CN106232812A - 短链核酸的回收方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的短链核酸的回收方法具有下述工序：工序(a)，使将全血试样与含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上的第1缓冲液混合而成的混合物与第1核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的核酸吸附于所述第1核酸吸附体，然后将所述第1核酸吸附体分离除去，回收液性成分，所述混合物不含有醇或醇浓度为5容量％以下；工序(b)，使将通过所述工序(a)回收的液性成分与含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上及醇的第2缓冲液混合而成的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体从所述回收的液性成分中分离回收，所述混合物的醇浓度为10容量％以上；和工序(c)，从在所述工序(b)中回收的所述第2核酸吸附体中将核酸洗脱、回收。

Description

短链核酸的回收方法
技术领域
本发明涉及从大量含有基因组DNA等长链核酸的全血试样中有效地回收循环DNA等链长较短的核酸的方法。
本申请基于2014年4月18日在日本申请的日本特愿2014-086247号主张优先权，将其内容援引于此。
背景技术
现在，在全血(末梢血)中循环的游离核酸在癌诊断领域中非常引人注目。全血中循环核酸(DNA/RNA)被用于癌瘤或与癌瘤相关的残留病变的诊断、癌瘤预后的诊断、对受癌瘤侵扰的人的疾病进程进行监测、或对针对恶性肿瘤的抗癌治疗的效果进行观察等各种目的。
据报告全血中循环核酸(DNA/RNA)在从核内释放到末梢血中时会受到损伤、片段化进展，其结果，以单或聚核小体(核小体：DNA卷绕成组蛋白8倍体而成的结构体)形式在末梢血中循环。全血中的循环DNA的长度据报告有各种各样，但报告通常为约100～800bp。
特别是，单核小体中的DNA的碱基数是非常短的链，为148bp，短至无法与全血中的来自血细胞的基因组DNA的链长相比的程度。据报告由于链长如此地短，与长链核酸相比更难以回收。
另一方面，用于对核酸进行精制的现有技术的方法几乎均是基于以下2种原理之一。自古使用的方法大多是基于在全血试样等含有核酸的试样中混合含有离液剂的缓冲液及有机提取剂以提取核酸的一步工序法的方法。作为有机提取剂，主要使用苯酚及氯仿中的至少一个。将蛋白等杂质与有机相一起废弃，保持于水相的核酸通过相分离处理分离而回收。该方法中，存在必须使用有毒且有害的有机提取剂和为了从通过相分离处理回收的水相中进行核酸的精制需要繁杂的工序等问题。
考虑到一步工序法的缺点，还建立了一步工序法的代替方法。所述代替法是基于核酸对二氧化硅等固相载体(核酸吸附体)的选择性吸附的方法。使含有核酸的试样在根据需要溶解后与核酸吸附体接触，从而使所述试样中的核酸吸附于所述核酸吸附体。将吸附于核酸吸附体的核酸在适当的缓冲液的作用下从所述核酸吸附体中被洗脱。作为所述方法的代表例，可列举出Boom法(例如参照专利文献1)。Boom法为通过将含有核酸的试样与离液剂-缓冲液和DNA结合固相(核酸吸附体)一起孵育而从所述试样中分离核酸的方法。利用离液剂-缓冲液，可实现从试样中的细胞提取核酸和所提取的核酸在核酸吸附体上的吸附这两者。另外，作为与上述方法类似的方法，例如专利文献2中也公开了下述方法：使含有核酸的试样在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换体接触、在使所述试样中的核酸吸附后，用高离子强度的缓冲液从所述阴离子交换体使核酸洗脱，进而使洗脱的核酸在低级醇存在下吸附于无机质载体材料，然后利用水或低离子强度的缓冲液从所述无机质载体材料中回收核酸。
链长较长的核酸比链长短的核酸更易吸附于核酸吸附体。因此，使用采用核酸吸附体的这些方法从全血试样中回收核酸时，来自血细胞的长链DNA比链长短的循环DNA更优先地被回收，从而难以选择性地回收循环DNA。因而，以往通过对从全血试样中预先除去了血细胞成分的血浆或血清进行利用了核酸吸附体的核酸回收方法来回收循环DNA。但是，此时存在下述问题：为了回收血浆或血清需要离心分离装置等特别的装置，若不是在设备齐备的环境下则无法实施。
另外，作为对短链核酸进行浓缩的技术或从长链核酸分离短链核酸的技术，例如专利文献3中公开了下述方法：在至少1种离液剂化合物及25～35容量％的支链的醇和非支链的醇中的至少1种的存在下，使含有核酸的试样与核酸吸附体接触，然后将吸附于所述核酸吸附体的核酸洗脱。另外，专利文献4中公开了下述方法：不使用离液剂盐而通过将柠檬酸盐与醇并用来使短链核酸优先地吸附于核酸吸附体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5234809号说明书
专利文献2：国际公开第1993/11221号小册子
专利文献3：日本特表2011-522529号公报
专利文献4：国际公开第2007/065934号小册子
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供不需要血清分离或血浆分离而直接从全血试样中高效地回收循环DNA等1000个碱基长度以下的短链DNA的方法、及所述方法中使用的试剂盒。
用于解决课题的方法
本发明方式的短链核酸的回收方法、短链核酸的精制方法及短链核酸回收用试剂盒如下所述。
[1]本发明第一方式的短链核酸的回收方法具有下述工序：工序(a)，使将全血试样与含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上的第1缓冲液混合而成的混合物与第1核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的核酸吸附于所述第1核酸吸附体，然后将所述第1核酸吸附体分离除去，回收液性成分，所述混合物不含有醇或醇浓度为5容量％以下；工序(b)，使将通过所述工序(a)回收的液性成分与含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上及醇的第2缓冲液混合而成的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体从所述回收的液性成分中分离回收，所述混合物的醇浓度为10容量％以上；和工序(c)，从在所述工序(b)中回收的所述第2核酸吸附体中将核酸洗脱、回收。
[2]来自所述全血试样的5000个碱基长度以上的核酸还可以通过在所述工序(a)中吸附于核酸吸附体而被分离除去。
[3]所述第1缓冲液可以含有胍盐酸盐及表面活性剂，胍盐酸盐的浓度可以为1mol/L以上且最大溶解度以下，表面活性剂的浓度可以为1～10容量％。
[4]所述醇可以为异丙醇或乙醇，所述工序(b)中的通过所述工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合物的醇浓度可以为10～60容量％。
[5]所述醇可以为异丙醇，所述工序(b)中的通过所述工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合物的异丙醇浓度可以为10～40容量％。
[6]所述第2缓冲液可以含有选自由硫氰酸胍及硫氰酸胍组成的组中的1种以上的离液剂和表面活性剂，离液剂的浓度可以为0.5mol/L以上且最大溶解度以下，表面活性剂的浓度可以为3～15容量％。
[7]所述第2缓冲液可以含有10～200mmol/L的阳离子盐。
[8]所述工序(b)可以为：工序(b’)，在通过所述工序(a)回收的液性成分中添加蛋白分解酶，进行酶反应；和工序(b”)，在所述工序(b’)之后，使所述液性成分和第2缓冲液的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体分离回收。
[9]所述第1核酸吸附体或所述第2核酸吸附体可以为选自由含硅酸物质、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、磁性粒子、陶瓷及聚苯乙烯组成的组中的1种以上。
[10]所述含硅酸物质可以为硅石、磁性硅石、玻璃或二氧化硅。
[11]所述短链核酸可以为循环DNA。
[12]本发明第二方式的从全血试样中精制短链核酸的方法使用上述第一方式的短链核酸的回收方法。
[13]本发明第三方式的短链核酸回收用试剂盒为上述第一方式的短链核酸的回收方法中使用的试剂盒，其含有：第1缓冲液，其含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上，并且用于按照醇浓度达到5容量％以下的方式与全血试样混合；第2缓冲液，其含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上及醇，并且用于与液性成分按照醇浓度达到10容量％以上的方式混合，所述液性成分是通过使核酸吸附体与所述第1缓冲液和所述全血试样的混合物接触，然后将所述核酸吸附体分离除去而得到的；和核酸吸附体。
[14]上述第三方式的短链核酸回收用试剂盒可以用于从全血试样中回收循环DNA。
发明效果
通过本发明一个方式的短链核酸的回收方法，能够从来自血细胞的基因组DNA(通常为数万～3亿bp)等长链核酸和循环DNA等(100bp～1000bp)短链核酸混合存在的全血试样中不需要血清分离处理或血浆分离处理地将短链核酸高效地回收。即，通过本发明一个方式的短链核酸的回收方法，即使在没有血清分离处理或血浆分离处理所需的离心分离装置等设备的机构中也能够实现从全血试样中有效地对循环DNA等短链核酸进行精制。
附图说明
图1为示出参考例3中对所回收的洗脱液进行琼脂糖电泳的结果的图。
图2为示出实施例1中对所回收的洗脱液进行琼脂糖电泳的结果的图。
图3为示出实施例2中对所回收的洗脱液进行琼脂糖电泳的结果的图。
具体实施方式
<短链核酸的回收方法>
本发明一个实施方式的短链核酸的回收方法(以下有时称为“本实施方式的核酸回收方法”)是基于通过使核酸吸附于核酸吸附体来回收核酸的原理、从全血试样中回收1000个碱基长度以下的短链核酸的方法，其利用了短链核酸对核酸吸附体的吸附性受醇浓度的强烈影响的性质。短链核酸对核酸吸附体的吸附性在醇浓度低或不存在醇的环境下非常弱(低)、在醇浓度高的环境下强(高)。长链核酸对核酸吸附体的吸附性也受醇浓度的影响，但与低链核酸相比其影响较小、特别是基因组DNA这样核酸非常长时，即使在不存在醇的环境下核酸的大部分也吸附于核酸吸附体。因而，本实施方式的核酸回收方法中，首先，从全血试样中将在醇浓度低或不存在醇的环境下吸附于核酸吸附体的核酸除去，然后使剩余核酸在醇浓度高的环境下吸附于核酸吸附体来进行回收。
具体而言，本实施方式的核酸回收方法的特征在于具有以下的工序(a)～(c)。下述工序(a)中的全血试样与第1缓冲液的混合物不含有醇或醇浓度为5容量％以下，下述工序(b)中的通过所述工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合物的醇浓度为10容量％以上。
本实施方式的核酸回收方法具有下述工序：
(1)工序(a)，使全血试样与第1缓冲液的混合物与第1核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的核酸吸附于所述第1核酸吸附体，然后将所述第1核酸吸附体分离除去，回收液性成分；
(2)工序(b)，使通过所述工序(a)回收的液性成分和第2缓冲液的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体从液性成分中分离回收；和
(3)工序(c)，从在所述工序(b)中回收的所述第2核酸吸附体中将核酸洗脱、回收。
工序(a)中，全血试样与第1缓冲液的混合物的醇浓度低至5容量％以下(包括0容量％)，因此短链核酸几乎不吸附于第1核酸吸附体，而基因组DNA等长链核酸优先地吸附。因此，通过将吸附有核酸的第1核酸吸附体分离除去，长链核酸被优先地从来自全血试样的核酸中除去，其结果，剩余的液性成分中短链核酸的存在比相对地增高。
接着，工序(b)中，通过在该回收的液性成分中混合第2缓冲液，由此使其在醇浓度调整为10容量％以上的状态下与第2核酸吸附体接触，由此使所述液性成分中的短链核酸吸附于第2核酸吸附体。
其后，作为工序(c)，通过从在工序(b)中回收的第2核酸吸附体将核酸洗脱，能够将来自全血试样的含有短链核酸的核酸回收。
关于在相同环境下对核酸吸附体的吸附性，长链核酸的吸附性比短链核酸的吸附性高。因此，在全血试样直接混合含有醇的缓冲液、并在醇存在下使其吸附于核酸吸附体时，长链核酸优先地吸附、短链核酸几乎不吸附，因此从所述核酸吸附体回收的核酸中几乎不含有短链核酸。与此相对，本实施方式的核酸回收方法中，首先，通过使来自全血试样的核酸中的长链核酸在短链核酸的吸附性弱的环境下吸附于核酸吸附体而除去，然后使未吸附于所述核酸吸附体的剩余核酸在短链核酸也可吸附的环境下吸附于新的核酸吸附体而回收。在从来自全血试样的核酸中除去长链核酸的大部分后，通过使短链核酸吸附于核酸吸附体，能够将短链核酸高效地回收。
本实施方式中示出了使用2个核酸吸附体的例子，但是也可以是下述工序：在用1个核酸吸附体将长链核酸回收后，将吸附于核酸吸附体的长链核酸洗脱、对核酸吸附体进行洗涤，然后将短链核酸吸附、进行回收。
本实施方式中使用的第1缓冲液含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上。所含有的离液剂可以仅为1种、也可以组合使用2种以上。同样地，所含有的表面活性剂可以仅为1种、也可以组合使用2种以上。作为第1缓冲液，优选含有1种或2种以上的离液剂和1种或2种以上的表面活性剂的缓冲液。
作为所述离液剂，可列举出胍盐酸盐(GHCl)、硫氰酸胍(GTC)、异硫氰酸胍(GITC)等胍盐、碘化钠、高氯酸钠等。作为第1缓冲液所含有的离液剂，优选胍盐、更优选胍盐酸盐。
作为所述表面活性剂，可以适当选择从生物体试样中提取核酸时本技术领域中通常使用的表面活性剂。作为第1缓冲液所含有的表面活性剂，可以是SDS(十二烷基硫酸钠)等离子性表面活性剂，但优选非离子性表面活性剂，更优选Triton(注册商标)X(聚氧乙烯(10)辛基苯基醚)、Tween(注册商标)20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇月桂酸酯)、Tween(注册商标)40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Tween(注册商标)60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、Tween(注册商标)80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Nonidet(注册商标)P-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、Brij(注册商标)35(聚氧乙烯(23)月桂基醚)、Brij(注册商标)58(聚氧乙烯(20)十六烷基醚)、洋地黄皂苷或皂素(saponin)等，进一步优选Triton X、Tween20或NonidetP-40。
第1缓冲液含有离液剂时，离液剂的浓度只要是从全血试样中的细胞提取核酸所需的充分浓度即可，可以在考虑所使用的离液剂的种类、有无将离液剂与表面活性剂并用等的基础上进行适当调节。例如，第1缓冲液的离液剂的浓度优选为1mol/L以上且最大溶解度以下，更优选为2mol/L以上且最大溶解度以下。
第1缓冲液含有表面活性剂时，表面活性剂的浓度只要是从全血试样中的细胞提取核酸所需的充分浓度即可，可以在考虑所使用的表面活性剂的种类、有无将表面活性剂与离液剂并用等的基础上进行适当调节。例如，第1缓冲液的表面活性剂的浓度优选为1～10容量％、更优选为2～5容量％。
第1缓冲液优选不含有醇的缓冲液，也可以含有醇。第1缓冲液含有醇时，适当调节第1缓冲液的醇浓度及第1缓冲液与全血试样的混合比以使全血试样与第1缓冲液的混合物的醇浓度达到5容量％以下。通过将全血试样与第1缓冲液的混合物的醇浓度调节至5容量％以下，可以使吸附于被分离除去的第1核酸吸附体的500个碱基长度以下的短链核酸的量小于检出限值。
第1缓冲液所含有的醇可以仅为1种、也可以组合使用2种以上。作为所述醇，优选使用支链状或直链状的碳原子数为1～5的烷醇类，更优选异丙醇或异丙醇与乙醇的混合溶剂，进一步优选异丙醇。
本实施方式中使用的第2缓冲液含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上。所含有的离液剂可以仅为1种、也可以组合使用2种以上。同样地，所含有的表面活性剂可以仅为1种、也可以组合使用2种以上。作为第2缓冲液，优选含有1种或2种以上的离液剂和1种或2种以上的表面活性剂的缓冲液。
作为第2缓冲液可含有的离液剂，可列举出与第1缓冲液可含有的化合物同样的化合物。作为第2缓冲液所含有的离液剂，优选胍盐，更优选即使少量也发挥强烈的离液效果的硫氰酸胍或异硫氰酸胍。
作为第2缓冲液可含有的表面活性剂，可列举出与第1缓冲液可含有的化合物同样的化合物。作为第2缓冲液所含有的表面活性剂，优选非离子性表面活性剂，更优选Triton(注册商标)X(聚氧乙烯(10)辛基苯基醚)、Tween(注册商标)20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇月桂酸酯)、Tween(注册商标)40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Tween(注册商标)60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、Tween(注册商标)80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Nonidet(注册商标)P-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、Brij(注册商标)35(聚氧乙烯(23)月桂基醚)、Brij(注册商标)58(聚氧乙烯(20)十六烷基醚)、洋地黄皂苷或皂素等，进一步优选Triton X、Tween20或NonidetP-40。
第2缓冲液含有离液剂时，离液剂的浓度只要是用第1缓冲液从细胞提取到的核酸维持被提取的状态所需的充分浓度即可，可以在考虑所使用的离液剂的种类、有无将离液剂与表面活性剂并用等的基础上适当调节。例如第2缓冲液的离液剂的浓度优选为0.5mol/L以上且最大溶解度以下，更优选为1mol/L以上且最大溶解度以下，进一步优选为2mol/L以上且最大溶解度以下。
第2缓冲液含有表面活性剂时，表面活性剂的浓度只要是用第1缓冲液从细胞提取到的核酸维持被提取的状态所需的充分浓度即可，可以在考虑所使用的离液剂的种类、有无将表面活性剂与离液剂并用等的基础上适当调节。例如，第2缓冲液的表面活性剂的浓度优选为3～15容量％、更优选为7～11容量％。
第2缓冲液含有醇。第2缓冲液所含有的醇可以仅为1种、也可以组合使用2种以上。作为所述醇，优选使用从生物体试样中提取/精制核酸时本技术领域中通常使用的支链状或直链状的碳原子数为1～5的烷醇类。作为所述烷醇类，可列举出甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或戊醇。作为第2缓冲液所含有的醇，优选核酸沉淀效果与异丙醇同等的醇，更优选乙醇、异丙醇或它们的混合溶剂，进一步优选异丙醇或异丙醇与乙醇的混合溶剂、更进一步优选异丙醇。
适当调节第2缓冲液的醇浓度及通过工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合比以使所述液性成分与第2缓冲液的混合物的醇浓度达到10容量％以上。第2缓冲液所含有的醇为异丙醇时，第2缓冲液的异丙醇浓度及所述液性成分与第2缓冲液的混合比优选被调节至所述液性成分与第2缓冲液的混合物的异丙醇浓度达到10～40容量％。第2缓冲液所含有的醇为乙醇时，第2缓冲液的乙醇浓度及所述液性成分与第2缓冲液的混合比优选被调节至所述液性成分与第2缓冲液的混合物的乙醇浓度达到30～60容量％。
本实施方式中使用的第2缓冲液优选还进一步含有阳离子盐。作为所述阳离子盐，可以是1价的阳离子盐，也可以是2价的阳离子盐。作为构成阳离子盐的阳离子，可列举出锂离子、钠离子、钾离子、铷离子、铯离子、铵离子、镁离子、钙离子、锶离子，优选锂离子、钠离子、镁离子或钙离子。作为构成阴离子盐的阴离子，优选氯化物离子、溴化物离子或碘化离子，更优选氯化物离子或溴化物离子，进一步优选氯化物离子。
第2缓冲液含有阳离子盐时，第2缓冲液的阳离子盐浓度只要是利用醇沉淀法可从生物体试样中对核酸进行提取/精制的浓度即可，可在考虑所使用的阳离子盐的种类的基础上适当决定。作为本实施方式中使用的第2缓冲液，考虑到将所回收的短链核酸用于PCR等通常使用的分析，优选为10～200mmol/L。
所述第1缓冲液通过在水或缓冲液中溶解离液剂盐及表面活性剂中的至少1种、和根据需要的醇或其他成分来制备。所述第2缓冲液通过在水或缓冲液中溶解离液剂盐及表面活性剂中的至少1种、醇、以及根据需要的阳离子盐或其他成分来制备。用于制备第1缓冲液及第2缓冲液的溶剂为缓冲液时，所述缓冲液的pH可在考虑所提取的目标核酸的种类(DNA还是RNA)、所回收的核酸被供于的分析方法等的基础上适当决定。本实施方式中，所述第1缓冲液及第2缓冲液优选pH为5～9，更优选pH为6.5～8.5。所提取的目标核酸为DNA时，特别优选pH为7.0～8.5。作为用于制备第1缓冲液及第2缓冲液的溶剂的缓冲液可以从核酸的提取或精制、分析时本该技术领域中通常使用的缓冲液中适当选择使用。作为所述缓冲液，具体而言，可列举出Tris(三羟基甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液、磷酸缓冲液等。作为用于制备第1缓冲液及第2缓冲液的溶剂的水，优选脱离子水或超纯水。
其中，只要不会影响本实施方式的效果，所述第1缓冲液及第2缓冲液中可以含有除离液剂、表面活性剂、醇、阳离子盐以外的其他物质。
作为本实施方式中使用的第1核酸吸附体及第2核酸吸附体，只要是核酸能够吸附的固体则没有特别限定。作为所述该核酸吸附体的原料，优选为选自由硅石(silica)、磁性硅石、玻璃、二氧化硅(silicon dioxide)等含硅酸物质、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、磁性粒子、陶瓷及聚苯乙烯组成的组中的1种以上，更优选含硅酸物质。其中，进一步优选硅膜(silica membrane)、硅胶(silica gel)、表面上具有硅石或玻璃的磁性粒子、或者将它们组合而成的材料。其中，第1核酸吸附体及第2核酸吸附体可以使用同种材料。
第1核酸吸附体及第2核酸吸附体的形状没有特别限定，可以是粒子状，也可以是膜状，还可以是固着于容器等的内壁表面的形状。
以下，对各工序进行说明。
首先，作为工序(a)，使全血试样与第1缓冲液的混合物与第1核酸吸附体接触。全血试样与第1缓冲液的混合物中，在来自第1缓冲液的离液剂或表面活性剂的作用下，核酸被从所述全血试样中的细胞中提取出来。
通过使该混合物与第1核酸吸附体接触，使所提取的核酸吸附于所述核酸吸附体。例如，第1核酸吸附体为粒状时，通过在全血试样与第1缓冲液的混合物中添加所述核酸吸附体，能够使所述混合物与所述核酸吸附体接触。另外，第1核酸吸附体固着于容器等的内壁表面时，通过在该容器内将全血试样与第1缓冲液混合或者将全血试样与第1缓冲液的混合物加入所述容器内，可以使所述混合物与所述核酸吸附体接触。
使来自全血试样的核酸吸附于第1核酸吸附体，然后将第1核酸吸附体分离除去，回收液性成分。第1核酸吸附体的分离除去及液性成分的回收可通过通用的固液分离操作进行。例如，第1核酸吸附体为粒子状时，对含有第1核酸吸附体的溶液(全血试样、第1缓冲液和第1核酸吸附体的混合物)进行离心分离处理，使所述核酸吸附体沉淀，然后回收上清，由此能够仅回收液性成分。另外，通过使含有第1核酸吸附体的溶液从核酸吸附体无法透过程度的孔径大小小的多孔质膜或滤纸中通过，还能够仅回收从多孔质膜或滤纸中通过的液性成分。此外，第1核酸吸附体为磁性粒子时，还可以利用磁铁仅将液性成分回收。第1核酸吸附体为硅膜等膜状时，通过使全血试样与第1缓冲液的混合物从硅膜透过，能够使所述混合物与所述核酸吸附体接触而仅将液性成分回收。在使所述混合物从硅膜通过时，可以通过进行离心分离处理、应用真空或施加压力来将液体从所述硅膜除去。
可以在全血试样与第1缓冲液的混合的同时将第1核酸吸附体与全血试样混合，也可以对全血试样与第1缓冲液的混合物进行某些时间的孵育，在从全血试样中的细胞中充分提取核酸后，使第1核酸吸附体与提取核酸后的混合物接触。另外，可以在使第1核酸吸附体与全血试样和第1缓冲液的混合物接触后立即将液性成分回收，也可以在使全血试样和第1缓冲液的混合物与第1核酸吸附体接触过的状态下，进行某些时间的孵育，然后将第1核酸吸附体分离除去。
工序(a)中，优选调整所使用的第1核酸吸附体的量、从使第1核酸吸附体与全血试样和第1缓冲液的混合物接触的时点开始至将所述核酸吸附体分离除去的时间的条件，以使来自全血试样的基因组DNA基本全部被吸附于第1核酸吸附体、且工序(b)中吸附于第2核酸吸附体的数万碱基长度以上的核酸小于检出限值。另外，更优选进行调整以使来自全血试样的5000个碱基长度以上的核酸基本全部被吸附于第1核酸吸附体、且工序(b)中吸附于第2核酸吸附体的5000个碱基长度以上的核酸小于检出限值。通过在工序(a)中使长链核酸充分吸附于第1核酸吸附体而除去，能够将目标短链核酸选择性地回收。
第1缓冲液可以含有蛋白分解酶。利用蛋白分解酶，能够从全血试样中的细胞中将核酸更高效地提取。作为所述蛋白分解酶，可列举出溶菌酶、蛋白酶、蛋白酶K、纤维素酶等。第1缓冲液含有蛋白分解酶时，优选在所含有的蛋白分解酶可发挥酶活性的温度范围、更优选在所述蛋白分解酶的酶活性的最适温度附近，将全血试样与第1缓冲液的混合物孵育5分钟～2小时左右，由此进行酶反应。
所述酶反应可以在使第1核酸吸附体与全血试样和第1缓冲液的混合物接触前进行，也可以在接触后且将第1核酸吸附体分离除去前进行。另外，用于所述酶反应的孵育还可以兼为用于使所提取的核酸吸附于第1核酸吸附体的孵育。
接着，作为工序(b)，使通过工序(a)回收的液性成分和第2缓冲液的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体从液性成分中分离回收。使通过工序(a)回收的液性成分和第2缓冲液的混合物与第2核酸吸附体接触的方法及使所述液性成分中的核酸吸附于第2核酸吸附体的方法可以与工序(a)中的使全血试样和第1缓冲液的混合物与第1核酸吸附体接触的方法及使来自全血试样的核酸吸附于第1核酸吸附体的方法同样地进行。另外，第2核酸吸附体的分离回收方法可以与第1核酸吸附体的分离除去同样地进行。
第1缓冲液不含有蛋白分解酶时，在将第2核酸吸附体分离回收前，优选还进行蛋白分解酶反应。作为所使用的蛋白分解酶，可列举出与第1缓冲液中可含有的材料同样的材料。例如，优选使第2缓冲液含有蛋白分解酶，并且在所含有的蛋白分解酶可发挥酶活性的温度范围、优选在所述蛋白分解酶的酶活性的最适温度附近，将通过工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合物孵育5分钟～2小时左右，由此进行酶反应。
工序(b)中进行蛋白分解酶反应时，也优选在与第2核酸吸附体接触前进行蛋白分解酶反应。具体而言，将工序(b)变更为下述工序(b’)及(b”)。工序(b”)中，酶反应后的液性成分与第2缓冲液的混合物的醇浓度为10容量％以上。
(1)工序(b’)，在通过所述工序(a)回收的液性成分中添加蛋白分解酶，进行酶反应；和
(2)工序(b”)，在所述工序(b’)之后，使所述液性成分与第2缓冲液的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体分离回收。
工序(b’)中，可以将离液剂或表面活性剂与蛋白分解酶一起重新添加。作为所述离液剂及表面活性剂，可以使用与作为第2缓冲液可含有的材料所列举的材料同种的材料。工序(b’)中的蛋白分解酶反应的反应溶液含有离液剂时，所述反应溶液的离液剂的浓度优选为0.5～2.5mol/L。工序(b’)中的蛋白分解酶反应的反应溶液含有表面活性剂时，所述反应溶液的表面活性剂的浓度优选为3～15容量％、更优选为7～11容量％。
工序(b’)中，可以将阳离子盐与蛋白分解酶一起重新添加。作为所述阳离子盐，可以使用作为第2缓冲液可含有的材料所列举的材料同种的材料。工序(b’)中的蛋白分解酶反应的反应溶液含有阳离子盐时，所述反应溶液的阳离子盐的浓度优选为10～200mmol/L。
其后，作为工序(c)，从工序(b)中回收的所述第2核酸吸附体中将核酸洗脱、回收。核酸从第2核酸吸附体中的洗脱及回收可以通过将吸附于硅石等的核酸洗脱时通常进行的方法来进行。例如，可以使用水作为洗脱用溶液。具体而言，可以通过使水与第2核酸吸附体接触来将吸附于所述第2核酸吸附体的核酸洗脱。
工序(b)中回收的所述第2核酸吸附体在工序(c)之前用适当的溶液进行洗涤。作为洗涤用溶液，从没有核酸会从核酸吸附体脱离的顾虑且不会引入新的盐等的角度出发，优选70～95容量％的醇水溶液，更优选70～95容量％的乙醇水溶液。
供于本实施方式的核酸回收方法的全血试样可以是含有血细胞和血浆成分的试样。作为供于本实施方式的核酸回收方法的全血试样，优选将从人或小鼠等动物采取的全血直接作为试样使用，但也可以将进行过能够使血球成分的至少一部分和血浆成分残留于全血的处理的试样作为全血试样供于工序(a)。作为所述处理，可列举出仅将特定大小的血细胞成分除去或回收的尺寸分离、或进行仅将呈现特定表面抗原的血球成分除去或回收的特异性吸附分离的过滤处理等。
本实施方式的核酸回收方法中回收的核酸可以是DNA，也可以是RNA。另外，所述核酸可以是单链核酸，也可以是双链核酸，可以是线状核酸，也可以是质粒等的环状核酸。另外，所述核酸还可以是经后成性(表观遗传学)修饰的核酸。此外，只要是全血试样中含有的核酸即可，可以是来自所采血的生物种的细胞的细胞核的核酸，也可以是来自线粒体的核酸，也可以是来自混入的微生物的核酸，还可以是人工或合成的核酸。作为人工或合成的核酸，可列举出粘粒、载体(vector)、cDNA及它们的片段等。
本实施方式的核酸回收方法可以将1000个碱基长度以下的短链核酸高效地回收。
本实施方式的核酸回收方法所回收的目标核酸优选为800个碱基长度以下的短链核酸，更优选为500个碱基长度以下的短链核酸，或进一步优选为200个碱基长度。本实施方式的核酸回收方法适于对全血中的循环DNA、非编码的RNA、miRNA、短链的合成核酸等进行浓缩-精制。
本实施方式的核酸回收方法特别适于对全血中的循环DNA进行精制。以往的方法中，将在末梢血中自由循环的来自肿瘤的核酸从血清或血浆中进行精制-回收，而本实施方式的核酸回收方法中，利用吸附于核酸吸附体的核酸的选择性，从全血试样中直接对自由循环的来自肿瘤的核酸进行精制。另外，本实施方式的核酸回收方法由于各工序的操作比较简便，因此还可向自动化发展。此外，通过本实施方式的核酸回收方法回收的循环DNA由于是将基因组DNA等长链核酸除去后进行精制的，因此能够适合供于各种分析方法。即，本实施方式的核酸回收方法通过将各种分析方法组合起来而成为可向临床研究-诊断领域发展的方法。
通过本实施方式的核酸回收方法得到的短链核酸可供于任意的核酸解析，特别优选供于基因多态或基因突变的解析(基因检査等)，更优选供于SNP(单碱基多态)或单基因突变的解析。特别是，回收来自癌细胞的循环DNA的目标为短链核酸时，所回收的循环DNA可供于癌瘤的预后诊断、对受癌瘤侵扰的人的疾病进程进行监测、或对针对恶性肿瘤的抗癌治疗的效果进行观察等各种目的的核酸解析。
以基因解析为代表的核酸解析通常是对解析对象的核酸进行分析，对得到的信息进行解析以作为分析的结果。核酸分析主要通过下述方法进行：用测序仪等直接读取核酸的碱基序列的方法、利用将与由特定的碱基序列构成的区域特异性杂交的引物作为起点的聚合酶反应的方法、或使用与由特定的碱基序列构成的区域特异性杂交的探针的方法。通过本实施方式的核酸回收方法得到的短链核酸由于通常包含多种多样的基因核酸或其片段，因此优选通过使用引物和探针中的至少一个的方法对解析对象基因进行分析。作为至少使用引物的方法，可列举出例如PCR(聚合酶链反应)法、实时PCR法、TaqMan(注册商标)-PCR法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification，环介导等温扩增)法、SMAP(SMart Amplification Process，智能等温扩增)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，核酸序列依赖性扩增)法、RCA(rolling circle amplification，滚环扩增)法及它们的变更方法等。另外，作为使用探针的方法，可列举出例如Invader(注册商标)法、DNA微阵列等。这些方法可适当组合使用。
本实施方式的核酸回收方法中，有时只得到微量的短链核酸。因此，作为对通过本实施方式的核酸回收方法回收的短链核酸进行解析的方法，优选(1)利用使用了探针的核酸扩增反应的分析方法、或(2)作为第一阶段，利用PCR等将核酸扩增；作为第二阶段，对第一阶段中得到的扩增产物进行核酸分析的方法。作为上述(1)，可列举出例如使用特定基因型的特异性引物进行延长反应的等位基因特异性延长法、TaqMan-PCR法等。作为上述(2)，可列举出例如Invader Plus法、PCR-RFLP(限制性酶切片段长度多态)法、PCR-SSCP(单链高次结构多态)法等。其中，为了即使解析对象的短链核酸的量非常微量，也可高灵敏度且高精度地进行核酸解析，优选将通过本实施方式的核酸回收方法得到的短链核酸首先通过PCR进行扩增、然后对得到的扩增产物进行Invader法的Invader Plus法。另外，还可以利用不需要PCR等核酸扩增工序的核酸分析法。
以下示出通过Invader Plus法对特定基因(解析对象基因)进行检测并解析的方法的例子，但通过本实施方式的核酸回收方法回收的短链核酸的核酸解析方法并不限定于此。
首先，在通过本实施方式的核酸回收方法回收的短链核酸溶液(工序(c)中，将核酸从第2核酸吸附体洗脱而得到的洗脱液)中混合Invader Plus反应液即Invader Plus缓冲液、用于检测解析对象基因的OligoMix和EnzymeMix，然后进行变性处理(95℃加热2分钟)，由此使DNA的双螺旋融解为单链。其中，OligoMix由PCR用引物、DNA探针、InvadingOligo、FRET盒组成。
接着，通过进行PCR，进行与解析对象基因相当的部分核酸的扩增反应，然后进行聚合酶的灭活处理，使PCR停止。
最后，实施Invader(注册商标)法，使与具有对应于解析对象基因的核酸序列的区域特异性杂交的DNA探针分解。接着，使通过所述分解反应生成的DNA的加热探针的5’-寡核苷酸与具有荧光色素的FRET盒结合。进而所述FRET盒被分解，荧光色素从所述FRET盒游离而发出荧光。通过对该荧光进行测定，能够间接地检测解析对象基因并进行测定。即，荧光信号强度表示所对应的解析对象基因的检出量。
通过Invader(注册商标)法解离的荧光色素的荧光信号强度(例如，荧光色素为FAM时，FAM的荧光信号强度(激发波长：485nm、发光波长：535nm)用荧光测定装置进行测定。作为所述荧光测定装置，可列举出例如Roche Applied Science公司制的荧光测定装置LightCycler 480等。
<短链核酸回收用试剂盒>
通过将所使用的试剂等制成试剂盒能够更简便地进行本发明第二实施方式的核酸回收方法。作为用于实施本实施方式的核酸回收方法的试剂盒，优选含有所述第1缓冲液、所述第2缓冲液和作为所述第1核酸吸附体及所述第2核酸吸附体使用的核酸吸附体。所述第1缓冲液为按照混合物的醇浓度达到5容量％以下的方式与全血试样混合的缓冲液。所述第2缓冲液为在使核酸吸附体与所述第1缓冲液和所述全血试样的混合物接触后将所述核酸吸附体分离除去、在所得液性成分中按照混合物的醇浓度达到10容量％以上的方式混合的缓冲液。另外，所述试剂盒还可以根据需要含有用于添加到第1缓冲液等中的蛋白分解酶、用于对吸附有核酸的第2核酸吸附体进行洗涤的洗涤用溶液、用于将核酸从吸附有核酸的第2核酸吸附体洗脱的洗脱液等。
实施例
以下示出实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于下述实施例。
[参考例1]
研究200bp、500bp、1000bp的dsDNA Fragment STANDARD样品(GensuraLaboratories公司制)及人基因组DNA(GEN Script公司制)在溶解于缓冲液1(胍盐酸盐为3mol/L、Triton X为10容量％)或缓冲液2(硫氰酸胍为1.2mol/L、Tween20为10容量％、异丙醇为40容量％、MgCl2为100mmol/L)的状态下对硅膜滤器(silica membranefilter，相当于核酸吸附体)的吸附性。其中，缓冲液1相当于本发明第一实施方式的核酸回收方法中使用的第1缓冲液，缓冲液2相当于本实施方式的核酸回收方法中使用的第2缓冲液。
具体而言，使1000ng的DNA溶解于所述缓冲液1或缓冲液2，得到DNA溶液，使该DNA溶液从硅膜滤器通过，由此使DNA吸附于所述硅膜滤器。接着，使精制水从所述硅膜滤器通过，由此将DNA从所述硅膜滤器洗脱。
得到的洗脱液中的DNA浓度用PicoGreen试剂(Invitrogen公司)测定，计算出洗脱液中的总DNA量(DNA回收量)。所述洗脱液中的总DNA量相当于在硅膜滤器上的吸附量。由计算出的洗脱液中的总DNA量和从硅膜滤器通过的DNA溶液的总DNA量(1000ng)计算出使用了硅膜滤器的DNA回收率(％)(计算式：[洗脱液中的总DNA量(ng)]/[1000(ng)]×100)。将求出的回收率示于表1。
表1
如表1所示，DNA溶解于异丙醇浓度为40容量％的缓冲液2时，无论DNA的长度如何，DNA回收率均非常高，为80％以上。另一方面，DNA溶解于不含有醇的缓冲液1时，DNA回收率在基因组DNA中高达80％以上，但在1000bp的dsDNA(双链DNA)中仅为30％左右，在500bp及200bp的dsDNA中非常低、小于10％，可知1000bp以下的短链核酸几乎不吸附于硅膜滤器。从这些结果可知，使核酸吸附于核酸吸附体时，在醇不存在下，1000bp以下的短链核酸几乎不吸附，来自血细胞的基因组DNA等长链核酸优先地吸附。另外，从这些结果可知，在异丙醇浓度为40容量％的环境下，1000bp以下、特别是800bp以下的短链核酸也强烈吸附于核酸吸附体而能够回收。这些结果启示，通过使来自全血试样的核酸首先在醇不存在下吸附于核酸吸附体而除去，能够在将1000bp以下的短链核酸残留于液性成分的情况下选择性地除去长链核酸；接着，使除去了核酸吸附体的剩余的液性成分与新的核酸吸附体在高浓度的醇存在下接触，使核酸吸附，由此能够将含有循环DNA的1000bp以下的短链核酸、特别是800bp以下的短链核酸回收。
本发明实施方式中的各缓冲液的pH在7.5～8.0之间。
[参考例2]
对市售的人血浆及人血清(均为Lonza公司制)进行利用蛋白分解酶的酶处理，然后将短链核酸回收。作为蛋白分解酶，使用蛋白酶K(Merck公司制)。
具体而言，首先，在5mL的人血浆或人血清中添加500μL的蛋白酶K及5mL的缓冲液3(硫氰酸胍为2.0mol/L、Tween 20为15容量％)并混合，制备酶反应溶液。将得到的酶反应溶液在52℃孵育30分钟，由此进行酶反应，其后，通过在70℃加热10分钟使蛋白酶K灭活。
接着，在灭活处理后的反应溶液中添加10mL的缓冲液4(硫氰酸胍为1.5mol/L、Tween 20为10容量％、异丙醇为40容量％、MgCl2为100mmol/L)并混合。其中，缓冲液4相对于本发明第一实施方式的核酸回收方法中使用的第2缓冲液，得到的混合物的醇浓度为约20容量％。使所述混合物从硅膜滤器通过，由此使DNA吸附于所述硅膜滤器。接着，使70质量％的乙醇水溶液从所述硅膜滤器透过、进行洗涤，然后使精制水通过，由此将DNA从所述硅膜滤器洗脱。
与参考例1同样地求出得到的洗脱液中的DNA量(所回收的DNA量)，计算出每1mL人血浆或人血清的DNA回收量(每1mL样品的DNA回收量(ng/1mL样品))。另外，为了研究所回收的DNA的纯度，求出洗脱液在260nm的吸光度(A260)与在280nm的吸光度(A280)的比例([A260]/[A280])。
作为对照，使用市售的核酸精制试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN公司制)，按照所述试剂盒所附的使用说明书从与使用了缓冲液3及4的方法(以下表示为“工序(b’)+(b”)变法”)等量的人血浆或人血清中对核酸进行精制。与通过工序(b’)+(b”)变法回收的洗脱液同样地求出所回收的DNA溶液中的DNA量(所回收的DNA量)、每1mL人血浆或人血清的DNA回收量(ng/1mL样品)及纯度([A260]/[A280])。
各测定进行3次独立的测试，求出平均值和标准偏差。将结果示于表2。其结果，从人血浆回收核酸时，工序(b’)+(b”)变法和使用了市售的核酸精制试剂盒的方法中，DNA的回收量和所回收的DNA的纯度均为同等程度。另外，从人血清回收核酸时，工序(b’)+(b”)变法中，能够将与使用了市售的核酸精制试剂盒的方法为同等程度的高纯度的DNA以比使用了市售的核酸精制试剂盒的方法更多量地回收。
表2
[参考例3]
将人全血中的核酸用本发明第一实施方式的核酸回收方法中使用的第1缓冲液和硅膜滤器(核酸吸附体)回收。作为所述第1缓冲液，使用参考例1中使用的缓冲液1。
具体而言，使100μL的人全血与500μL的缓冲液1混合而成的混合物从硅膜滤器通过，由此使来自人全血的核酸吸附于所述硅膜滤器。接着，使70(质量/容量)％的乙醇水溶液从所述硅膜滤器透过、进行洗涤，然后使精制水通过，由此将核酸从所述硅膜滤器洗脱。
得到的洗脱液中所含的DNA的链长通过琼脂糖电泳确认。将电泳的结果示于图1。图1中，左泳道(M)为1kbp LadderDNA标记物的泳动结果，右泳道(S)为洗脱液的泳动结果。如图1所示，洗脱液中只含有链长长的DNA，特别是完全未确认到比1kbp标记物小的条带。这些结果显示，从本实施方式的核酸回收方法中使用的第1缓冲液与全血试样混合而成的混合物中利用核酸吸附体使核酸吸附时，长链核酸选择性地吸附、短链核酸不吸附。即显示，本实施方式的核酸回收方法的工序(a)中，不会有违背回收含有循环DNA的短链核酸的意图的顾虑。
[参考例4]
研究醇浓度对200bp、500bp、1000bp的DNA对核酸吸附体的吸附强度的影响。作为dsDNA，使用参考例1中使用的200bp、500bp、1000bp的dsDNA Fragment STANDARD样品。另外，作为使DNA溶解的缓冲液，使用不含有醇的缓冲液4-1(胍盐酸盐为3mol/L、Triton X为10容量％)、含有5容量％醇的缓冲液4-2(胍盐酸盐为3mol/L、Triton X为10容量％、异丙醇为5容量％)及含有10容量％醇的缓冲液4-2(胍盐酸盐为3mol/L、Triton X为10容量％、异丙醇为10容量％)。
具体而言，使1000ng的DNA溶解于所述缓冲液4-1、4-2或4-3而得到的DNA溶液从硅膜滤器通过，由此使DNA吸附于所述硅膜滤器。接着，使精制水从所述硅膜滤器通过，由此将DNA从所述硅膜滤器洗脱。
与参考例1同样地求出得到的洗脱液中的总DNA量(所回收的DNA量)及DNA回收率(％)。将结果示于表3。其结果，当使用异丙醇浓度为5容量％的缓冲液4-2时，与使用异丙醇浓度为0容量％的缓冲液4-1时同样地，几乎无法回收200bp及500bp的DNA。与此相对，当使用异丙醇浓度为10容量％的缓冲液4-3时，200bp的DNA回收率飞跃性地高达20％以上、500bp的DNA回收率飞跃性地高达50％以上。这些结果启示，本发明第一实施方式的核酸回收方法中，第1缓冲液含有醇时，通过将第1缓冲液与全血试样的混合物的醇浓度调节至5容量％以下，能够抑制短链核酸的损失。
表3
[实施例1]
从人全血试样通过本发明第一实施方式的核酸回收方法将短链核酸回收。另外，从与回收核酸后的人全血试样等量的从来自同一提供者的人全血中制备的人血清试样中通过本实施方式的核酸回收方法中的工序(b)及(c)将短链核酸回收。
从人全血试样的核酸回收具体而言，将1mL的人全血试样与5mL的参考例1中使用的缓冲液1混合，使所制备的混合物从硅膜滤器通过。在从所述硅膜滤器透过的溶液(液性成分)5mL中添加600μL的蛋白酶K和6mL的参考例2中使用的缓冲液3并混合，制备酶反应溶液。通过将得到的酶反应溶液在52℃孵育30分钟，进行酶反应，其后，通过在70℃加热10分钟，使蛋白酶K灭活。
接着，在灭活处理后的反应溶液中添加12mL的参考例2中使用的缓冲液4并混合。得到的混合物的醇浓度为约20容量％。通过使所述混合物从硅膜滤器通过，使DNA吸附于所述硅膜滤器。接着，使70(质量/容量)％的乙醇水溶液从所述硅膜滤器透过、进行洗涤，然后使精制水通过，由此将DNA从所述硅膜滤器洗脱。
从人血清试样的核酸回收具体而言，在从1mL的人全血试样制备的人血清试样(500μL)中添加50μL的蛋白酶K和500μL的参考例2中使用的缓冲液3并混合，制备酶反应溶液。与从人全血试样的核酸回收同样地操作，在对得到的酶反应溶液进行酶反应后，在经灭活处理的反应溶液中添加缓冲液4，使所得混合物从硅膜滤器通过，将吸附于所述硅膜滤器的核酸洗脱。
与参考例2同样地求出得到的洗脱液中的DNA量(所回收的DNA量)及纯度([A260]/[A280])。将结果示于表4。如表4所示，从人全血试样回收的DNA回收量与从人血清试样回收的量基本为同等程度。该结果启示，通过本实施方式的核酸回收方法，从全血试样中将来自血细胞的基因组DNA等长链核酸选择性地除去，能够选择性地回收含有目标循环DNA的短链核酸。
表4
与参考例3同样地用丙烯酰胺凝胶电泳确认通过上述本实施方式的核酸回收方法从人全血试样得到的DNA的链长。将电泳的结果示于图2。图2中，左泳道(M)为100bpLadderDNA标记物的泳动结果，右泳道(S)为洗脱液的泳动结果。如图2所示，洗脱液中仅含有链长短的经片段化的DNA，特别是完全未确认到比1000bp标记物大的条带。另外，从条带变为smear确认到已被片段化。
这些结果启示，通过本实施方式的核酸回收方法从全血试样中将来自血细胞的基因组DNA等长链核酸选择性除去，能够将含有目标循环DNA的短链核酸选择性回收。
[实施例2]
从人全血试样中通过本发明第一实施方式的核酸回收方法中的工序(b)及(c)将短链核酸回收。即，实施例2中，仅通过本实施方式的核酸回收方法中的工序(b)及(c)来将短链核酸回收而未进行工序(a)。
从人全血试样的核酸回收具体而言，在500μL的人全血试样(与实施例1相同的试样)中添加50μL的蛋白酶K和500μL的参考例2中使用的缓冲液3并混合，制备酶反应溶液。与从人全血试样的核酸回收同样地操作，在对得到的酶反应溶液进行酶反应后，在经灭活处理的反应溶液中添加缓冲液4，使得到的混合物从硅膜滤器通过，将吸附于所述硅膜滤器的核酸洗脱。
与参考例2同样地求出得到的洗脱液中的DNA量(所回收的DNA量)及纯度([A260]/[A280])。将结果示于表5。如表5所示，可知从人全血试样回收的DNA回收量与实施例1的从人血清试样回收的DNA量(表4)相比，量显著地多。
表5
与参考例3同样地通过琼脂糖凝胶电泳确认从人全血试样得到的DNA的链长。将电泳的结果示于图3。图3中，左泳道(M)为1kbp LadderDNA标记物的泳动结果，右泳道(S)为洗脱液的泳动结果。如图3所示，洗脱液中只含有链长长的DNA，特别是完全无法确认到比1kbp标记物小的条带。
从这些结果可知，本实施方式的核酸回收方法中，通过(不进行工序(a))工序(b)及(c)回收短链核酸时，长链核酸优先地吸附，短链核酸不吸附。
即启示了，本实施方式的核酸回收方法的工序(a)中，将来自血细胞的基因组DNA等长链核酸预先除去的处理的重要性。
[实施例3]
从人全血试样中通过本发明第一实施方式的核酸回收方法将短链核酸回收。
从人全血试样的核酸回收具体而言，使用代替参考例2中使用的缓冲液3、4中的异丙醇而混合有乙醇的缓冲液5、6，按照与实施例1同样的顺序将DNA洗脱。
与参考例2同样地求出得到的洗脱液中的DNA量(所回收的DNA量)及纯度([A260]/[A280])。将结果示于表6。如表6所示，从人全血试样回收的DNA回收量与使用了异丙醇的实施例1的结果(表4)相比，少量地减少。
从该结果可知，本实施方式的核酸回收方法中，即使使用乙醇作为异丙醇的代用物，也能够从全血试样中将来自血细胞的基因组DNA等长链核酸选择性除去，将含有目标循环DNA的短链核酸选择性回收。不过可知，本实施方式的核酸回收方法中，使用异丙醇时比使用乙醇时更为优选。
表6
[实施例4]
从人全血试样中通过本发明第一实施方式的核酸回收方法不进行酶处理(蛋白酶处理)地将短链核酸回收。
从人全血试样的核酸回收具体而言，除了不进行蛋白酶处理外，使用参考例1中使用的缓冲液1、2按照与实施例1同样的顺序将DNA洗脱。
与参考例2同样地求出得到的洗脱液中的DNA量(所回收的DNA量)及纯度([A260]/[A280])。将结果示于表7。如表7所示，从人全血试样回收的DNA回收量与实施例1的结果(表4)相比，少量地减少。
该结果启示，本实施方式的核酸回收方法中，即使没有蛋白酶处理，也能够从全血试样中将来自血细胞的基因组DNA等长链核酸选择性除去，将含有目标循环DNA的短链核酸选择性回收。
表7

Claims (14)

1.一种短链核酸的回收方法，其是从全血试样中将1000个碱基长度以下的短链核酸回收的方法，其具有下述工序：
工序(a)，使将全血试样与含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上的第1缓冲液混合而成的混合物与第1核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的核酸吸附于所述第1核酸吸附体，然后将所述第1核酸吸附体分离除去，回收液性成分，所述混合物不含有醇或醇浓度为5容量％以下；
工序(b)，使将通过所述工序(a)回收的液性成分与含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上及醇的第2缓冲液混合而成的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体从所述回收的液性成分中分离回收，所述混合物的醇浓度为10容量％以上；和
工序(c)，从在所述工序(b)中回收的所述第2核酸吸附体中将核酸洗脱、回收。
2.根据权利要求1所述的短链核酸的回收方法，其中，来自所述全血试样的5000个碱基长度以上的核酸通过在所述工序(a)中吸附于核酸吸附体而被分离除去。
3.根据权利要求1或2所述的短链核酸的回收方法，其中，所述第1缓冲液含有胍盐酸盐及表面活性剂，胍盐酸盐的浓度为1mol/L以上且最大溶解度以下，表面活性剂的浓度为1～10容量％。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述醇为异丙醇或乙醇，所述工序(b)中的通过所述工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合物的醇浓度为10～60容量％。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述醇为异丙醇，所述工序(b)中的通过所述工序(a)回收的液性成分与第2缓冲液的混合物的异丙醇浓度为10～40容量％。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述第2缓冲液含有选自由硫氰酸胍及硫氰酸胍组成的组中的1种以上的离液剂和表面活性剂，离液剂的浓度为0.5mol/L以上且最大溶解度以下，表面活性剂的浓度为3～15容量％。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述第2缓冲液含有10～200mmol/L的阳离子盐。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述工序(b)为：
工序(b’)，在通过所述工序(a)回收的液性成分中添加蛋白分解酶、进行酶反应；和
工序(b”)，在所述工序(b’)之后，使所述液性成分和第2缓冲液的混合物与第2核酸吸附体接触，由此使来自所述全血试样的1000个碱基长度以下的短链核酸吸附于所述第2核酸吸附体，然后将所述第2核酸吸附体分离回收。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述第1核酸吸附体或所述第2核酸吸附体为选自由含硅酸物质、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、磁性粒子、陶瓷及聚苯乙烯组成的组中的1种以上。
10.根据权利要求9所述的短链核酸的回收方法，其中，所述含硅酸物质为硅石、磁性硅石、玻璃或二氧化硅。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的短链核酸的回收方法，其中，所述短链核酸为循环DNA。
12.一种从全血试样中精制短链核酸的方法，其使用权利要求1～11中任一项所述的短链核酸的回收方法。
13.一种短链核酸回收用试剂盒，其为权利要求1～11中任一项所述的短链核酸的回收方法中使用的试剂盒，其含有：
第1缓冲液，其含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上，并且用于按照醇浓度达到5容量％以下的方式与全血试样混合；
第2缓冲液，其含有选自由离液剂及表面活性剂组成的组中的1种以上及醇，并且用于与液性成分按照醇浓度达到10容量％以上的方式混合，所述液性成分是通过使核酸吸附体与所述第1缓冲液和所述全血试样的混合物接触，然后将所述核酸吸附体分离除去而得到的；和
核酸吸附体。
14.根据权利要求13所述的短链核酸回收用试剂盒，其用于从全血试样中回收循环DNA。
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