JP6201587B2 - 包埋組織からの核酸抽出方法、包埋剤除去用具、及び核酸抽出用キット - Google Patents
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Description
非特許文献4のように、包埋組織からDNAを抽出した後、フェノール/クロロホルム処理等を行ったり、非特許文献5のように、回収された核酸を解析に供する前に遠心分離処理によりパラフィンを除去することにより、パラフィン混入量が抑えられた核酸が得られる。しかし、これらの方法は、遠心分離処理が必須であり簡便性に欠ける上に、FFPE切片中のパラフィン量の影響により核酸を含む溶液の単離操作が難しくなり、収量が著しく落ちるおそれもある。
[1] 核酸抽出用容器内において、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内である包埋剤によって包埋された包埋組織の表面の少なくとも一部を、当該包埋剤の溶融温度以上で、界面活性剤及びアルカリ性物質からなる群より選択される1種以上を含む核酸抽出用水溶液中に接触させることにより、当該包埋組織中の核酸を前記核酸抽出用水溶液に抽出し、溶融した前記包埋剤を主成分とする包埋剤層と、抽出された核酸を含む水層とに分離する抽出工程と、
前記抽出工程後、前記核酸抽出用容器の内部に、当該核酸抽出用容器の内面形状に対応する外周面形状を有する筒状部材を、当該筒状部材の少なくとも下端部が前記水層に接し、当該筒状部材の少なくとも上端部は前記包埋剤層に接していないように設置した状態で、前記水層は液状に保持したまま、前記包埋剤層を固化させる包埋剤固化工程と、
前記包埋剤固化工程後、前記筒状部材を固化した包埋剤層と共に前記核酸抽出用容器から取り外す包埋剤除去工程と、
を有することを特徴とする、包埋組織からの核酸抽出方法。
[2] 前記抽出工程を、前記筒状部材を内部に設置した核酸抽出用容器内において行う、又は、
前記抽出工程後に、前記筒状部材を前記核酸抽出用容器の内部に設置する、前記[1]の包埋組織からの核酸抽出方法。
[3] 前記核酸抽出用水溶液が、界面活性剤及びタンパク質分解酵素を含む、前記[1]又は[2]の包埋組織からの核酸抽出方法。
[4] 前記タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼKであり、
前記抽出工程を、前記包埋剤の溶融温度以上かつ65℃以下で行う、前記[3]の包埋組織からの核酸抽出方法。
[5] 前記抽出工程後、前記包埋剤除去工程前に、前記水層を、前記タンパク質分解酵素がタンパク質分解活性を有する温度よりも高温でインキュベートする、前記[3]又は[4]の包埋組織からの核酸抽出方法。
[6] 前記抽出工程を、90〜100℃で行う、前記[1]又は[2]の包埋組織からの核酸抽出方法。
[7] 前記抽出工程後、前記包埋剤除去工程前に、前記水層に水分を添加する、前記[1]〜[6]のいずれかの包埋組織からの核酸抽出方法。
[8] 筒状本体と、固化した包埋剤は透過できず、液状の包埋剤は透過可能な選別部材とを備え、
前記選別部材は、前記筒状本体の一方の端部又はその近傍に設けられており、
包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用容器の内部に設置されることを特徴とする、包埋剤除去用具。
[9] 筒状本体と、前記筒状本体の外周面又は内周面から張り出した突出部とを備え、
包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用容器の内部に設置されることを特徴とする、包埋剤除去用具。
[10] 界面活性剤及びアルカリ性物質からなる群より選択される1種以上を含む核酸抽出用水溶液と、
前記[8]又は[9]の包埋剤除去用具と、
を備え、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内である包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられることを特徴とする、包埋組織からの核酸抽出用キット。
[11] さらに、核酸抽出用容器を備える、前記[10]の包埋組織からの核酸抽出用キット。
また、本発明に係る包埋剤除去用具又はキットを用いることによって、本発明に係る包埋組織からの核酸抽出方法をより簡便に実施することができる。
本発明の第一の態様に係る包埋組織からの核酸抽出方法(以下、「本発明に係る核酸抽出方法」)は、核酸抽出用容器内において、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内である包埋剤によって包埋された包埋組織の表面の少なくとも一部を、当該包埋剤の溶融温度以上で、界面活性剤及びアルカリ性物質からなる群より選択される1種以上を含む核酸抽出用水溶液中に接触させることにより、当該包埋組織中の核酸を前記核酸抽出用水溶液に抽出し、溶融した前記包埋剤を主成分とする包埋剤層と、抽出された核酸を含む水層とに分離する抽出工程と、前記抽出工程後、前記核酸抽出用容器の内部に、当該核酸抽出用容器の内面形状に対応する外周面形状を有する筒状部材を、当該筒状部材の少なくとも下端部が前記水層に接するように設置した状態で、前記水層は液状に保持したまま、前記包埋剤層を固化させる包埋剤固化工程と、前記包埋剤固化工程後、前記筒状部材を固化した包埋剤層と共に前記核酸抽出用容器から取り外す包埋剤除去工程と、を有する。
本発明に係る核酸抽出方法に供される包埋組織の包埋剤は、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内のものである。当該性質を満たすものであれば特に限定されるものではなく、パラフィン、セロイジン、樹脂等の当該技術分野で一般的に用いられている包埋剤の中から適宜選択して用いることができる。市販されているものをそのまま用いてもよい。当該包埋剤としては、パラフィンが好ましく、溶融温度が40〜65℃の範囲内であるパラフィンがより好ましく、溶融温度が40〜50℃の範囲内であるパラフィンがさらに好ましい。ここで、包埋剤として用いるパラフィンは、パラフィンのみからなるものであってもよく、副成分として他の樹脂や各種添加剤を含むものであってもよい。
本発明に係る核酸抽出方法では、まず、抽出工程として、核酸抽出用容器(核酸抽出反応に用いる容器)内において、包埋組織の表面の少なくとも一部を、当該包埋組織の作製に用いられた包埋剤の溶融温度以上で核酸抽出用水溶液中に接触させる。核酸抽出用水溶液と接触した表面から、包埋組織中の生体試料に含まれていた核酸が抽出される。この際、核酸抽出用水溶液の温度が包埋剤の溶融温度以上であるため、当該包埋組織の包埋剤も溶融する。包埋剤の溶融を同時に行うため、核酸抽出を効率よく行うことができる。
一方で、包埋組織が核酸抽出用水溶液中に浸漬させた状態で核酸抽出を行う場合には、予め調製した核酸抽出用水溶液を核酸抽出用容器に注入してもよく、包埋組織が投入された核酸抽出用容器内に核酸抽出用水溶液の原料試薬を個別に添加して、当該容器内で核酸抽出用水溶液を調製してもよい。例えば、包埋組織が投入された核酸抽出用容器内に、バッファーと界面活性剤(及び/又はアルカリ性物質)と必要に応じてその他の物質をそれぞれ個別に添加してもよい。また、核酸抽出用水溶液がタンパク質分解酵素を含む場合には、包埋組織が投入された核酸抽出用容器内に、タンパク質分解酵素以外の全ての原料試薬を添加した溶液を添加した後、適当量のバッファーに溶解させたタンパク質分解酵素溶液を添加してもよい。
前記抽出工程後、核酸抽出用容器の内部に、当該核酸抽出用容器の内面形状に対応する外周面形状を有する筒状部材を設置した状態で、前記水層は液状に保持したまま、前記包埋剤層を固化させる。当該筒状部材は、核酸抽出用容器の内面形状に対応する外周面形状を有するため、核酸抽出用容器の内壁面に密着するように設置される。核酸抽出用容器の内壁面ではなく、筒状部材の内壁面に接触させた状態で包埋剤層を固化させるため、当該筒状部材に接着した状態で包埋剤層は固化する。包埋剤層の量が少量の場合には、当該筒状部材の内壁表面に固着するように、ドーナツ形状に包埋剤層が固化する。
包埋剤固化工程の後、包埋剤除去工程として、前記筒状部材を固化した包埋剤層と共に前記核酸抽出用容器から取り外す。これにより、当該核酸抽出用容器内に、核酸を含む水層のみが残される。
本発明に係る包埋剤除去用具は、本発明に係る核酸抽出方法において、包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用容器の内部に設置される前記筒状部材として使用することができる。
本発明に係る包埋組織からの核酸抽出用キット(以下、「本発明に係る核酸抽出用キット」)は、前記核酸抽出用水溶液と、前記包埋剤除去用具とを備え、本発明に係る核酸抽出方法によって、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内である包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられることを特徴とする。当該核酸抽出用キットを用いることによって、本発明に係る核酸抽出方法をより簡便に実施することができる。
<FFPE組織サンプルから抽出されたDNAと包埋剤との分離>
本発明に係る核酸抽出方法により、FFPE組織サンプルからDNAを抽出し、包埋剤から分離した状態で得た。
まず、筒状部材を予め内部に設置した核酸抽出用容器内において、ヒト大腸癌症例FFPE切片(腫瘍部:約1cm×1mm×10μm)1枚を、600μLの核酸抽出用水溶液(1% Tween20及び0.5mg/mL プロテイナーゼKを含むTEバッファー)に浸漬させ、52℃で30分間インキュベートした後、90℃で10分間インキュベートした。インキュベート後には、パラフィン層と水層の二相に分離しており、パラフィン層は、核酸抽出用容器の内壁ではなく、筒状部材の内壁に接触していた。次いで、当該核酸抽出用容器内の液体を4℃で5分間インキュベートし、パラフィン層を固化させた。固化処理後、核酸抽出用容器から筒状部材を取り外し、核酸抽出液(水層)のみを核酸抽出用容器に残留させた。取り外した筒状部材と、核酸抽出用容器の写真を図6に示す。核酸抽出用容器2の内部には、核酸抽出液5が残っており、筒状部材1の内部には、固化したパラフィン6bが接着していた。核酸抽出用容器2内の核酸抽出液5は無色透明であり、パラフィンの混入は確認できなかった。
<FFPE組織サンプルからのDNA抽出効率の比較>
FFPE組織サンプルから、本発明に係る核酸抽出方法によりDNAを抽出した。1.5mL容のプラスチックチューブを核酸抽出用容器とし、筒状部材として、図4に示す筒状部材2と同様の形状のものを用いた。
<抽出された核酸の遺伝子解析サンプルとしての適性>
FFPE試料より核酸を抽出する方法の評価法として、得られた核酸抽出液の濃度測定の他に、純度や下流の核酸分析の成功率測定が行われている。
そこで、本発明に係る核酸抽出方法により回収されたDNAが、遺伝子解析サンプルとして適するか、インベーダープラス法を用いてK−ras遺伝子を検出することにより、検証した。
本実施例では、FFPEサンプルを検体とした遺伝子解析の中で世界的に意義が認められているK−ras遺伝子のコドン12の6変異及びコドン13の1変異を、検出対象遺伝子として実施した。
まず、筒状部材を予め内部に設置した核酸抽出用容器内において、ヒト大腸がん組織のFFPE切片(腫瘍部:約1cm×1mm×10μm)5枚を、100μLの核酸抽出用水溶液(0.5mg/mL プロテイナーゼK及び1%のTween20を含むTEバッファー)に浸漬させ、52℃で30分間インキュベートした後、90℃で10分間インキュベートした。インキュベート後には、パラフィン層は、核酸抽出用容器の内壁ではなく、筒状部材の内壁に接触していた。次いで、当該核酸抽出用容器内の液体を4℃で5分間インキュベートし、パラフィン層を固化させた。固化処理後、核酸抽出用容器から筒状部材を取り外し、核酸抽出液(水層)のみを核酸抽出用容器に残留させた。
まず、専用反応容器に、あらかじめPCR試薬(純水、バッファー、DNAポリメラーゼ、dNTP、プライマー1001及び1002)と、インベーダー試薬(純水、バッファー、クリベース酵素(Hologic社製)、インベイディングオリゴ1003、1004、1005、1006、1007、アレルプローブ1008〜1016、FAM標識FRETカセット(Hologic社製)、及びZ35 Red DyeFRETカセット(Hologic社製)を充填し、前記でFFPE切片から抽出した核酸抽出液および反応用バッファーとの混合液を専用反応容器に添加し、12.5μLの反応液を調製した。反応に用いた合成オリゴDNA(1001〜1016)の塩基配列を表1に示す。
Claims (11)
- 核酸抽出用容器内において、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内である包埋剤によって包埋された包埋組織の表面の少なくとも一部を、当該包埋剤の溶融温度以上で、界面活性剤及びアルカリ性物質からなる群より選択される1種以上を含む核酸抽出用水溶液中に接触させることにより、当該包埋組織中の核酸を前記核酸抽出用水溶液に抽出し、溶融した前記包埋剤を主成分とする包埋剤層と、抽出された核酸を含む水層とに分離する抽出工程と、
前記抽出工程後、前記核酸抽出用容器の内部に、当該核酸抽出用容器の内面形状に対応する外周面形状を有する筒状部材を、当該筒状部材の少なくとも下端部が前記水層に接し、当該筒状部材の少なくとも上端部は前記包埋剤層に接していないように設置した状態で、前記水層は液状に保持したまま、前記包埋剤層を固化させる包埋剤固化工程と、
前記包埋剤固化工程後、前記筒状部材を固化した包埋剤層と共に前記核酸抽出用容器から取り外す包埋剤除去工程と、
を有することを特徴とする、包埋組織からの核酸抽出方法。 - 前記抽出工程を、前記筒状部材を内部に設置した核酸抽出用容器内において行う、又は、
前記抽出工程後に、前記筒状部材を前記核酸抽出用容器の内部に設置する、請求項1に記載の包埋組織からの核酸抽出方法。 - 前記核酸抽出用水溶液が、界面活性剤及びタンパク質分解酵素を含む、請求項1又は2に記載の包埋組織からの核酸抽出方法。
- 前記タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼKであり、
前記抽出工程を、前記包埋剤の溶融温度以上かつ65℃以下で行う、請求項3に記載の包埋組織からの核酸抽出方法。 - 前記抽出工程後、前記包埋剤除去工程前に、前記水層を、前記タンパク質分解酵素がタンパク質分解活性を有する温度よりも高温でインキュベートする、請求項3又は4に記載の包埋組織からの核酸抽出方法。
- 前記抽出工程を、90〜100℃で行う、請求項1又は2に記載の包埋組織からの核酸抽出方法。
- 前記抽出工程後、前記包埋剤除去工程前に、前記水層に水分を添加する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の包埋組織からの核酸抽出方法。
- 筒状本体と、固化した包埋剤は透過できず、液状の包埋剤は透過可能な選別部材とを備え、
前記選別部材は、前記筒状本体の一方の端部又はその近傍に設けられており、
包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用容器の内部に設置されることを特徴とする、包埋剤除去用具。 - 筒状本体と、前記筒状本体の外周面又は内周面から張り出した突出部とを備え、
包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用容器の内部に設置されることを特徴とする、包埋剤除去用具。 - 界面活性剤及びアルカリ性物質からなる群より選択される1種以上を含む核酸抽出用水溶液と、
請求項8又は9に記載の包埋剤除去用具と、
を備え、水に不溶であり、かつ溶融温度が40〜90℃の範囲内である包埋剤によって包埋された包埋組織から核酸を抽出するために用いられることを特徴とする、包埋組織からの核酸抽出用キット。 - さらに、核酸抽出用容器を備える、請求項10に記載の包埋組織からの核酸抽出用キット。
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