidos nucleicos extracelulares pueden concentrarse a partir de un volumen de muestra grande hasta un volumen de muestra pequeno. Basicamente, puede usarse cualquier protocolo de purificacion de acidos nucleicos convencional posterior al metodo segun la presente invencion para purificar adicionalmente los acidos nucleicos extracelulares que se concentraron usando el metodo segun la presente invencion. Los ejemplos para los respectivos metodos de purificacion incluyen pero no se limitan a extraccion, extraccion en fase solida, purificacion basada en poli(acido silfcico), purificacion basada en partfculas magneticas, extraccion con fenol-cloroformo, cromatograffa de intercambio anionico (usando superficies de intercambio anionico), electroforesis, precipitacion y combinaciones de los mismos. Tambien esta dentro del alcance de la presente invencion aislar espedficamente acidos nucleicos extracelulares diana espedficos de la poblacion de acidos nucleicos extracelulares enriquecidos, por ejemplo usando sondas apropiadas que permiten una union espedfica de secuencia y se acoplan a un soporte solido. Ademas, puede usarse cualquier otra tecnica de aislamiento de acidos nucleicos conocida por el experto. Segun una realizacion, los acidos nucleicos se afslan y por tanto se purifican adicionalmente de los acidos nucleicos extracelulares enriquecidos usando al menos un agente caotropico y/o al menos un alcohol. Preferiblemente, los acidos nucleicos se afslan uniendolos a una fase solida, preferiblemente una fase solida que comprende silicio, preferiblemente poli(acido silfcico). Metodos y kits adecuados tambien estan disponibles comercialmente tal como el kit de acido nucleico circulante QIAamp® (QIAGEN), el kit de vado o centrifugacion de virus QIAamp MinElute (QIAGEN), el kit de NA circulante Chemagic (Chemagen), el kit NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel), el kit de purificacion de ADN circulante en plasma/suero (Norgen Biotek), el kit de purificacion de ARN circulante en plasma/suero (Norgen Biotek), el kit de gran volumen de acidos nucleicos virales de alta pureza (Roche) y otros kits comercialmente disponibles adecuados para purificar acidos nucleicos circulantes. En este caso, tambien estan disponibles protocolos automatizados tales como aquellos que se ejecutan en el sistema QIAsymphony, los instrumentos EZ1, el sistema QIAcube (QIAGEN) o MagNApure (Roche), sistemas de prep. de muestra m2000 (Abbott), sistemas EasyMag (bioMerieux). Ademas, puede usarse cualquier otro sistema de prep. de muestra de manipulacion de lfquidos automatizado disponible comercialmente adecuado para aislar acidos nucleicos a partir de muestra biologicas libres de celulas. Si se realiza una respectiva etapa de purificacion adicional posterior al metodo de aislamiento segun la presente invencion, no es necesario realizar las etapas de lavado descritas anteriormente.

El enriquecimiento de los acidos nucleicos extracelulares a partir de un gran volumen (por ejemplo 5 ml o mas) de material de partida permite la posterior purificacion de acidos nucleicos usando metodos de extraccion de acidos nucleicos comercialmente disponibles convencionales. En particular, realizar una etapa de enriquecimiento inicial mediante union reversible de los acidos nucleicos extracelulares a una fase solida que porta grupos de intercambio anionico permite purificar estos acidos nucleicos usando sistemas automatizados actualmente disponibles, que normalmente limitan el volumen de entrada de muestra original a 1 ml o menos debido al aumento del volumen que se produce mediante la adicion de reactivos adicionales que se anaden para lisar la muestra y/o para establecer las condiciones de union.

El protocolo de aislamiento segun la presente invencion, tal como se ilustra en la seccion de ejemplos mas adelante, puede realizarse manualmente pero tambien se sometio a prueba en sistemas roboticos tales como QIAsymphony SP, un robot de extraccion de acidos nucleicos comercialmente disponible que puede realizar una ejecucion

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completamente automatizada de protocolos de enriquecimiento y purificacion de acidos nucleicos. Dado que solo pequenos volumenes de una qmmica simple han de anadirse segun la presente invencion, casi 3 ml de muestra pueden procesarse automaticamente y los acidos nucleicos pueden extraerse de aproximadamente 3 ml de muestra (el volumen que pueden manejar dichos sistemas roboticos esta limitado a 3 ml). Cuando se realiza el metodo segun la presente invencion manualmente (o cuando se adapta, por consiguiente, el sistema automatizado), pueden procesarse incluso volumenes de muestra mas grandes de 5 ml, 10 ml, 15 ml o mas. Debido a la simplicidad del metodo segun la presente invencion, el riesgo de errores de manipulacion es bajo. Ademas, el metodo es muy rapido y, por tanto, puede integrarse facilmente como procedimiento de pretratamiento en operaciones existentes con el fin de concentrar los acidos nucleicos extracelulares a partir de grandes volumenes de muestra antes de realizar un protocolo de aislamiento de acidos nucleicos convencional. De ese modo, se garantiza un rendimiento y pureza maximos de los acidos nucleicos extracelulares aislados.

El metodo segun la presente invencion es particularmente adecuado para procesar muestras que comprenden bajas cantidades de acidos nucleicos extracelulares. Los inventores pudieron demostrar sorprendentemente que el metodo segun la presente invencion proporciona buenos rendimientos de acido nucleico incluso si la concentracion de acido nucleico en la muestra es muy baja. Tal como se comento en la introduccion, los acidos nucleicos extracelulares estan comprendidos habitualmente en las muestras (tales como por ejemplo una muestra de plasma o suero) en cantidades bastante bajas de 1 a 100 ng/ml de muestra. Por tanto, segun una realizacion, la muestra que contiene el acido nucleico comprende solo bajas cantidades de acido nucleico en una concentracion seleccionada de menos de 1 |ig/ml de muestra, menos de 500 ng/ml de muestra, menos de 300 ng/ml de muestra, menos de 200 ng/ml de muestra, menos de 150 ng/ml de muestra, menos de 100 ng/ml de muestra, menos de 50 ng/ml de muestra o menos de 30 ng/ml de muestra.

La ventaja de que sea posible procesar grandes volumenes de muestra con el metodo segun la presente invencion y concentrar los acidos nucleicos aislados en un bajo volumen de elucion compensa la baja concentracion de los acidos nucleicos extracelulares en el material de partida. Ademas, tal como se muestra en los ejemplos, el rendimiento del metodo segun la presente invencion no se ve dificultado por una baja concentracion de los acidos nucleicos extracelulares en la muestra. Por tanto, las tasas de recuperacion son sustancialmente las mismas, independientemente de si los acidos nucleicos estan comprendidos en altas o en bajas diluciones de concentracion en la muestra.

Segun una realizacion definida en la reivindicacion dependiente 15, el metodo comprende las siguientes etapas:

a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH < 6 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas;

b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH que se uso para unir el acido nucleico extracelular a la fase solida;

e. aislar los acidos nucleicos extracelulares a partir del eluato.

Tal como se define en la reivindicacion 1, la muestra es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo de un lfquido corporal retirando las celulas mediante separacion y los acidos nucleicos extracelulares son ADN extracelular.

Este metodo describe una realizacion, en el que las etapas a. a d. se usan para concentrar los acidos nucleicos extracelulares preferiblemente a partir de un volumen de muestra grande en un volumen de muestra pequeno que luego puede procesarse adicionalmente en la etapa e. para aislar los acidos nucleicos extracelulares a partir de la misma por ejemplo usando un metodo de aislamiento de acidos nucleicos convencional. Las ventajas se explicaron anteriormente. Los detalles con respecto a las etapas individuales a. a e. tambien se describieron anteriormente y tambien se aplican en este caso. Se remite a la divulgacion anterior.

Tambien se da a conocer un metodo para mejorar la recuperacion de acidos nucleicos pequenos cuando se usa una fase solida de union a acidos nucleicos. Cuando se afslan acidos nucleicos, en particular acidos nucleicos mas pequenos tales como por ejemplo acidos nucleicos extracelulares, los acidos nucleicos mas pequenos no se recuperan eficazmente, aun cuando se unieron inicialmente a la fase solida de acido nucleico en la etapa de union. Se supone que esta perdida de recuperacion resulta de la union fuerte, potencialmente irreversible de los acidos nucleicos mas pequenos a la fase solida de union a acidos nucleicos. Por tanto, estos acidos nucleicos permanecen unidos principalmente a la fase solida de union a acidos nucleicos en condiciones de elucion comunes. De ese modo, el rendimiento de acidos nucleicos mas pequenos se reduce, lo que supone un problema si los acidos nucleicos pequenos estan solo representados en la poblacion de acidos nucleicos en una baja cantidad de por ejemplo menos de 100 ng/ml de muestra como es el caso con los acidos nucleicos extracelulares. Ademas, dentro

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de la poblacion de acidos nucleicos extracelulares, un posible acido nucleico diana tal como por ejemplo un determinado marcador de diagnostico esta comprendido habitualmente en una cantidad incluso inferior. Por tanto, existia la necesidad de mejorar la tasa de recuperacion de acidos nucleicos mas pequenos cuando se usa una fase solida de union a acidos nucleicos. Se da a conocer que el pretratamiento de la fase solida de union a acidos nucleicos con un polfmero, preferiblemente poli(acido acnlico) antes de la union de los acidos nucleicos a la fase solida mejora sorprendentemente la tasa de recuperacion de acidos nucleicos mas pequenos. Por tanto, tambien se da a conocer una fase solida de union a acidos nucleicos que se ha pretratado con un polfmero. Ademas se da a conocer un metodo para producir una fase solida de union a acidos nucleicos respectiva, que comprende poner en contacto la fase solida de union a acidos nucleicos con un polfmero, uniendo de ese modo el polfmero a la fase solida. Tambien se da a conocer un metodo para aislar acidos nucleicos, preferiblemente acidos nucleicos extracelulares, en el que se usa una fase solida de union a acidos nucleicos que se ha pretratado con un polfmero. Tal como se dio a conocer anteriormente, el pretratamiento de la fase solida con un polfmero, preferiblemente un polfmero sintetico tal como poli(acido acnlico), da como resultado que las caractensticas de union a acido nucleico de la fase solida de acido nucleico mejoran porque la recuperacion de pequenos acidos nucleicos puede aumentarse.

El polfmero puede ser cualquier polfmero o compuesto polimerico siempre que pueda unirse a la fase solida de union a acidos nucleicos y proporcione el efecto descrito en el presente documento, concretamente mejorar la recuperacion de pequenos acidos nucleicos. La union del polfmero a la fase solida de union a acidos nucleicos es preferiblemente no covalente y preferiblemente implica interaccion ionica. El polfmero es preferiblemente un poliacido que comprende multiples grupos acidos y/o un polianion que comprende multiples grupos cargados negativamente. Segun una realizacion, el polfmero presenta al menos una funcion oxfgeno desprotonatable y, preferiblemente, la carga negativa de la forma desprotonada puede deslocalizarse entre atomos de oxfgeno geminales. Los ejemplos de polfmeros respectivos incluyen polfmeros que contienen funciones carboxilo, por ejemplo copolfmeros de poli(acido acnlico) o acido maleico, asf como tales que contienen fosforo o azufre incluyendo funciones acido organico, por ejemplo polifosfato, poli-dT resp. polisulfonato. Los polfmeros respectivos son particularmente adecuados cuando se usa una fase solida de union a acidos nucleicos que comprende grupos de intercambio anionico tal como se describio anteriormente. El polfmero puede unirse a la fase solida de union a acidos nucleicos por medio de interacciones ionicas. El polfmero puede ser un polipeptido (este termino incluye protemas) tal como por ejemplo una protema lactea o BSA. En realizaciones preferidas, el polfmero no es un acido nucleico y/o un polipeptido y/o un polisacarido. El polfmero puede estar al menos parcialmente desprotonado cuando se une a la matriz de union a acido nucleico.

Puede usarse poli(acido acnlico) con el fin de pretratar la fase solida de union a acidos nucleicos. Puede usarse un poli(acido acnlico) corto que tiene un peso molecular por debajo de 2500, preferiblemente por debajo de 2000. El peso molecular del poli(acido acnlico) puede encontrarse en un intervalo entre 1500 y 1950. Tal como se muestra en la seccion de ejemplos, el pretratamiento de fase solida de union a acidos nucleicos con un poli(acido acnlico) respectivo da como resultado que la recuperacion de acidos nucleicos mas pequenos, por ejemplo que tienen una longitud de menos de 500 nt, 300 nt, 250 nt, 200 nt, 150 nt, 100 nt o 75 nt (tal como se comento anteriormente la longitud de cadena indicada por “nt” se refiere a “pb” en el caso ADN bicatenario) se aumenta significativamente.

Los ejemplos de fases solida de union a acidos nucleicos incluyen pero no se limitan a materiales que contienen silicio tales como materiales de sflice y poli(acido silfcico), borosilicatos, silicatos, vidrios anorganicos, polfmeros organicos tales como poli(met)acrilatos, poliuretanos, poliestireno, agarosa, polisacaridos tales como celulosa, oxidos de metal tales como oxido de aluminio, oxido de magnesio, dioxido de silicio, oxido de titanio y oxido de zirconio, metales tales como oro o platino, sephadex, sepharose, poliacrilamida, polfmeros de divinilbenceno, polfmeros de estireno-divinilbenceno, dextranos, y derivados de los mismos; superficies de vidrio o sflice. Los formatos de la fase solida incluyen pero no se limitan a partfculas, perlas, membranas, filtros, placas y tubos capilares. La fase solida de union a acidos nucleicos puede ser una fase solida tal como se describio anteriormente que comprende grupos de intercambio anionico. La fase solida puede comprender grupos silano sobre su superficie y por ejemplo se ha silanizado. Partfculas magneticas que comprenden preferiblemente un material de sflice tal como poli(acido silfcico) pueden usarse como fase solida. La fase solida puede ser un material poroso.

Tambien se da a conocer que para producir la fase solida de union a acidos nucleicos pretratada, la fase solida puede sumergirse en el polfmero. De ese modo, al menos una porcion de los sitios de union de la fase solida que se unen fuertemente a acidos nucleicos pequenos reducidos se bloquean. El bloqueo puede ser reversible o irreversible. La fase solida de union a acidos nucleicos puede incubarse durante varias horas con el polfmero. Durante el proceso de incubacion, el polfmero puede usarse en una concentracion de al menos 1 mg/ml, preferiblemente al menos 5 mg/ml, al menos 7,5 mg/ml, mas preferido al menos 10 mg/ml. Los intervalos adecuados incluyen pero no se limitan a de 2,5 mg/ml a 25 mg/ml, preferiblemente de 5 mg/ml a 20 mg/ml. Estas cantidades son particularmente adecuadas cuando se usa poli(acido acnlico).

Tambien se da a conocer un kit que comprende una fase solida de union a acidos nucleicos que se ha pretratado con un polfmero tal como se describio anteriormente. El kit dado a conocer puede comprender ademas reactivos tales como por ejemplo una disolucion de union, lavado y/o elucion. El kit dado a conocer puede estar disenado para su uso en el metodo segun la presente invencion. Se da a conocer ademas que la fase solida de union a acidos nucleicos dada a conocer que se ha pretratado con el polfmero tal como se describio anteriormente puede usarse en

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los metodos dados a conocer en el presente documento.

Tambien se da a conocer un metodo para producir una fase solida de union a acidos nucleicos que tiene caractensticas mejoradas, comprendiendo el metodo dado a conocer poner en contacto una fase solida de union a acidos nucleicos con un polfmero tal como se describio anteriormente, preferiblemente seleccionado de poli(acido acnlico), copoKmeros de acido maleico, polisulfonatos, polifosfatos y poli (dT) y unir el polfmero a la fase solida de union a acidos nucleicos, en el que la fase solida de union a acidos nucleicos que se ha tratado con el polfmero proporciona un mayor rendimiento de acidos nucleicos que tienen una longitud de menos de 500 nt, por ejemplo menos de 400 nt, menos de 350 nt, menos de 300 nt, menos de 250 nt, menos de 200 nt, menos de 150 nt o menos de 100 nt (tal como se comento anteriormente la longitud de cadena indicada por “nt” se refiere a “pb” en el caso de ADN bicatenario), en comparacion con la fase solida de union a acidos nucleicos sin tratar cuando se usa en el metodo de aislamiento de acidos nucleicos segun la presente invencion. La fase solida de union a acidos nucleicos pretratada dada a conocer puede usarse tambien en un procedimiento de aislamiento de acidos nucleicos diferente. Los detalles con respecto al polfmero, la fase solida de union a acidos nucleicos y el proceso de pretratamiento se describieron anteriormente. Se remite a la divulgacion anterior que tambien se aplica en este caso.

Tambien se da a conocer un metodo para aumentar la recuperacion de acidos nucleicos pequenos (por ejemplo que tienen una longitud de menos de 500 nt, 350 nt, 250 nt, 200 nt, 150 nt o 100 nt) en un metodo para aislar acidos nucleicos usando una fase solida de union a acidos nucleicos, que comprende la etapa de poner en contacto la fase solida de union a acidos nucleicos con un polfmero. Dicho contacto puede producirse sumergiendo la fase solida de union a acidos nucleicos en el polfmero, que puede ser un poliacido, durante el proceso de produccion de la fase solida. Se describieron detalles anteriormente.

El metodo dado a conocer puede comprender ademas una etapa de lavado tras la etapa de poner en contacto la matriz de union a acido nucleico con un polfmero y antes de poner en contacto la matriz de union a acido nucleico con un acido nucleico. Las condiciones de lavado se eligen preferiblemente de modo que compuestos de polfmero unidos dentro de y/o a la abertura de superficie de los poros pequenos de la matriz de union a acido nucleico permanezcan predominantemente unidos mientras que los compuestos de polfmero restantes se eliminan predominantemente de la matriz de union a acido nucleico. “Predominantemente” a este respecto en particular se refiere a al menos el 50% de los compuestos de polfmero de la poblacion de compuestos de polfmero designada, preferiblemente a al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Esta invencion no esta limitada por los metodos y materiales a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento, y cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede usarse en la practica o las pruebas de realizaciones de esta invencion. Los intervalos numericos son inclusivos de los numeros que definen el intervalo. Los intervalos numericos incluyen un intervalo de tolerancia de +/-10%, +/-5%, preferiblemente +/-3% y lo mas preferido +/-1%. Segun una realizacion, los intervalos numericos indicados no incluyen un intervalo de tolerancia.

El termino “disolucion” tal como se usa en el presente documento, por ejemplo en forma de una disolucion de acidificacion, disolucion de lavado o disolucion de elucion, en particular se refiere a una composicion liquida, preferiblemente una composicion acuosa. Puede ser una mezcla homogenea de solo una fase pero tambien esta dentro del alcance de la presente invencion que una disolucion que se usa segun la presente invencion comprenda componentes solidos tales como por ejemplo precipitados.

Ejemplos

Los ejemplos que no estan cubiertos por las reivindicaciones son para comparacion.

Como fase solida de union a acidos nucleicos, se usaron las siguientes tres partfculas magneticas de intercambio ionico en los ejemplos. Estas partfculas magneticas (“perlas”) permiten la union directa y espedfica de acidos nucleicos presentes a bajas concentraciones en un material de muestra complejo:

1. Perlas magneticas (tipo I)

2. Perlas magneticas (tipo II)

3. Perlas magneticas (tipo III)

Los tres tipos de perlas tienen un nucleo magnetico y una superficie de intercambio anionico.

Las perlas magneticas (tipo I) y perlas magneticas (tipo II) tienen un nucleo magnetico de magnetita (Fe3O4). Estas partfculas magneticas se cubren con poli(acido silfcico) y juntos forman la denominada perla. Ambos tipos de partfculas magneticas se almacenan en agua pero pueden almacenarse tambien en otras disoluciones tales como por ejemplo disolucion de SN-C (MES 0,5 M y Triton X-100, pH 6,1). Las perlas magneticas (tipo I) tienen una superficie mixta de aminas cargadas positivamente y alcoholes neutros (los detalles de la respectiva tecnologfa de

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perlas se describen tambien en el documento WO 2010/072834). Por tanto, la carga electrica positiva se “diluye” sobre la superficie de la perla mediante grupos neutros. Esta carga positiva baja conduce a una union mas debil de los acidos nucleicos diana, permitiendo de ese modo la elucion a un valor de pH bajo (por ejemplo 8,5). En cambio, las perlas magneticas (tipo II) tienen una carga positiva constante e intensa, conteniendo solo aminas terciarias cargadas positivamente sobre su superficie. De modo que la union de acidos nucleicos cargados negativos sucede de manera rapida y facil. Para lograr una elucion eficaz, se usan preferiblemente valores de pH superiores.

Las perlas magneticas (tipo III) portan grupos polietilenimina sobre la superficie del nucleo magnetico. Estas perlas se almacenan en una suspension de SN-C. Para perlas magneticas (tipo I) y (tipo II), estan presentes aminas terciarias sobre la superficie. Para lograr una reaccion alcalina de la amina, se une un par de electrones libres sobre el atomo de nitrogeno. La protonacion del resto de nitrogeno puede inducirse mediante adicion de acido. El grupo amina terciaria provoca que la carga positiva se una a polianiones (acidos nucleicos). Los grupos polietilenimina, que estan acoplados sobre la superficie de las perlas magneticas (tipo III), funcionan de un modo similar. El par de electrones libres, unidos al atomo de nitrogeno, se protonan tras la adicion del acido.

En los ejemplos subsiguientes, se uso el kit de acido nucleico circulante QIAamp como protocolo de limpieza tras la concentracion/enriquecimiento inicial de los acidos nucleicos extracelulares usando el metodo segun la presente invencion. De ese modo, se logro una pureza muy alta. Sin embargo, tal como se demuestra mas adelante, el metodo segun la presente invencion tambien permite usar directamente los acidos nucleicos extracelulares aislados por ejemplo en ensayos de deteccion por PCR.

Tambien se uso el kit de acido nucleico circulante QIAamp en los ejemplos mostrados mas adelante, como metodo de referencia para determinar la cantidad total de acidos nucleicos virales y circulantes en una muestra dada y, por tanto, para poder monitorizar el exito de la concentracion obtenida con un protocolo de enriquecimiento basados en perlas de intercambio anionico diferente segun la presente invencion.

Se identifico el kit de acido nucleico circulante QIAamp como metodo de referencia adecuado, porque permite extraer acidos nucleicos circulantes, libres de celulas y virales de hasta 5 ml de plasma, suero y otros lfquidos corporales. Este kit manual funciona basandose en una tecnologfa de caotropo de sflice, que conduce, en comparacion con otros metodos, a una alta recuperacion de todos los tamanos de fragmento entre el ADNlcc.

Para la cuantificacion del acido nucleico aislado, se usaron diferentes ensayos:

Los ensayos de ADN se prepararon segun el manual de PCR multiplex QuantiTect con las siguientes excepciones:

• Para el ensayo de duplex de 18S, se usa otra concentracion de cebadores (16 |iM en lugar de 8 |iM).

• Para el ensayo de ADN 18S, el tiempo para el apareamiento/extension se cambia desde 1 hasta 2 minutos.

El ensayo de ARN de GAPDH se llevo a cabo segun el manual de RT-PCR multiplex QuantiTect con estas modificaciones:

• Las condiciones de ciclado se cambiaron: La desnaturalizacion tiene lugar durante 1 min a 95°C y el apareamiento/extension durante 1:30 min a 60°C.

Los ensayos de CMV y VIH estan disponibles comercialmente como kits de PCR Artus de QIAGEN. El ensayo de PhHV se desarrollo internamente.

Ejemplo 1: Rendimientos de la extraccion de acidos nucleicos dependiendo de las perlas usadas Para el aislamiento de acidos nucleicos, se realizo el siguiente protocolo.

• Se centrifugan 4 ml de plasma agrupado a 16.000 g a 4°C durante 10 min para eliminar celulas residuales y el plasma reducido en celulas se transfiere a un tubo falcon de 15 ml

• Se anaden 100 |il de tampon acetato de sodio/acido acetico 1 M (pH 4) para ajustar el pH a un valor de entre 5 y 6 (NaOAc/HOAc ~25 mM en 4 ml de muestra)

• Se usan entonces 8 mg de cada uno de ambos tipos perlas magneticas (tipo I), 4 mg de las perlas magneticas (tipo II) o 4 mg de perlas magneticas (tipo III) para la union

• Se realiza la union durante 20 min. a temperatura ambiente sobre un agitador rotatorio superior (20 rpm)

• Entonces se separan las perlas durante 10 min en una gradilla de tubos falcon magnetica y se desecha el sobrenadante

• Se anade 1 ml de Tris-HCI 100 mM (con cloruro de sodio al 0,9% y a pH 8,5)

• Se transfiere la disolucion a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se eluyen los acidos nucleicos de las perlas durante 20

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• Se separan las perlas durante 10 min en una gradilla de tubos magnetica

• Se purifica el eluato usando el kit de acido nucleico circulante QIAamp segun el manual, pero sin anadir ARN portador

• Se eluyen los acidos nucleicos en 100 |il de AVE, que se usa como molde para PCR en tiempo real cuantitativa (volumen de molde del 10% en la mezcla de reaccion de qPCR)

La figura 1 muestra el rendimiento en porcentaje de fragmentos de ADN, al tiempo que se comparan los resultados usando tres tipos de perlas diferentes. Se realizaron adiciones conocidas de los fragmentos de tres tamanos diferentes (75, 200 y 1000 pb) en la muestra de plasma como control interno y se detectaron tras la extraccion. Se anadieron 200.000 copias de cada uno de los tres fragmentos a 4 ml de muestra. Para determinar el rendimiento de referencia del ADN anadido, se proceso el plasma con el kit de acido nucleico circulante QIAamp y se uso el rendimiento de ADN medido como referencia para poder determinar el rendimiento logrado con los protocolos de enriquecimiento basados en perlas de intercambio anionico (vease la figura 1).

El uso de perlas magneticas (tipo II) condujo a una recuperacion de ~100%. Para garantizar una recuperacion maxima de los acidos nucleicos, se encontro ventajoso modificar las perlas magneticas (tipo I) para mejorar especialmente la recuperacion de los fragmentos de ADN mas pequenos (en este caso se sometieron a prueba los fragmentos de 75 pb del control interno). Por tanto, segun una realizacion, se incubaron las perlas magneticas (tipo I) con poli(acido acnlico) antes del proceso de concentracion para evitar la difusion de los fragmentos de aDn pequenos al interior de los poros de las perlas, donde podnan unirse, respectivamente quedando atrapados irreversiblemente. Los polianiones de poli(acido acnlico) cortos saturaron los sitios de union y, por tanto, mejoraron su recuperacion (recuperacion de ~100% de todos los tamanos de fragmento). Las perlas magneticas (tipo III) tambien condujeron a una recuperacion de ADN de entre el 70 y el 90%. Debido a los grupos de intercambio anionico usados, era ventajoso usar un tampon de elucion (hidroxido de sodio 40 mM) a un valor de pH de aproximadamente 12,6. Para los otros tipos de perlas, podnan usarse condiciones de elucion mas moderadas, y se eluyeron los acidos nucleicos extracelulares con Tris-HCI 100 mM, pH 8,5 que contema cloruro de sodio al 0,9%.

Ejemplo 2: Enriquecimiento de ADNlcc

Entonces se usaron las perlas magneticas (tipo II) para el enriquecimiento de ADNlcc. Por tanto, se uso el mismo protocolo que se describio en el ejemplo 1 con los siguientes cambios:

• El acido nucleico no solo se extrajo del eluato, sino tambien del sobrenadante de plasma tras la etapa de union. Esto permite evaluar la eficacia de union y elucion.

• Tras purificar el eluato usando el kit de acido nucleico circulante QIAamp, los acidos nucleicos se eluyeron entonces en un volumen mas pequeno (60 |il de AVE).

Con este experimento, se confirmaron los resultados del control interno (fragmentos de 75, 200 y 1000 pb) mediante el analisis de ADNlcc. De ese modo, no solo de afirmo una recuperacion de ADN de ~100%, tambien se mostro que no habfa perdida de perlas durante la etapa de union. En la figura 2, se uso un ensayo de ADN para detectar ADN libre de celulas circulante. Se cuantificaron dos amplicones de ADN diferentes (66 y 500 pb) de la secuencia codificante de ARNr 18S. Se uso la referencia para determinar la cantidad total de ADNlcc.

Aunque solo pudo encontrarse menos del 2 o incluso el 1% de ADN no unido entre el sobrenadante tras la etapa de union, se logro una recuperacion de casi el 100% para ambas dianas de ADNr 18S. Esto indica que los fragmentos de ADN podfan unirse y recuperarse eficazmente a partir de 4 ml de plasma usando las perlas magneticas (tipo II).

Ejemplo 3: Elucion selectiva de tamano de ADN

Se descubrio un comportamiento selectivo de tamano inesperado de las perlas magneticas (tipo II) usando casi el mismo protocolo que para el enriquecimiento de ADNlcc. La unica diferencia era que los acidos nucleicos se eluyeron en dos etapas de las perlas usando dos tampones de elucion diferentes. La figura 3 muestra los resultados del ensayo de fragmentos de ADN.

En una primera etapa, fue posible lograr una elucion preferida de fragmentos de ADN mas cortos usando el tampon de elucion ya mencionado (Tris-HCI 100 mM, que contiene cloruro de sodio al 0,9%), pero a pH 8. Los fragmentos de ADN restantes y especialmente mas largos se eluyeron finalmente a un pH alcalino (12,6) usando hidroxido de sodio 40 mM. Sin embargo, tal como se muestra en los otros ejemplos, tambien pueden usarse valores de pH inferiores de por ejemplo 8,5 para lograr una elucion eficaz. El uso de valores de pH inferiores por debajo de 10 y preferiblemente por debajo de 9 es favorable para las reacciones posteriores.

Se anadieron 400 |il de tampon de neutralizacion de perlas magneticas (tipo III) (pH 8,5) a los 600 |il de eluato que conteman el hidroxido de sodio 40 mM antes de limpiar la muestra usando el kit de acido nucleico circulante

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QIAamp. Para la neutralizacion del eluato, se uso un tampon que contema hidroxido de sodio 30 mM, Tris 170 mM, HCI al 0,31% y azida de sodio 6 mM.

Ejemplo 4: Enriquecimiento de ARNlcc

Las condiciones de union y elucion se optimizaron especialmente para ADNlcc. Pero, tal como muestra la figura 4, tambien puede enriquecerse ARNlcc a partir de plasma usando el metodo descrito en el presente documento.

La figura 4 muestra la media de Ct. El valor de Ct de 29,6, obtenido con la extraccion de referencia, representa la cantidad total de ARNm de GAPDH circulante dentro de la muestra de 4 ml de plasma, mientras que el valor de ct de 30,5 indica que puede recuperarse ARNm de GAPDH al final tras un enriquecimiento directo a partir de plasma usando las perlas magneticas (tipo III).

Protocolo que condujo a la mejor recuperacion de ARN en las realizaciones sometidas a prueba:

• Se centrifugan 4 ml de plasma agrupado a 16.000 g a 4°C durante 10 min y se ponen en un tubo falcon

• Se anaden 1000 |il de tampon acetato de sodio/acido acetico 0,12 M (pH 4) para ajustar a un valor de pH < 5 (~25 mM en 4 ml de muestra)

• Se usan entonces 400 |il de perlas magneticas (tipo III) para la union

• Se realiza la union durante 20 min a temperatura ambiente sobre un agitador rotatorio superior (20 rpm)

• Entonces se separan las perlas durante 10 min en una gradilla de tubos falcon magnetica y se desecha el sobrenadante

• Se anade 1 ml de Tris-HCI 100 mM (cloruro de sodio al 0,9% y a pH 8)

• Se transfiere la disolucion a un tubo eppendorf de 1,5 ml y se eluyen los acidos nucleicos de las perlas durante 20 min en una termomezcladora

• Se separan las perlas durante 10 min sobre una gradilla de tubos eppendorf magnetica

• Se purifica el eluato usando el kit de acido nucleico circulante QIAamp segun el protocolo del manual para la purificacion de ADN circulante a partir de 4 o 5 ml de plasma o suero, pero sin usar ARN portador

• Se eluyen los acidos nucleicos en 60 |il de AVE, que se usa como molde para la PCR en tiempo real cuantitativa (volumen de molde del 10%)

Ejemplo 5: Uso directo del eluato como molde de PCR

La figura 2 mostro ya que podna lograrse una recuperacion de ADN de casi el 100% usando las perlas magneticas (tipo II). Pero para estos experimentos, se uso la version del protocolo con limpieza adicional. Por tanto, se sometio a prueba si el eluato podna usarse directamente como molde en metodos que son sensibles a impurezas tales como PCR en tiempo real cuantitativa. El protocolo esta disenado tal como sigue:

Protocolo de aislamiento “directo” sin limpieza adicional para demostrar la compatibilidad con PCR

• Se centrifugan 4 ml de plasma agrupado a 16.000 g a 4°C durante 10 min y se ponen en un tubo falcon

• Se anaden 100 |il de tampon acetato de sodio/acido acetico 1 M (pH 4) para ajustar a un pH de entre 5 y 6 (~25 mM en 4 ml de muestra)

• Se usan entonces 4 mg de las perlas magneticas (tipo II) para la union

• Se realiza la union durante 20 min a temperatura ambiente sobre un agitador rotatorio superior (20 rpm)

• Entonces se separan las perlas durante 10 min en una gradilla de tubos falcon magnetica y se desecha el sobrenadante

• Se lavan las perlas dos veces usando H2O+ TritonX-100 al 0,05% (en primer lugar con 1000, luego con 300 |il); durante la primera etapa de lavado la disolucion de perlas se transfiere a un tubo falcon de 1,5 ml

• Tras la adicion del tampon de lavado, se incuban las perlas durante 5 min usando la termomezcladora y se separan durante 10 min

• Tras la segunda etapa de lavado, se anaden 150 |il de Tris-HCI 100 mM (cloruro de sodio al 0,9% y a pH 8,5)

• Se eluyen los acidos nucleicos de las perlas durante 20 min en una termomezcladora

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• Entonces se separan durante 10 min sobre una gradilla de tubos eppendorf magnetica

• Se usa el eluato/concentrado como molde para la PCR en tiempo real cuantitativa directamente (volumen de molde del 10%)

Para el protocolo de aislamiento con limpieza adicional, el eluato se procesa usando el kit de acido nucleico circulante QIAamp segun el protocolo disponible para la purificacion de ADN circulante a partir de 4 6 5 ml de plasma o suero, pero sin ARN portador. Los acidos nucleicos se eluyen en 100 |il de AVE, que se usa como molde para la PCR en tiempo real cuantitativa.

Para someter a prueba si podna usarse el eluato (en este caso de muestras de plasma agrupadas) como molde para la qPCR directamente, se realizo una prueba de inhibicion de PCR: se comparo la recuperacion de ADNlcc con o sin realizar un protocolo de limpieza antes de la qPCR. Se compararon tres volumenes de molde diferentes por PCR. Si habfa un problema de inhibicion de PCR, la recuperacion tras la realizacion de un protocolo de limpieza debena ser mayor que usando el eluato directamente como molde para la qPCR directamente. Ademas, la recuperacion disminuina usando un volumen de molde superior debido al aumento de la concentracion de sustancias que inhiben la PCR en la mezcla de reaccion.

La figura 5 muestra que la recuperacion de ADN con o sin la realizacion de un protocolo de limpieza es casi la misma y los resultados son similares entre los tres volumenes de molde diferentes. De ese modo, sorprendentemente, el eluato que se obtiene cuando se usa el metodo sencillo, rapido segun la presente invencion es compatible con PCR sin ninguna purificacion adicional.

Para la cuantificacion de ADN libre de celulas circulante, se uso el ensayo de 18S ya descrito (amplicon de 66 pb). Como metodo de referencia, se uso el kit de acido nucleico circulante QIAamp.

Los ejemplos 1-5 demuestran que pueden enriquecerse satisfactoriamente acidos nucleicos extracelulares tales como ADN y ARN libre de celulas circulante usando perlas magneticas de intercambio anionico tras acidificar la muestra anadiendo acetato de sodio/acido acetico. La elucion de ADN/ARN se logra aplicando un tampon de elucion de neutro a alcalino.

Ejemplo 6: Enriquecimiento de virus a partir de plasma Protocolo

• Se centrifugan 4 ml de plasma agrupado a 16.000 g a 4°C durante 10 min y se ponen en un tubo falcon

• Se hacen adiciones conocidas de los virus CMV, VIH y PhHV (en forma de partfculas)

• Se anaden 100 |il de tampon acetato de sodio/acido acetico 1 M (pH 4) para ajustar a un pH de entre 5 y 6 (~25 mM en 4 ml de muestra) •

• Se usan entonces 8 mg de ambos tipos de perlas magneticas (tipo I) (con y sin poli(acido acnlico)) o 4 mg de las perlas magneticas (tipo II) para la union

• Se realiza la union durante 20 min a temperatura ambiente sobre un agitador rotatorio superior (20 rpm)

• Se separan las perlas durante 10 min en una gradilla de tubos falcon magnetica y se desecha el sobrenadante

• Se anade 1 ml de Tris-HCI 100 mM (cloruro de sodio al 0,9%, pH 8,5)

• Se transfiere la disolucion a un tubo eppendorf de 1,5 ml y se eluyen los acidos nucleicos de las perlas durante 20 min en una termomezcladora

• Se separan las perlas durante 10 min sobre una gradilla de tubos eppendorf magnetica

• Se limpia el eluato usando el kit de acido nucleico circulante QIAamp segun el protocolo disponible para la purificacion de ADN circulante a partir de 4 o 5 ml de plasma o suero, pero sin ARN portador

• Se eluyen los acidos nucleicos en 100 |il de AVE, que se usa como molde para la PCR en tiempo real cuantitativa

Se sometieron a prueba diversos virus y se compararon tres tipos de perlas diferentes (perlas magneticas (tipo I), perlas magneticas (tipo I) tras la incubacion con poli(acido acnlico), asf como perlas magneticas (tipo II)). Para CMV, VIH y PhHV, se lograron recuperaciones que corresponden al 70-100% de las recuperaciones respectivas logradas con el protocolo de referencia (vease la figura 6).

Ejemplo 7: Enriquecimiento de acido nucleico automatizado

El protocolo basado en perlas de intercambio anionico par el aislamiento de acidos nucleicos y virus circulantes libres de celulas se automatizo en el instrumento QIAsymphony SP (QIAGEN) y se comparo con la ejecucion manual

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del mismo protocolo. En contraposicion a experimentos previos, se usaron muestras de plasma de donantes individuales.

Protocolo

Muestras de plasma de 2,9 ml de doce donantes individuales (a) se procesaron con el kit de acido nucleico circulante QIAamp como referencia, (b) se aislaron manualmente usando perlas magneticas (tipo II) (version de protocolo directo) o (c) se aislaron en el instrumento QIAsymphony. Se realizo el kit de acido nucleico circulante QIAamp segun el protocolo del manual para la purificacion de ADN circulante a partir de 1 ml, 2 ml o 3 ml de plasma o suero, pero sin ARN portador (elucion en 150 |il de AVE).

Version manual del protocolo “directo” segun la presente invencion

• Se centrifugan 2,9 ml de plasma a 16.000 g a 4°C durante 10 min y se ponen en un tubo

• Se hacen adiciones conocidas de los virus CMV, VIH y PhHV (en forma de partfculas)

• Se anaden 75 |il de tampon acetato de sodio/acido acetico 1 M (pH 4) para ajustar a un pH de entre 5 y 6

• Se usan entonces 4 mg de las perlas magneticas (tipo II) para la union

• Se realiza la union durante 20 min a temperatura ambiente sobre un agitador rotatorio superior (20 rpm)

• Entonces se separan las perlas durante 10 min en una gradilla de tubos falcon magnetica y se desecha el sobrenadante

• Se lavan las perlas dos veces usando H2O + TritonX-100 al 0,01% (en primer lugar con 1000 |il, luego con 300 |il) y ya durante la primera etapa de lavado la disolucion de perlas se transfiere a un tubo falcon de 1,5 ml

• Tras la adicion del tampon de lavado se incuban las perlas durante 5 min usando la termomezcladora y se separan durante 10 min

• Tras la segunda etapa de lavado, se anaden 150 |il de Tris-HCI 100 mM (cloruro de sodio al 0,9%, pH 8,5)

• Se eluyen los acidos nucleicos de las perlas durante 20 min en una termomezcladora

• Entonces se separan las perlas durante 10 min sobre una gradilla de tubos eppendorf magnetica

• Se usa el eluato como molde para la PCR en tiempo real cuantitativa directamente (volumen de molde del 10%) Version automatizada del protocolo directo segun la presente invencion

• Se centrifugan 2,9 ml de plasma a 16.000 g a 4°C durante 10 min y se ponen, por ejemplo, en un tubo de ensayo de fondo redondo de poliestireno de 14 ml (17* 100 mm, BD)

• Se hacen adiciones conocidas de los virus CMV, VIH y PhHV (en forma de partfculas)

• Se insertan los tubos en el portador de tubos y luego se cargan en el instrumento QIAsymphony SP para el procesamiento automatizado

• Se usan los mismos tiempos de incubacion y reactivos que para la version de concentracion manual

• El volumen de elucion es tambien el mismo (150 |il)

La cantidad total de acidos nucleicos circulantes libres de celulas vario entre las muestras de plasma individuales. En la mayona de los casos, las versiones del protocolo manual y automatizado eran comparables. Se midio la recuperacion de ADN circulante mediante ensayos de qPCR que seleccionan como diana ADNr 18S (amplicon de 66 pb), DYS14 y RhD (exon n.° 5). La mediana de las recuperaciones mostrada en la figura 7 muestra que no hay realmente una diferencia significativa entre la version del protocolo manual y automatizado y que la recuperacion de ADNlcc lograda con el protocolo basado en perlas de intercambio anionico corresponde al 60-80% de la cantidad total de ADN libre de celulas circulante (tal como se determina tras la extraccion usando el metodo de referencia de kit de acido nucleico circulante QIAamp). La tasa de recuperacion puede mejorarse adicionalmente optimizando las condiciones de union y elucion.

La figura 8 muestra la mediana de la recuperacion de los tres tamanos de fragmento diferentes del control interno (75, 200 y 1000 pb). Pero mientras que se detectaron del 70 al 80% de los fragmentos de ADN de 75 y 200 pb dentro del concentrado, la recuperacion de los fragmentos de ADN de 1000 pb largos fue < 50%. Este resultado sorprendente apunta a una propiedad selectiva de tamano del protocolo basado en perlas de intercambio anionico: en este caso, se recuperan preferentemente fragmentos de ADN mas cortos (75-200 pb) en comparacion con ADN mas largo (1000 pb). Este comportamiento es util para, por ejemplo, el enriquecimiento de acidos nucleicos

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extracelulares tales como ADN circulante fetal en plasma materno y tambien fragmentos de ADN circulantes derivados de tumores. La union preferente de los acidos nucleicos mas pequenos con respecto a los acidos nucleicos mas largos reduce la cantidad de acidos nucleicos mas largos en la poblacion de acidos nucleicos aislados poblacion. Esto es, con respecto al aislamiento de acidos nucleicos extracelulares, una ventaja porque en muestras que comprenden acidos nucleicos extracelulares tales como por ejemplo orina, sangre o productos sangumeos tales como plasma o suero, los acidos nucleicos mas largos comprendidos representan habitualmente acidos nucleicos intracelulares, que se liberaron de celulas (por ejemplo de celulas danadas). Tales acidos nucleicos intracelulares representan una contaminacion de la poblacion de acidos nucleicos extracelulares. El metodo de aislamiento de acidos nucleicos descrito reduce ventajosamente los acidos nucleicos mas largos contaminantes respectivos en los acidos nucleicos extracelulares aislados.

Ejemplo 8: Union de acidos nucleicos muy poco concentrados

Para analizar la capacidad de union de las perlas magneticas (tipo I) y su rendimiento de union con muestras que contienen solo bajas concentraciones de acido nucleico, se realizo el siguiente ensayo:

• Pipetear 50 mg de perlas en un recipiente de reaccion de 2 ml, separacion magnetica (3 min), desechar el sobrenadante de la suspension de perlas

• Anadir el volumen indicado de tampon de union (MOPS 50 mM, pH 7,0) que contiene los 40 |ig de ADN de plasmido (pCMVb, 7164 pb)

• Incubar 10 min sobre un agitador rotatorio de extremo a extremo

• Separacion magnetica (3 min), desechar el sobrenadante, lavar dos veces con 500 |il de tampon de union (5 min de extremo a extremo)

• Eluir dos veces con 500 |il (cada una) de Tris 50 mM, KCI 20 mM, pH 8,5

En los ensayos, se unio todo el ADN anadido a las perlas magneticas (tipo I) y se eluyo de las mismas, independientemente del volumen de muestra usado (vease la figura 9). Por tanto, la dilucion de la muestra no disminuye la realizacion y el rendimiento del metodo. Los resultados de estos ensayos demuestran que las perlas magneticas (tipo I) pueden unirse eficazmente a todos los acidos nucleicos incluso en muestras que contienen el acido nucleico solo en baja concentracion.

De ese modo, pueden extraerse las siguientes conclusiones de los experimentos descritos anteriormente:

1. Las condiciones de union optimas de acidos nucleicos extracelulares a partir de muestras de sangre (plasma y suero) u otros lfquidos corporales pueden ajustarse usando 1/40 de volumen de muestra de tampon de acetato de sodio/acido acetico acido para establecer el valor de pH de la muestra entre 5 y 6, en particular cuando se pretende aislar ADN extracelular.

2. La union completa y directa de acidos nucleicos extracelulares a partir del lfquido biologico se logra tras la adicion de, por ejemplo, partfculas magneticas con una qmmica superficie de intercambio anionico (por ejemplo, aminas terciarias o polietileniminas de perlas magneticas (tipo I) o perlas magneticas (tipo III)). Preferiblemente, se incuban perlas magneticas (tipo I) con poli(acido acnlico) antes de su uso para mejorar la recuperacion de ADN de, especialmente, fragmentos mas cortos.

3. El sobrenadante restante tras la etapa de union puede eliminarse y los acidos nucleicos extracelulares unidos pueden eluirse de las partfculas magneticas anadiendo un tampon alcalino (por ejemplo MOPS o Tris 100 mM) a un pH de 8 o superior (opcional: adicion de sal tal como cloruro de sodio para la mejora de la recuperacion).

4. Tras la eliminacion de las partfculas magneticas, el eluato puede purificarse adicionalmente o usarse directamente como molde para metodos de analisis/deteccion tales como PCR en tiempo real cuantitativa (en el ultimo caso, se recomiendan dos etapas de lavado adicionales antes de que se eluyan los acidos nucleicos).

5. Pueden aislarse cuantitativamente acidos nucleicos a partir de muestras que comprenden solo bajas concentraciones de acido nucleico y la dilucion de la muestra no disminuye el rendimiento del metodo segun la presente invencion.

Eiemplo 9: Recuperacion de ADNlcc (18S) usando un protocolo de enriquecimiento manual segun la invencion

Se uso plasma con EDTA de donantes sanos para el enriquecimiento de ADNlcc usando un protocolo manual segun las ensenanzas de la presente invencion. Se purifico ADN libre de celulas circulante a partir de 3 ml de plasma de 8 donantes individuales usando la version manual del protocolo de enriquecimiento segun la presente invencion. Se cuantifico el rendimiento de ADN mediante PCR en tiempo real que selecciona como diana un amplicon de 66 pb dentro de la secuencia codificante de ARN ribosomico 18S usando el kit de PCR multiplex QIAGEN QuantiTect®. El kit de acido nucleico circulante QIAamp® (QIAGEN) sirvio como referencia (=100%). Los resultados se muestran en la figura 10. A la derecha, se muestra la mediana de la recuperacion porcentual de todos los donadores. Para indicar

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la desviacion superior e inferior, se indican los percentiles 10° y 90° mediante barras de error.

Ejemplo 10: Recuperacion de ADN con adiciones conocidas-protocolo de enriquecimiento manual

Con el fin de rastrear una posible selectividad de tamano del procedimiento y como control interno, se anadieron fragmentos de ADN (75 pb, 200 pb, 1000 pb) a muestras de plasma estabilizadas con EDTA a 200.000 copias/muestra. Se purifico ADN libre de celulas circulante a partir de 3 ml de plasma de 8 donantes individuales usando una version manual del protocolo segun la presente invencion. Se cuantifico el rendimiento de ADN mediante PCR en tiempo real triple que selecciona como diana regiones dentro del fragmento de 75 pb, 200 pb y 1000 pb usando el kit de PCR multiplex QuantiTect® de QIAGEN. El kit de acido nucleico circulante QIAamp® (QIAGEN) sirvio como referencia (=100%). Los resultados se muestran en la figura 11.

Ejemplo 11: Diagnostico prenatal

Se aislo acido nucleico libre de celulas circulante a partir de muestras de sangre materna usando el metodo de la invencion y se detecto ADNlcc usando un ensayo de qPCR triple. Se procesaron 5,8 ml de plasma a partir de doce donantes individuales. Se procesaron las muestras en el instrumento QIAsymphony SP que, sin embargo, solo puede procesar un volumen maximo de 3 ml. Por tanto, se dividieron las muestras en dos porciones (2,9 ml de plasma cada una) y se cargaron en el instrumento QIAsymphony SP para el procesamiento automatizado siguiendo el protocolo de enriquecimiento automatizado para el instrumento QIAsymphony SP (vease el ejemplo 7). Por tanto, se procesaron las dos porciones de la muestra original en paralelo acidificando las porciones de muestra y anadiendo una almuota de perlas a cada porcion de muestra. Se usaron perlas de tipo II en este y todos los ejemplos subsiguientes si no se establece lo contrario. Tras la union, se retiraron las perlas con los acidos nucleicos unidos de la mezcla de union creada a partir de la primera porcion de muestra y se transfirieron a la mezcla de union resultante de la segunda porcion de muestra que tambien comprendfa una almuota de perlas. De ese modo, se combinaron los acidos nucleicos de la primera y segunda porcion de muestra. Por tanto, para la incubacion de union restante de la mezcla de union de la segunda porcion de muestra, esta presenta la cantidad doble de perlas. Esta division y reunificacion de la muestra permite procesar un volumen de muestra que es dos veces tan grande como el volumen de muestra del sistema automatico. Cuando se procesan muestras incluso mas grandes, pueden crearse mas porciones. Se recogieron todas las perlas con acidos nucleicos unidos y se lavaron dos veces con Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 7,2) + TritonX-100 al 0,1%, y se eluyeron los acidos nucleicos en 150 |il de Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9). Acidos nucleicos aislados con el kit de acido nucleico circulante QIAamp sirvieron como referencia para determinar la tasa de recuperacion. Ademas, se aislaron acidos nucleicos del sobrenadante obtenido tras retirarse las perlas con los acidos nucleicos unidos, usando el kit de acido nucleico circulante QIAamp. De ese modo, el ADNlcc no unido que queda en el sobrenadante puede detectarse y cuantificarse. Se uso un volumen de molde del 10% de eluato en el ensayo de qPCR triple para la deteccion de ADNr 18S (vease la figura 12a), DYS14 (vease la figura 12b) y RhD (vease la figura 12c). Se muestra el % de recuperacion en comparacion con el kit de acido nucleico circulante QIAamp.

La figura 12a muestra que el ADNlcc se une casi completamente a partmulas magneticas y se eluye al final (excepcion: donante 10). Solo pueden detectarse cantidades residuales de ADNlcc en la fraccion de sobrenadante. La figura 12b muestra el resultado del ensayo de Dys14. Dys14 es una protema espedfica de testmulos. Por tanto, la deteccion de ADNlcc de DYS14 en plasma derivado del feto puede usarse para la determinacion del sexo y es predictiva de un feto masculino. De 12 muestras sometidas a prueba, solo se detectan 2 donantes masculinos. La recuperacion de ADNlcc era comparable al resultado de ADNr 18S.

La figura 12c muestra el resultado del ensayo de RhD como parte del ensayo de qPCR de ADN triple. En este caso, se determina el grupo sangumeo y factor Rh sometiendo a prueba el antfgeno D. Los donantes 7 y 8 son negativos para RhD. La recuperacion de ADNlcc de todos los donantes positivos para RhD era comparable a los resultados del ensayo de ADNr 18S y DYS14.

El experimento muestra que el metodo de la invencion puede usarse para la deteccion espedfica de ADNlcc en plasma sangumeo materno. El metodo de la invencion puede aplicarse facilmente en diagnostico prenatal, por ejemplo para la determinacion del sexo prenatal y la determinacion del factor Rh.

Ejemplo 12: Recuperacion y enriquecimiento eficaces de fragmentos de ADN extracelular cortos a partir de plasma sangumeo

Se detecto ADNlcc usando tamanos de amplicon diferentes para protema precursora de amiloide beta (APP). Se aislo ADNlcc tal como se describio en el ejemplo 11. Se realizo deteccion por PCR en tiempo real de fragmentos de ADNlcc con los tamanos de 67, 180 y 476 pb tal como se describe en Pinzani et al. 2011, Clin. Chim. Acta. 412: 2141. Se calcularon las razones de numero de copias 67/476 y 180/476. Se calcularon las mismas razones para ADNlcc aislado con el kit de acido nucleico circulante QIAamp (kit de CNA QIAamp). Un enriquecimiento de fragmentos de ADN mas cortos conduce a un aumento de la razon de numero de copias.

Tal como puede observarse en la figura 13a, el protocolo de enriquecimiento automatizado de la invencion procesado con el instrumento QIAsymphony SP (QSSP) muestra valores de razon similares o superiores en comparacion con el protocolo de referencia del kit CNA QIAamp (QIAamp). Por tanto, el metodo de la invencion

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puede usarse para aislar eficazmente fragmentos de ADNIcc de diversos tamanos, en particular de fragmentos de ADNIcc cortos que pueden incluso enriquecerse. La figura 13b representa las razones de % de recuperacion de ADN obtenido con el metodo de invencion (protocolo de QIAsymphony SP) en comparacion con fragmentos de ADNlcc de APP aislados con el kit CNA QIAamp. Un enriquecimiento de fragmentos de ADN mas cortos conduce a razones > 1,0. Los resultados muestran que fragmentos de ADN mas cortos se extraen completamente del plasma usando el protocolo de QIAsymphony SP. Para algunos donantes, incluso podna lograrse un enriquecimiento de fragmentos de ADN mas cortos usando el metodo de la invencion en comparacion con el protocolo de referencia.

Ejemplo 13: Compatibilidad con PCR de las condiciones de elucion

Para determinar si un alto valor de pH durante la elucion podna interferir con la subsiguiente deteccion basada en PCR, se hicieron adiciones conocidas de cantidades variables de ADN genomico humano masculino (31 - 8.000 copias) en diferentes tampones de elucion (tampon Tris 10-50 mM a pH 9 y ~pH 10,2). Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S. Agua libre de ARNasa sirvio como referencia. Se compararon los valores de Ct para un volumen de molde del 40% en reaccion PCR en tiempo real.

Los resultados para el amplicon de 66 pb corto se muestran en la figura 14a, los resultados para el amplicon de 500 pb se muestran en la figura 14b. Valores de Ct comparables entre tampones de elucion sometidos a prueba y agua pura indican que no hay inhibicion de PCR significativa, ni para diferentes concentraciones de ADN ni para los tampones de elucion sometidos a prueba. Tal como puede observarse, todos los tampones sometidos a prueba pueden usarse facilmente para la elucion de ADN y no inhiben la reaccion PCR posterior.

Ejemplo 14: Elucion selectiva de fragmentos de ADN cortos a valores de pH altamente basicos

Se sometieron a prueba diferentes tampones de elucion para determinar la elucion de ADN con diversos tamanos. Se procesaron 4 replicas de 5,8 ml de plasma agrupado tal como se describio en el ejemplo 11 para el protocolo de QIAsymphony SP. Tras unir el ADN a las perlas, se realizaron dos etapas de lavado con Agua libre de ARNasa + TritonX-100 al 0,1%, seguido por elucion con 150 |il usando 5 tampones Tris diferentes tal como se muestra en la figura 15a. Se analizo el ADN eluido usando el ensayo de duplex de ADNr 18S para el amplicon de 66 pb. Para el amplicon de 500 pb solo se muestran datos para Tris 20 mM (base libre, ~pH 10,2) y el kit de CNA QIAamp como referencia.

La figura 15a representa el resultado para el amplicon de 66 pb obtenido a partir de muestras de plasma agrupado, el resultado para el amplicon de 500 pb se muestra en la figura 15b. Para el amplicon de 66 pb, los resultados son comparables entre todas las replicas y tambien los rendimientos de ADN obtenidos con diferentes tampones de elucion son comparables con la referencia del kit de CNA QIAamp. Para el amplicon de 500 pb, sin embargo, el rendimiento de ADN era muy bajo en comparacion con la referencia. Por tanto, cuando se usa el metodo de la invencion, es posible la elucion selectiva de fragmentos de ADN mas cortos (66 pb frente a 500 pb) usando Tris 20 mM (base libre ~pH 10,2) para la elucion.

Ejemplo 15: Elucion dependiente de sal de fragmentos de ADN mas largos frente a mas cortos

Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S. Se procesaron muestras de plasma de 5,8 ml tal como se describio en el ejemplo 11. Tras la union del ADN a las perlas, se realizaron dos etapas de lavado con agua libre de ARNasa + TritonX-100 al 0,1%, seguido por elucion con 150 |il usando 5 tampones Tris diferentes. ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp sirvio como referencia. El % de recuperacion usando el protocolo de QIAsymphony SP (en comparacion con el kit de CNA QIAamp) se muestra en la figura 16. La molaridad de Tris y la concentracion de sal parecen no tener influencia sobre la recuperacion de fragmentos de ADN pequenos (amplicon de 66 pb de ADNr 18S). Sin embargo, para fragmentos de ADN mas largos (amplicon de 500 pb de ADNr 18S), la recuperacion de ADN aumenta usando concentraciones de sal superiores. Por tanto, variando la concentracion de sal en el tampon de elucion, es posible influir y ajustar el tamano de los acidos nucleicos eluidos.

Ejemplo 16: Compatibilidad con PCR de diferentes tampones de elucion

Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S. Se hicieron adiciones conocidas de cantidades variables de ADN genomico humano masculino (de 0 a 5.000 copias) en agua libre de ARNasa (referencia) y Tris 100 mM + NaCl 154 mM, pH 9. Se uso un 20% del ADNlcc de volumen de molde en la reaccion PCR en tiempo real. Los resultados para el amplicon de 66 pb se muestran en la figura 17. Valores de Ct comparables entre el tampon de elucion sometido a prueba y agua pura indican que no hay inhibicion de la PCR para diferentes concentraciones de ADN, al menos no en el intervalo de hasta 5.000 copias.

Ejemplo 17: Elucion preferida de fragmentos de ADN mas cortos con tampones de elucion de molaridad variable, en ausencia de sal y a pH altamente basico

Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S. Se procesaron 4 replicas de 5,8 ml de muestras de plasma agrupado tal como se describio en el ejemplo 11. Tras la union del ADN a las perlas, se realizaron dos etapas de lavado con agua libre de ARNasa + TritonX-100 al 0,1%, seguido por elucion con 150 |il usando 5 tampones Tris diferentes (base de Tris 10 - 50 mM y Tris 100 mM + NaCl 154 mM, pH 9). ADNlcc aislado con el kit de CNA

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QIAamp sirvio como referencia. Se uso un volumen de molde del 10% en la reaccion PCR en tiempo real. Los resultados se muestran en las figuras 18a y 18b. Todos los resultados son comparables entre las replicas sometidas a prueba 1 - 4. Para los fragmentos de ADN mas cortos (amplicon de 66 pb) los rendimientos de ADN obtenidos tras usar tampones de elucion con diferentes molaridades son comparables a los rendimientos de ADN obtenidos con un tampon que contiene sal y con la referencia. Sin embargo, el rendimiento de ADN de fragmentos de ADN mas largos (amplicon de 500 pb) es muy bajo para los tampones sometidos a prueba sin NaCl, en comparacion con el tampon que contiene sal y la referencia. Por tanto, una elucion preferida de fragmentos de ADN mas cortos (amplicon de 66 pb) es posible usando por ejemplo un tampon Tris a molaridades variables sin sal adicional a ~pH 10,2.

Ejemplo 18: Seleccion por tamano ajuntando las condiciones de elucion, en particular valor de pH y contenido en sal del tampon de elucion

Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S. Se procesaron muestras de plasma de 5,8 ml tal como se describio en el ejemplo 11. Tras la union del ADN a las perlas, se realizaron dos etapas de lavado con agua libre de ARNasa + TritonX-100 al 0,1%, seguido por elucion con 150 |il usando diferente tampones Tris o NaOH. Se uso el 10% del ADN eluido como molde en la reaccion PCR en tiempo real. Se analizo el % de recuperacion en comparacion con el ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp. Los resultados se representan en la figura 19. La adicion de sal o el uso de NaOH para la elucion aumenta la recuperacion de fragmentos de ADN mas largos (vease el amplicon de 500 pb). Por tanto, es posible la seleccion por tamano ajustando condiciones de elucion espedficas referentes a la concentracion de sal y el valor de pH.

Ejemplo 19: Seleccion por tamano ajustando las condiciones de elucion, en particular el valor de pH y el contenido en sal del tampon de elucion

En este experimento se sometieron a prueba diferentes tampones de elucion para eluir fragmentos de ADN con diferentes longitudes. Se aislo ADNlcc a partir de plasma sangumeo y se detecto usando el ensayo de APP para cuatro longitudes de amplicon diferentes. El aislamiento y la deteccion se realizaron esencialmente tal como se describio en el ejemplo 18. Se realizo el ensayo de APP para las longitudes de amplicon de APP de 67 pb, 180 pb, 306 pb y 476 pb, y se amplificaron todos los fragmentos de ADN del mismo modo. Se comparo la recuperacion de ADN con el ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp.

Los resultados se muestran en la figura 20. La adicion de sal al tampon de elucion aumenta la recuperacion de fragmentos de ADN mas largos. Por tanto, puede lograrse una elucion selectiva de tamano ajustando las concentraciones de sal. Esto significa, en esencia, que cuanto mas sal se use, mayor es la tasa de recuperacion de ADN de fragmentos de ADN mas largos.

Ejemplo 20: Recuperacion de ADN fetal con el metodo automatizado de la invencion

Se comparo el protocolo de aislamiento de ADNlcc automatizado de la invencion con el metodo de referencia de kit de CNA QIAamp para el aislamiento de ADN fetal a partir de plasma materno. Tras el aislamiento, se detecto ADN fetal usando el ensayo de Dys14/18S. Se usaron 4 ml de plasma materno como volumen de entrada de muestra para el protocolo de QIAsymphony SP, mientras que se usaron 0,4 - 1 ml para el kit de CNA QIAamp. Se realizo el protocolo de QIAsymphony Sp esencialmente tal como se describio en el ejemplo 11. Se realizaron dos etapas de lavado usando Tris 35 mM a pH 7,2 + TritonX-100 al 0,1%. Se eluyo el ADN unido con Tris 35 mM + NaCl 80 mM (pH 10,2) en 100 |il de volumen de elucion. Se realizo la deteccion de ADN fetal usando el ensayo de Dys14/18S tal como se describio en el ejemplo 11. Se uso un 10% del volumen de molde en una reaccion PCR en tiempo real. Finalmente, se calculo la razon entre las copias de ADN del ensayo de Dys14/18S para determinar la fraccion de ADN fetal en %. Los resultados se representan en la figura 21. El porcentaje de ADN fetal detectado dentro del ADNlcc es comparable para el protocolo de QIAsymphony SP (QSSp) y el kit de CNA QIAamp (QIAamp). El ADN fetal puede extraerse completamente usando el metodo automatizado de la invencion.

Ejemplo 21: Enriquecimiento de ADNlcc a partir de muestras de orina, y poli(acido acrilico) aumenta la eficacia de elucion

Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S. Se procesaron manualmente muestras de plasma de 3 ml. Adicionalmente, se proceso orina (3 ml). Se realizaron dos etapas de lavado usando Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 7,2) + TritonX-100 al 0,1%. Se eluyo el ADN unido con Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0) (tambien se uso para la orina), Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0) + PAA al 0,02% o con Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0) + PAA al 0,04%. El volumen de elucion fue de 150 |il. Se cuantifico el ADNlcc eluido usando el ensayo de duplex de 18S doble. Se comparo la recuperacion de ADN con el ADNlcc procesado con el kit de CNA QIAamp. Los resultados se muestran en la figura 22. La adicion de PAA da como resultado una mayor recuperacion de ADN de tanto el fragmento de 66 pb como el de 500 pb. Tambien es posible el enriquecimiento de ADNlcc a partir de orina.

Ejemplo 22: Se eluye facilmente ADNlcc a partir de perlas usando diferentes volumenes de elucion

Se detecto ADNlcc usando el ensayo de duplex de 18S (amplicon de 66 y 500 pb). Se procesaron manualmente muestras de plasma de 3 ml derivadas de 3 donantes diferentes tal como se describio anteriormente. Se realizaron dos etapas de lavado usando Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 7,2) + TritonX-100 al 0,1%.

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Se eluyo el ADN unido con Tris 100 mM + NaCI 154 mM (pH 9), usando un volumen de elucion de 60, 80, 100 o 150 |il. Se cuantifico el ADNlcc eluido con el ensayo de ADNr 18S doble. Los resultados para la deteccion del amplicon de 66 pb se muestran en la figura 23a, y los del amplicon de 500 pb en la figura 23b. La reduccion del volumen de elucion no tiene un efecto significativo sobre la recuperacion de ADN. Sin embargo, un volumen de elucion tan bajo como sea posible es ventajoso con el fin de obtener un alto factor de enriquecimiento. Puede lograrse un alto factor de enriquecimiento usando un alto volumen de entrada de muestra y un bajo volumen de elucion.

Ejemplo 23: Union y liberacion altamente eficaces de ADNlcc a partir de plasma

Se procesaron manualmente muestras de plasma de 3 ml derivadas de 3 donantes diferentes tal como se describio anteriormente. Tras la union del ADNlcc a las perlas, se guardo la fraccion de sobrenadante. Se realizaron dos etapas de lavado usando Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 7,2) + TritonX-100 al 0,1%. Se eluyo el ADN unido con un protocolo de 2 etapas: En primer lugar, se realizo la elucion con Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9) en un volumen de elucion de 150 |il. Luego, se libero el ADN residual de las perlas con 150 |il de NaOH 40 mM. Antes de la deteccion por qPCR, se neutralizo la fraccion de NaOH. Se realizo la deteccion de ADNlcc usando el ensayo de ADNr 18S doble para el amplicon de 66 pb y el de 500 pb tal como se describio en el ejemplo 2.

Los resultados se muestran en la figura 24. Basicamente, no puede detectarse ADNlcc no unido en el sobrenadante. Ademas, no puede detectarse ADNlcc residual en las fracciones de elucion de NaOH. Por tanto, el ADNlcc puede unirse completamente a partir de plasma a perlas magneticas y liberarse de nuevo en un tampon de elucion. Esto da como resultado buenas tasas de recuperacion.

Ejemplo 24: La limpieza de eluatos antes de la deteccion por PCR esta obsoleta - ausencia de efecto inhibidor de PCR en eluatos

En este experimento se sometio a prueba si los eluatos pueden comprender inhibidores de PCR. Para ese fin, se procesaron manualmente muestras de plasma de 3 ml derivadas de 2 donantes diferentes tal como se describio anteriormente. Se realizaron dos etapas de lavado usando agua libre de ARNasa + TritonX-100 al 0,1%. Se eluyo el ADN unido con un protocolo de 2 etapas: La primera elucion se realizo con Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 7,2) en un volumen de elucion de 150 |il. La segunda elucion se realizo con Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0), de nuevo en un volumen de elucion de 150 |il. Se usaron 100 |il del primero y segundo eluato como entrada de muestra para una limpieza usando el kit de CNA QIAamp. Se usaron entonces un volumen de molde del 5% de la fraccion de 50 |il restante y de la fraccion de 100 |il limpiada para la deteccion por PCR en tiempo real segun el ensayo ADNr 18S doble (amplicon de 66 pb y 500 pb). ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp sirvio como referencia.

Los resultados para el amplicon de 66 pb se muestran en la figura 25a, los resultados para el amplicon de 500 pb en la figura 25b. Los amplicones de 66 pb y 500 pb del ADNr 18S solo pueden detectarse en eluatos a pH 9,0, pero no en eluatos a pH 7,2. Esto significa que la elucion es altamente dependiente del pH y, por tanto, puede controlarse mediante el valor de pH. La deteccion de los fragmentos de 66 pb y 500 pb es igualmente eficaz en eluatos directos y limpiados. Por tanto, no puede observarse un efecto inhibidor de PCR en los eluatos.

Ejemplo 25: Comparacion entre el volumen de perlas, el tipo y la influencia de PAA

Se procesaron manualmente muestras de plasma de 3 ml derivadas de 3 donantes diferentes tal como se describio anteriormente. Se usaron 3 mg o 7,5 mg de perlas de tipo II. Adicionalmente, se sometieron a prueba perlas de tipo I, tratadas con PAA. Se incubaron las perlas durante la noche en una disolucion de PAA acuosa, se desecho el sobrenadante. Tras la union, se realizaron dos etapas de lavado usando agua libre de ARNasa + TritonX-100 al 0,1%. Se eluyo el ADN unido de las perlas de tipo II usando un protocolo de elucion de 2 etapas tal como se describio en el ejemplo 24 adicional. Se eluyo el ADN unido de las perlas de tipo I o bien con 150 |il de Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0) + PAA 15 mg/ml o bien con 150 |il de Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0) + PAA 20 mg/ml. ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp sirvio como referencia. Se uso un 5% del volumen eluido en la PCR en tiempo real. Tal como se muestra en la figura 26, un aumento del volumen de perlas conduce a una mejor recuperacion de ADN. Perlas de tipo I y tipo II conducen a resultados comparables, si se anade PAA a las perlas de tipo I. Ademas puede observarse que no se eluye ADN de las perlas de tipo II durante la 1a etapa de elucion.

Ejemplo 26: Comparacion entre diferentes tipos y volumenes de perlas

Se procesaron manualmente muestras de plasma de 3 ml derivadas de 8 donantes diferentes tal como se describio en el ejemplo 25. Sin embargo, para la union, se anadieron 3 mg de perlas de tipo I tratadas con PAA y 3 mg o 7,5 mg de perlas de tipo II para la union de ADNlcc. Tras las dos etapas de lavado, se eluyo el ADN unido de las perlas de tipo I con 150 |il de Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 9,0), mientras que se eluyo el ADN unido de las perlas de tipo II usando un protocolo de elucion de 2 etapas tal como se describio en el ejemplo 24. Se uso el 5% del volumen eluido para la deteccion por PCR en tiempo real segun el ensayo de ADNr 18S doble (amplicon de 66 pb y 500 pb). ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp sirvio como control.

Ejemplo 27: Enriquecimiento de ADNIcc a partir de suero

En este experimento se comparo la recuperacion de ADNIcc tras la union a partir de muestras de suero y de plasma. Se procesaron manualmente muestras de plasma o suero de 4 ml tal como se describio anteriormente. Tras la union, no se realizaron etapas de lavado. Se guardo el sobrenadante obtenido a partir de plasma para analisis 5 adicional. Se eluyo el ADN unido a las perlas usando Tris 100 mM + NaCl 154 mM (pH 8,5) en un volumen de elucion de 1 ml. Se procesaron los eluatos y el sobrenadante usando el kit de CNA QIAamp, y se eluyo el ADN en un volumen de elucion de 60 |il. Se uso un 10% del volumen eluido en el ensayo de ADN 18S doble. ADNlcc aislado con el kit de CNA QIAamp sirvio como referencia.

La figura 28 muestra que puede unirse completamente ADNlcc a partir de plasma y tambien puede eluirse y por 10 tanto recuperarse de las perlas. Ademas, tambien puede recuperarse ADNlcc a partir de muestras de suero.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de una muestra uniendo los acidos nucleicos extracelulares a una fase solida que porta grupos de intercambio anionico, en el que dicho metodo comprende las siguientes etapas:

   a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH de < 6,5 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas;

   b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

   c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

   d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida, en el que la elucion se produce a un segundo pH que se encuentra en el intervalo de > 8 a < 14;

   en el que la muestra es una muestra libre de celulas o reducida en celulas que se obtuvo a partir de un lfquido corporal eliminando las celulas mediante separacion y en el que los acidos nucleicos extracelulares son ADN extracelular.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, que comprende las siguientes etapas:

   a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH de < 6,5 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas y en el que la muestra constituye al menos el 85% del volumen de la mezcla de union;

   b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

   c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

   d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida, en el que la elucion se produce a un segundo pH que se encuentra en el intervalo de > 8 a < 14.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende las siguientes etapas:

   a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH < 6 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas, en el que la muestra constituye al menos el 85% del volumen de la mezcla de union y en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas que portan grupos amino terciarios, preferiblemente grupos dialquilamino, mas preferido grupos dietilaminopropilo;

   b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

   c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

   d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida, en el que la longitud de los acidos nucleicos que se eluyen y la longitud de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la resina de intercambio anionico se controla ajustando las condiciones de elucion, en el que acidos nucleicos que tienen una longitud de aproximadamente 1000 nt o mas, preferiblemente 700 nt o mas, mas preferido 500 nt o mas permanecen unidos predominantemente a la fase solida en dicha etapa de elucion.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que se logra una elucion selectiva de acidos nucleicos cortos en la etapa d. ajustando la concentracion de cargas positivas sobre la superficie de la fase solida de modo que solo las moleculas de acido nucleico mas largas permanecen unidas a la fase solida durante la etapa d. mientras que los acidos nucleicos mas pequenos se eluyen, en el que el valor de corte se controla mediante la eleccion del valor de pH que se usa durante la elucion.
5. 5. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1, 3 o 4, en el que en la etapa d., se eluyen selectivamente acidos nucleicos extracelulares segun su tamano y en el que dicha etapa de elucion de fraccionamiento por tamano comprende eluir una porcion de los acidos nucleicos extracelulares unidos a la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH, en el que la longitud promedio de los acidos nucleicos eluidos de la fase solida en esta etapa es mas corta que la longitud promedio de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida.

   5

   10

   15

   20

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   30

   35

   40

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6. 6. Metodo segun la reivindicacion 2, para aislar acidos nucleicos extracelulares a partir de la muestra libre de celulas o reducida en celulas, preferiblemente plasma o suero, uniendo los acidos nucleicos extracelulares a una fase solida que porta grupos de intercambio anionico, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas que portan preferiblemente aminas terciarias, que comprende las siguientes etapas

   a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH < 6 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas y en el que la muestra constituye al menos el 85% del volumen de la mezcla de union;

   b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

   c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

   d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida, en el que en la etapa d., se eluyen selectivamente

   acidos nucleicos extracelulares segun su tamano y en el que dicha etapa de elucion de fraccionamiento por tamano comprende eluir una porcion de los acidos nucleicos extracelulares unidos a la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH y > 8, en el que la longitud promedio de los acidos nucleicos eluidos de la fase solida en esta etapa es mas corta que la longitud promedio de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida y en el que acidos nucleicos que tienen una longitud de aproximadamente

   1000 nt o mas, preferiblemente 700 nt o mas, mas preferido 500 nt o mas permanecen unidos

   predominantemente a la fase solida en dicha etapa de elucion.
7. 7. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en la etapa d) los acidos nucleicos se eluyen

   selectivamente segun su tamano, en el que el valor de corte se controla mediante el valor de pH y/o la

   concentracion de sal usados durante la elucion.
8. 8. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra se divide y las porciones de muestra se procesan en paralelo y se reunifican o bien los eluatos o bien el material de intercambio anionico antes de la elucion.
9. 9. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa a) tiene una o mas de las siguientes caractensticas:

   i) el primer pH esta por debajo del valor de pKa de un grupo protonable de los grupos de intercambio anionico de la fase solida;

   ii) al menos un reactivo y/o compuesto acidificante, preferiblemente una disolucion acida, se anade a la muestra para ajustar el primer pH;

   iii) el primer pH es < 6;

   iv) el primer pH se encuentra en un intervalo seleccionado desde 4 hasta 6,5, de 4,5 a 6,5, de 5 a 6,5 y de 5 a

   6;

   v) la muestra constituye al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 97% del volumen de la mezcla de union; y/o

   vi) la mezcla de union se prepara ajustando el pH de la muestra al primer pH.
10. 10. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra tiene una o mas de las siguientes caractensticas:

    a) es una muestra libre de celulas o reducida en celulas derivada eliminando celulas mediante separacion de una muestra seleccionada del grupo que consiste en sangre completa, plasma, suero, lfquido linfatico, orina, licor, lfquido cefalorraqrndeo, ascitis, leche, lavado bronquial, saliva, lfquido amniotico y semen/lfquido seminal;

    b) se selecciona de plasma y/o suero;

    c) es plasma;

    d) es una muestra estabilizada; y/o

    e) es una muestra de plasma estabilizada.
11. 11. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los acidos nucleicos extracelulares aislados tienen una o mas de las siguientes caractensticas:

    a) se afslan como una porcion del acido nucleico total aislado a partir de la muestra;

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    b) comprenden acidos nucleicos circulantes extracelulares;

    c) comprenden acidos nucleicos relacionados con una enfermedad;

    d) comprenden acidos nucleicos asociados a tumor o derivados de tumor;

    e) comprenden acidos nucleicos relacionados con inflamacion;

    f) comprenden acidos nucleicos fetales;

    g) comprenden acidos nucleicos virales;

    h) comprenden acidos nucleicos patogenos y/o

    i) comprenden acidos nucleicos extracelulares de mairnfero.
12. 12. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la etapa d) se eluyen acidos nucleicos extracelulares de la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH que se uso para unir el acido nucleico extracelular a la fase solida y en el que el metodo tiene una o mas de las siguientes caractensticas:

    i) se usa una disolucion de elucion en la etapa d;

    ii) en la etapa d, se eluyen selectivamente acidos nucleicos extracelulares segun su tamano y en el que dicha etapa de elucion de fraccionamiento por tamano comprende las siguientes etapas:

    aa) una porcion de los acidos nucleicos extracelulares unidos a la fase solida se eluye de la misma a un segundo pH que es mayor que el primer pH, en el que la longitud promedio de los acidos nucleicos eluidos de la fase solida en esta etapa es mas corta que la longitud promedio de los acidos nucleicos que permanecen unidos a la fase solida;

    bb) opcionalmente eluir los acidos nucleicos extracelulares que permanecen unidos a la fase solida en la etapa aa) de la fase solida preferiblemente a un tercer pH que es mayor que el segundo pH.
13. 13. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la fase solida que se usa para unir los acidos nucleicos extracelulares tiene una o mas de las siguientes caractensticas:

    (i) la fase solida porta un tipo de grupo de intercambio anionico que esta cargado positivamente al primer pH;

    (ii) la fase solida porta un tipo de grupo de intercambio anionico que comprende un grupo protonable, y el valor de pKa del grupo protonable esta preferiblemente en el intervalo de desde 8 hasta 12, preferiblemente desde 9 hasta 11;

    (iii) la fase solida porta un tipo de grupo de intercambio anionico que comprende un atomo de nitrogeno, preferiblemente el grupo de intercambio anionico es un grupo amino, en particular un grupo amino terciario tal como un grupo dialquilamino, preferiblemente un grupo dietilamino;

    (iv) la fase solida porta ligandos inertes que no se unen fuertemente a acidos nucleicos al primer pH, preferiblemente el ligando inerte es un ligando no cargado, en particular un ligando que comprende al menos un grupo hidroxilo, preferiblemente un ligando que comprende un grupo 2,3-dihidroxipropilo;

    (v) la fase solida porta los grupos de intercambio anionico y ligandos inertes en una razon en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:10, preferiblemente desde aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 1:5, mas preferiblemente de aproximadamente 1:3; y/o

    (vi) la superficie de la fase solida se derivatiza con un compuesto de silano que comprende el grupo de intercambio anionico y preferiblemente no se derivatiza con otro compuesto de silano.
14. 14. Metodo segun una o mas de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el metodo comprende eliminar mediante separacion celulas del lfquido corporal antes de la etapa a) proporcionando de ese modo la muestra reducida en celulas o libre de celulas que comprende acidos nucleicos extracelulares.
15. 15. Metodo segun la reivindicacion 1, que comprende las siguientes etapas:

    a. acidificar la muestra para establecer las condiciones de union y unir los acidos nucleicos extracelulares a la fase solida en una mezcla de union que tiene un primer pH < 6 que permite la union de los acidos nucleicos extracelulares a los grupos de intercambio anionico de la fase solida, en el que la fase solida esta dotada de partfculas magneticas;

    b. separar la fase solida con los acidos nucleicos extracelulares unidos;

    c. opcionalmente lavar los acidos nucleicos extracelulares;

    d. eluir los acidos nucleicos extracelulares de la fase solida a un segundo pH que es mayor que el primer pH que se uso para unir el acido nucleico extracelular a la fase solida y que se encuentra en el intervalo de > 8 a < 14;

    5 e. aislar los acidos nucleicos extracelulares del eluato.
16. 16. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo se realiza usando un sistema automatizado.