CN104164417A - 一种外周血胎儿游离dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种外周血胎儿游离DNA提取方法，包括1）取孕妇外周血，离心取上清液；2）取步骤1）得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55~62℃孵育；3）把步骤2）得到的样品在冰上冷却，沉淀蛋白，离心；4）转移步骤3）上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育；5）将步骤4）得到的样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；6）将步骤5）得到的上清与磁珠混悬液室温孵育，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清，75%酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体；7）采用DNA洗脱液，将步骤6）获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸提取方法，具体上的涉及一种脱氧核糖核酸（DNA）的提取方法。
背景技术
基因组DNA 提取一般需遵循以下几个原则：1、保证提取的DNA 具有一定的长度；2、排除有机溶剂和金属离子污染；3、蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程℃；4、排除其他核酸分子的污染。对于范围在2-10ml 血样的基因组DNA 提取，经典方法是用SDS、蛋白酶k 消化，再用酚氯仿反复抽提，此过程用到了有毒的苯酚、氯仿、异戊醇等溶剂，苯酚对皮肤有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经系统；而氯仿易挥发，能分解出有毒气体，作用于中枢神经系统。吸入后对心、肾、肝有损害；异戊醇吸入或经皮肤吸收有麻醉作用，对皮肤和呼吸道有刺激，引起神经系统功能紊乱。酚氯仿法操作繁琐、耗时耗力，极易造成样本的丢失和污染。尤其应用于外周血胎儿游离DNA检测时，由于外周血中胎儿游离DNA含量较低，采用酚氯仿法时，需要的样本量较大，其有毒溶剂用量多，检测过程复杂，容易发生污染和样本丢失的问题更加突出，因此迫切需要无毒且操作步骤简单，提取时间段的提取试剂和方法。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设外周血胎儿游离DNA提取方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种外周血胎儿游离DNA提取方法。
本发明提供了一种外周血胎儿游离DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤
1）、取2~10ml孕妇外周血，3~6℃1600g 离心8-12min，将上清液于3~6℃16000g 离心8-12min后再取上清液；
2）取步骤1）中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55~62℃孵育30min；
3）把步骤2）得到的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min；
4）转移步骤3）上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育10min；
5）将步骤4）得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；
6）将步骤5）得到的上清液与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育10min，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75%酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体。
7）采用DNA洗脱液，将步骤6）获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。
所述的外周血胎儿游离DNA提取方法，优选
步骤1）为：取2~10ml孕妇外周血，4℃1600g 离心10min，将上清液于4℃16000g 离心10min后再取上清液。
步骤2) 为：取步骤1）中经16000g离心得到的上清液得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，60℃孵育30min。
步骤3)为：把步骤2）得到的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心5min。
本发明提供的外周血胎儿游离DNA提取方法，采用磁珠吸附方法将提取外周血DNA，与现有的酚氯仿法相比，避免了苯酚、氯仿、异丙醇等有毒试剂的使用，且操作步骤简单，磁珠通过静电作用能和DNA结合在一起，能吸附溶液中的DNA，且本发明提供的方法，针对胎儿游离DNA在外周血中含量较低的特点，采用了两次加入磁珠混悬液吸附的方法，能够更有针对性的提取外周血中的胎儿游离DNA。通过乙醇清洗，可以去除DNA中的其他小分子污染，DNA提取完全且纯度高，与酚氯仿法提取的DNA样品相比，本法提取的DNA样品，除了适用于巢式PCR扩增外，还可以适用于普通PCR扩增，显著的降低了后续检测的成本。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1外周血胎儿游离DNA提取方法
样品类型：新鲜外周血，取自孕周为12～37的健康妇女
一． 实验步骤
1) 取2ml孕妇外周血，4℃1600g 离心10min，所得上清液于4℃16000g 离心10min后再取上清液；
2) 取步骤1）经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，60℃孵育30min；
3) 把步骤2）得到的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心5min；
4) 转移步骤3）上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育10min；
5) 将步骤4）得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清，
6)将步骤5）得到的上清液与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育10min，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75%酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体。
7) 采用DNA洗脱液，将步骤6）获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种外周血胎儿游离DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取2~10ml孕妇外周血，3~6℃1600g 离心8-12min，将上清液于3~6℃16000g 离心8-12min后再取上清液；
2）取步骤1）中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55~62℃孵育30min；
3）把步骤2）得到的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min；
4）转移步骤3）上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育10min；
5）将步骤4）得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；
6）将步骤5）得到的上清与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育10min，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75%酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体；
7）采用DNA洗脱液，将步骤6）获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。
2.如权利要求1所述外周血胎儿游离DNA提取方法，其特征在于，所述步骤1）为：取2~10ml孕妇外周血，4℃1600g 离心10min，将上清液于4℃16000g 离心10min后再取上清液。
3.如权利要求1所述外周血胎儿游离DNA提取方法，其特征在于，所述步骤2) 为：取步骤1）中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，60℃孵育30min。
4.如权利要求1所述外周血胎儿游离DNA提取方法，其特征在于，所述步骤3)为： 把步骤2）得到的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心5min。
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