CN115786330B - 一种提取柞蚕微孢子虫dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于DNA提取技术领域，具体公开了一种提取柞蚕微孢子虫DNA的方法，取病蚕或单颗蚕卵作为样品进行保存处理；对保存处理的病蚕或单颗蚕卵进行预处理；取预处理后的病蚕或单颗蚕卵水浴加热后离心取上清液，加入与上清液等体积的预冷异丙醇，加入1μL‑7.5μL直径为100nm‑500nm的硅基磁珠涡旋震荡混匀冰上静置10min，置于磁力架上2min，吸取全部液体；用洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ分别洗涤后风干磁珠；待酒精全部挥发加入洗脱液洗脱之后离心，完成DNA提取。与现有技术相比，本发明的方法提取柞蚕微孢子虫DNA所得Ct值更低，筛选微孢子虫的效果更好，因此，本发明的方法更适合病蚕微孢子虫的DNA提取，而且可以在最节约成本的前提下高效完成柞蚕微孢子虫DNA的提取。

Description

一种提取柞蚕微孢子虫DNA的方法

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，特别是一种提取柞蚕微孢子虫DNA的方法。

背景技术

柞蚕属于节肢动物门，昆虫纲，鳞翅目，大蚕蛾科，柞蚕属，学名Antherea pernyi，柞蚕在东北地区是一种二化性经济昆虫，春秋两次生长周期，专性采食柞树，它具有较强抗逆性，在野外也有保护色，由于我国丰富的林业资源与柞蚕的优秀环境适应能力，柞蚕已成为我国的一项特色农业产业。辽宁省作为养蚕大省，每年农户通过柞蚕养殖可创造数亿元的直接收入(刘爱华,2020)，柞蚕可以缫丝而它的蛹也具有极高营养价值，是集可食用性与经济生产功能于一体的优质经济昆虫。虽然他的驯化程度不及家蚕与蜜蜂，但蚕丝比家蚕丝更加牢固坚韧，蚕蛹比家蚕蛹更具食用价值与适口性。食用昆虫一直是冷门领域，但柞蚕蛹的普及度却很高，人们的接受程度也很高，具有客观的经济效益与推广空间。

柞蚕微孢子虫也是柞蚕微粒子病的病原物，属于微粒子属(Nosema)，是侵染无脊椎动物的微孢子虫家族中的一员，与野外的大部分此类微孢子虫一样具备一定的宿主专一性。柞蚕微孢子虫与其他微孢子虫具有相似的侵染过程，柞蚕的生产中由于高密度的放养，会造成微孢子虫的传播，影响柞蚕生长周期，造成减产并影响蚕农的收益。

微孢子虫作为一类专性细胞内寄生的单细胞微生物，在目前已发现的1300余种微孢子虫中，约半数的微孢子虫宿主为昆虫。昆虫微孢子虫一般对于宿主具有亚致死性，可影响宿主的繁殖能力，降低其生命力并延缓昆虫的生长速度(Brooks et al.,2010)，使其长期维持幼年状态，玉米螟微粒子虫，卷叶蛾微粒子虫的蛹重，成虫寿命和繁殖力都明显下降(Brooks et al.,2010)。一般在自然的环境下由于低宿主密度微孢子虫对宿主的影响一般只有到幼虫的最后阶段时才能明显表现。但是也存在有急性发病的情况，大多是由于宿主自身的免疫丧失与环境的共同影响。

在研究微孢子虫或者对微孢子虫进行分子水平的检测，高质量核酸的提取显得非常重要(Cheng,2002；Jiang,2011；Liu et al.,2015)，对于微孢子虫DNA的提取通常需要经过胞壁的破裂与核酸的抽提两个部分(梁喜丽等,2018)。如能通过对孢子施加不同的压力或刺激，使微孢子虫的胞壁受到物理性伤害或诱发孢子出芽，以此简化微孢子虫DNA的抽提，而常规实验室通常使用CTAB法、SDS法这些传统手法提取核酸。随着更多核酸提取手法进入应用，如常用于法医痕量DNA提取的磁性微粒吸附法(Qie et al.,2012)，应用聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM对DNA的结合效应将其修饰在铁磁性纳米粒子表面，应用修饰后的粒子提取DNA(李海洋等,2017)。

比较各种核酸纯化方法，磁珠纯化法的纯化速度快、质量优(Wittt et al.,2016)。商用试剂盒常用到的硅基吸附柱，尿素裂解法，盐酸胍裂解法，SDS+CTAB裂解法，异硫氰酸胍法等很多的新型核酸提取方法，可以根据微孢子虫自身的生物学特性设计出最快捷稳定的提取方案。

目前提取DNA的方法繁多，如CTAB法、SDS法以及各种试剂盒，但不同提取方法使用的试剂有很大差别。而且微孢子虫的结构特异，如何在最便捷、高效的前提下提取纯化DNA，成为研究柞蚕微孢子虫的基础，也是开展该病原的高效分子检测的前提。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种提取柞蚕微孢子虫DNA的方法，可以在最优成本的前提下高效完成柞蚕微孢子虫DNA的提取。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种提取柞蚕微孢子虫DNA的方法，包括以下步骤：

S1、取病蚕或单颗蚕卵作为样品进行保存处理；

S2、对保存处理的病蚕或单颗蚕卵进行预处理；

S3、取预处理后的病蚕或单颗蚕卵水浴加热后离心取上清液，加入与上清液等体积的预冷异丙醇，加入1μL-7.5μL直径为100nm-500nm的硅基磁珠涡旋震荡混匀冰上静置10min，置于磁力架上2min，吸取全部液体；

S4、移下磁力架加入等体积洗涤液Ⅰ，移液枪吹匀，再次至于磁力架2min，吸取全部液体，重复此步骤两次；

S5、加入等体积洗涤液Ⅱ，移液枪吹匀，再次至于磁力架2min，吸取全部液体，重复此步骤两次；

S6、移下磁力架后，置于常温下风干硅基磁珠；待酒精全部挥发加入洗脱液，于27℃-80℃下洗脱，然后放入水浴锅内水浴5min；置于磁力架上等待2min后吸取全部溶液转移至新的离心管内，完成DNA提取。

进一步地，所述步骤S1中，样品的保存处理具体为室温活样品保存或液氮急冻样品保存。

进一步地，所述步骤S2中，对病蚕的预处理具体包括：对病蚕进行穿刺，取病蚕脂肪体放入1.5mL的EP管内；向管内加入5M的盐酸胍裂解液与100mg/L的蛋白酶K进行裂解20min-360min；然后加入陶瓷研磨珠，向研磨器内加入液氮，以3000次/min～6000次/min的速度研磨3.5min-15min。

进一步地，所述步骤S2中，对单颗蚕卵的预处理具体包括：取单颗蚕卵或利用20％KOH清洗卵胶或直接挑破蚕卵将内容物加入1.5mL EP管内；向管内加入5M的盐酸胍裂解液与100mg/L的蛋白酶K进行裂解20min-360min；然后加入陶瓷研磨珠，向研磨器内加入液氮，以3000次/min～6000次/min的速度研磨3.5min-15min。

进一步地，所述洗涤液Ⅰ由60mmol/L的GuHCl和60％的乙醇组成；所述洗涤液Ⅱ为70％的乙醇。

进一步地，所述盐酸胍裂解液由5M GuHCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1％SDS，0.5％2-巯基乙醇，750mmol/L NaCl组成。

与现有技术相比，本发明的方法与商品化磁珠核酸提取试剂盒提取的柞蚕微孢子虫DNA相比，虽然试剂盒可以提取更多的组织总DNA，但通过对柞蚕微孢子虫特异DNA进行荧光定量扩增发现，本发明的方法提取的柞蚕微孢子虫DNA更多，荧光定量Ct-value更低，更有利于柞蚕微孢子虫的扩增。因此，本发明的方法更适合病蚕中微孢子虫DNA的提取，而且可以在最节约成本的前提下高效完成柞蚕微孢子虫DNA的提取。

附图说明

图1为样品保存状态对比。

图2为样品研磨器工作档位优化。

图3为样品研磨器工作时间优化。

图4为不同DNA提取方法样品裂解时间优化。

图5为与SDS-DNA提取方法样品不同裂解时间效果比较。

图6为磁珠添加量优化。

图7为核酸洗脱温度优化。

图8为磁珠提取试剂盒与优化方案DNA提取效果对比。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

在4种不同的样品状态下提取DNA。并比较不同状态样本的DNA定量结果，经液氮急冻并保存于﹣80℃超低温冰箱中的样本DNA浓度达到568.8μg/mL；而直接保存于﹣20℃冷冻层的样品的DNA提取浓度为106.7μg/mL；常温下的活样本取样DNA浓度达到496.61μg/mL；保存于4℃冷藏中的样本DNA提取浓度为563.13μg/mL。

分别对这些DNA样本进行荧光定量PCR扩增，结果显示保存于﹣80℃超低温冰箱中的样本Ct-value达到17.42，直接保存于﹣20℃冷冻层的样品Ct-value：24.43，常温下的活样本Ct-value：16.85，保存于4℃冷藏中的样本Ct-value：28.67。

结果如图1(图中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，图2、图3、图6、图7、图8中与之相同)所示，从DNA的提取浓度可知，除了﹣20℃保存的样本DNA提取效果不佳，其余三种处理的样本所提取的DNA浓度变化不大，都在496-569μg/mL之间。比较Ct-value发现在常温和﹣80℃的样本Ct-value在16.85至17.43之间，而保存于﹣20℃和4℃的样本所提取的DNA进行荧光定量扩增后Ct-value都很高，在24-28之间。所以提取室温下新鲜病蚕DNA或液氮急冻超低温保存的微孢子虫DNA得率较好。

因此，后续实施例中采用室温活样品保存或液氮急冻样品保存。

实施例2

为了确定病蚕或单颗蚕卵预处理过程中的最佳研磨档位(即速度)，改变不同的研磨档位与时间使用研磨珠破碎样本，使用纯化微孢子虫作为提取对象，记录DNA浓度与所得Ct-value。

2档研磨(3000次/min)：当研磨时间为2min 30s时所得DNA平均浓度为37.03μg/mL；当研磨时间为3min时所得DNA平均浓度为30.55μg/mL；当研磨时间为3min 30s时所得DNA平均浓度为28.82μg/mL；当研磨时间为4min时所得DNA平均浓度为23.76μg/mL。

3档研磨(4000次/分)：当研磨时间为2min 30s时所得DNA平均浓度为27.76μg/mL；当研磨时间为3min时所得DNA平均浓度为186.53μg/mL；当研磨时间为3min 30s时所得DNA平均浓度为133.87μg/mL；当研磨时间为4min时所得DNA平均浓度为85.57μg/mL。

4档研磨(5000次/min)：当研磨时间为2min 30s时所得DNA平均浓度为31.96μg/mL；当研磨时间为3min时所得DNA平均浓度为115.30μg/mL；当研磨时间为3min 30s时所得DNA平均浓度为221.32μg/mL；当研磨时间为4min时所得DNA平均浓度为102.37μg/mL。

5档研磨(6000次/min)：当研磨时间为2min 30s时所得DNA平均浓度为57.67μg/mL；当研磨时间为3min时所得DNA平均浓度为41.95μg/mL；当研磨时间为3min 30s时所得DNA平均浓度为68.34μg/mL；当研磨时间为4min时所得DNA平均浓度为50.33μg/mL。

结果如图2所示，比较不同研磨档位下的核酸浓度得出最佳的研磨档位为4档(5000次/min)研磨3min 30s。

柞蚕微孢子虫筛查对象为柞蚕，故摸索出微孢子虫的最佳研磨档位以及时间的条件下后续使用病蚕作为试验样品，对研磨时间进行优化。选择最佳研磨档位4档(5000次/min)，病蚕研磨成为匀浆需要适当增加研磨时间。记录DNA浓度以及定量Ct-value，当使用4档研磨样本时，研磨时间为3min 30s时所得DNA浓度为499.76μg/mL定量PCR扩增所得Ct-value为18.83；当研磨时间为6min 30s时所得DNA浓度为496.61μg/mL，定量PCR扩增所得Ct-value为16.85；当研磨时间为10min 30s时所得DNA浓度为292.46μg/mL，定量PCR扩增所得Ct-value为16.62；当研磨时间为15min时所得DNA浓度为378.58μg/mL，定量PCR扩增所得Ct-value为16.93。

结果如图3所示，可知当研磨时间为3min 30s时所得DNA浓度与6min 30s时所得的DNA浓度相似，但荧光定量所得Ct-value在6min 30s时明显比3min30s时大幅降低。之后再延长研磨时间Ct-value变化不大，所以最佳的研磨档位与时间为4档(5000次/min)、6min30s。

因此，后续实施例中采用5000次/min的速度研磨6min 30s。

实施例3

分别使用SDS裂解法和盐酸胍裂解法在不同的裂解时间之后进行磁珠富集，测定DNA浓度，并对所得DNA样本进行定量扩增，比较各组Ct-value的大小区别。水浴锅65℃裂解20min后盐酸胍法所得DNA浓度为346.2μg/mL，Ct-value：30.55；SDS未成功获得DNA，延长裂解时间为30min后盐酸胍法所得DNA浓度为217.23μg/mL，Ct-value：27.2；SDS未成功获得DNA，延长裂解时间为40min后盐酸胍法所得DNA浓度为268.56μg/mL，Ct-value：27.43；SDS未成功获得DNA，延长裂解时间为50min后盐酸胍法所得DNA浓度为205.93μg/mL，Ct-value：27.57；SDS未成功获得DNA，延长裂解时间为60min后盐酸胍法所得DNA浓度为308.8μg/mL，Ct-value：27.91；SDS未成功获得DNA，延长裂解时间为180min后盐酸胍法所得DNA浓度为219.46μg/mL，Ct-value：26.87；SDS成功获得DNA所得DNA浓度为29.26μg/mL，Ct-value：N/A，延长裂解时间为360min后盐酸胍法所得DNA浓度为187.56μg/mL，Ct-value：26.87；SDS所得DNA浓度为167.6μg/mL，Ct-value：30.88。

结果如图4所示，可见盐酸胍的DNA提取浓度随着裂解时间的增长并没有明显的变化趋势，但是比较其定量扩增结果发现当裂解时间达到30min时Ct-value明显降低之后一直维持无规律的平缓波动。而普通的SDS裂解法直到裂解时间达到180min时才获得可用DNA，其定量扩增结果显示当裂解时间达到360min时，Ct-value只到30.88，高于盐酸胍裂解法裂解20min所获得的Ct-value。

比较常规DNA提取操作与优化方案的结果，排除磁珠吸附能力对于SDS裂解剂的影响，使用有机溶剂萃取的传统方法进行SDS提取DNA。水浴65℃裂解20min后SDS未成功获得DNA，延长裂解时间为30min后SDS成功获得DNA，所得DNA浓度为526.9μg/mL，Ct-value：N/A；延长裂解时间为40min后SDS所得DNA浓度为345.2μg/mL，Ct-value：N/A；延长裂解时间为50min后盐酸胍法所得DNA浓度为549.2μg/mL，Ct-value：N/A；延长裂解时间为60min后SDS所得DNA浓度为702.13μg/mL，Ct-value：30.33；延长裂解时间为180min后SDS所得DNA浓度为694.26μg/mL，Ct-value：29.73；延长裂解时间为360min后SDS所得DNA浓度为813.836μg/mL，Ct-value：24.39。

结果如图5所示，可见常规SDS裂解法纯化DNA达到360min时才可得到与盐酸胍裂解30min类似的Ct-value。所以盐酸胍裂解效率确实高于SDS，盐酸胍最适宜的裂解时间为30min。

因此，后续实施例中裂解时间采用30min。

实施例4

取同一头病蚕，每个管内加入10-20mg的病蚕样本，其他的试验操作不变的情况下仅改变硅基磁珠的直径与剂量，测定DNA样本浓度，当我们选择直径为100nm的硅基磁珠富集核酸时，硅基磁珠添加剂量为1μL时可获得平均DNA浓度为143.463μg/mL，硅基磁珠添加剂量为2.5μL时可获得平均DNA浓度为143.463μg/mL，硅基磁珠添加剂量为5μL时可获得平均DNA浓度为170.973μg/mL，硅基磁珠添加剂量为7.5μL时可获得平均DNA浓度为467.76μg/mL。

选择直径为300nm的硅基磁珠富集核酸时，硅基磁珠添加剂量为1μL时可获得平均DNA浓度为183.13μg/mL，硅基磁珠添加剂量为2.5μL时可获得平均DNA浓度为275.96μg/mL，硅基磁珠添加剂量为5μL时可获得平均DNA浓度为982.76μg/mL，硅基磁珠添加剂量为7.5μL时可获得平均DNA浓度为589.5μg/mL。

选择直径为500nm的硅基磁珠富集核酸时，硅基磁珠添加剂量为1μL时可获得平均DNA浓度为110.53μg/mL，硅基磁珠添加剂量为2.5μL时可获得平均DNA浓度为148.87μg/mL，硅基磁珠添加剂量为5μL时可获得平均DNA浓度为215.08μg/mL，硅基磁珠添加剂量为7.5μL时可获得平均DNA浓度为79.42μg/mL。

汇总所有DNA样本定量扩增结果如图4-6所示，添加1μL，100nm的硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到26.04；添加2.5μL，100nm的硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到27.07；添加5μL，100nm的硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到27.73；添加7.5μL 100nm的硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到27.92。

当改变硅基磁珠直径为300nm时，添加1μL硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到26.14；添加2.5μL后所获得的DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到25.63；添加5μL的硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到25.01；添加7.5μL后所获得的DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到25.98。

当使用直径为500nm的硅基磁珠进行核酸提取时，添加1μL硅基磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到27.30；添加2.5μL后所获得的DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到26.89；添加5μL的磁珠所获DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到26.08；添加7.5μL后所获得的DNA进行荧光定量PCR后可得到Ct-value可达到26.83。

结果如图6显示，比较三个不同直径的硅基磁珠核酸富集情况，可知四个不同的硅基磁珠添加量中都是300nm直径的硅基磁珠表现最好。

综上所述，当我们选择添加5μL 300nm硅基磁珠时，所得到的核酸提取浓度与Ct-value都是最佳的。

因此，后续实施例中采用300nm硅基磁珠，添加量为5μL。

实施例5

使用盐酸胍法提取DNA改变最后水浴洗脱的温度，观察DNA得率是否有变化。可知在洗脱温度为27℃时样本DNA的提取浓度为214.4μg/mL,将洗脱温度提升至55℃时DNA的提取浓度为358.3μg/mL，提升至65℃时DNA的提取浓度为156.2μg/mL，80℃时DNA的提取浓度为377.63μg/mL。观察DNA样品的荧光定量Ct-value，当洗脱温度为27℃时DNA样品的荧光定量Ct-value：25.39，当洗脱温度为55℃时DNA样品的荧光定量Ct-value：25.08，当洗脱温度为65℃时DNA样品的荧光定量Ct-value：25.28，当洗脱温度为80℃时DNA样品的荧光定量Ct-value：24.76。

结果如图7显示，发现四个不同的洗脱温度下的Ct-value波动平缓，仅比较DNA的提取效果当洗脱温度上升到80℃和55℃时获得DNA浓度可达到358-377μg/mL之间，洗脱温度为80℃时Ct-value最小，所以定义最佳洗脱温度为80℃。

因此，后续实施例中洗脱温度选择80℃。

上述实施例1-实施例5确定了最佳的样品保存方式：室温活样品保存或液氮急冻样品保存；样品裂解时间：30min；研磨器工作档位及工作时间：5000次/min，6min 30s；磁珠添加量：5μL的300nm硅基磁珠；洗脱温度：80℃。

实施例6

在上述实施例1-实施例5的基础上，采用本发明的方法来提取柞蚕微孢子虫DNA，以病蚕为样品，具体步骤如下：

S1、取病蚕于室温活样品保存或液氮急冻样品保存；

S2、对病蚕进行穿刺，取病蚕脂肪体放入1.5mL的EP管内；向管内加入5M的盐酸胍裂解液(由5M GuHCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1％SDS，0.5％2-巯基乙醇，750mmol/L NaCl组成)与100mg/L的蛋白酶K进行裂解30min；然后加入陶瓷研磨珠，向研磨器内加入液氮，以5000次/min的速度研磨6min 30s；

S3、取预处理后的病蚕或单颗蚕卵水浴加热后离心取上清液，加入与上清液等体积的预冷异丙醇，加入5μL直径为300nm的硅基磁珠涡旋震荡混匀冰上静置10min，置于磁力架上2min，吸取全部液体；

S4、移下磁力架加入等体积洗涤液Ⅰ(由60mmol/L的GuHCl和60％的乙醇组成)，移液枪吹匀，再次至于磁力架2min，吸取全部液体，重复此步骤两次；

S5、加入等体积洗涤液Ⅱ(70％的乙醇)，移液枪吹匀，再次至于磁力架2min，吸取全部液体，重复此步骤两次；

S6、移下磁力架后，置于常温下风干硅基磁珠；待酒精全部挥发加入洗脱液，于80℃下洗脱，然后放入水浴锅内水浴5min；置于磁力架上等待2min后吸取全部溶液转移至新的离心管内，完成DNA提取。

进一步地，比较其与磁珠提取试剂盒的提取效果之间的差异。使用本实施例的方案进行DNA提取所得DNA浓度为489.98μg/mL，而使用磁珠试剂盒所提取的DNA浓度为665.07μg/mL。对所得样本进行定量PCR检测发现使用优化方案所得Ct-value：16.68，而使用磁珠试剂盒所得Ct-value：27.09。

结果如图8显示，优化方案的Ct-value明显低于试剂盒的测定数值，说明优化方案更适合病蚕微孢子虫的DNA提取。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种提取柞蚕微孢子虫DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取病蚕或单颗蚕卵作为样品进行保存处理；

S2、对保存处理的病蚕或单颗蚕卵进行预处理；

S3、取预处理后的病蚕或单颗蚕卵水浴加热后离心取上清液，加入与上清液等体积的预冷异丙醇，加入1µL-7.5µL直径为100nm-500nm的硅基磁珠涡旋震荡混匀冰上静置10min，置于磁力架上2 min，吸取全部液体；

S4、移下磁力架加入等体积洗涤液Ⅰ，移液枪吹匀，再次至于磁力架2 min，吸取全部液体，重复此步骤两次；

S5、加入等体积洗涤液Ⅱ，移液枪吹匀，再次至于磁力架2 min，吸取全部液体，重复此步骤两次；

S6、移下磁力架后，置于常温下风干硅基磁珠；待酒精全部挥发加入洗脱液，于27℃-80℃下洗脱，然后放入水浴锅内水浴5 min；置于磁力架上等待2 min后吸取全部溶液转移至新的离心管内，完成DNA提取；

所述步骤S1中，样品的保存处理为室温活样品保存或液氮急冻样品保存；

所述步骤S2中，对病蚕的预处理包括：对病蚕进行穿刺，取病蚕脂肪体放入1.5 mL的EP管内；向管内加入5 M的盐酸胍裂解液与100 mg/L的蛋白酶K进行裂解20min-360min；然后加入陶瓷研磨珠，向研磨器内加入液氮，以3000次/min~6000次/min的速度研磨3.5min-15min；

所述步骤S2中，对单颗蚕卵的预处理包括：取单颗蚕卵或利用20% KOH清洗卵胶或直接挑破蚕卵将内容物加入1.5 mL EP管内；向管内加入5 M的盐酸胍裂解液与100 mg/L的蛋白酶K进行裂解20min-360min；然后加入陶瓷研磨珠，向研磨器内加入液氮，以3000次/min-6000次/min的速度研磨3.5min-15min；

所述洗涤液Ⅰ由60mmol/L的盐酸胍和60%的乙醇组成；所述洗涤液Ⅱ为70%的乙醇；

所述盐酸胍裂解液由5 M GuHCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，0.1%SDS，0.5%2-巯基乙醇，750 mmol/L NaCl组成。