CN105349532A

CN105349532A - 一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN105349532A
Application number: CN201510939670.4A
Authority: CN
Inventors: 尹华立; 郑银娜; 裘惠良
Original assignee: Hangzhou Meilian Medical Examination Institute Co Ltd; HANGZHOU QIANJI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Meilian Medical Examination Institute Co Ltd; HANGZHOU QIANJI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明涉及一种磁珠法提取游离核酸的方法，于200ul样本中加入300ul裂解结合液和20ul磁性纳米颗粒，混合后进行第一次磁分离处理，弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5-1ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所述静置的温度为20-65℃，然后进行第三次磁分离处理，取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸。本发明还涉及一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒。本发明的磁珠法提取游离核酸的方法具有操作简便、提高提取效率和提取纯度、增大样本量并适用于片段长度短的核酸的提取的优点。

Description

一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸提取技术，特别涉及一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒。

背景技术

1948年Mandel和Metais首次报道游离核酸至今，游离核酸研究已有近70年历史，但因当时核酸是否是遗传物质而没有引起人们的广泛关注。1970年，欧洲学者首次报道肿瘤病人的血浆或血浆中存在游离DNA，其含量为健康人群的10倍左右，其为双链DNA分子，长度基本在500bp以下，大部分以核小体形式存在。大量研究证明，游离DNA与肿瘤基因组DNA具有相同的遗传变异，例如，基因突变、基因启动子甲基化等，因此，游离核酸可被用于一种预测肿瘤发生的新型标记物。1997年，Lo等首次证明孕妇外周血存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。存在于血浆或血清中来源于肿瘤细胞的游离DNA主要来源于：肿瘤细胞的凋亡、坏死释放到血液中和肿瘤细胞的转移、增殖释放到血液中。

近年来，游离DNA研究成为基因组分子诊断研究的一个热门领域，首先其可作为一种无创诊断方法，可以随时采集患者样本进行相关检测分析。其次，其可作为一类新型生物标志物，因其具有与肿瘤细胞基因组相同的遗传变异，具有显著的特异性，可以对肿瘤进行分型及早期筛查。因此，循环游离DNA的检测在临床诊断上具有非常重要的应用价值，如癌症早期筛查、肿瘤复发、疗效监控等。游离DNA研究的主要障碍为：游离DNA的分离纯化和高灵敏度检测。因游离DNA在血液中的含量低，且片段长度短，为游离DNA研究带来比较大的困难。

目前核酸提取方法主要有酚氯仿抽提、离心柱法和磁珠法。酚氯仿抽提因大量使用有毒溶剂，对操作者毒性较大，且难于实现自动化操作。离心柱法因其游离核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，均不能广泛适用于大规模的临床检测。近年发展起来的磁珠法提取核酸技术，其采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作用下就能将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作。而目前市场上的基于磁珠法的商品化试剂操作过于复杂，并且需要一定温度下使用蛋白酶K及carrierRNA进行孵育，同时需要多步洗涤等步骤，导致其自动化程度偏低，核酸提取的重复性差及提取效率低；而且提取的样本量基本在0.1-1.2ml，难于满足一些循环肿瘤DNA研究应用。

专利申请号为201410292018.3的发明专利公开了一种外周血胎儿游离DNA提取方法，包括以下步骤：1)取2～10ml孕妇外周血，3～6℃1600g离心8-12min，将上清液于3～6℃16000g离心8-12min后再取上清液；2)取步骤1)中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55～62℃孵育30min；3)把步骤2)得到的样品在冰上冷却，然后加入NH₄AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min；4)转移步骤3)上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育10min；5)将步骤4)得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；6)将步骤5)得到的上清与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育10min，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75％酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体；7)采用DNA洗脱液，将步骤6)获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。

上述专利公开的游离DNA提取方法仍存在操作复杂、重复性差、提取效率低以及提取的样本量少的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种提取效率高、操作简便且适用于大样本量的磁珠法提取游离核酸的方法，进一步针对上述方法提供一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种磁珠法提取游离核酸的方法，于0.2-5ml样本中加入0.3-7.5ml裂解结合液和20-40ul磁性纳米颗粒，混合10-20min后进行第一次磁分离处理，2-5min后弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5-1ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，2-5min后弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所述静置的温度为20-65℃，然后进行第三次磁分离处理，1-2min后取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；

所述裂解结合液包括0.5-6M的A试剂、0.5-10％体积浓度的B试剂、10-50％体积浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述B试剂为tween20、triton-X100、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7；

所述洗涤液包括0.5-3M的D试剂和10-70％体积浓度的E试剂混合制得，所述D试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍和高氯酸钠中的至少一种，所述E试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述洗涤液的pH值为5-7。

本发明还公开一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒，包括裂解结合液、磁性纳米颗粒、洗涤液和洗脱液；

所述洗涤液包括0.5-3M的D试剂和10-70％体积浓度的E试剂混合制得，所述D试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍和高氯酸钠中的至少一种，所述E试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述洗涤液的pH值为5-7。本发明的有益效果在于：

(1)采用磁珠法，通过裂解结合液、洗涤液和洗脱液，并结合三次磁分离处理的提取方法的设计，具体的，A试剂、B试剂、C试剂分别具有裂解、变性和促进核酸结合的作用，包含A试剂、B试剂、C试剂的裂解结合液通过三者的协同配合作用，从而获得优良的裂解、变性和促进核酸结合的作用；裂解结合液和洗涤液的pH值为5-7，即通过高盐低pH分离核酸，再通过低盐高pH的洗脱液洗脱核酸，通过优化改进裂解结合液，得到最佳的配方，能在不使用蛋白酶K及carrierRNA的情况下进行常温提取低浓度游离核酸，且能在常温下进行提取，无需任何高温孵育，具有操作简便、提高提取效率和提取纯度的优点；同时结合一种洗涤液，只进行一次洗涤过程得到高纯度的核酸，最后的洗脱也可以在常温下进行洗脱；具有提取操作简单方便且省时的优点。

(2)由于游离核酸浓度低，其中的游离肿瘤核酸浓度更低，裂解结合液、洗涤液和洗脱液的配方设计使得大样本量提取试剂能富集更多的核酸以用于相关检测，本发明的磁珠法提取游离核酸的方法，可以增大样本量至0.2-5ml，相应的裂解结合液按比例增大至0.3-7.5ml，磁性纳米颗粒的用量增大至20-40ul，具有大幅度提高样本量的优点，可满足大样本量提取的需求；同时，对于低浓度样本具有非常明显的富集作用；

(3)可减少提取的时间，整个提取过程时间在半小时以内，快速方便，易于全自动化、标准化操作；

(4)适用于短片段的核酸的提取，能高效用于低至100bp游离核酸片段的分离纯化；同时，分离纯化的游离核酸可直接应用于下游的各类分子生物学检测，尤其能应用临床分子诊断；

(5)本发明的磁珠法提取游离核酸的方法可以同时适用于无细胞样本和细胞样本的游离核酸的提取。

附图说明

图1为本发明磁珠法提取游离核酸的方法与采用进口Q公司磁珠法提取方法提取获得的核酸的对比检测示意图；

图2为本发明磁珠法提取游离核酸的方法用于不同样本量的提取时获得的核酸的检测示意图；

图3为本发明磁珠法提取游离核酸的方法用于提取血浆和血清样本时获得的核酸的检测示意图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

tween20为吐温-20；

triton-X100为聚乙二醇辛基苯基醚，分子式为C₃₄H₆₂O₁₁；

SDS为十二烷基硫酸钠；

NP40为乙基苯基聚乙二醇。

裂解结合液中，异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、tween20、tritonX100、SDS、NP40、高氯酸钠、异丙醇和乙醇均为化学纯或分析纯或生物纯试剂。

洗涤液中，异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠、异丙醇和无水乙醇均为化学纯或分析纯或生物纯试剂。

本发明最关键的构思在于：通过裂解结合液、洗涤液和洗脱液，并结合三次磁分离处理的提取方法的设计，使提取能在常温下进行，并提高提取效率和提取纯度。

请参照图1以及图3，本发明的磁珠法提取游离核酸的方法，于0.2-5ml样本中加入0.3-7.5ml裂解结合液和20-40ul磁性纳米颗粒，混合10-20min后进行第一次磁分离处理，2-5min后弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5-1ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，1-5min后弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所述静置的温度为20-65℃，然后进行第三次磁分离处理，1-2min后取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；

所述裂解结合液包括0.5-6M的A试剂、0.5-5％体积浓度的B试剂、10-50％体积浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述B试剂为tween20、triton-X100、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7；

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：

进一步的，所述洗脱液为无DNase和RNase酶的无菌水或者Tris缓冲液，所述Tris缓冲液为摩尔浓度为1-10mM的Tris-HCl，所述Tris缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述TE缓冲液为10mM的tris-HCl与1mM的EDTA混合物，所述的TE缓冲液的pH值为7.5-8.5。

进一步的，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。

由上述描述可知：所述磁性纳米颗粒为超顺的表面修饰羟基或羧基的二氧化硅包裹的四氧化三铁或三氧化二铁颗粒，上述的磁性纳米颗粒是经过长期实验筛选获得，具有高效吸附富集核酸的优点。

进一步的，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒于20-30℃条件下振荡10-20min。

由上述描述可知，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒先振荡再进行第一次磁分离处理，可以保证样本中的游离核酸在裂解结合液存在下与纳米磁性颗粒充分结合并在磁场作用下分离。

先将第二次磁分离处理后获得的磁珠分离物静置1-5min，弃去上清液后再加入洗脱液。

由上述描述可知，可以对获得的磁珠分离物进行洗涤操作，再通过磁场作用将上清液弃去，再进行静置操作，可以提高第二次磁纯化处理的效果；可以对磁珠结合的核酸在洗脱液条件下进行磁珠分离，提高核酸回收效率。

进一步的，将第三次磁分离处理后的上清液转移至无DNase和RNase酶的离心管中，于-20℃条件下进行保存。

由上述描述可知，可以对获得的所述游离核酸进行上述操作，进行保存。

进一步的，所述第一次磁分离处理的时间为2-5min，所述第二次磁分离处理的时间为2-5min，所述第三次磁分离处理的时间为1-2min，三次磁分离处理可采用常用的磁力分离器进行。

由上述描述可知，上述三次磁分离处理的操作时间为优选的磁分离处理时间，具有分离效果好的优点。

进一步的，所述样本为无白细胞血浆或者无白细胞血清。

由上述描述可知，本发明的样本尤指无白细胞血浆或者无白细胞血清等样本。

本发明的一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒，包括裂解结合液、磁性纳米颗粒、洗涤液和洗脱液；

所述裂解结合液包括0.5-6M的A试剂、0.5-10％体积浓度的B试剂、10-50％体积浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述B试剂为tween20、triton-X100、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇和乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7；

进一步的，所述洗脱液为无DNase和RNase酶的无菌水或者Tris缓冲液或者TE缓冲液。

所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。

本发明的实施例1为：

本实施例的磁珠法提取游离核酸的方法，本实施例采用无白细胞血浆作为样本。采用的磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。裂解结合液包括0.5M的异硫氰酸胍、0.5％的tween20、10％的异丙醇混合制得，裂解结合液的pH值为5；洗涤液包括0.5M的高氯酸钠和70％的无水乙醇混合制得，洗涤液的pH值为5。洗脱液为无DNase和RNase酶的Tris缓冲液，Tris缓冲液为摩尔浓度为10mM、pH值为8.5的Tris-HCl。

具体的提取方法为：于0.2ml样本中加入0.3ml裂解结合液和20ul磁性纳米颗粒，进行混合10min，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒于20℃条件下振荡10min，然后进行第一次磁分离处理，第一次磁分离处理的时间为2min，弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，第二次磁分离处理的时间为2min，弃去第二次磁分离处理后的上清液，先将第二次磁分离处理后磁珠分离物静置1min，弃去上清液后再加入40ul洗脱液，混合后静置5min，所述静置的温度为20℃，然后进行第三次磁分离处理，第三次磁分离处理的时间为1min，取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；将获得的所述游离核酸转移至无DNase和RNase酶的离心管中，于-20℃条件下进行保存。本发明的磁分离处理可以采用现有的磁分离技术进行，例如采用磁力架等装置对待分离的溶液进行分离处理。

本发明的实施例2为：

本实施例的磁珠法提取游离核酸的方法，本实施例采用无白细胞血清作为样本。采用的磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。裂解结合液包括6M的盐酸胍、5％的SDS、50％的乙醇和0.5M的碘化钠混合制得，裂解结合液的pH值为7；洗涤液包括3M的异硫氰酸胍和30％的无水乙醇混合制得，洗涤液的pH值为7。洗脱液为无DNase和RNase酶的Tris缓冲液，Tris缓冲液为摩尔浓度为10mM、pH值为8.5的Tris-HCl。

具体的提取方法为：于5ml样本中加入7.5ml裂解结合液和40ul磁性纳米颗粒，进行混合，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒于30℃条件下振荡20min，然后进行第一次磁分离处理，第一次磁分离处理的时间为5min，弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入1000ul洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，第二次磁分离处理的时间为5min，弃去第二次磁分离处理后的上清液，先将第二次磁分离处理后磁珠分离物静置5min，弃去上清液后再加入100ul洗脱液，混合后静置10min，所述静置的温度为65℃，然后进行第三次磁分离处理，第三次磁分离处理的时间为2min，取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；将获得的所述游离核酸转移至无DNase和RNase酶的离心管中，于-20℃条件下进行保存。

本发明的实施例3为：

本实施例的磁珠法提取游离核酸的方法，本实施例采用无白细胞血浆作为样本。采用的磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。裂解结合液包括4M的异硫氰酸胍、3％的tritonX100、30％的异丙醇和2M的高氯酸钠混合制得，裂解结合液的pH值为6；洗涤液包括1.5M的盐酸胍和50％的无水乙醇混合制得，洗涤液的pH值为6。洗脱液为无DNase和RNase酶的Tris缓冲液，Tris缓冲液为摩尔浓度为10mM、pH值为8.5的Tris-HCl。

具体的提取方法为：于2ml样本中加入3.5ml裂解结合液和30ul磁性纳米颗粒，进行混合，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒于25℃条件下振荡15min，然后进行第一次磁分离处理，第一次磁分离处理的时间为3min，弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.8ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，第二次磁分离处理的时间为3min，弃去第二次磁分离处理后的上清液，先将第二次磁分离处理后磁珠分离物静置3min，弃去上清液后再加入60ul洗脱液，混合后静置7min，所述静置的温度为56℃，然后进行第三次磁分离处理，第三次磁分离处理的时间为1.5min，取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；将获得的所述游离核酸转移至无DNase和RNase酶的离心管中，于-20℃条件下进行保存。

血浆或血清样本的制备保存：

(一)血浆样本制备：

1、全血收集：

1)受检者无需特别准备，无禁食禁水要求。

2)抽取10ml静脉血，用K2EDTA抗凝采血管。

2、全血暂存：

全血样本4℃保存，不能冷冻，24小时内完成血浆制备。

3、血浆制备：

1)离心采血管中的全血，1350±150rcf(相对离心力)12min。

2)从离心机中取出采血管，使用一次性移液器将血浆转移至一个1.5-10ml离心管。(为确保检测实验的需求尽量多转移血浆但不要触碰细胞层)

3)离心1.5-10ml离心管，1350±150rcf(相对离心力)12min。

4)从离心机中取出1.5-10ml离心管，使用移液器将血浆转移到一个新的1.5-10ml离心管。(为确保检测实验的需求尽量多转移血浆但不要触碰细胞层)

(二)血清制备：

1、全血收集：

1)受检者无需特别准备，无禁食禁水要求。

2)抽取10ml静脉血，注入无菌干燥玻璃管。

3)室温放置1小时(不要超过4h)，血标本自动凝析出血清(或1600rpm离心12min)，吸取上层血清转移至一个1.5-10ml离心管(为确保检测实验的需求尽量多转移血浆但不要触碰细胞层)。

4)离心1.5-10ml离心管，1600rpm离心12min，吸取上层血清转移至一个1.5-10ml离心管(为确保检测实验的需求尽量多转移血浆但不要触碰细胞层)。

制备好的血浆或血清室温放置不要超过2h，4度保存不超过24h，-20度保存不超过3个月，长期保存放置-70度冰箱。

实施例4：

本发明磁珠法提取方法与采用磁珠法循环游离核酸提取试剂盒(art1090)提取血浆样本对比检测

1、本发明的磁珠法提取游离核酸的方法的具体实施步骤为：

在1.5ml离心管中加入200ul血浆，再加入200ul裂解结合液、20ul纳米磁性颗粒，混匀，室温振荡10min；

将离心管置于磁力架上2min，待磁珠分离后，弃去上清液；

加入1ml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2min，待磁珠分离后，弃去上清液；

在磁力架上静置1min，弃去上清液；

加入60ul洗脱液，充分混匀后，置于56度水浴锅中5min；

再将离心管置于磁力架上1min，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无DNase与RNase酶离心管中，-20度保存备用；

以上方法中，所述的裂解结合液的组成为：6M异硫氰酸胍、5％tritonX-100、2M高氯酸钠、30％异丙醇，pH6.5；

所述的纳米磁性颗粒为超顺的表面修饰羟基的二氧化硅包裹的四氧化三铁或三氧化二铁颗粒；

所述的洗涤液为3M异硫氰酸胍、50％无水乙醇，pH7；所述的洗脱液无DNase与RNase酶无菌水。

2、磁珠法循环游离核酸提取试剂盒(art1090)具体实施步骤：

在1.5ml离心管中加入200ul血浆，再加入4ulpolyARNA、10ul蛋白酶及200ul裂解液1，振荡10s混匀，置于56度水浴锅10min；

加入600ul结合液2、20ul纳米磁性颗粒，混匀，室温振荡器放置60min孵育；

将离心管置于磁力架上5min，待磁珠分离后，弃去上清液；

加入1ml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2-5min，待磁珠分离后，弃去上清液；

在磁力架上静置1min，弃去上清液；

加入60ul洗脱液，充分混匀后，置于65度水浴锅中10min；

再将离心管置于磁力架上1-2min，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无DNase与RNase酶离心管中，-20度保存备用；

分别取实施例1-4和磁珠法循环游离核酸提取试剂盒(art1090)提取的游离核酸2ul进行实时荧光PCR检测。检测结果见图1(图1中A指的是本发明实施例1-4提取的游离核酸的检测图，B指的是磁珠法循环游离核酸提取试剂盒(art1090)提取的游离核酸的检测图)和表1。

表1

从图1扩增曲线和表1中ct值可以看出，本发明的提取试剂盒的提取效率和磁珠法循环游离核酸提取试剂盒(art1090)的提取效率相当，但本发明的提取试剂在操作步骤和程序上明显比磁珠法循环游离核酸提取试剂盒(art1090)的简单方便。

实施例5：

采用本发明的磁珠法提取游离核酸的方法提取不同样本量核酸的检测

具体实施步骤为：

在不同规格离心管中分别加入200ul、1ml、2ml、4ml和5ml血浆，再分别在相应的离心管内加入300ul、1.5ml、3ml、6ml、7.5ml裂解结合液、20ul、20ul、40ul、40ul、40ul纳米磁性颗粒，混匀，室温振荡10min；

将离心管置于磁力架上2min，待磁珠分离后，弃去上清液；

在磁力架上静置1min，弃去上清液；

加入60ul洗脱液，充分混匀后，置于室温环境中5min；

以上方法中，所述的裂解结合液的组成为：4M异硫氰酸胍、3％tritonX100、3M高氯酸钠、35％异丙醇，pH6.5；

所述的洗涤液为2M盐酸胍、50％无水乙醇，pH7；

所述的洗脱液无DNase与RNase酶tris缓冲液(10mMtris-HCl，pH8.5)；

取上述各种样本量提取的游离核酸2ul进行实时荧光PCR检测。检测结果见图2(图2中C为样本量为200ul提取的游离核酸的检测图谱，D为样本量为1ml提取的游离核酸的检测图谱，E为样本量为5ml提取的游离核酸的检测图谱，F为样本量为4ml提取的游离核酸的检测图谱，G为样本量为2ml提取的游离核酸的检测图谱)和表2。

表2

从图2和表2结果显示，本发明的提取试剂能用于不同样本量提取游离核酸，随着样本量的增加，ct值变小，提取核酸浓度增加。对于低浓度样本，增加样本量，可以富集更多的核酸，适用于下游分子生物学检测，尤其临床分子诊断。

实施例6：

本发明的磁珠法提取游离核酸的方法提取血浆和血清样本核酸检测

具体实施步骤为：

在不同规格离心管中分别加入200ul血浆或血清，再分别在相应的离心管内加入400ul裂解结合液、20ul纳米磁性颗粒，混匀，室温振荡10min；

将离心管置于磁力架上2min，待磁珠分离后，弃去上清液；

在磁力架上静置1min，弃去上清液；

加入60ul洗脱液，充分混匀后，室温5min；

以上方法中，所述的裂解结合液的组成为：6M异硫氰酸胍、5％tritonX100、2M高氯酸钠、30％异丙醇，pH6.5；

所述的洗涤液为3M异硫氰酸胍、50％无水乙醇，pH7；

所述的洗脱液无DNase与RNase酶无菌水；

取上述各种样本量提取的游离核酸2ul进行实时荧光PCR检测。检测结果见图3(图3中H指的是血浆样本提取的游离核酸的检测图谱，I指的是血清样本提取的游离核酸的检测图谱)。

从图3可以看出，本发明提取试剂能同时用于血浆或血清游离核酸的提取。

综上所述，本发明提供的磁珠法提取游离核酸的方法具有操作简便、提高提取效率和提取纯度、增大样本量至0.2-5mll并适用于片段长度短的核酸的提取的优点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，于0.2-5ml样本中加入0.3-7.5ml裂解结合液和20-40ul磁性纳米颗粒，混合后进行第一次磁分离处理，弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5-1ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所述静置的温度为20-65℃，然后进行第三次磁分离处理，取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；

2.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述洗脱液为无DNase和RNase酶的无菌水或者Tris缓冲液或者TE缓冲液，所述Tris缓冲液为摩尔浓度为1-10mM的Tris-HCl，所述Tris缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述TE缓冲液为10mM的tris-HCl与1mM的EDTA混合物，所述的TE缓冲液的pH值为7.5-8.5。

3.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。

4.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒于20-30℃条件下振荡10-20min。

5.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，先将第二次磁分离处理后获得的磁珠分离物静置1-5min，弃去上清液后再加入洗脱液。

6.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，将第三次磁分离处理后的上清液转移至无DNase和RNase酶的离心管中，于-20℃条件下进行保存。

7.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述第一次磁分离处理的时间为2-5min，所述第二次磁分离处理的时间为2-5min，所述第三次磁分离处理的时间为1-2min。

8.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述样本为无白细胞血浆或者无白细胞血清。

9.一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、磁性纳米颗粒、洗涤液和洗脱液；

10.根据权利要求9所述的磁珠法提取游离核酸的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无DNase和RNase酶的无菌水或者Tris缓冲液，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰有羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。