CN115141825A - 一种微小型昆虫基因组dna的提取方法 - Google Patents

一种微小型昆虫基因组dna的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及DNA提取技术领域，具体涉及一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法。具体包括以下步骤：在特定的裂解液中破碎昆虫组织，破碎完成后加入蛋白酶K进行裂解，之后离心，收集上清并加入核糖核酸酶A消化处理，再次离心收集上清，加入氯仿/异戊醇溶液进行抽提，离心取上清，加入磁珠并将其置于磁力架上，待溶液澄清透明后，吸弃上清，沉淀中加入乙醇并在磁力架上洗涤，离心弃去上清并晾干磁珠，再用Elution buffer溶解，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后取上清即得。采用该方法300ng起始量样品即可提取到足够多的纯度、完整性满足测序和三代基因组文库构建要求的微小型昆虫基因组DNA，且测序数据总量及N50长度上表现良好。

Description

一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法
技术领域
本发明涉及DNA提取技术领域，具体涉及一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法。
背景技术
昆虫微量DNA提取一直以来是DNA提取中的一个难题，尤其是以一些体型微小的昆虫为甚。考虑到个体差异，一般会希望使用单只昆虫来进行DNA提取，如果某些昆虫本身还有甲壳，则需要将部分杂质较多的组织分离出来，那么能够用于DNA提取的组织量会更少，如何利用有限的组织量提取得到足以及进行三代文库构建的DNA起始量一直都是一个值得研究的课题。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法，采用该方法能够提取到足够多的纯度及完整性满足测序和三代基因组文库构建要求的微小型昆虫基因组DNA。
本发明采用如下技术方案：一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤S1，在裂解液中破碎昆虫组织至无明显块状；
步骤S2，加入蛋白酶K，并用移液枪轻轻吹打混匀，45～55℃裂解80～100min，期间每隔一段时间轻柔混匀处理；
步骤S3，10000～12000rpm离心3～10min，取上清；
步骤S4，在上清中添加核糖核酸酶A，35～38℃消化20～40min并冷却至室温；
步骤S5，10000～12000rpm离心3～10min，用移液器将上清转移到phase Lock Gel管，并加入等体积的氯仿/异戊醇抽提液，混匀后，放置于摇床上抽提8～15min；
步骤S6，10000～12000rpm离心8～15min，吸取上清并加入磁珠，充分混匀后，短暂离心后静置，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，弃去上清；
步骤S7，沉淀中加入预冷的75％乙醇，在磁力架上缓慢旋转离心管，使磁珠充分接触清洗液，吸弃上清，并重复操作；
步骤S8，短暂离心后，用移液器吸干残余液体，将磁珠室温晾干至磁珠表面无明显液体残留或反光，加入溴化乙锭溶液，35～40℃干浴器上溶解15～25min；
步骤S9，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，吸取上清即可。
进一步，步骤S1中的裂解液包括以下成分：0.8M盐酸胍、30mM pH 8.0的Tris、30mMpH 8.0的EDTA、体积比为5％的吐温-20、体积比为0.5％的Triton X-100。
进一步，步骤S1中裂解液的添加量为没过组织即可。
进一步，研磨过程中用裂解液多次冲洗破碎设备。
进一步，步骤S2中蛋白酶K的添加量为步骤S1中研磨后的溶液总体积的1～3％。
进一步，步骤S4中核糖核酸酶A的添加量为上清体积的0.6～1.2％。
进一步，步骤S6中磁珠的添加量与上清的体积比为1：1。
进一步，步骤S8中Elution buffer(QIAGEN REF19086)溶液。
进一步。步骤S8中Elution buffer(QIAGEN REF19086)的添加量为30uL。
进一步，步骤S1中涉及到的溶液和仪器都提前预冷处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首先在特定的裂解液中破碎昆虫组织，之后采用蛋白酶K、核糖核酸酶A进行进一步的消化处理，再采用氯仿抽提，磁珠吸附等处理，通过各试剂的选取及各步骤的严格控制，提取得到的微小型昆虫基因组DNA的纯度、完整性及量能够满足测序和三代基因组文库构建的要求，且测序数据总量及N50长度上表现良好，300ng起始量的样品即可满足上述提取要求。
附图说明
图1为本发明实施例2中Pippin Pulse脉冲场电泳检测图；其中两个图中五个条带均依次为D2203771A-GQ、D2203772A-GQ、D2203775A-GQ、15kb DNA Marker(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)、λDNA/HindIII(23130、9416、6557、4361、2322、2027、564bp)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤S1，在裂解液中破碎昆虫组织至无明显块状。
需要注意的是，样本在破碎前，需要进行前处理，如昆虫动物材料要除去与实验无关甚至又妨碍的腹部、翅膀等组织。细胞破碎就是采用外力的方法破坏细胞膜及细胞壁，使细胞内容物包括目的产物充分释放的技术。动物细胞虽然没有细胞壁，但具有细胞膜，也需要相应的细胞破碎方法来破膜，本申请中主要是通过机械切力的作用使组织细胞破碎，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研磨杵等。在本申请的该步骤中，首先要保证接触到昆虫组织的试剂及设备为预冷后的试剂或设备，并且昆虫组织在裂解液中进行破碎，如采用研磨杵进行破碎时，先将裂解液和研磨杵放置在冰盒中进行预冷处理，之后将处理后的昆虫组织样品放置于预冷灭菌后的离心管底部，先加入少量的裂解液，刚好没过组织为宜，使用塑料研磨杵，碾碎微量昆虫组织样本，直至组织均匀匀浆，无明显块状，并且尽量用裂解液多次冲洗研磨杵。
本申请中，所用的裂解液成分如下：0.8M盐酸胍、30mM Tris(pH 8.0)、30mM EDTA(pH 8.0)、5％吐温-20(V/V)、0.5％Triton X-100(v/v)。
制备方法如下：溶解76.42g盐酸胍，11.17g Na2EDTA·2H2O和3.63gTris base在600ml的超纯水中，加入250ml 20％Tween-20溶液和50ml 10％Triton X-100溶液，用NaOH调节pH至8.0后，用超纯水定容至1L。
该裂解液中，
吐温-20是一种非离子型表面活性剂，裂解膜周边蛋白；
Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，相对比较温和，可以提高真核细胞细胞膜的通透性，并使蛋白酶K保持较高活性；
盐酸胍是核酸酶的强抑制剂，它在核酸提取中的主要作用是使蛋白质变性并抑制酶活性，盐酸胍能够提高高盐环境，快速破坏细胞膜，使蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕，而且具有灭活核酸酶、释放核酸、保护核酸分子的作用。
步骤S2，加入蛋白酶K，并用移液枪轻轻吹打混匀，45～55℃裂解80～100min，期间每隔一段时间轻柔混匀处理。
也即在步骤S1得到的匀浆中，加入蛋白酶K酶解膜蛋白以及与DNA结合的组蛋白，使DNA充分游离在溶液中；之后将离心管放入水浴锅中裂解，期间每隔一段时间如15min轻柔混匀一次，保证裂解充分。蛋白酶K的添加量为步骤S1中研磨后的溶液总体积的1～3％。
步骤S3，将步骤S2中含有裂解的体系的1.5mL离心管在10000～12000rpm条件下离心3～10min，优选的为12000rpm离心5min，取上清至新的1.5mL离心管中。
步骤S4，在上清中添加核糖核酸酶A，放入35～38℃干浴锅中消化20～40min，消化完成后取出并冷却至室温。核糖核酸酶A的添加量为上清体积的0.6～1.2％
步骤S5，10000～12000rpm离心3～10min，用移液器小心将上清转入phase LockGel管，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提液，混匀后，放置于摇床上抽提8～15min。
步骤S6，10000～120000rpm离心8～15min，吸取上清到新的2mL离心管中，并加入等体积的磁珠(购自诺唯赞VAHTS DNA Clean BeadsN411)，充分混匀后，短暂离心后静置10min左右，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，弃去上清；
磁珠微球具有核壳结构，即超顺磁性核心及无机氯化硅外壳，表面修饰大量羟基基团，羟基在变性剂(如盐酸胍等)存在的条件下，和溶液中的DNA通过疏水作用、氢键作用和静电作用发生特异性结合，而不与蛋白质、色素、脂类等杂质结合。
步骤S7，沉淀中加入预冷的75％乙醇，盖上离心管盖，保持离心管在磁力架上，缓慢旋转离心管，使磁珠充分接触清洗液，吸弃上清，并重复该步操作；
步骤S8，短暂离心后，再将离心管置于磁力架上，使用10μL白色吸头吸干残余液体，注意不要吸到磁珠，将磁珠室温晾干数分钟至磁珠表面无明显残留或反光，加入适量的Elution buffer(QIAGEN REF19086)溶液，35～40℃干浴器上溶解15～25min；
步骤S9，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，吸取上清于新的1.5mL离心管内即得。
实施例
本发明实施例提供了一种微量提取寄生蜂基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将灭菌后的1.5mL离心管，塑料研磨杵，稳固放置于冰盒上预冷；
(2)将芝麻大小的寄生蜂微量组织样品至于用液氮预冷的锡箔纸盒中，使用解剖针剔除寄生蜂的一对翅膀，使用药匙将不含翅膀的寄生蜂放置于预冷灭菌后的1.5mL离心管底部，先加入少量的裂解液，刚好浸没过组织为宜，使用塑料研磨杵，碾碎微量组织样本，直至组织均匀匀浆，无明显块状，尽量用裂解液多次冲洗研磨杵，所用的裂解液成分如下：0.8M盐酸胍、30mM Tris(pH 8.0)、30mM EDTA(pH 8.0)、5％吐温-20(V/V)、0.5％Triton X-100(v/v)；
(3)在含有裂解液匀浆后的微量组织离心管中，将4μL蛋白酶K加入，移液器轻轻吹打混匀；
(4)将离心管放入50℃水浴锅裂解90min，期间每隔15min轻柔混匀一次；
(5)将上步含有200μL裂解体系的1.5mL离心管12000rpm离心5min，取上清至新的1.5mL离心管中；
(6)加入2μL核糖核酸酶RNase A，放入37℃干浴锅中消化30min；
(7)从干浴锅中取出裂解消化好的样品，冷却至室温，12000rpm室温离心5min，使用移液器小心将上清转入phase Lock Gel管中；
(8)加入等体积(上步转移至phase Lock Gel管中的上清体积)的氯仿/异戊醇(体积比24：1)抽提液，混匀后，将离心管放置于摇床上抽提10min；
(9)12000rpm离心10min，吸取上清到新的2mL离心管中；
(10)将上步的上清液加入等体积的磁珠，充分混匀，短暂离心后静置10min，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，弃去上清。
(11)加入1mL预冷的75％乙醇，盖上离心管盖，保持离心管在磁力架上，缓慢旋转离心管，使磁珠充分接触清洗液，吸弃上清；
(12)重复上一步，短暂离心后，再将离心管置于磁力架上，使用10μL白色吸头吸干残余液体，注意不要吸到磁珠；
(13)磁珠室温晾干数分钟至磁珠表面无明显液体残留或反光，加入适量的EB溶液，37℃干浴器上溶解20min；
(14)将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，吸取上清于新的1.5mL离心管内；
(15)DNA检测：Nanodrop检测(样品纯度判定)；Qubit检测(样品浓度精确测定)；Pippin Pulse脉冲场电泳(样品完整性判定)；
(16)建库上机测序。
其中，Nanodrop/Qubit检测结果如下表1所示，Pippin Pulse脉冲场电泳结果如图1所示，ONT测序结果如下表2所示：
表1 Nanodrop/Qubit检测结果
Figure BDA0003796118330000071
表2 ONT测序结果
Figure BDA0003796118330000081
从图1中Pippin Pulse脉冲场电泳检测图可以看出，用本发明方法提取的总DNA，目的条带特备清晰，无点样孔残留，结合表1中Nanodrop检测结果可知，A260/280在1.8～1.9之间，说明提取的DNA纯度及完整性达标，能够满足测序实验需要；
从表1中Qubit检测结果可知，DNA总量均大于0.3μg，说明提取的DNA总量能达到三代基因组文库构建的起始量标准；
从表2中ONT测序结果可知，在测序数据总量及N50长度上均有较好的表现。
发明人进一步采用上述方法用于萤火虫，瓢虫的提取，均提取到了足够的基因组DNA，纯度及完整性也均能满足测序实验要求，且进一步的测序结果显示：测序数据总量及N50长度上均具有较好的表现。其中萤火虫样本前处理如下：将绿豆大小的萤火虫微量组织样品至于用液氮预冷的锡箔纸盒中，使用解剖针剔除萤火虫的一对翅膀，使用药匙将不含翅膀的萤火虫,放置于预冷灭菌后的1.5mL离心管底部,先加入少量的裂解液，刚好浸没过组织为宜，使用塑料研磨杵，碾碎微量组织样本，直至组织均匀匀浆，无明显块状，尽量用裂解液多次冲洗研磨杵。
本发明首先在特定的裂解液中破碎昆虫组织，之后采用蛋白酶K、核糖核酸酶A进行进一步的消化处理，再采用氯仿抽提，磁珠吸附等处理，通过各试剂的选取及各步骤的严格控制，300ng起始量的样品即可保证提取得到的微小型昆虫基因组DNA的纯度、完整性及量能够满足测序和三代基因组文库构建的要求，且测序数据总量及N50长度上表现良好。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，在裂解液中破碎昆虫组织至无明显块状；其中，裂解液包括以下成分：0.8M盐酸胍、30mM pH 8.0的Tris、30mM EDTA、体积比为5％的吐温-20、体积比为0.5％的TritonX-100；
步骤S2，加入蛋白酶K，并用移液枪轻轻吹打混匀，45～55℃裂解80～100min，期间每隔一段时间轻柔混匀处理；
步骤S3，10000～12000rpm离心3～10min，取上清；
步骤S4，在上清中添加核糖核酸酶A，35～38℃消化20～40min并冷却至室温；
步骤S5，10000～12000rpm离心3～10min，用移液器将上清转移到phase Lock Gel管，并加入等体积的氯仿/异戊醇抽提液，混匀后，放置于摇床上抽提8～15min；
步骤S6，10000～12000rpm离心8～15min，吸取上清并加入磁珠，充分混匀后，短暂离心后静置，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，弃去上清；
步骤S7，沉淀中加入预冷的75％乙醇，在磁力架上缓慢旋转离心管，使磁珠充分接触清洗液，吸弃上清，并重复操作；
步骤S8，短暂离心后，用移液器吸干残余液体，将磁珠室温晾干至磁珠表面无明显液体残留或反光，加入溴化乙锭溶液，35～40℃干浴器上溶解15～25min；
步骤S9，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清透明后，吸取上清即可。
2.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S1中裂解液的添加量为没过组织即可。
3.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，研磨过程中用裂解液多次冲洗破碎设备。
4.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S2中蛋白酶K的添加量为步骤S1中研磨后的溶液总体积的1～3％。
5.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S4中核糖核酸酶A的添加量为上清体积的0.6～1.2％。
6.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S6中磁珠的添加量与上清的体积比为1：1。
7.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S8中Elution buffer溶液。
8.根据权利要求8所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S8中Elution buffer的添加量为30uL。
9.根据权利要求1所述的微小型昆虫基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤S1中涉及到的溶液和仪器都提前预冷处理。
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