JP6768700B2 - 組織材料を破壊するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、特に、固形組織などの組織試料を破壊するための組成物であって、機械的なグラインディングまたはミリングによる破壊と、酵素消化とを同時に行うことによる組合せ破壊処理のために、固体破壊粒子を、酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素、および少なくとも1つのカオトロピック剤との組合せで含む組成物に関する。さらに、本発明は、機械的なグラインディングまたはミリングによる破壊と、酵素消化とを同時に適用することにより、固形組織材料を破壊するための方法にも関する。本発明はさらに、本発明に従う、固形組織破壊を実行するためのキットおよびシステムにも関する。
試料材料の破壊ステップは、無傷の試料に由来する所望の成分(分析物)を、分離、単離、および分析することを伴う分析的調査研究、特に、核酸、RNA、DNA、タンパク質、および他の生化学的分析物などの細胞成分の単離/採取および分析における、最初の根本的なステップの1つである。
本発明の目的は、例えば、核酸、RNA、DNA、および他の細胞成分など、感受性の生化学的分析物を単離および採取するために、固形組織材料を効率的に破壊し、ホモジナイズするための、新たな改善された方法であって、先行技術による方法の欠点を回避する方法を提供することであった。好ましくは、固形組織を破壊するための、新たな改善された方法は特に、穏和である。より好ましくは、新たな方法は、固形組織試料の、穏和な破壊およびホモジナイゼーション、単離分析物の品質の改善を提供し、より迅速に働き、特に、ハイスループットを伴う自動式分析のために、試料調製を簡略化する。なおより好ましくは、新たな改善された方法は、穏和な機械的および/または穏和な化学的衝撃を、組織試料に適用すること、特に、低減された機械的力および/または低減された化学的衝撃を適用することにより実行する。なおより好ましくは、カオトロピック剤の化学的衝撃は低減される。さらに、組織試料の、機械的溶解処理と、化学的(すなわち、酵素的)溶解処理との組合せにおいて、その最適の有効性をもたらすように、溶解酵素の活性を改善し、その不活化を回避することが好ましい。破壊/消化時間を短縮した、より迅速な方法を提供することも、さらに好ましい。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
固形組織材料を破壊するための組成物であって、
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・1Mと等しいかまたはこれ未満の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤と;好ましくは
・少なくとも1つの緩衝液と
を含み、前記酵素を変性または不活化させる量でアルコールを含まない組成物。
(項目2)
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤;
およびこれらの混合物
から選択される、1または複数の作用剤をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目3)
酵素的溶解のための前記酵素以外の、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(項目4)
酵素的溶解のための、前記少なくとも1つの酵素が、プロテアーゼ、好ましくは、プロテイナーゼKの群から選択される、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(項目5)
前記組織材料が、ヒトおよび動物に由来する固形組織から選択される、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(項目6)
前記少なくとも1つのカオトロピック剤が、グアニジニウム塩酸塩である、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(項目7)
前記固体破壊粒子が、少なくとも1mmのサイズを呈する、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
前記固体破壊粒子が、2mm超のサイズを呈する、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記固体破壊粒子が、3mm以上のサイズを呈する、項目7または8に記載の組成物。
(項目10)
組織材料を破壊するためのキットであって、
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と;
・1Mと等しいかまたはこれ未満の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤と;任意選択で、
・少なくとも1つの界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤;
・酵素的溶解のための前記酵素以外の、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼ;
・少なくとも1つの有機溶媒、好ましくは、アルコール
から選択される、1または複数の作用剤と;
・任意選択で、前記組織材料を受け入れるための容器と;
・前記組織材料を処理するための指示を伴う小冊子と
を含むキット。
(項目11)
項目1から9のいずれか一項に規定の組成物、または項目10に規定のキットと、前記組織材料のミリングをもたらすためのデバイス、好ましくは、高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーとを含むシステム。
(項目12)
項目1から9のいずれか一項に規定の組成物、項目10に規定のキット、または項目11に規定のシステムを含み、破壊のための組織材料をさらに含むシステム。
(項目13)
組織材料を破壊するための方法であって、1または複数の固体破壊粒子と、酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と、1Mと等しいかまたはこれ未満の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤とを含み、前記酵素を変性または不活化させる量でアルコールを含まない溶解液中で、前記組織材料を、グラインディング、ミリング、またはビーティングすることにより、前記組織材料を、
・グラインディング、ミリング、またはビーティングによる機械的破壊と
・酵素的溶解による化学的破壊と
の同時的処理に供する方法。
(項目14)
前記少なくとも1つのカオトロピック剤が、グアニジニウム塩酸塩である、項目13に記載の方法。
(項目15)
破壊を、ボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用すること、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより実行する、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
項目1から9のいずれか一項に規定の組成物、項目10に規定のキット、または項目11および12に規定のシステムを使用することにより実行される、項目13から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
(i)適切な容器内の組織材料へと、
a)前記1もしくは複数の固体破壊粒子、少なくとも1つの緩衝液、酵素的溶解のための、前記少なくとも1つの酵素、前記少なくとも1つのカオトロピック剤、任意選択で、RNアーゼ、および任意選択で、界面活性剤、浸透圧安定化剤、還元剤、ヌクレアーゼ阻害剤、消泡剤、もしくはこれらの混合物から選択される、1もしくは複数の作用剤、または
b)項目1から9のいずれか一項に規定の組成物
を添加するステップと;
(ii)任意選択で、前記容器を閉止するステップと;
(iii)高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用して、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより、前記容器内の前記組織材料を破壊するステップと;
(iv)ステップ(iii)の混合物を、高温でインキュベートするステップと;
(v)任意選択で、ステップ(iii)および(iv)を反復するステップと;
(vi)任意選択で、結果として得られる混合物を、後続の精製工程ステップ、分離工程ステップ、抽出工程ステップおよび/または分析工程ステップのために提供するステップと
を含む、項目13から16のいずれか一項に記載の方法。
本発明の主題は、組織材料の破壊およびホモジナイゼーションのための、新たな組成物および方法である。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と
を含む。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と
を含む。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と;
・好ましくは、1Mを下回るかまたはこれと等しいカオトロピック剤の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤と
を含む。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つの消泡剤と
を含む。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と;
・好ましくは、1Mを下回るかまたはこれと等しいカオトロピック剤の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤と;
・少なくとも1つの消泡剤と
を含む。
・少なくとも1つのカオトロピック剤;
・少なくとも1つのデタージェント;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤、
およびこれらの任意の混合物
から選択される、1または複数の作用剤
をさらに含む。
・少なくとも1つのデタージェント;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの還元剤;
およびこれらの任意の混合物
から選択される、1または複数の作用剤と
を含む組成物に関する。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・好ましくは、トリス緩衝液およびPBS緩衝液から選択される、少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩と;
任意選択で、
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤であり、好ましくは、Tween20およびTriton X−100から選択される界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは、EDTA;
・少なくとも1つの消泡剤、好ましくは、ポリジメチルシロキサン;
・好ましくは、スクロースおよびソルビトールから選択される、少なくとも1つの浸透圧安定化剤;ならびに
・RNアーゼの群から選択される、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼ
から選択される、1または複数の作用剤と
からなる組成物に関する。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・好ましくは、トリス緩衝液およびPBS緩衝液から選択される、少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩と;
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤であり、好ましくは、Tween20およびTriton X−100から選択される界面活性剤と;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは、EDTAと;
・RNアーゼの群から選択される、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼと
からなる組成物に関する。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・好ましくは、トリス緩衝液およびPBS緩衝液から選択される、少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩と;
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤であり、好ましくは、Tween20およびTriton X−100から選択される界面活性剤と;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは、EDTAと
からなる組成物に関する。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・好ましくは、トリス緩衝液およびPBS緩衝液から選択される、少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩と;
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤であり、好ましくは、Tween20およびTriton X−100から選択される界面活性剤と;
・RNアーゼの群から選択される、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼと
からなる組成物に関する。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・好ましくは、トリス緩衝液およびPBS緩衝液から選択される、少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩と;
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤であり、好ましくは、Tween20およびTriton X−100から選択される界面活性剤と
からなる組成物に関する。
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・好ましくは、トリス緩衝液およびPBS緩衝液から選択される、少なくとも1つの緩衝液と;
・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩と;
任意選択で、
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤であり、好ましくは、Tween20およびTriton X−100から選択される界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは、EDTA;
・少なくとも1つの消泡剤、好ましくは、ポリジメチルシロキサン;
・好ましくは、スクロースおよびソルビトールから選択される、少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・好ましくは、グルタチオン、ジチオトレイトール、およびベータ−メルカプトエタノールから選択される、少なくとも1つの還元剤;
・RNアーゼの群から選択される、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼ
から選択される、1または複数の作用剤と;
・任意選択で、組織材料を受け入れるための容器と;さらに、
・好ましくは、アルコール、好ましくは、エタノールおよび/またはイソプロパノールから選択される、少なくとも1つの有機溶媒と;
・組織材料を処理するための指示を伴う小冊子と
を含むキットにも関する。
・グラインディング、ミリング、またはビーティングによる機械的破壊と
・酵素的溶解による化学的破壊と
の同時的処理に供する方法にも関する。
(i)適切な容器(例えば、キットとの関連で、上記で規定された)内の組織材料へと、
a)1もしくは複数の固体破壊粒子、少なくとも1つの緩衝液、酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素、少なくとも1つのカオトロピック剤、任意選択で、RNアーゼ、および任意選択で、界面活性剤、還元剤、ヌクレアーゼ阻害剤、消泡剤、もしくはこれらの混合物から選択される、1もしくは複数の作用剤、または
b)上記で規定された組成物のうちのいずれか
を添加するステップと;
(ii)任意選択で、容器を閉止するステップと;
(iii)高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用して、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより、容器内の組織材料を破壊するステップと;
(iv)ステップ(iv)の混合物を、好ましくは、24℃を上回り、より好ましくは、25〜70℃の間の高温でインキュベートするステップと;
(v)任意選択で、ステップ(iii)および(iv)を反復するステップと;
(vi)任意選択で、結果として得られる混合物を、後続の精製、分離、抽出および/または分析工程ステップのために提供するか;あるいは、代替的に、好ましくは、例えば、失活化に適する試薬の添加および/または結果として得られる混合物の冷却もしくは冷凍により、溶解試薬、特に、溶解酵素を失活化させた後で、結果として得られる混合物を保存するステップと
を含むことによって特徴付けられる。
・処理された材料の回収ステップ;
・例えば、溶解作用剤、特に、溶解酵素を不活化すること、例えば、混合物を冷凍することによる、処理された材料の安定化ステップ;
・処理した(かつ安定化させた)材料を保存するステップ;
・例えば、さらなるカオトロープならびに/またはアルコール、特に、エタノールおよび/もしくはイソプロパノールなどの有機溶媒を添加することによる、分析物の結合ステップ;
・例えば、シリカベースの膜、カラム、またはシリカ磁気ビーズベースの技法を使用する、分析物の精製ステップ;
・例えば、溶出技法を使用する、分析物の単離ステップ;
・分析物の濃縮ステップ;
・分析物の回収ステップ;
・精製/単離された分析物の安定化ステップ;
・精製/単離された分析物を保存するステップ;
・分析するステップ、例えば、PCR分析ステップ
を含むステップを含みうる。
1.組織材料を破壊するための組成物であって、
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;好ましくは
・少なくとも1つの緩衝液と
を含み、酵素を変性または不活化させる量でアルコールを含まない組成物。
2.・少なくとも1つのカオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム塩酸塩;
・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤;
およびこれらの混合物
から選択される、1または複数の作用剤をさらに含む、実施形態1に記載の組成物。
3.酵素的溶解のための酵素以外の、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼをさらに含む、実施形態1または2に記載の組成物。
4.酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素が、プロテアーゼ、好ましくは、プロテイナーゼKの群から選択される、前記実施形態のいずれか1つに記載の組成物。
5.組織材料が、ヒトおよび動物に由来する固形組織から選択される、前記実施形態のいずれか1つに記載の組成物。
6.1Mと等しいかまたはこれ未満の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤を含む、前記実施形態のいずれか1つに記載の組成物。
7.固体破壊粒子が、少なくとも1mmのサイズを呈する、前記実施形態のいずれか1つに記載の組成物。
8.組織材料を破壊するためのキットであって、
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と;
任意選択で、
・少なくとも1つのカオトロピック剤;
・少なくとも1つの界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤;
・酵素的溶解のための酵素以外の、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼ;
・少なくとも1つの有機溶媒、好ましくは、アルコール
から選択される、1または複数の作用剤と;
・任意選択で、組織材料を受け入れるための容器と;
・組織材料を処理するための指示を伴う小冊子と
を含むキット。
9.実施形態1から7のいずれか1つに規定の組成物、または実施形態8に規定のキットと、組織材料のミリングをもたらすためのデバイス、好ましくは、高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーとを含むシステム。
10.実施形態1から7のいずれか1つに規定の組成物、実施形態8に規定のキット、または実施形態9に規定のシステムを含み、破壊のための組織材料をさらに含むシステム。
11.組織材料を破壊するための方法であって、1または複数の固体破壊粒子と、酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素とを含み、酵素を変性または不活化させる量でアルコールを含まない溶解液中で、組織材料を、グラインディング、ミリング、またはビーティングすることにより、組織材料を、
・グラインディング、ミリング、またはビーティングによる機械的破壊と
・酵素的溶解による化学的破壊と
の同時的処理に供する方法。
12.溶解液が、1Mと等しいかまたはこれ未満の総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤をさらに含む、実施形態11に記載の方法。
13.破壊を、ボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用すること、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより実行する、実施形態11または12に記載の方法。
14.実施形態1から7のいずれか1つに規定の組成物、実施形態8に規定のキット、または実施形態9および10に規定のシステムを使用することにより実行される、実施形態11から13のいずれか1つに記載の方法。
15.(i)適切な容器内の組織材料へと、
a)1もしくは複数の固体破壊粒子、少なくとも1つの緩衝液、酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素、任意選択で、RNアーゼ、および任意選択で、カオトロピック剤、界面活性剤、浸透圧安定化剤、還元剤、ヌクレアーゼ阻害剤、消泡剤、もしくはこれらの混合物から選択される、1もしくは複数の作用剤、または
b)実施形態1から7のいずれか1つに規定の組成物
を添加するステップと;
(ii)任意選択で、容器を閉止するステップと;
(iii)高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用して、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより、容器内の組織材料を破壊するステップと;
(iv)ステップ(iii)の混合物を、高温でインキュベートするステップと;
(v)任意選択で、ステップ(iii)および(iv)を反復するステップと;
(vi)任意選択で、結果として得られる混合物を、後続の精製、分離、抽出および/または分析工程ステップのために提供するステップと
を含む、実施形態11から14のいずれか1つに記載の方法。
RNALater(Qiagenから市販されている)で安定化させた、ラット
肝臓:25mg、筋肉:25mg、肺:10mg、腎臓:20mg、心臓:10mg
組織試料を受け入れるための容器
チューブ:2mlスクリューキャップ式チューブ(PP;Sarstedt:スカート付き基部)
ビーズ:5/32インチのボールコーン(ABBOTTBall)、
5mmの球形ステンレス鋼製ビーズ、
ファセットジルコニウムビーズ
A)多様なアダプター:フォームインサート、水平方向および垂直方向のMicrotube Holderを伴うVortex Genie 2(Scientific Industries SI−V524)(VortexD)
B)TissueLyser II(Qiagenから市販されている)
C)TissueLyser LT(Qiagenから市販されている)
20μlのプロテイナーゼK
4μlのRNアーゼA
200μlのAVE緩衝液、および
40μlのVXL緩衝液(Qiagenから市販されている)
265μlのMVL緩衝液、
500μlのAW1緩衝液、
500μlのAW2緩衝液、
50〜100μlのATE緩衝液(Qiagenから市販されている)
・プロテイナーゼKは、この濃度のカオトロピック塩中で極めて活性であるが、1Mから0.5Mまでの任意の濃度のグアニジンを使用しうる可能性が高い。
・界面活性剤(デタージェント)としては、Tween20およびTritonX−100が存在するが、他の界面活性剤もまた有効であろう。界面活性剤は、全ての組織に必要なわけではないが、いかなる組織のための工程にも有害ではなく、特に、肝臓または脳などの脂肪組織を使用する場合の結果を改善する。
・化学反応は、カラムベースの手順に制約されず、シリカ磁気ビーズベースの手順も同等に有効である。
1.組織試料を切り出すか、または保存場所から取り出す
A)適切な2mlチューブアダプターを備えたVortex Genie2:最高速度(3200rpm)で5分間
B)2×24の2mlマイクロ遠心アダプターを備えたTissueLyser II:24Hzで30秒間
C)TissueLyser LT:30〜45Hzで1〜2分間
インキュベーションの後で、残留組織がなお残っていたら、組織のホモジナイゼーションを再度実行した。
A)Vertical Microtube Holderを伴うVortex Genie2:最高速度(3200rpm)で3分間
B)TissueLyser II:20Hzで15秒間
C)TissueLyser LT:30〜40Hzで45秒間
UV−VIS分光光度計(Nanodrop)/DNA特異的蛍光アッセイ(Qubit 2.0);
0.6%のTAEゲル:
20ボルトで18時間
鋳型:同じ容量の溶出物
反応1回当たり12000コピーの内部対照DNA(ICDNA)および溶出物6μl当たり1μlの添加を伴う、QF Pathogen+内部対照DNAアッセイ(QFPathgenmitlCDNA−Assay)
試験結果:
上記で与えた試験条件を適用して、本発明の方法の有効性を、古典的なプロテイナーゼK消化と比較した時間および労力の点で査定した。
上記で与えた試験条件を適用して、本発明の方法の有効性を、異なる破壊粒子を考慮して査定した。
上記で与えた試験条件を適用して、本発明の方法の有効性を、異なる組織材料を考慮して査定した。
上記で与えた試験条件を適用して、機械的溶解と、化学的(酵素的)溶解との組合せの有効性であって、個別の処理と比較した有効性について査定した。
肝臓:10mg 筋肉:10mg
3.87 2.12
本発明の組成物の有効性を、いくつかの市販の試験キットと比較して査定した。
Claims (15)
- 固形組織材料を破壊するための組成物であって、
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・0.5M〜1Mの総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤であって、グアニジニウム塩酸塩である、少なくとも1つのカオトロピック剤と;好ましくは
・少なくとも1つの緩衝液と
を含み、前記酵素を変性または不活化させる量でアルコールを含まない組成物。 - ・好ましくは、非イオン性界面活性剤の群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤;
およびこれらの混合物
から選択される、1または複数の作用剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。 - 酵素的溶解のための前記酵素以外の、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼをさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 酵素的溶解のための、前記少なくとも1つの酵素が、プロテアーゼ、好ましくは、プロテイナーゼKの群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組織材料が、ヒトおよび動物に由来する固形組織から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記固体破壊粒子が、少なくとも1mmのサイズを呈する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記固体破壊粒子が、2mm超のサイズを呈する、請求項6に記載の組成物。
- 前記固体破壊粒子が、3mm以上のサイズを呈する、請求項6または7に記載の組成物。
- 固形組織材料を破壊するためのキットであって、
・1または複数の固体破壊粒子と;
・酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と;
・少なくとも1つの緩衝液と;
・0.5M〜1Mの総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤であって、グアニジニウム塩酸塩である、少なくとも1つのカオトロピック剤と;任意選択で、
・少なくとも1つの界面活性剤;
・少なくとも1つのヌクレアーゼ阻害剤;
・少なくとも1つの消泡剤;
・少なくとも1つの浸透圧安定化剤;
・少なくとも1つの還元剤;
・酵素的溶解のための前記酵素以外の、少なくとも1つのさらなる酵素、好ましくは、RNアーゼ;
・少なくとも1つの有機溶媒、好ましくは、アルコール
から選択される、1または複数の作用剤と;
・任意選択で、前記組織材料を受け入れるための容器と;
・前記組織材料を処理するための指示を伴う小冊子と
を含むキット。 - 請求項1から8のいずれか一項に規定の組成物、または請求項9に規定のキットと、前記組織材料のミリングをもたらすためのデバイス、好ましくは、高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーとを含むシステム。
- 請求項1から8のいずれか一項に規定の組成物、請求項9に規定のキット、または請求項10に規定のシステムを含み、破壊のための組織材料をさらに含むシステム。
- 固形組織材料を破壊するための方法であって、1または複数の固体破壊粒子と、酵素的溶解のための少なくとも1つの酵素と、0.5M〜1Mの総濃度の、少なくとも1つのカオトロピック剤であって、グアニジニウム塩酸塩である、少なくとも1つのカオトロピック剤とを含み、前記酵素を変性または不活化させる量でアルコールを含まない溶解液中で、前記組織材料を、グラインディング、ミリング、またはビーティングすることにより、前記組織材料を、
・グラインディング、ミリング、またはビーティングによる機械的破壊と
・酵素的溶解による化学的破壊と
の同時的処理に供する方法。 - 破壊を、ボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用すること、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより実行する、請求項12に記載の方法。
- 請求項1から8のいずれか一項に規定の組成物、請求項9に規定のキット、または請求項10および11に規定のシステムを使用することにより実行される、請求項12または13に記載の方法。
- (i)適切な容器内の組織材料へと、
a)前記1もしくは複数の固体破壊粒子、少なくとも1つの緩衝液、酵素的溶解のための、前記少なくとも1つの酵素、前記少なくとも1つのカオトロピック剤、任意選択で、RNアーゼ、および任意選択で、界面活性剤、浸透圧安定化剤、還元剤、ヌクレアーゼ阻害剤、消泡剤、もしくはこれらの混合物から選択される、1もしくは複数の作用剤、または
b)請求項1から8のいずれか一項に規定の組成物
を添加するステップと;
(ii)任意選択で、前記容器を閉止するステップと;
(iii)高出力ミキシングミル、高速ミキサー、またはボルテクサーを含む低出力ミキサーを使用して、好ましくは、ボルテクサーを使用することにより、前記容器内の前記組織材料を破壊するステップと;
(iv)ステップ(iii)の混合物を、高温でインキュベートするステップと;
(v)任意選択で、ステップ(iii)および(iv)を反復するステップと;
(vi)任意選択で、結果として得られる混合物を、後続の精製工程ステップ、分離工程ステップ、抽出工程ステップおよび/または分析工程ステップのために提供するステップと
を含む、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
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