ES2865280T3 - Composición y método para la disrupción de material de tejido - Google Patents

Composición y método para la disrupción de material de tejido Download PDF

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Tanya Sperling
Stefanie Schroeer
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Abstract

Uso de una composición que comprende - una o más partículas disruptivas sólidas; - al menos una enzima para la lisis enzimática; - al menos un agente caotrópico en una concentración total igual o menor de 1 M; y preferiblemente - al menos un tampón para la disrupción de material de tejido sólido derivado de seres humanos y animales.

Description

D E S C R IP C IÓ N
C o m p o s ic ió n y m é to do p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o
In tro d u c c ió n
La p re se n te inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m u e s tra s de te jid o , ta l co m o en p a rticu la r te jid o só lid o , d o n d e la co m p o s ic ió n co m p re n d e p a rtícu la s d is ru p tiv a s só lid a s en co m b in a c ió n con al m e no s u n a e n z im a p a ra lis is e n z im á tica , y al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, p a ra un tra ta m ie n to de d is ru p c ió n co m b in a d o p o r m e d io de d is ru p c ió n p o r tr itu ra c ió n o m o lie n d a m e cá n ica y d ig e s tió n e n z im á tic a s im u ltá n e a s . A d ic io n a lm e n te , la inve nc ión se re fie re a un m é to do p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o a p lica n d o de fo rm a s im u ltá n e a d is ru p c ió n p o r tr itu ra c ió n o m o lie n d a m e cá n ica y d ig e s tió n e n z im á tica . La inve n c ió n se re fie re a d ic io n a lm e n te a un kit y s is te m a s p a ra lle v a r a ca b o la d is ru p c ió n de te jid o só lid o de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión .
A n te c e d e n te s
La e ta p a de d is ru p c ió n de un m a te ria l de m u e s tra es u na de las e ta p a s p rim e ra s y fu n d a m e n ta le s en la inve stig ac ión a na lítica , q ue im p lica sep a ra r, a is la r y a n a liza r e l co m p o n e n te d e s e a d o (a na lito ) de u na m u e s tra in ta c ta , en p a rtic u la r en e l a is la m ie n to /re co le cc ió n y a n á lis is de c o m p o n e n te s c e lu la re s ta le s co m o á c id os n uc le icos , A R N , A D N , p ro te ín a s y o tro s a n a lito s b io q u ím ico s .
En p rin c ip io , e x is te n m é to d o s q u ím ic o s y m e cá n ico s /fís ico s p a ra la d is ru p c ió n de m u e s tra s b io ló g ica s . P ara m u ch os tip o s de m u e s tra s ta le s com o , p o r e je m p lo , E. c o Ií y c é lu la s c u ltiva d a s se p re fie re n h a b itu a lm e n te los m é to d o s q u ím ico s . P ara m u e s tra s b io ló g ica s q u e no p ue de n ro m p e rse e fic a zm e n te p o r tra ta m ie n to s q u ím ico s , co m o p o r e je m p lo , m u ch o s m ic ro o rg a n ism o s , te jid o s só lid os , m u e s tra s só lid a s (p o r e je m p lo , se m illa s ) se usa n g e n e ra lm e n te los m é to d o s m e cá n ico s /fís ico s , q ue se b asan en la tr itu ra c ió n , c iza lla m ie n to , p o r m e d io de g o lp e s y fu e rz a s de cho qu e .
Los m é to d o s de d is ru p c ió n q u ím ica c o n o c id o s sue len u sa r las d e n o m in a d a s s o lu c io n e s de lis is o ta m p o n e s de lis is a b ase de d e te rg e n te s , te n s io a c tivo s , e n z im a s lítica s o ca o tró p ico s , q u e ro m p en la e s tru c tu ra de la m u e s tra b io ló g ica o d e las c é lu la s p a ra lib e ra r e l c o n te n id o c e lu la r o los a na lito s .
Los m é to do s de d is rup c ió n m e cá n ico s o fís icos sue len u tiliza r h om o ge ne izad o res , m orteros , son ica d ore s , m ezc lado res, m o lino s y ag itad o res de vó rtex , q ue rom pen m e cá n ica m en te la e s tru c tu ra de la m u es tra b io ló g ica m e d ia n te el tritu rac ión , c iza llam ie n to , p o r m ed io de g o lpes y fu e rza s de cho qu e p ara libe ra r e l con ten ido ce lu la r o los ana litos.
La e le cc ió n de l m é to do de d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n d e p e n d e en g ran m e d id a d e l tip o de m u e s tra b io ló g ica a tra ta r, a s í co m o de los c o m p o n e n te s ce lu la re s q u e se va n a a is la r y a n a liza r, y la e le cc ió n de las h e rra m ie n ta s , q u ím ic a s y su m é to d o de u so p u e d e te n e r un im p a c to s ig n ifica tivo en el re su lta d o d e l a ná lis is .
H a s ta a ho ra , e l m a te ria l d e te jid o só lid o g e n e ra lm e n te se h o m o g e n e iza o rom p e a p lica n d o va r ia s e ta p a s d e té cn ica s de d is ru p c ió n m e cá n ica co m o se m e n c io n ó a n te r io rm e n te o a p lica n d o d ig e s tió n q u ím ica (es d ec ir, e n z im á tica ) d u ra n te un p e río d o p ro lo n g a d o de tie m p o (g e n e ra lm e n te d ig e s tió n d u ra n te la n oche ). S in e m b a rg o , ta le s m é to d o s co n su m e n m u ch o tie m p o y n ece s ita n d is p o s itivo s de m e zc la e sp e c ia le s de a lto re n d im ie n to p a ra c o n s e g u ir u na h o m o g e n e iza c ió n a d e cu a d a y u n a lis is s u fic ie n te , p o r lo q u e con m u ch a fre cu e n c ia se d e te r io ra n los a n a lito s s e n s ib le s a is la d o s . La m o lie n d a con un m e zc la d o r de b a ja p o te n c ia ta l co m o p o r e je m p lo , un a g ita d o r de v ó rte x ha d e m o s tra d o no s e r e fica z p a ra m o le r m a te ria l d e te jid o só lid o .
El u so de u n a co m b in a c ió n de m é to d o s de d is ru p c ió n q u ím ica co m o p o r e je m p lo , ta m p o n e s de lis is en co m b in a c ió n con m é to d o s de d is ru p c ió n m e cá n ica se ha m e n c io n a d o de m a n e ra m u y g e n e ra l, p o r e je m p lo , en D. W . B urden "G u id e to th e D is rup tio n o f B io lo g ica l S a m p le s - 2012 " (R a nd om P rim e rs , E d ic ión n.° 12, p á g in a s 1 -25, 2012), q u e p ro p o rc io n a u na a m p lia d e sc rip c ió n de d ive rso s m é to d o s de d is ru p c ió n q u ím ic a y m e cá n ica p a ra su a p lica c ió n en la d is ru p c ió n de d ive rsa s m u e s tra s b io ló g ica s . La p u b lica c ió n d e ja a b ie rto q u é m é to d o s de d is ru p c ió n e sp e c ífico s de los d ive rso s m é to d o s q u ím ico s y m e cá n ico s p ue de n co m b in a rs e o có m o (p o r e je m p lo , en las e ta p a s de tra ta m ie n to p o s te rio re s o s im u ltá n e a m e n te ) p a ra q u é tip o de m u e s tra b io ló g ica p a rticu la r. Se m e n c io n a e l uso de b o la s de tr itu ra c ió n con a g ita d o r de v ó r te x p a ra la d is ru p c ió n de te jid o , p e ro se se ñ a la q ue los a g ita d o re s de v ó r te x son m e no s a d e cu a d o s (m e n o s e fe c tivo s ) p a ra tr itu ra r m a te ria l de te jid o d e b id o a su b a jo re nd im ie n to .
En el ca m p o d e l p re tra tam ien to d e m uestras b io lóg icas p ara la libe rac ión de los ana litos d esea do s , se con oce n d ive rsas co m p o s ic io n e s de h om o ge ne izac ión o reactivos de lisis. P or e je m p lo en los d o cu m e n to s W O 2014 /096136 A2, EP 2447352 A 1, o W O 1999 /33559 A1 se m e nc ion an m edios de hom o ge ne izac ión , q ue pueden c o m p re n d e r una e nz im a lítica y p artícu la s de m o lien da m ecán ica . T odos e stos m edios se describe n p ara su uso en la d is rup c ió n de cé lu las ind iv idua les, cu ltivos ce lu la res , m ic ro o rga n ism o s, bac terias , v iru s o esporas.
La so lic itud in te rn a c io n a l W O 2002 /00600 A1 d e l p re se n te s o lic ita n te se re fie re a un m é to do p a ra a is la r y e s ta b iliz a r á c id o s n u c le ico s en o de m ic ro o rg a n ism o s ta le s co m o p ro ca rio ta s , h on go s, p ro to zo o s o a lg a s . A llí, se m e n c io n a g e n e ra lm e n te q u e las m u e s tra s b io ló g ica s c o m p a c ta s p ue de n h o m o g e n e iza rse o ro m p e rse u sa n d o m é to do s m e cá n ico s , q u ím ico s , f ís ic o s o e n z im á tico s . En e l E jem p lo 5 se d e sc rib e la d is ru p c ió n c e lu la r de u n a m u e s tra de b a c te ria s y en él se m e n c io n a q u e las p a re d e s ce lu la re s b a c te ria n a s se ro m p en u sa n d o lis is e n z im á tic a (d is ru pc ión c e lu la r m e d ia d a p o r liso z im a ) s o p o rta d a p o r e l u so de un m o lino de p e rla s con p erla s de v id r io con un d iá m e tro de 150 a 600 pm a u n a ve lo c id a d de m e zc la de 30 Hz d u ra n te 5 m inu tos .
La so lic itu d in te rn a c io n a l W O 2011 /144304 A1 se re fie re a un ta m p ó n de lis is y a un m é to do p a ra la lis is de m u es tra s co rp o ra le s . El ta m p ó n de lis is seg ún se re iv in d ica co m p re n d e a d e m á s de al m e no s un a ge n te c a o tró p ico y al m enos un a g e n te re d u c to r ta m b ié n al m e no s u n a e n z im a p ro te o lítica . El ta m p ó n de lis is p ue de c o m p re n d e r a d e m á s p a rtícu la s de m o lie n d a con p erla s y el m é to d o p a ra p ro c e sa r m u e s tra s c o rp o ra le s co m o se d e sc rib e en e l m ism o inc lu ye la m o lie n d a con p erla s de u na m e zc la q u e co m p re n d e la m u e s tra co rp o ra l y el ta m p ó n de lis is con la al m e no s u na e n z im a p ro te o lítica . La so lic itu d se re fie re e sp e c ífica m e n te a m u e s tra s co rp o ra le s q ue son re le va n te s p a ra el d ia g n ó s tico de e n fe rm e d a d e s re sp ira to r ia s y en e lla s se d e fin e q ue las m u e s tra s c o rp o ra le s co m p re n d e n m u e s tra s de flu id o s o s e m iflu id o s c o rp o ra le s , co m o e sp u to , pus, se c re c ió n , a sp ira d o s , lava do s , h iso po s o m u e s tra s no re sp ira to ria s co m o san g re , pus, líqu ido p le u ra l, m a rca d o s p le u ra le s , ju g o g á s trico , a sp ira d o s g á s trico s , d re n a je s o flu id o s m a rcad os . El ta m p ó n de lis is e s tá d e s tin a d o p rin c ip a lm e n te a a lte ra r las m u e s tra s re sp ira to ria s y co m p re n d e o b lig a to r ia m e n te un a g e n te re d u c to r p a ra d is o lv e r los co n s titu ye n te s de l m o co en d ich a s m u es tra s .
El d o c u m e n to EP 2 166 335 A1 de l p re se n te so lic ita n te d e sc rib e un d isp o s itivo de m o lie n d a con p erla s de a lto re n d im ie n to y un m é to do p a ra la d is ru p c ió n de m u e s tra s de te jid o só lid o , u sa n d o ta l d isp o s itivo . El E jem p lo m e n c io n a q ue la m u e s tra de te jid o m e cá n ica m e n te ro to se tra ta p o s te rio rm e n te con p ro te in a s a K y R N a sa A p a ra un a ná lis is a d ic io n a l de a cu e rd o con un p ro to co lo de D N e asy (d isp o n ib le de Q ia g en ).
El d o c u m e n to W O 2005039722 A 2 y el c o rre sp o n d ie n te US 8 ,020 ,790 d e sc rib e n la d is ru p c ió n de m u e s tra s b io ló g icas m e d ia n te e l u so de p a rtícu la s de m o lie n d a e sp e c ífica s y un ta m p ó n de lis is no e sp e c ifica d o .
C icco n e y co l. d e sc rib e n en su p u b lica c ió n c ie n tíf ic a “A B -ce ll ta rg e tin g v iru s d is ru p ts p o te n tia lly p ro te c tive g e n o m ic m e th y la tio n p a tte rn s in lym ph o id t issu e by inc rea s in g g lo b a l 5 -h y d ro xy m e th y lcy to s in e leve ls" (V e te rin a rys R esea rch 2014 , 45, 108) la d is ru p c ió n t is u la r p a ra un e n sa yo de tra n s fe re n c ia de A D N u sa n d o p erla s de v id r io de 10 m m y tris 10 m M , pH 8,0, N aC l 100 m M , E D T A 10 m M , S D S al 0 ,5% . A llí se a ñ a d e n 100 ug de p ro te in a sa K y se d e ja n re p o sa r p a ra la d ig e s tió n de p ro te ín a s d u ra n te u n a n oche a 50°C.
M ann y B abb d e sc rib e n en su p u b lica c ió n c ie n tíf ic a "N e u ra l s te ro id h o rm o n e re ce p to r g en e e xp re ss io n in p re g n a n t ra ts" ("E xp res ión g é n ica d e l re ce p to r de la h o rm o n a e s te ro id e n eu ra l en ra tas p re ñ a d a s") (M o le cu la r B ra in R esea rch 2005 , 142, 39 -46 ) un m é to d o de h o m o g e n e iza c ió n de m u e s tra s de te jid o c e re b ra l u sa n d o un ta m p ó n de lis is que c o n tie n e p ro te in a sa K y d o s p erla s de m o lie n d a de 4 m m y lle va n d o a cab o la d ig e s tió n de p ro te ín a s a 56°C d u ra n te 30 m in u tos , se g u id o de 30 m in u to s a -20°C .
C om o se m u e s tra a rriba , u na c o m b in a c ió n e sp e c ífica de e n z im a s líticas y p a rtícu la s de d is ru p c ió n m e cá n ica p a ra u na d is ru p c ió n s im u ltá n e a de m u e s tra s b io ló g ica s so lo se ha d e sc rito p a ra m a te ria l de m u e s tra b io ló g ica , q u e p re se n te u n a e s tru c tu ra b io ló g ica q u e se c a ra c te r iza p o r un ta m a ñ o c o m p a ra tiv a m e n te p e q u e ñ o (m ic ro o rg a n ism o s , cé lu las , v iru s , e tc .) o q ue es e s tru c tu ra lm e n te "d é b il" (cé lu la s in d iv id u a le s , cu ltivo s ce lu la re s , f lu id o s co rp o ra le s ). P o r el co n tra rio , el m a te ria l de te jid o só lid o e s tá c a ra c te r iza d o h a b itu a lm e n te p o r u na c o n s tru cc ió n c e lu la r co m p a ra b le m e n te e s ta b le , o u n a e s tru c tu ra fib ro s a o m e m b ra n o sa y es m u ch o m ás c o m p a c to ta l com o , p o r e je m p lo , m u e s tra s flu id a s o se m iflu id a s . P o r lo ta n to , e l m a te ria l de te jid o só lid o p re se n ta u n a re s is te n c ia m e cá n ica o in te g rida d inc re m e n ta d a s , u n a d e n s id a d m ás a lta y con m u ch a fre cu e n c ia se p ro p o rc io n a o m u e s tre a en fo rm a de p ie za s de m u e s tra in ta c ta s /e s tre ch a m e n te c o n e c ta d a s o co m p a c ta s m u ch o m ás g ra n d e s en c o m p a ra c ió n con los m a te ria le s de m u e s tra m ás p e q u e ñ o s y "m ás d é b ile s " q u e se d e sc rib e n en la té c n ica a n te r io r (p o r e je m p lo , cé lu la s , cu ltivo s ce lu la res , m ic ro o rg a n ism o s , b ac te ria s , v iru s o e sp o ra s ). Es e v id e n te q u e d ich o m a te ria l de te jid o só lid o , en p rin c ip io , d ebe tra ta rs e de u na m a n e ra to ta lm e n te d ife re n te p a ra la d is ru p c ió n y libe ra c ión de los a n a lito s d e se a d o s . La d is ru p c ió n de la e s tru c tu ra c e lu la r c o m p a ra tiv a m e n te c o m p a c ta g e n e ra fu e rz a s m ás fu e rte s y tie m p o s de d ig e s tió n m ás la rgo s que la d is ru p c ió n de u n a m u e s tra de flu id o o u n a m u e s tra de c u ltivo ce lu la r. La a p lica c ió n de fu e rte s fu e rz a s de d is ru p c ió n m e cá n ica s o q u ím ica s c o n lle v a e l r iesgo de d a ñ a r o d e te r io ra r los a n a lito s d e se a d o s , a m e nu do m u y sen s ib le s , ta le s com o , p o r e je m p lo , á c id o s n uc le icos , A D N , A R N y o tro s c o m p o n e n te s ce lu la re s .
O b je to d e la in ve n c ió n
Un o b je to de la p re se n te in ve n c ió n fu e p ro p o rc io n a r un m é to do n ue vo y m e jo rad o p a ra la d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n de fo rm a e fica z de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s p a ra a is la r y re c o le c ta r a n a lito s b io q u ím ico s sen s ib les , ta le s com o , p o r e je m p lo , á c id os n uc le icos , A R N , a D n y o tros c o m p o n e n te s ce lu la re s , lo q ue e v ita las d e s v e n ta ja s de los m é to d o s de la té c n ica an te rio r. P re fe rib le m e n te , e l m é to d o n uevo y m e jo ra d o p a ra la d is ru p c ió n de te jid o só lid o d e b e ría se r p a rtic u la rm e n te sua ve . M ás p re fe rib le m e n te , e l n ue vo m é to do d e b e ría p ro p o rc io n a r u n a leve d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n de las m u e s tra s de te jid o só lid o , m e jo ra r la ca lid a d de los a n a lito s a is la d o s , tra b a ja r m ás rá p ido y s im p lif ic a r la p re p a ra c ió n de la m u es tra , en p a rtic u la r p a ra a ná lis is a u to m a tiza d o s de a lto re n d im ie n to . Inc lu so m ás p re fe rib le m e n te , e l m é to do nue vo y m e jo ra d o d e b e ría lleva rse a cab o a p lica n d o un leve im p ac to m e cá n ico y /o leve im p a c to q u ím ico so b re la m u e s tra de te jid o , en p a rtic u la r a p lica n d o fu e rz a s m e cá n ica s re d u c id a s y /o im p a c to q u ím ico re du c ido . A ún m ás p re fe rib le m e n te , d e b e ría re d u c irse e l im pacto q u ím ico de los a g e n te s ca o tró p ico s . A d e m á s, se p re fie re q u e se m e jo re la a c tiv id a d de la e n z im a lítica y se e v ite su in a c tiva c ió n p a ra p ro p o rc io n a r su e fica c ia ó p tim a en un tra ta m ie n to co m b in a d o de lis is m e cá n ica y q u ím ic a (es dec ir, e n z im á tic a ) de la m u e s tra de te jid o . Se p re fie re a d e m á s p ro p o rc io n a r un m é to do m ás rá p id o con tie m p o s de d is ru p c ió n /d ig e s tió n m ás cortos .
S e e n co n tró , de fo rm a s o rp re n d e n te , q u e con las c o m p o s ic io n e s , k its , s is te m a s y e l m é to do de a cu e rd o con la p re se n te inve n c ió n se ha re sue lto e s te o b je to . Las c o m p o s ic io n e s , kits , s is te m a s y el m é to d o de la p re se n te inve nc ión p e rm ite n la d is ru p c ió n e fica z de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s , inc lu so de m u e s tra s de te jid o m u y re s is te n te s con u na e s tru c tu ra de te jid o m u y c o m p a c ta o d ura , ta l com o , p o r e je m p lo , co la s de ro e d o re s (p o r e je m p lo , co la s de ra tón ), en un p e río d o de tie m p o s ig n ific a tiv a m e n te m ás corto , in c lu so cu a n d o se lle va a cab o con el e q u ip o de la b o ra to rio h ab itu a l, co m o un a g ita d o r de v ó rte x de b a ja p o te n c ia , y s im u ltá n e a m e n te c o n s ig u e m a yo re s re n d im ie n to s de los a n a lito s d e se a d o s con u na m e jo r ca lid a d de los a n a lito s en c o m p a ra c ió n con los m é to d o s de h o m o g e n e iza c ió n a p lica d o s h as ta a h o ra p a ra m a te ria l de te jid o in tac to .
S o rp ren de n te m en te , resu ltó que la p rese n te invenc ión m e jo ra en p a rticu la r la e xtra cc ió n de A D N de m ues tras de te jido en com p arac ió n con la d igestión e n z im á tica o la d is rup c ió n m e cá n ica con m o linos de perlas so los. La d ig estión quím ica , es dec ir, e n z im á tica p o r s í so la , g e n e ra lm e n te no p uede m a x im iza r los re nd im ie n tos e x tra ídos de las m u es tra s de te jido . La d is rup c ió n m e cá n ica con un m o lino de perlas p o r s í so la g en e ra lm e n te requ iere un e qu ipo e sp e c ia liza d o y g rande (m o linos de perlas) p a ra h o m o g e n e iza r de m a ne ra e fic ien te las m u es tra s de te jido p ara u na extra cc ió n de A D N e fic ien te . En la p rese n te invenc ión se ha d e m o strad o que la com b ina c ión de u na q u ím ica de lisis o p tim iza d a en com b ina c ión con u na e lecc ión o p tim iza d a de pa rtícu la s de m o lien da p erm ite u na d is rup c ió n y hom o ge ne izac ión e fic ien te , ráp ida y com p le ta de las m u es tra s de te jid o , inc luso en m o linos de vó rte x de so b re m e sa com u ne s , m e jo ran do a s í e n o rm e m e n te el re nd im ie n to en com p arac ió n con el uso de d ig estión q u ím ica , es dec ir, e n z im á tica sola , y adem ás, so rp ren de n te m en te , la ca lid ad (e spe c ia lm e n te el ta m a ñ o ) de l ácido nuc le ico e x tra ído no se de te rio ró con el p roce d im ie n to de m o lienda y resu ltó se r su p e rio r a la co n se g u id a con los tra ta m ie n to s hab itua les de m o lien da con perlas.
En p a rticu la r, se ha e n co n tra d o s o rp re n d e n te m e n te q u e con la co m b in a c ió n e sp e c ífica de las co n d ic io n e s m e cá n ica s de m o lie n d a y las co n d ic io n e s de lis is q u ím ic a e sp e c ífica s de la p re se n te inve n c ió n se p ue de c o n s e g u ir un e fe c to m ás q u e a d itivo en e l se n tid o de un tip o de e fe c to s in é rg ico , en c o m p a ra c ió n con la a p lica c ió n de l co n d ic io n e s de m o lie n d a m e cá n ica o las c o n d ic io n e s de lis is q u ím ic a e sp e c ífica s p o r s í so las.
D e s c rip c ió n d e la in ve n c ió n
El o b je to de la p re se n te inve nc ión son n u e va s co m p o s ic io n e s y m é to d o s p a ra la d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se re s h um a n o s y an im a les .
En e l co n te x to de la p re se n te inve nc ión , e l té rm in o "m a te r ia l de te jid o " o "te jid o " se re fie re a m u e s tra s de te jid o só lid o d e riva d a s de se res h um a n o s y a n im a le s , ta le s co m o en p a rtic u la r m u e s tra s de te jid o e n te ro o in tac to . El té rm in o "m a te r ia l de te jid o " o "te jid o " inc lu ye in te rm e d io s de n ive l de o rg a n iza c ió n c e lu la r e n tre cé lu la s y un ó rg a n o com p le to , a s í co m o m u e s tra s de c u e rp o s de se res h u m a n o s o a n im a le s q u e co m p re n d e n d ich o s in te rm e d io s de n ive l de o rg a n iza c ió n ce lu la r. El m a te ria l de te jid o só lid o en e l se n tid o de la p re se n te inve n c ió n se c a ra c te r iza h a b itu a lm e n te p o r u n a e s tru c tu ra c e lu la r u o rg a n iza c ió n c e lu la r c o m p a ra tiv a m e n te e s ta b le , o u n a e s tru c tu ra fib ro s a o m e m b ra n o sa . P o r lo g e n e ra l, d ich o m a te ria l de te jid o es m ás re s is te n te y m u ch o m ás c o m p a c to o e s tá co n e c ta d o firm e m e n te , p o r e je m p lo , cu ltivo s c e lu la re s s im p le s o m u e s tra s f lu id a s o s e m iflu id a s . P o r c o n s ig u ie n te , e l m a te ria l de te jid o só lid o en el se n tid o de la p re se n te inve n c ió n p re se n ta u n a re s is te n c ia m e cá n ica o in te g rida d m e jo rad as , u na d e n s id a d m ás a lta y m uy fre c u e n te m e n te e s tá m u e s tre a d o en fo rm a de fra g m e n to s de m u e s tra in ta c to s /firm e m e n te c o n e c ta d o s o co m p a c to s m u ch o m ás g ra n d e s en co m p a ra c ió n con m a te ria le s de m u e s tra p e q u e ñ o s y "d é b ile s " com o los d e sc rito s a n te r io rm e n te en la té c n ica a n te r io r (p o r e je m p lo , c é lu la s in d iv id u a le s , cu ltivo s ce lu la re s , m ic ro o rg a n ism o s , b ac te ria s , v iru s o e sp o ra s ). En p a rticu la r, e l m a te ria l de te jid o seg ún la p re se n te inve n c ió n co m p re n d e , sin lim itac ió n , te jid o c o n ju n tivo , te jid o m u scu la r, te jid o n e rv io so , te jid o e p ite lia l y te jid o m in e ra liza d o . P o r c o n s ig u ie n te , te jid o en e l sen tido de la p re se n te inve n c ió n inc luye , sin lim itac ió n , co n s tru c c io n e s de c é lu la s o rg a n iza d a s (co n e c ta d a s ), te jid o fib ro s o y /o m e m b ra n o so , q ue co m p re n d e , p o r e je m p lo , p ie l, m ú scu lo , te n d o n e s , fila m e n to s , n e rv io s , ca rtíla g o , hueso , ó rga n os , ta le s co m o co m o p o r e je m p lo in te s tin o , g á s trico , h íg ad o , bazo, ce re b ro , linfa , m é d u la ó se a , riñón , co ra zó n , a s í com o c o la (ta l com o co la de roedo r, p o r e je m p lo , c o la de ra tón ), e tc . P re fe rib le m e n te , el m a te ria l de te jid o ta l co m o se usa en la p re se n te inve nc ión es el re su lta d o de u n a b io p s ia . M á s p re fe rib le m e n te , e l m a te ria l de te jid o ta l co m o se usa en la p re se n te inve n c ió n es te jid o só lid o en c o m p a ra c ió n con m u e s tra s de flu id o o s e m iflu id o ta le s com o , p o r e je m p lo , san g re , m e m b ra n a m u co sa . A d ic io n a lm e n te , se p re fie re q u e el m a te ria l de te jid o q u e se u sa en la p re se n te inve nc ión se a te jid o só lid o re s is te n te en c o m p a ra c ió n con c é lu la s in d iv id u a le s d é b ile s o cu ltivo s ce lu la re s .
En el co n te x to de la p re se n te inve nc ión , e l té rm in o "d is ru p c ió n " o "ro m p e r" co m p re n d e to d o s los n ive les de d is rup c ió n d e l m a te ria l de te jid o m u e s tre a d o y tra ta d o , lo q u e p e rm ite la libe ra c ión o p ro d u cc ió n de c o m p o n e n te s c e lu la re s o los a n a lito s d e se a d o s de la m u e s tra de te jid o en u n a ca n tid a d s u p e r io r al lím ite de d e te cc ió n ind iv id u a l de l a na lito re sp e c tivo o en u na ca n tid a d q u e p e rm ita e l a is la m ie n to , re co le cc ió n y d e te cc ió n con té cn ica s de a n á lis is a d e cu a d a s . A h í, un a lto g ra d o de d is ru p c ió n inc lu ye la h o m o g e n e iza c ió n c o m p le ta o al m e no s p a rc ia l de la m u e s tra de te jid o . H o m o g e n e iza c ió n s ig n ifica q u e la m u e s tra de te jid o se lle va a un e s ta d o ta l q u e to d a s (o al m e no s las partes h o m o g e n e iza d a s ) de las fra cc io n e s de la m u e s tra son e se n c ia lm e n te igu a les en c o m p o s ic ió n . E s to s ig n ifica q u e una m u e s tra h o m o g e n e iza d a es d isg re g a d a , m o lid a o p ica d a y luego es m e zc la d a tan b ien q u e la re tira d a de p a rte de la m u e s tra no a lte ra la co m p o s ic ió n m o le cu la r g e n e ra l de la m u e s tra re s ta n te y es id é n tica a la fra cc ió n re tirada . P re fe rib le m e n te , la co m p o s ic ió n , e l k it y los s is te m a s , a s í co m o el m é to do de la p re se n te inve nc ión , se re fie ren a la d is ru p c ió n y /u h o m o g e n e iza c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a les .
La inve n c ió n se re fie re al uso de u na co m p o s ic ió n co m o se d e fin e en las re iv in d ica c io n e s 1 a 6 p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se re s h um a n o s y an im a les .
A d e m á s, la inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de seres h u m a n o s y a n im a le s ta l co m o se d e fin e en las re iv in d ica c io n e s 7 y 8.
A d e m á s, la inve n c ió n se re fie re a un k it p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se re s h u m a n o s y a n im a le s ta l co m o se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 9.
La co m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o seg ún la p re se n te inve n c ió n co m p re n d e
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u na c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M; y p re fe rib le m e n te
- al m e no s un ta m p ó n .
P re fe rib le m e n te , la co m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión co m p re n d e
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u na c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M ; y
- al m e no s un ta m p ó n .
M á s p re fe rib le m e n te , la c o m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s de a cu e rd o con la p re se n te inve n c ió n co m p re n d e
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n ;
- al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u na c o n ce n tra c ió n to ta l m e n o r o igua l a 1 M; y
- al m e no s un a g e n te a n tie sp u m a n te .
En u na fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a a d ic io n a l, la co m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión co m p re n d e a d e m á s u no o m ás a ge n tes se le cc io n a d o s de
- al m e no s un a g e n te ca o tró p ico ;
- al m e no s un d e te rg e n te ;
- al m e no s un in h ib id o r de nuc lea sas ;
- al m e no s un a g e n te a n tie sp u m a n te ;
- al m e no s un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico ;
- al m e no s un a g e n te reducto r,
y c u a lq u ie r m e zc la de los m ism os .
O tras fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s se re fie ren a las co m p o s ic io n e s p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o com o se d e fin ió a n te rio rm e n te , q ue co m p re n d e n u na o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as , al m enos u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica , al m e no s un ta m p ó n , al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u na c o n ce n tra c ió n to ta l de a g e n te ca o tró p ico m e n o r o igua l a 1 M, y al m e no s un a g e n te a n tie s p u m a n te y u no o m ás a g e n te s se le cc io n a d o s de
- al m e no s un d e te rg e n te ;
- al m e no s un in h ib id o r de nuc lea sas ;
- al m e no s un a g e n te re du c to r;
y c u a lq u ie r m e zc la de los m ism os .
Se p re fie re p a rtic u la rm e n te q u e las co m p o s ic io n e s p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o ta l co m o se d e fine n a n te r io rm e n te no co m p re n d a n un d iso lve n te o rg á n ico , ta l co m o en p a rtic u la r a lco h o le s , en co n ce n tra c io n e s que e fe c tú e n la d e sn a tu ra liza c ió n y, p o r tan to , la in a c tiva c ió n de la al m e no s u n a e n z im a lítica . P or e je m p lo , e ta no l, p ro p a n o l y /o iso p ro p a n o l no d e b e ría n e s ta r p re se n te s en la co m p o s ic ió n de la p re se n te inve nc ión en u na ca n tid a d q ue d e sn a tu ra lice o ina c tive las e n z im a s (ta les com o en p a rtic u la r las e n z im a s lítica s q ue se d e fin e n a co n tin u a c ió n , e sp e c ífica m e n te p ro te a sa s ta le s co m o p a rticu la rm e n te p ro te in a sa K). Lo m ás p re fe rib le m e n te , las co m p o s ic io n e s de la p re se n te inve n c ió n no co m p re n d e n d is o lve n te s o rg á n ico s , en p a rtic u la r no co m p re n d e n a lco h o le s , m uy p a rtic u la rm e n te no co m p re n d e n m e ta no l, e ta no l, p ro p a n o l y /o isop ro pa no l.
Las pa rtícu la s d is rup tiva s só lidas en e l con tex to de la p rese n te invenc ión com p re nd en p artícu las só lidas, p re fe rib lem e n te en fo rm a de p erlas só lidas, esfe ras , bolas, conos, c ilind ros, cubos, triá ng u lo s , rec tángu los y fo rm a s g eo m étrica s a de cu a d a s s im ila res , a s í com o fo rm a s irregu la res , p o r e je m p lo d en o m in a d o s b o la -cono y sa té lites (con fo rm a de S atu rno, p la n e ta u O V N I), p a ra e fe c tu a r u na d is rup c ió n de l m ate ria l de te jido cu a n d o se ap lican fu e rzas de m e zc la o m o lien da a la m u es tra de te jid o en la com p os ic ión de la p rese n te invenc ión . Sin e m ba rg o , las p artícu la s d is rup tiva s só lidas deben se le cc io na rse en v is ta de no d e te rio ra r o ro m p e r los ana litos o co m p o n e n te s ce lu la res liberados.
P ara o b te n e r u na d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n su fic ie n te s d e l m a te ria l de te jid o y la libe ra c ión sin d a ñ o s de los a n a lito s d e se a d o s p a ra su p o s te rio r a is la m ie n to , re co le cc ió n y a n á lis is , se p re fie re q ue las p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid a s de la p re se n te inve n c ió n sean p a rtícu la s só lid a s ine rte s, es d ec ir, p a rtícu la s re a liza d a s en un m a te ria l, q u e no re a cc io n a con e l m a te ria l de te jid o , con n in g un o de los re a c tivo s de la co m p o s ic ió n y, en c u a lq u ie r caso , no con los a n a lito s d e se a d o s q ue se libe ra rá n tra s la d is ru p c ió n . S e p re fie re p a rticu la rm e n te q ue los a n a lito s a is la d o s no sean a d so rb id o s p o r las p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid a s ine rtes o no se a dh ie ra n a las m ism as . M a te ria le s ine rte s a d e cu a d o s co m p re n d e n , p o r e je m p lo , m e ta les ine rtes, a ce ro , a ce ro ino x ida b le , ó x id o s m e tá licos , v id r io (s ílice ), p lá s tico y ce rá m ica . E jem p los de m a te ria le s ine rte s co m p re n d e n Z rO 2 , S iO 2 , Al2O3, Fe2O3, T iO 2 , s ilica to de c irco n io , m e ta les y a le a c io n e s de tá n ta lo , p la tino , e tc . Se co n o ce n o tro s m a te ria le s d is ru p tivo s ine rte s a d e cu a d o s de p a rtícu la s d is ru p tiva s ine rte s d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te . T a m b ié n es p o s ib le u sa r m e zc la s de uno o m ás tip o s de p a rtícu la s d is ru p tiva s , es d ec ir, u sa r p a rtícu la s d is ru p tiva s de d ife re n te s fo rm a s y /o re a liza d a s en d ife re n te s m a te ria le s ine rtes.
Se p re fie re a d e m á s q u e las p a rtícu la s d is ru p tiva s p re se n te n u n a d u re za su fic ie n te p a ra q ue no se p ro d u zc a a b ra s ión d u ra n te e l p ro ce so de m o lie n d a o tritu ra c ió n .
Se p re fie re n las p erlas , e s fe ra s o b o la s (d e n o m in a d a s p erla s de m o lie n d a ), p re fe rib le m e n te p erla s de a ce ro ino x ida b le , p e rla s ce rá m ica s , ta le s co m o en p a rtic u la r p e rla s de c irco n io . S on m ás p re fe rid a s las p a rtícu la s de m o lie n d a de fo rm a irreg u la r, ta le s com o b o la s -co n o s o sa té lite s , en p a rtic u la r re a liza d a s en a ce ro o a ce ro ino x ida b le .
P ara c o n s e g u ir fu e rz a s de d is ru p c ió n s u fic ie n te s p a ra la d is ru p c ió n de m a n e ra e fe c tiv a y, en p a rticu la r, h o m o g e n e iza r la m u e s tra de te jid o tra ta d a , las p a rtícu la s d is ru p tiva s d eb en p re s e n ta r p re fe rib le m e n te un ta m a ñ o co m p a ra tiva m e n te g ra n d e , en c o m p a ra c ió n con las p erla s u sa d a s en la té c n ica a n te r io r p a ra la d is ru p c ió n de m ic ro o rg a n ism o s o cu ltivo s ce lu la re s , q ue tie n e n un ta m a ñ o de 100 |um h as ta a p ro x im a d a m e n te 600 |um. A u m e n ta r la ca n tid a d de p e rla s de ta m a ñ o p e q u e ñ o (p erlas de 100 |um a a p ro x im a d a m e n te 600 u 800 |um) p a ra a u m e n ta r las fu e rz a s de d is ru p c ió n no es un e n fo q u e a d e cu a d o , ya q ue la g ran ca n tid a d de d ich a s p a rtícu la s p e q u e ñ a s d a ñ a o inc lu so d e s tru ye los a na lito s s e n s ib le s ta le s com o , en p a rticu la r, e l A D N .
P or lo tan to , se p re fie re q u e las p a rtícu la s d is ru p tiva s según la p re se n te inve n c ió n p re se n te n un ta m a ñ o de al m enos 1 m m , p re fe rib le m e n te m ás de 1 m m . M ás p re fe rib le m e n te , las p a rtícu la s p re se n te n un ta m a ñ o de al m e no s 1,5 mm , m ás p re fe rib le m e n te de m ás de 2 m m (> 2 m m ), p re fe rib le m e n te m ás de 2 ,5 m m . A d ic io n a lm e n te , las p a rtícu la s d is ru p tiv a s p ue de n p re s e n ta r p re fe rib le m e n te un ta m a ñ o de al m e no s 3 m m (> 3 m m ), m ás p re fe rib le m e n te de al m e no s 4 m m , m ás p re fe rib le m e n te de al m enos 5 m m .
Se p re fie re a d ic io n a lm e n te q u e las p a rtícu la s d is ru p tiva s de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión p re se n te n un ta m a ñ o de h as ta 15 m m , p re fe rib le m e n te h as ta 12 m m , m ás p re fe rib le m e n te h as ta 11,5 m m .
Las partícu las d is rup tiva s según la p rese n te invenc ión pueden p re se n ta r un ta m a ñ o de 1 m m o m ás de 1 m m a 15 mm, 1,5 m m a 15 m m , m ás de 2 m m a 15 m m , 2,5 m m a 15 m m , 3 m m o m ás de 3 m m a 15 m m , 4 m m a 15 m m . Las p artícu la s p ueden p re se n ta r a d ic ion a lm e n te un ta m a ñ o de 1 m m o m ás de 1 m m a 12 m m , 1,5 m m a 12 m m , m ás de 2 m m a 12 m m, 2,5 m m a 12 m m , 3 m m o m ás de 3 m m a 12 mm , 4 m m a 12 m m . A d ic io na lm en te , las partícu las d is rup tivas pueden p re se n ta r un tam a ño de 1 m m o m ás de 1 mm a 11,5 m m , 1,5 m m a 11,5 m m , m ás de 2 mm a 11,5 m m , 2 ,5 mm a 11,5 m m , 3 m m o m ás de 3 m m a 11,5 m m , 4 m m a 11,5 mm . Las p artícu la s p ueden p re se n ta r a de m ás un ta m a ñ o de 1 m m o m ás de 1 mm a 7 mm , 1,5 m m a 7 m m , m ás de 2 mm a 7 m m , 2 ,5 m m a 7 m m , 3 m m o m ás de 3 m m a 7 mm , 4 m m a 7 m m . El m ás p re fe rid o es un ta m a ñ o de 3 mm o m ás de 3 m m a 7 m m o de 4 m m a 7 mm .
Los ta m a ñ o s d e fin id o s de las p a rtícu la s d is ru p tiv a s ind ican la d is ta n c ia m ás la rg a e n tre d o s p u n to s o p u e s to s de la re sp e c tiva p a rtícu la . P o r co n s ig u ie n te , en e l ca so de p a rtícu la s re d o n d a s o e se n c ia lm e n te re d o n d a s (p erlas , bo las, e s fe ra s ), e l ta m a ñ o d e fin id o se re fie re al d iá m e tro . En e l ca so de p a rtícu la s de fo rm a irreg u la r, co m o sa té lite s o b o la sco n o s , la d is ta n c ia m ás la rg a e n tre d o s p un to s o p u e s to s sue le s e r e l d iá m e tro d e l "a n illo s im ila r a S a tu rn o " q ue rodea la b o la o la p a rte de b o la -co n o de ta le s p a rtícu la s .
D e p e n d ie n d o d e l ta m a ñ o de las p a rtícu la s d is ru p tiva s , se p ue de n u sa r u na o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s . En e l caso de p a rtícu la s m uy g ra n d e s , los re su lta d o s d e se a d o s de d is ru p c ió n y c o n se rva c ió n de los a n a lito s p ue de n co n se g u irse con u n a so la p a rtícu la (en p a rticu la r, u na b o la o b o la -co n o ). S e p re fie re u sa r u n a p a rtícu la d is ru p tiva .
P a rtícu la s d is ru p tiva s a d e cu a d a s co m p re n d e n p e rla s de 1,0 a 1,7 m m , p e rla s de 2 ,8 a 3 ,0 m m , b o la s de m o lie n d a de 7 /64 " (a p ro x im a d a m e n te 2 ,8 m m ) (en p a rtic u la r b o la s de m o lie n d a de a ce ro in o x id a b le ), b o la s de m o lie n d a de 5 /32" (a p ro x im a d a m e n te 6 ,0 -7 ,0 m m ), p a rtícu la s de 6 m m (en p a rtic u la r sa té lite s de c irco n io ), b o la s de m o lie n d a de 3 /8" (a p ro x im a d a m e n te 9 ,5 m m ) y b o la s de m o lie n d a de 7 /16 " (a p ro x im a d a m e n te 11,1 m m ). Se p re fie re n p e rla s de 5 /32" y p a rtícu la s e se n c ia lm e n te re d o n d a s de 5 m m (p o r e je m p lo , p e rlas , bo las, e s fe ra s ). O tros e je m p lo s de p a rtícu la s d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te de fo rm a irreg u la r, b o la s -co n o s o p a rtícu la s en fo rm a de sa té lite , q ue ta m b ié n se p re fie re n , p re se n ta n los s ig u ie n te s ta m a ñ o s :
Figure imgf000007_0001
A hí, la m itad de la b o la -co n o de a ce ro es u n a se m ie s fe ra (b o la (A )), la o tra m itad es un con o y a m b o s e s tá n se p a ra d o s p o r u na b rid a ce n tra l in c lin a d a (a n illo (B)).
T a m b ié n es p o s ib le u sa r m e zc la s de p a rtícu la s d is ru p tiv a s de d ife re n te s ta m a ñ o s . A d e m á s, es p o s ib le m e zc la r p a rtícu la s d is ru p tiva s de c u a lq u ie r fo rm a , m a te ria l y ta m a ñ o , co m o se d e fin e en el p re se n te d o cu m e n to .
La e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a seg ún la p re se n te inve n c ió n e s tá s e le cc io n a d a de l g ru p o de las h id ro la sa s (según el g rup o EC 3 en la c la s if ica c ió n d e l n ú m e ro C E de e n z im a s ). En p a rticu la r, la al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a e s tá se le cc io n a d a de l g ru p o de p ro te a sa s (EC 3.4 ), q ue a m e n u d o ta m b ié n se d e n o m in a n p e p tid a sa s , p ro te in a sa s o e n z im a s p ro te o lítica s . P re fe rib le m e n te , la al m e no s u n a e n z im a p ara la lis is e n z im á tic a e s tá se le cc io n a d a d e l g ru p o de p ro te in a s a K, co la g e n a sa , d isp a sa , tr ip s in a , p ep s in a , la m ás p re fe rid a es p ro te in a sa K.
A d e m á s de la al m enos u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a (e n z im a p ro te o lítica ), se p u e d e a ñ a d ir al m enos u n a e n z im a a d ic io n a l, d is tin ta de la e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica . P re fe rib le m e n te , d ich a e n z im a a d ic io n a l e s tá se le cc io n a d a del g ru p o de h id ro la sa s q u e a c túan so b re e n la ce s é s te r seg ún la c la se de e n z im a EC 3.1. P re fe rib le m e n te , co m o tal e n z im a a d ic io n a l, se p u e d e a ñ a d ir u na R N asa , p re fe rib le m e n te se a ña de R N a sa A.
El al m e no s un ta m p ó n de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión p ue de s e r c u a lq u ie r ta m p ó n , q u e se a a d e cu a d o p ara re c ib ir la m u e s tra de te jid o , la al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a (la e n z im a o e n z im a s p ro te o lít ica s ) y el u no o m ás a g e n te s a d ic io n a le s o p c io n a le s en la co m p o s ic ió n de la p re se n te inve nc ión . En p a rticu la r, el ta m p ó n d eb e s e r co m p a tib le con la e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a y no d e b e in h ib ir co m p le ta m e n te la a c tiv id a d de la e n z im a p ro te o lít ica o de c u a lq u ie r a g e n te a d ic io n a l de la c o m p o s ic ió n . P re fe rib le m e n te , se p ue de e le g ir un ta m p ó n q ue e s ta b ilice los a n a lito s a is la d o s com o , p o r e je m p lo , á c id os n u c le ico s a is la d o s , A D N , A R N u o tro s co m p o n e n te s ce lu la re s . Los ta m p o n e s a d e cu a d o s co m p re n d e n ta m p ó n T R IS , ta m p ó n PBS, ta m p o n e s de G ood, S S C , c itra to de sod io , a ce ta to de sod io , ta m p o n e s fo s fa to y ta m p o n e s b io ló g ico s , se le cc io n a d o s de la lis ta q ue co m p re n d e , p o r e je m p lo , M ES, B is -T ris , A D A , A C E S , P IP E S , M O P S O , B is -T ris P ropano , B ES , M O P S , T E S , H E P E S , D IP S O , M O B S , T A P S O , T rizm a , H E P P S O P O P S O , T E A , E P P S , T ric in e , G ly -G ly , B ic ine , H E P B S , T A P S , A M P D , T A B S , A M P S O , C H E S , C a PSO , A M P , C A P S , C A B S . S e p re fie re n los ta m p o n e s q ue tie n e n un pH > 6 (ig ua l o s u p e r io r a 6). S i el a na lito q ue se d e se a lib e ra r de l m a te ria l de te jid o es A D N , se p re fie re un ta m p ó n q u e te n g a un pH > 7 (ig ua l o s u p e r io r a 7). S i e l a na lito q u e se d e se a lib e ra r de l m a te ria l de te jid o es A R N , se p re fie re un ta m p ó n q ue te n g a un pH > 6 (igua l o s u p e r io r a 6). P a rticu la rm e n te p re fe rid o s son los ta m p o n e s de la lis ta de ta m p o n e s b io ló g ico s a n te rio re s . M ás p re fe rib le m e n te , el al m enos un ta m p ó n e s tá s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS , ta m p ó n PBS.
Los a g e n te s ca o tró p ic o s (o ca o tro p o s ) son e fe c tivo s p a ra a p o ya r o a u m e n ta r la d ig e s tió n q u ím ica , p ue de n a yu d a r a re d u c ir la a c tiv id a d n u c le a sa y a yu d a r a d e s n a tu ra liz a r las p ro te ín a s , q u e p ue de n c a u s a r e s tra g o s en las m u es tra s rec ién h o m o g e n e iza d a s . En el u so de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión , en p rin c ip io p ue de n u sa rse to d o s los ca o tro p o s co m u n e s , ta le s com o , p o r e je m p lo , yo d u ro de sod io , h id ro c lo ru ro de g u a n id in a (g u a n id in a H C l, G u H C l), t io c ia n a to de g u a n id in io (G TC ), iso tio c ia n a to de g u a n id in a y u rea . S e p re fie re el h id ro c lo ru ro de g u a n id in io en la p re se n te inve n c ió n . La a d ic ión de un ca o tro p o es p a rtic u la rm e n te a d e cu a d a , cu a n d o e l m a te ria l de te jid o ro to e stá d e s tin a d o a p o s te rio re s p ro ce d im ie n to s de a is la m ie n to de á c id o n uc le ico , en p a rtic u la r p ro c e d im ie n to s q u e usan re s in a s /g e le s a base de s ílice p a ra la p u rifica c ió n de los a n a lito s de á c id o n u c le ico a is la d o s . A d e m á s, los ca o tro p o s son p a rtic u la rm e n te a d e cu a d o s cu a n d o e l a n a lito lib e ra d o d e se a d o es A R N .
G e n era lm e n te , los cao trop o s se usan en m o la ridades co m p a ra tiva m e n te a ltas. P or e je m p lo , las sa les de g ua n id ina se usan hab itu a lm e n te a con ce n tra c io n e s de 6 M, en p a rticu la r para e l a is la m ien to de A R N . Ta m bié n se u sa yod u ro de sod io g e n e ra lm e n te a 6 M. A m enudo se usa u rea a 9,5 M. Los inve n to re s de la p rese n te invenc ión d escub rie ron so rp re n d e n te m e n te q ue las nuevas co m p os ic ion es , k its y s is te m as y e l m é todo de la p rese n te invenc ión perm ite n una con cen trac ión s ign ifica tiva m en te re du c ida de a ge n tes cao tróp icos , de m odo q ue la con cen trac ión de l al m enos un agente cao tróp ico (concen trac ión to ta l de a ge n tes cao tróp icos ) sea igual o m e no r de 1 M (< 1 M). En particu la r, se p re fie re usa r cao trop o s en u na con cen trac ión (to ta l) de 0 ,5 M a 1 M. El uso de co n ce n tra c io n e s re du c ida s de a gen te cao tróp ico de no m ás de 1 M es ve n ta jo so ya q ue cao trop o s ta le s co m o G uH C l y G T C son tó x ico s y un p o r tan to , se d e se a u na reducción de los m ism os p o r razones de seguridad y p ara p ro te g e r a los u su a rios de ta le s com p os ic ion es . A d ic io na lm en te , las a ltas co n ce n tra c io n e s de cao trop o s d ism in u irán la e fica c ia de la p ro te ina sa K, d eb ido a sus e fe c to s d esna tu ra lizan tes de p ro te ínas. P or con s ig u ie n te , la reducc ión de la co n cen trac ión de cao trop o s, a no m ás de 1 M, e je rce un im pacto q u ím ico re du c ido en la m u es tra de te jido y p erm ite p ro p o rc io n a r u na com p os ic ión de lisis m ás suave o de licada .
Los te n s io a c tiv o s (a m e n u d o ta m b ié n d e n o m in a d o s d e te rg e n te s ) p u e d e n fa v o re c e r la lis is de la m u e s tra de te jid o y fa v o re c e r la so lu b iliza c ió n d e l h o m o g e n e iza d o . Se p re fie re p a rtic u la rm e n te la a d ic ión de al m e no s un te n s io a c tiv o p ara la d is ru p c ió n de te jid o g ra so ta l co m o h íg ad o o c e re b ro . Los te n s io a c tiv o s co m p re n d e n te n s io a c tiv o s ión icos ta le s co m o te n s io a c tiv o s a n ió n ico s y ca tió n ico s , te n s io a c tiv o s b ip o la re s y te n s io a c tiv o s no ión icos.
El g ru p o de te n s io a c tiv o s a n ió n ico s co m p re n d e , p o r e je m p lo , d o d e c il su lfa to de sod io (S D S ), d e so x ic o la to de sod io , lau ril é te r su lfa to de sod io (S LE S , lau re th su lfa to de sod io ) y m irre th su lfa to de sod io , p re fir ié n d o se el SD S.
El g ru p o de te n s io a c tiv o s c a tió n ico s co m p re n d e , p o r e je m p lo , b ro m u ro de ce tiltr im e tila m o n io (C T A B ), c lo ru ro de c e tiltr im e tila m o n io (C T A C ), c lo ru ro de ce tilp ir id in io (C P C ), c lo ru ro de b e n za lco n io (B A C ), c lo ru ro de b e n ce to n io (B Z T), 5 -b ro m o -5 -n itro -1,3 -d io x a n o , c lo ru ro de d im e tild io c ta d e c ila m o n io , b ro m u ro de ce trim o n io , b ro m u ro de d io c ta d e c ild im e tila m o n io (D O D A B ).
El g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos co m p re n d e , p o r e je m p lo , T rito n X -100 , T w e e n 20 (p o liso rb a to 20, m o n o la u ra to de p o lio x ie tile n (20) so rb itá n ), B rij-35 (p o lia lq u ile n g lico lé te r), N P -40 (n on il fe n o x ip o lie to x il e ta n o l), N on ide t P-40 (o c tilfe n o x ip o lie to x ie ta n o l), p re fir ié n d o se T rito n X -100 y T w ee n 20.
El g ru p o de te n s io a c tiv o s b ip o la re s co m p re n d e , p o r e je m p lo , fo s fo líp id o s fo s fa tid ilse rin a , fo s fa tid ile ta n o la m in a , fo s fa tid ilc o lin a y e s fin g o m ie lin a s .
P re fe rib le m e n te , e l al m e no s un te n s io a c tiv o e s tá s e le cc io n a d o d e l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos co m o se d e fin ió a n te r io rm e n te . M ás p re fe rib le m e n te , e l al m e no s un te n s io a c tiv o e s tá s e le cc io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te en SD S, T w e e n 20 y T rito n X -100. A ún m ás p re fe rid o , e l al m enos un te n s io a c tiv o e s tá s e le cc io n a d o de T w e e n 20 y T rito n X -100, y se p re fie re m u y p a rtic u la rm e n te u sa r u n a co m b in a c ió n de am bo s, T w e e n 20 y T riton X -100.
Los in h ib id o re s de n u c le a sa de a cu e rd o con la p re se n te inve n c ió n c o m p re n d e n , p o r e je m p lo , E D TA , P M S F, p e p s ta tin a A, le u p e p tin a , a p ro tin in a . P re fe rib le m e n te , e l al m e no s un in h ib id o r de n u c le a sa es ED TA.
A d e m á s, es p o s ib le a ñ a d ir al m e no s un a g e n te a n tie sp u m a n te (o d e se sp u m a n te ), q u e p ue de re d u c ir y p re v e n ir la fo rm a c ió n de e sp u m a en la m e zc la de re acc ión y a s í m e jo ra r la p ro ce sa b ilid a d a d ic io n a l. P ueden u sa rse a ge n tes a n tie s p u m a n te s p a ra p re v e n ir la fo rm a c ió n de e s p u m a o p u e d e n a ñ a d irse p a ra ro m p e r u na e sp u m a ya fo rm a d a . En p rin c ip io , se p u e d e n u sa r to d o s los a g e n te s a n tie sp u m a n te s u sa d o s co m ú n m e n te , co m o p o r e je m p lo a ce ites inso lu b le s , p o lid im e tils ilo x a n o s y o tras s ilico n a s , c ie rto s a lco h o le s , e s te a ra to s y g lico les , s ie m p re q u e no a fe c te n n e g a tiva m e n te a n in g u n o de los a g e n te s de re acc ión , a la m u e s tra de te jid o , a n a lito s a is la d o s o a lte re n c u a lq u ie r m é to do p o s te rio r de aná lis is , re co le cc ió n y a is la m ie n to . Un a g e n te a n tie s p u m a n te p re fe rid o es e l p o lid im e tils ilo xa n o .
Se p ue de n a ñ a d ir e s ta b iliz a d o re s o sm ó tico s p a ra a yu d a r a u n ir el a g u a y p re v e n ir la d iso c ia c ió n de so lu tos re la c io n a d o s . E s ta b iliza d o re s o sm ó tico s co m p re n d e n , p o r e je m p lo , sa c a ro s a o so rb ito l.
C om o los e s ta b iliz a d o re s o sm ó tico s p ue de n in te rfe r ir con la lis is ce lu la r, la p re se n c ia de un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico es m e no s p re fe rid a , y es inc lu so m ás p re fe rid o no a ñ a d ir e s ta b iliz a d o re s o sm ó tico s y a s í m e jo ra r m ás la d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n de l te jid o con las co m p o s ic io n e s de la p re se n te inve nc ión .
S eg ú n la p re se n te inve nc ión ta m b ié n es p o s ib le a ñ a d ir al m e no s un a g e n te re du c to r. En p a rticu la r, se p u e d e n a ñ a d ir a g e n te s re du c to re s , cu a n d o e l a n a lito q ue se d e se a a is la r de l te jid o ro to es A R N , ya q u e e l a g e n te re d u c to r reduce la R N asa . A g e n te s re du c to re s co m p re n d e n , p o r e je m p lo , g lu ta tió n , d it io tre ito l y p -m e rca p to e ta n o l.
M u y p a rticu la rm e n te , se p re fie re q u e las co m p o s ic io n e s de la p re se n te inve n c ió n co m p re n d a n un a g e n te re d u c to r si e l a na lito d e se a d o es A R N y q ue en ta l caso la co m p o s ic ió n no c o m p re n d a u n a R N asa .
S in e m b a rg o , co m o los a g e n te s re d u c to re s p ue de n c a u s a r re a cc io n e s s e cu n d a ria s no d e se a d a s y son in có m o d o s en el p ro ce so de tra b a jo (p o r e je m p lo , d e b id o a m a los o lo re s ), se p re fie re no a ñ a d ir a g e n te s re d u c to re s a las co m p o s ic io n e s , k its y s is te m a s o en e l m é to do de la p re se n te inve nc ión . En p a rticu la r, cu a n d o el a na lito q u e se d e se a a is la r de l te jid o ro to es A D N , se e v ita o p re fe rib le m e n te inc lu so se e xc lu ye la a d ic ión de un a g e n te re du c to r.
P o r tan to , u na fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de la p re se n te inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n seg ún la p rese n te inve n c ió n , q u e c o n s is te en
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS y PBS;
- al m enos un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, p re fe rib le m e n te h id ro c lo ru ro de g u a n id in io ;
y o p c io n a lm e n te uno o m ás a g e n te s se le cc io n a d o s de
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de T w e e n 20 y T rito n X -100 ;
- al m e no s un in h ib id o r de nuc lea sas , p re fe rib le m e n te ED TA;
- al m e no s un a g e n te a n tie sp u m a n te , p re fe rib le m e n te p o lid im e tils ilo xa n o ;
- al m e no s un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de sa c a ro s a y so rb ito l; y
- al m e no s u n a e n z im a a d ic io n a l se le cc io n a d a d e l g ru p o de R N asas, p re fe rib le m e n te R N asa.
O tra fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de la p re se n te inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n seg ún la p re se n te inve nc ión , q ue c o n s is te en
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS y PBS;
- al m enos un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, p re fe rib le m e n te h id ro c lo ru ro de g u a n id in io ;
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de T w e e n 20 y T rito n X -100 ;
- al m e no s un in h ib id o r de nuc lea sas , p re fe rib le m e n te E D TA ; y
- al m e no s u n a e n z im a a d ic io n a l se le cc io n a d a d e l g ru p o de R N asas, p re fe rib le m e n te R N asa.
O tra fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de la p re se n te inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n seg ún la p re se n te inve nc ión , q ue c o n s is te en
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS y PBS;
- al m enos un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, p re fe rib le m e n te h id ro c lo ru ro de g u a n id in io ;
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de T w e e n 20 y T rito n X -100 ; y
- al m e no s un in h ib id o r de nuc lea sas , p re fe rib le m e n te EDTA.
O tra fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de la p re se n te inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n seg ún la p re se n te inve nc ión , q ue c o n s is te en
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS y PBS;
- al m enos un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, p re fe rib le m e n te h id ro c lo ru ro de g u a n id in io ;
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de T w e e n 20 y T rito n X -100 ; y
- al m e no s u n a e n z im a a d ic io n a l se le cc io n a d a d e l g ru p o de R N asas, p re fe rib le m e n te R N asa.
O tra fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de la p re se n te inve n c ió n se re fie re a u n a co m p o s ic ió n seg ún la p re se n te inve nc ión , q u e c o n s is te en
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS y PBS;
- al m enos un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, p re fe rib le m e n te h id ro c lo ru ro de g u a n id in io ; y
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de T w e e n 20 y T riton X -100.
La p re se n te inve n c ió n se re fie re a d e m á s a un k it p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riv a d o de seres h u m a n o s y a n im a le s , co m p re n d ie n d o e l kit
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un ta m p ó n , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de ta m p ó n T R IS y PBS;
- h id ro c lo ru ro de g u a n id in io en u n a co n ce n tra c ió n igu a l o in fe rio r a 1 M;
y o p c io n a lm e n te uno o m ás a g e n te s se le cc io n a d o s de
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de T w e e n 20 y T rito n X -100 ;
- al m e no s un in h ib id o r de nuc lea sas , p re fe rib le m e n te ED TA;
- al m e no s un a g e n te a n tie sp u m a n te , p re fe rib le m e n te p o lid im e tils ilo xa n o ;
- al m e no s un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de sa c a ro s a y so rb ito l;
- al m e no s un a g e n te re du c to r, p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de g lu ta tió n , d it io tre ito l y b e ta -m e rca p to e ta n o l; - al m e no s u n a e n z im a a d ic ion a l, d is tin ta de la e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica , p re fe rib le m e n te R N asa ;
y
- o p c io n a lm e n te , un re c ip ie n te p a ra re c ib ir e l m a te ria l de te jid o ; y a de m ás
- al m e no s un d iso lve n te o rg á n ico , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de a lco h o le s , p re fe rib le m e n te e ta no l y /o iso p ro p a n o l;
- y un fo lle to con in s tru cc io n e s p a ra p ro c e sa r e l m a te ria l de te jid o .
Se p re fie re p a rtic u la rm e n te q ue e l k it c o m p re n d a un a g e n te re d u c to r si e l a na lito d e se a d o es A R N y, en ta l caso , se p re fie re a d e m á s q ue el k it no c o m p re n d a u n a R N asa .
El re c ip ie n te p a ra re c ib ir e l m a te ria l de te jid o p u e d e s e r c u a lq u ie r re c ip ie n te a d e cu a d o o re c ip ie n te de re acc ión , q ue se a ine rte con re sp e c to a los a g e n te s u sa d o s en el tra ta m ie n to de d is ru p c ió n , q u e p re se n te s u fic ie n te e s ta b ilid a d m e cá n ica p a ra re s is tir las fu e rz a s de m o lie n d a o tr itu ra c ió n de las p a rtícu la s d is ru p tiv a s sin se r d e s tru id o o d e sg a s ta d o , q ue p re se n te un ta m a ñ o a d e cu a d o p a ra re c ib ir e l m a te ria l de m u es tra , la so lu c ió n de lis is y u na o m ás p a rtícu la s d is ru p tiv a s se le cc io n a d a s y aún p ro p o rc io n e un e sp a c io a d e cu a d o p a ra p e rm itir la a g ita c ió n y e l m o v im ie n to de los c o m p o n e n te s in se rta d o s p a ra e fe c tu a r la d is ru p c ió n d e l te jid o , y q u e se p u e d a u sa r a d e cu a d a m e n te con el d isp o s itivo q ue se u sa p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a o tr itu ra c ió n d e l m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s m e d ia n te las p a rtícu la s d is ru p tiva s . R e c ip ie n te s o re c ip ie n te s de re acc ión (tu bo s) a d e cu a d o s son c o n o c id o s y están co m ú n m e n te d isp o n ib le s .
La a d ic ión de un d iso lve n te o rg á n ico ta l com o , en p a rticu la r, al m e no s un a lco h o l a la m u e s tra de te jid o fá c ilm e n te ro ta y /u h o m o g e n e iza d a es v e n ta jo sa p a ra p ro p o rc io n a r e xc e le n te s co n d ic io n e s de u n ión de los a n a lito s lib e ra d o s sob re s u p e rfic ie s de s ílice en e ta p a s p o s te rio re s de p u rifica c ió n , a is la m ie n to y re co le cc ió n , co m o se d e sc rib e a co n tin u a c ió n con m ás d e ta lle . A lco h o le s a d e cu a d o s a in c lu ir en un k it c o m p re n d e n , sin lim ita c ió n , m e ta no l, e ta no l, p rop a no l, iso p ro p a n o l, e tc . P re fe rib le m e n te , se a ña de e ta n o l y /o iso p ro p a n o l. C om o se e xp licó a n te rio rm e n te , los d iso lve n te s o rg á n ico s e fe c tú a n la d e sn a tu ra liz a c ió n y, p o r tan to , inh ib en p o te n c ia lm e n te la al m enos u n a e n z im a lítica de la c o m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de la m u e s tra de te jid o . P or c o n s ig u ie n te , los d is o lve n te s o rg á n ico s en d ich o s k its se se p a ra n de los co m p u e s to s p a ra la d is ru p c ió n d e l te jid o y se a ña de n d e sp u é s de q ue se h aya lleva do a ca b o la d is ru p c ió n de l te jid o .
O tra s fo rm a s d e re a liza c ió n d e un k it d e a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión co m p re n d e n u n a co m b in a c ió n de c o m p o n e n te s (re a c tivo s ) co rre sp o n d ie n te s a las c o m p o s ic io n e s d e fin id a s a n te r io rm e n te p ara la d is ru p c ió n de te jid o y, o p c io n a lm e n te , un re c ip ie n te p a ra re c ib ir e l m a te ria l de te jid o y al m e no s un d iso lve n te o rg á n ico , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de a lco ho les , p re fe rib le m e n te e ta n o l y /o iso p ro p a n o l y un fo lle to con in s tru cc io n e s p a ra p ro c e sa r el m a te ria l d e te jid o só lido d e riva d o d e se res h um a n o s y an im a les .
El k it de a cu e rd o con la p re se n te inve n c ió n p ue de c o m p re n d e r a d e m á s c o m p o n e n te s a d e cu a d o s p a ra lle va r a cab o las s u b s ig u ie n te s e ta p a s de u n ió n , p u rifica c ió n , a is la m ie n to y re co le cc ió n c ita d a s a n te rio rm e n te . Se p re fie re p a rtic u la rm e n te p ro p o rc io n a r u na co m b in a c ió n d e l k it c ita d o a n te r io rm e n te p a ra lle va r a ca b o la d is ru p c ió n de te jid o d e a cu e rdo con la inve nc ión en co m b in a c ió n con un ta m p ó n d e u n ió n q u e co m p re n d e el a g e n te ca o tró p ico e iso p ro p a n o l. S in e m b a rg o , ta m b ié n es p o s ib le u sa r y p ro p o rc io n a r e l k it c ita d o a n te r io rm e n te p a ra e fe c tu a r la d is ru p c ió n de te jid o de a cu e rd o con la inve n c ió n en c o m b in a c ió n con k its de p ru e b a c o n o c id o s y d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te p ara lle va r a ca b o la u n ión de A D N o A R N , a s í co m o con k its de p ru e b a d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te p a ra lle va r a cab o la p u rifica c ió n y a n á lis is d e A D N o A R N . P or c o n s ig u ie n te , los k its c ita d o s a n te r io rm e n te p ue de n c o m p re n d e r a de m ás co m p u e s to s co rre sp o n d ie n te s a los k its de p ru e b a d isp o n ib le s com o , p o r e je m p lo , los k its D N e asy o R N e asy (d isp o n ib le s de Q ia g e n ) o los re sp e c tivo s k its de p ru e b a p ro p ia m e n te d ich o s y /o m a te ria le s p a ra a bso rc ió n y p u rifica c ió n ta le s co m o m e m b ra n a s o c o lu m n a s de s ílice a d e cu a d a s (p o r e je m p lo , c o lu m n a s Q IA a m p d isp o n ib le s de Q ia g e n ) o p e rla s m a g n é tica s de sílice .
La p re se n te inve nc ión se re fie re a d e m á s a un s is te m a (u na co m b in a c ió n , k it de p a rte s) q ue co m p re n d e u na c o m p o s ic ió n o un k it co m o se d e fin e a n te r io rm e n te y un d isp o s itivo p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a o tritu ra c ió n m e cá n ica s d e l m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s m e d ia n te las p a rtícu la s d is ru p tiva s .
D icho d isp o s itivo p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a o tritu ra c ió n m e cá n ica s p ue de s e r c u a lq u ie r d is p o s itivo co m ú n u sa d o en té c n ica s d e tritu ra c ió n o m o lie n d a con p erlas , q u e co m p re n d e , p o r e je m p lo , m o lino s d e m e zc la d e a lta p o ten c ia , m e zc la d o re s o m o lino s d e a lto re n d im ie n to , m e zc la d o re s de a lta ve lo c id a d , m o lin o s de p e rla s co m u n e s a s í com o m e zc la d o re s de b a ja p o te n c ia , ta l co m o un a g ita d o r de v ó r te x de la b o ra to rio co m ú n , a g ita d o r de v ó rte x de so b re m e sa o a g ita d o r de la b o ra to rio com ú n (p o r e je m p lo , a g ita d o r ho rizo n ta l).
C om o se m e n c io n ó a n te rio rm e n te , a p a rtir de la té c n ica a n te r io r ya se c o n o c ía e l u so de p erla s de m o lie n d a y m o linos de p e rla s p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o in ta c to d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s . S in e m b a rg o , p a ra o b te n e r u na h o m o g e n e iza c ió n e fic ie n te d e l m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a les , g e n e ra lm e n te se tu v ie ro n q u e u s a r e q u ip o s d e m o lie n d a g ra n d e s y e sp e c ia liza d o s , ta le s co m o m o lino s d e p erla s o m e zc la d o re s de a lta p o te n c ia /a lto re n d im ie n to . S o rp re n d e n te m e n te , la p re se n te inve n c ió n p ro p o rc io n ó a h o ra la p o s ib ilid a d de ro m p e r u h o m o g e n e iz a r m a te ria l de te jid o de m a n e ra e fic ie n te , rá p id a y co m p le ta , inc lu so con m e zc la d o re s de b a ja p o te n c ia , co m o los m e zc la d o re s de v ó r te x de so b re m e s a co m u n e s , q ue p e rte n e ce n al e q u ip a m ie n to co n v e n c io n a l de cas i to d o s los la b o ra to rio s . P o r c o n s ig u ie n te , co m o d isp o s itivo p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a o tr itu ra c ió n d e l m e zc la d o r de te jid o de b a ja p o te n c ia , se p re fie re n , en p a rticu la r, un a g ita d o r de v ó r te x o un a g ita d o r h o rizo n ta l. Son p a rticu la rm e n te p re fe rid o s los a g ita d o re s de vó rte x .
Los m e zc la d o re s o m o lin o s de a lta p o te n c ia o a lto re n d im ie n to sue len tra b a ja r con u n a fre cu e n c ia de 15 a 60 Hz.
Los m e zc la d o re s de b a ja p o te n c ia , com o en p a rtic u la r e l a g ita d o r de v ó r te x com ú n , sue len tra b a ja r con u n a fu e rz a de 150 a 3200 rpm .
A p lic a r u na p o te n c ia m e cá n ica re du c ida , p o r e je m p lo , de un m e zc la d o r de b a ja p o te n c ia o de v ó r te x es v e n ta jo so p ara p re s e rv a r la ca lid ad d e los a n a lito s lib e ra d o s y e v ita r d a ñ o s o d e te r io ro d e los a n a lito s d e b id o a un im p ac to m e cá n ico m asivo .
Un o b je to a d ic io n a l de la p re se n te inve n c ió n se re fie re a un s is te m a (una co m b in a c ió n , k it de p a rte s ) q ue co m p re n d e u n a co m p o s ic ió n , un k it o e l s is te m a co m o se d e fin ió a n te rio rm e n te , y q ue a d e m á s co m p re n d e un m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a no s y a n im a le s , q ue e s tá d e s tin a d o p a ra la d is ru p c ió n p o r m e d io de la co m p o s ic ió n , kit o s is te m a de la p re se n te inve nc ión . C on re sp e c to al m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se re s h um a n o s y a n im a les de ta l s is te m a , se h ace re fe re n c ia a la d e fin ic ió n a n te r io r de "m a te r ia l de te jid o ".
La p re se n te in ve n c ió n se re fie re a d e m á s a un nue vo m é to do p a ra la d is ru p c ió n u h o m o g e n e iza c ió n de m a te ria l de te jid o , d o n d e el m a te ria l de te jid o se so m e te a un tra ta m ie n to s im u ltá n e o de
- d is ru p c ió n m e cá n ica p o r tr itu ra c ió n , m o lie n d a o g o lp e s y
- d is ru p c ió n q u ím ica p o r lis is e n z im á tica ,
m e d ia n te tr itu ra c ió n , m o lie n d a o g o lp e s de l m a te ria l de te jid o en u na so lu c ió n de lis is q u e co m p re n d e u na o m ás p a rtícu la s d is ru p tiv a s só lid as , al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a y e l a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o in fe rio r a 1M.
El m é to do según la p re se n te in ve n c ió n se ca ra c te r iza p o r q u e la tr itu ra c ió n , m o lie n d a o g o lp e s de l m a te ria l de te jid o se e fe c tú a m e d ia n te u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid a s co m o se d e fin ió a n te rio rm e n te . C on re sp e c to a las fo rm a s d e re a liza c ió n y s e le cc io n e s p re fe rid a s , se hace re fe re n c ia a las fo rm a s d e re a liza c ió n y se le cc io n e s d e fin id a s a n te rio rm e n te .
El m é to d o de a cu e rd o con la p re se n te inve n c ió n se c a ra c te r iza p re fe rib le m e n te p o r q u e la d is ru p c ió n d e l m a te ria l de te jid o se lleva a ca b o o se e fe c tú a u sa n d o un d isp o s itivo p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a o tritu ra c ió n de l te jid o co m o se d e fin ió a n te rio rm e n te , ta l com o p re fe rib le m e n te m o lin o s de m e zc la de a lta p o te n c ia , m e zc la d o re s de a lta ve lo c id a d o m e zc la d o re s de b a ja p o te n c ia , inc lu id o s a g ita d o re s de vó rte x , en p a rtic u la r m e d ia n te e l uso de m e zc la d o re s o a g ita d o re s v ó rte x d e b a ja p o te n c ia co m o se d e fin ió a n te rio rm e n te .
El m é to do de a cu e rd o con la p re se n te inve n c ió n se lleva a cab o p re fe rib le m e n te u sa n d o cu a lq u ie ra de las co m p o s ic io n e s , k its o s is te m a s (co m b in a c io n e s , k its de p a rte s) co m o se d e fin ió a n te rio rm e n te .
Se p re fie re p a rticu la rm e n te , q u e cu a n d o se lleve a ca b o e l m é to d o de la p re se n te inve nc ión , no e s té n p rese n te s d is o lve n te s o rg á n ico s , ta le s co m o en p a rtic u la r los a lco ho les , en las co m p o s ic io n e s p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s en co n ce n tra c io n e s q ue e fe c tú e n la d e sn a tu ra liza c ió n y p o r lo ta n to la in a c tiva c ió n de la al m e no s u n a e n z im a lítica . C om o se d e fin ió a n te rio rm e n te , p o r e je m p lo , no d e b e ría n e s ta r p re se n te s e ta no l, p ro p a n o l y /o iso p ro p a n o l en u n a ca n tid a d q u e d e sn a tu ra lice o ina c tive las e n z im a s . Lo m ás p re fe rib le m e n te , no e s tá n p re se n te s d is o lve n te s o rg á n ico s , en p a rtic u la r a lco h o le s , m uy p a rtic u la rm e n te e ta no l, p ro p a n o l y /o iso p ro p a n o l cu a n d o se lle va a ca b o el m é to do de d is ru p c ió n de l m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y an im a les .
El m é to d o según la p re se n te inve n c ió n se c a ra c te r iza en p a rtic u la r p o r c o m p re n d e r las e ta p a s :
(i) a ñ a d ir a un m a te ria l de te jid o en un re c ip ie n te a d e cu a d o (p o r e je m p lo , co m o se d e fin e a n te r io rm e n te en el co n te x to d e l k it)
a) u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as , e l al m e no s un ta m p ó n , la al m e no s u n a e n z im a p a ra lis is e n z im á tica , e l al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u n a c o n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, o p c io n a lm e n te u na R N asa y o p c io n a lm e n te uno o m ás a g e n te s se le cc io n a d o s de te n s io a c tiv o s , a g e n te s re du c to re s , in h ib id o re s de n u c le a sa s , a g e n te s a n tie sp u m a n te s o m e zc la s de los m ism os , o
b) c u a lq u ie ra d e las c o m p o s ic io n e s d e fin id a s a n te r io rm e n te ;
(ii) o p c io n a lm e n te c e rra r e l re c ip ie n te ;
(iii) la d is ru p c ió n d e l m a te ria l de te jid o en e l re c ip ie n te u sa n d o un m o lino m e zc la d o r d e a lta p o te n c ia , un m e zc la d o r de a lta ve lo c id a d o un m e zc la d o r de b a ja p o te n c ia , in c lu ye n d o un a g ita d o r de vó rte x , p re fe rib le m e n te u sa n d o un a g ita d o r d e v ó rte x ;
(iv) in c u b a r la m e zc la de la e ta p a (iv) a u na te m p e ra tu ra s u p e r io r a 24°C , p re fe rib le m e n te e n tre 25 y 70°C ;
(v) o p c io n a lm e n te re p e tir las e ta p a s (iii) y (iv);
(v i) o p c io n a lm e n te p ro p o rc io n a r la m e zc la re su lta n te a las e ta p a s p o s te rio re s d e l p ro ce so d e p u rifica c ió n , se p a ra c ió n , e x tra cc ió n y /o a n á lis is ; o a lte rn a tiva m e n te a lm a c e n a r la m e zc la re su ltan te , p re fe rib le m e n te d e sp u é s de la d e sa c tiva c ió n de los re a c tivo s líticos, en p a rtic u la r las e n z im a s líticas, p o r e je m p lo , m e d ia n te la a d ic ión de un re ac tivo a d e cu a d o p a ra la d e sa c tiva c ió n y /o m e d ia n te el e n fr ia m ie n to o c o n g e la c ió n d e la m e zc la re su ltan te .
El t ie m p o de m o lie n d a p re fe rid o según la e ta p a (iii) es de a p ro x im a d a m e n te 1 m inu to , p re fe rib le m e n te de a p ro x im a d a m e n te 30 se g u n d o s a a p ro x im a d a m e n te 15 m in u tos , p re fe rib le m e n te d e a p ro x im a d a m e n te 30 se g u n d o s a a p ro x im a d a m e n te 5 m in u tos . C u a n d o se u sa un m o lino o m e zc la d o r de a lta p o te n c ia o de a lto re n d im ie n to , e l t ie m p o de m o lie n d a es p re fe rib le m e n te de a p ro x im a d a m e n te 30 se g u n d o s . C u a n d o se u sa un m e zc la d o r de b a ja p o ten c ia , co m o en p a rtic u la r un a g ita d o r de vó rte x , el tie m p o de m o lie n d a es p re fe rib le m e n te de a p ro x im a d a m e n te 5 m inu tos .
El t ie m p o de lis is según la e ta p a (iv) p re fe rib le m e n te no e xce d e de 4 horas , m ás p re fe rib le m e n te 3 h oras , inc lu so m ás p re fe rib le m e n te 2 horas, m u cho m ás p re fe rib le m e n te 1 h ora e inc lu so m ás p re fe rib le m e n te m e no s de 1 h ora ta l com o p a rtic u la rm e n te m enos de 30 m in u tos . Si se re p ite la e ta p a (iv) (e ta p a (v)), e n to n ce s e l t ie m p o to ta l de lis is no d ebe e x c e d e r las 4 horas , p re fe rib le m e n te 3 horas , m ás p re fe rib le m e n te 2 horas , m u ch o m á s p re fe rib le m e n te 1 h ora e inc lu so m ás p re fe rib le m e n te m e no s de 1 h o ra ta l co m o p a rticu la rm e n te m e no s de 30 m in u tos . P re fe rib le m e n te , el t ie m p o de lis is seg ún la e ta p a (iv) (o e l t ie m p o de lis is to ta l re sp e c tiva m e n te ) es de al m e no s 5 m in u tos , m ás p re fe rib le m e n te al m e no s 10 m in u tos . P re fe rib le m e n te , con el m é to d o de la p re se n te inve n c ió n se p ue de c o n s e g u ir u na d is ru p c ió n de te jid o s u fic ie n te p a ra q u e se co m p le te en 15 m in u tos .
En p a rticu la r, cu a n d o el m é to do se u sa p a ra la e x tra cc ió n de A D N , se p re fie re n los tie m p o s de lis is d e fin id o s .
Se p re fie re en p a rtic u la r q ue el m a te ria l de te jid o no e s té en co n ta c to con la so lu c ió n de lis is de la p re se n te inve nc ión d u ra n te m ás de 4, p re fe rib le m e n te 3, m ás p re fe rib le m e n te 2 horas , m u ch o m ás p re fe rib le m e n te m ás de 1 h ora e inc lu so m ás p re fe rib le m e n te m ás de 30 m in u tos . De fo rm a m uy p a rticu la r, se e v ita rá u na d ig e s tió n d u ra n te u na noche (a l m enos 8 hora s de d ig e s tió n ). En p a rticu la r, cu a n d o el m é to do se usa p a ra la e x tra cc ió n de A D N .
C on las c o m p o s ic io n e s , k its , s is te m a s (co m b in a c io n e s , k it de p a rte s ) y m é to d o de la p re se n te inve nc ión , e l t ie m p o de d is ru p c ió n y h o m o g e n e iza c ió n se p ue de re d u c ir s ig n ifica tiva m e n te a 1 o 2 hora s e inc lu so m ás h as ta 30 m in u to s o inc lu so m enos, co m o p a rticu la rm e n te a no m ás de u nos 15 m in u tos . P o r el co n tra rio , las té c n ica s h a b itu a le s n eces itan un tie m p o m e d io m ín im o de d ig e s tió n de al m e no s 150 m in u to s (2 ,5 h ora s ), m ie n tra s q ue la d ig e s tió n d u ra n te una n oche (a l m e no s 8 hora s de d ig e s tió n ) es hab itua l.
La p re se n te inve n c ió n es p a rtic u la rm e n te a d e cu a d a p a ra e x tra e r á c id o s n uc le icos , A D N , A R N , A R N m i (A R N m icro ), A R N m , A R N t, A R N r, e tc . de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s co m o se d e fin e a n te rio rm e n te .
Se p re fie re p a rtic u la rm e n te u sa r la p re se n te inve n c ió n p a ra e x tra e r A D N , A R N y A R N m i de m u e s tra s de te jid o , se p re fie re m uy p a rtic u la rm e n te la e x tra cc ió n de A D N .
A s í, el m é to do de la p re se n te inve n c ió n p ue de c o m p re n d e r u n a o m ás e ta p a s a d ic io n a le s , p o s te rio re s a la e ta p a (vi) a n te rio r, q ue co m p re n d e n
- re co le cc ió n de l m a te ria l p ro ce sa d o ;
- e s ta b iliza c ió n d e l m a te ria l p ro ce sa d o ; p o r e je m p lo , in a c tiva n d o los a g e n te s líticos, en p a rtic u la r las e n z im a s lítica s, p o r e je m p lo , c o n g e la n d o la m e zc la ;
- a lm a c e n a m ie n to d e l m a te ria l p ro ce sa d o (y e s ta b iliza d o );
- u n ió n de los a na lito s , p o r e je m p lo , m e d ia n te la a d ic ió n de d iso lve n te s ca o tró p ic o s y /u o rg á n ico s a d ic io n a le s ta le s co m o a lco ho les , en p a rtic u la r e ta n o l y /o iso p ro p a n o l;
- p u rifica c ió n de los a na lito s , p o r e je m p lo , u sa n d o m e m b ra n a s a b ase de s ílice , co lu m n a s o té c n ica s b a sa d a s en p erla s m a g n é tica s de s ílice ;
- a is la m ie n to de los a na lito s , p o r e je m p lo , u sa n d o té c n ica s de e lu c ió n ;
- c o n ce n tra c ió n de los a na lito s ;
- re co le cc ió n de los a na lito s ;
- e s ta b iliza c ió n de los a n a lito s p u rif ica d o s /a is la d o s ;
- a lm a c e n a m ie n to de los a n a lito s p u rif ica d o s /a is la d o s ;
- a n á lis is , p o r e je m p lo , a n á lis is de PCR.
En p a rticu la r, es p o s ib le u sa r e l m a te ria l de te jid o p ro ce sa d o re su lta n te de la e ta p a (vi) a n te r io r co m o m a te ria l de p a rtid a en p ru e b a s de p u rifica c ió n , a is la m ie n to y a n á lis is c o n o c id a s y co m e rc ia lm e n te d isp o n ib le s o u sa r k its de p ru e b a d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te p a ra e l p ro ce sa m ie n to p os te rio r.
La p re se n te inve n c ió n se re fie re a d e m á s al uso de las c o m p o s ic io n e s , los k its y los s is te m a s (co m b in a c io n e s , k it de p a rte s ) co m o se d e fin e n en e l p re se n te d o c u m e n to p a ra tra ta r m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s co m o se d e fin e a n te rio rm e n te . En e ste , e l tra ta m ie n to se re fie re p re fe rib le m e n te a la d is ru p c ió n y/u h o m o g e n e iza c ió n co m o se d e fin ió a n te r io rm e n te , p e ro ta m b ié n p u e d e c o m p re n d e r la lib e ra c ió n o a d ic ión de la m u es tra de te jid o a u n a co m p o s ic ió n o m e zc la de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión .
Sin lim ita r el á m b ito de la p re se n te inve nc ión , los s ig u ie n te s e je m p lo s ilus tra rá n la p re se n te inve nc ión :
E je m p lo s :
E xtra cc ió n de A D N de m u e s tra s de te jid o de ra ta
M a te ria l d e l te jid o :
ra ta , e s ta b iliz a d a con R N A L a te r (d isp o n ib le en Q ia g en )
H íg a d o 25 m g, m ú scu lo 25 m g, p u lm ó n 10 m g, riñón 20 m g, co ra zó n 10 mg
Equipo:
R e c ip ie n te p a ra re c ib ir la m u e s tra de te jid o
T u b o : tu b o con ta p ó n de ro sca de 2 ml (PP , S a rs te d t - b ase con fa ld ó n )
P a rtícu la s d is ru p tiva s
P erlas : B o la -co n o de 5 /32 ” (A B B O T T B a ll),
P e rlas de a ce ro in o x id a b le de 5 m m re do n da s,
P e rlas de c irco n io fa c e te a d a s
D isp o s itivo p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a /tr itu ra c ió n
A) V o rte x G e n ie 2 (S c ie n tific Ind us trie s S I-V 524 ), con v a r io s a d a p ta d o re s : inse rto de e sp u m a , S o p o rte de m ic ro tu b o s h o rizo n ta l y v e rtica l (V o rte xD )
B) T is s u e L y s e r II (d isp o n ib le de Q ia g en )
C ) T is s u e L y s e r LT (d isp o n ib le en Q ia g en )
Lisis:
20 gl de p ro te in a s a K
4 gl de R N a sa A
200 gl de ta m p ó n A V E y
40 gl de ta m p ó n V X L (d isp o n ib le en Q ia g en )
Unión y lavado:
265 gl de ta m p ó n M VL,
500 gl de ta m p ó n A W 1,
500 gl de ta m p ó n A W 2,
50 - 100 gl de ta m p ó n A T E (d isp o n ib le en Q ia g en ))
N o tas a los a g e n te s q u ím ico s
- La p ro te in a s a K es m uy a c tiva en e s ta c o n ce n tra c ió n de sa l ca o tró p ica , pero es p ro b a b le q u e se p u e d a u sa r c u a lq u ie r c o n ce n tra c ió n de g u a n id in a d e sd e 1 M h asta 0 ,5 M.
- T w e e n 20 y T r ito n X -100 e s tá n p re se n te s co m o te n s io a c tiv o s (d e te rg e n te s ), a u n q u e o tro s te n s io a c tiv o s tam b ién se ría n e fica ce s . Los te n s io a c tiv o s no son n e ce sa rio s p a ra to d o s los te jid o s , p e ro no son d a ñ in o s p a ra e l p roce so de n in g ún te jid o y m e jo ran los re su lta d o s cu a n d o se usan te jid o s e sp e c ia lm e n te g ra so s co m o e l h íg ad o o el ce reb ro .
- La q u ím ic a no e s tá lim ita d a a los p ro ce d im ie n to s b a sa d o s en co lu m n a s , los p ro ce d im ie n to s b a sa d o s en p erlas m a g n é tica s de s ílice son ig u a lm e n te e fe c tivo s .
Protoco lo :
1. S e p a ra r la m u e s tra de te jid o o sa ca rla d e l a lm a ce n a m ie n to
2. P esa r y c o r ta r la m u e s tra de te jid o en u n a ro da ja de ta m a ñ o a d e cu a d o (5 -25 m g), s e g u id a m e n te c o lo c a r e l fra g m e n to en un tu b o con ta p ó n de ro sca de 2 ml (S a rs te d t 72.608 ta p ó n azu l 65.716.001 ), a ñ a d ie n d o u n a o m ás de las p a rtícu la s d is ru p tiv a s m e n c io n a d a s a n te r io rm e n te , p o r e je m p lo , u n a b o la -co n o de 5 /32 ” (A B B O T T B a ll), o v a r ia s de las p e rla s re d o n d a s de 5 m m o de las p erla s de c irc o n io fa ce ta d a s .
3. A ñ a d ir los re a c tivo s de lis is y las e n z im a s co m o se ind ica a rrib a y c e rra r la tap a .
200 gl de A V E /40 gl de VXL/1 g l de re a c tivo D X /20 gl de p ro te in a sa K /4 g l de R N a sa A (100 m g /m l) y c e rra r la tap a . P ara p ro c e sa r v a r ia s m u es tra s , se p ue de p re p a ra r u n a m e zc la m a e s tra de ta m p ó n de d ig e s tió n .
4. C o n tin u a r con la h o m o g e n e iza c ió n :
A ) V o rte x G e n ie 2 con a d a p ta d o r de tu b o de 2 ml a p ro p ia d o : 5 m in u tos a m á x im a ve lo c id a d (3200 rpm )
B) T is s u e L y s e r II con 2 x 24 a d a p ta d o re s de m ic ro ce n tr ífu g a de 2 m l: 30 se g u n d o s a 24 Hz
C) T is s u e L y s e r LT: 1-2 m in u to s a 30 -45 H z
5. In cu b a r a 56°C y 1200 rpm en un T e rm o s h a k e r d u ra n te 10 m in u tos
N o ta : La incu ba c ió n c o n tin u ó d e s p u é s de la d is ru p c ió n in d e p e n d ie n te m e n te d e l te jid o re s idu a l v is ib le .
Si d e sp u é s de la in cu b a c ió n aún q u e d a b a te jid o re s idu a l, se llevó a cab o u na s e g u n d a h o m o g e n e iza c ió n de l te jid o : A ) V o rte x G e n ie 2 con so p o rte ve rtic a l p a ra m ic ro tu b o s : 3 m in u to s a m á x im a v e lo c id a d (3200 rpm )
B) T is s u e L y s e r II: 15 se g u n d o s a 20 Hz
C) T is s u e L y s e r L T : 45 se g u n d o s a 30 -40 H z
S e g u id a m e n te , la m u e s tra se incubó n ue va m e n te a 56°C y 1200 rpm en un T h e rm o s h a k e r d u ra n te 10 m in u to s m ás.
6. A b r ir e l tu b o y a ñ a d ir 265 gl de ta m p ó n M V L (d isp o n ib le en Q ia g e n ), m e zc la r m e d ia n te p ip e te o o a g ita c ió n con vó rte x .
7. A p lic a r la m e zc la de la e ta p a 6 a u n a c o lu m n a Q IA a m p M in i S p in (d isp o n ib le en Q ia g e n ), c e rra r la ta p a , se g u id o de ce n tr ifu g a c ió n d u ra n te 1 m in u to a m á x im a ve lo c id a d (s in e xc e d e r 20000 x g), c o lo c a r la co lu m n a S p in en un nuevo tu b o de re co le cc ió n de 2 ml y d e s e c h a r e l tu b o de re co g id a q u e co n tie n e e l f iltra d o .
8. A b r ir la co lu m n a de ce n tr ifu g a d o y a ñ a d ir 500 g l de ta m p ó n AW 1 (d isp o n ib le en Q ia g en ), c e rra r la ta p a , se g u id o de ce n tr ifu g a c ió n d u ra n te 30 se g u n d o s a m á x im a v e lo c id a d (sin e xc e d e r 20000 x g), c o lo ca r la c o lu m n a de c e n tr ifu g a d o en un n ue vo tu b o de re co le cc ió n de 2 ml y d e s e c h a r e l tu b o de re co g id a q ue c o n tie n e el f iltra d o .
9. A b r ir la co lu m n a de ce n tr ifu g a d o y a ñ a d ir 500 g l de ta m p ó n A W 2 (d isp o n ib le en Q ia g en ), c e rra r la ta p a , se g u id o de ce n tr ifu g a c ió n d u ra n te 30 se g u n d o s a v e lo c id a d m á x im a (sin e xc e d e r 20000 x g), c o lo ca r la c o lu m n a de c e n tr ifu g a d o en un tu b o de re co le cc ió n nue vo de 2 ml y d e s e c h a r e l tu b o de re co g id a q ue c o n tie n e el f iltra d o .
10. C e n tr ifu g a r a m á x im a ve lo c id a d d u ra n te 2 m in u to s (para e lim in a r la p o s ib ilid a d de un p o s ib le a rra s tre de A W 2), c o lo c a r la c o lu m n a de ce n tr ifu g a d o en un tu b o de m ic ro ce n tr ífu g a lim p io de 1,5 ml.
11. A b r ir la co lu m n a de ce n tr ifu g a d o y a ñ a d ir 100 gl de ta m p ó n A T E (d isp o n ib le en Q ia g en ), in cu b a c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 1 m inu to , se g u id o de ce n tr ifu g a c ió n a m á x im a v e lo c id a d (sin su p e ra r 20000 x g) d u ra n te 1 m inu to .
12. R e p e tir la e ta p a 11.
A . D e te rm in a c ió n de l re n d im ie n to en v a rio s tip o s d e m u e s tra s en c o m p a ra c ió n con la d ig e s tió n c lá s ic a con P ro te in a s a K
D eterm inación d e l ren d im iento
E sp e c tro fo tó m e tro U V -V IS (N a n o d ro p )/e n sa yo flu o re sc e n te e sp e c ífico de A D N (Q ub it 2.0 ); G e l T A E al 0 ,6% :
18 h 20 vo ltio s ,
p la n tilla : m ism o v o lu m e n de e lu id o
E n sa yo Q F P a th o g e n m itlC D N A con 12000 c o p ia s de IC D N A /re a cc ió n y a d ic ión de 1 g l/6 gl de e lua to .
R e su lta d o s de las p ru e b a s :
Tabla 1
Figure imgf000016_0001
Tabla 2
Figure imgf000017_0001
T a b la 3
Figure imgf000017_0002
Tabla 4
Figure imgf000018_0001
Los re n d im ie n to s de á c id o n uc le ico de los tip o s de te jid o m e jo ra ro n h as ta 20 v e c e s con re spe cto a u na d ig e s tió n con p ro te in a s a K c o n ve n c io n a l. El t ie m p o to ta l de d ig e s tió n ta m b ié n se re du jo en un fa c to r de c in co al co m p a ra r lo con la d ig e s tió n con p ro te in a sa K so la (en a m b o s caso s, la d ig e s tió n se llevó a cab o h as ta q u e la m u e s tra a p a re c ió v is ib le m e n te h om o g é n e a ).
El tie m p o m e d io de d ig e s tió n con p ro te in a sa K (s in m o lie n d a m e cá n ica ) fu e de 150 m in u tos , m ie n tra s q ue el nuevo m é to do c o n s ig u ió u na h o m o g e n e iza c ió n p o r lo g e n e ra l en m e no s de 30 m in u tos .
El e xp e rim e n to ta m b ié n m u e s tra q u e se p ue de n c o n s e g u ir re n d im ie n to s e q u iva le n te s en un a g ita d o r de v ó rte x de la b o ra to rio com ú n (d isp o s itivo de b a ja p o te n c ia ) y en un c o s to so m o lino de p erla s de a lta po ten c ia .
A d ic io n a lm e n te , se ha d e m o s tra d o q u e ta m b ié n se m e jo ró la ca lid a d de l A D N (ta m a ñ o de l A D N ) m e d ia n te e l u so de a g ita d o re s de vó rte x .
B. E s fu e rzo d e tie m p o e x p e rim e n ta l c o m p a ra d o c o n d ig e s tió n c lá s ic a con P ro te in a s a K
Se ha e va lu a d o la e fica c ia d e l m é to d o de la p re se n te inve n c ió n en v is ta d e l e s fu e rzo de tie m p o en c o m p a ra c ió n con la d ig e s tió n con p ro te in a sa K c lá s ica , a p lica n d o las co n d ic io n e s de p ru e b a in d ica d a s a n te rio rm e n te .
R e s u lta d o s de la p ru e b a
Tabla 5
Figure imgf000019_0001
T a b la 6
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
In fo rm a c ió n a d ic io n a l T a b la 6: A D N IC: v a lo r c t = 27 ,37 ; v a lo r c t = 27 ,85 (M V, n = 4)
El n ue vo m é to d o p ue de c o n s e g u ir m a yo re s re n d im ie n to s en 10 m in de d is ru p c ió n 10 m in de d ig e s tió n con p ro te in a sa K q ue los q u e se c o n s ig u e n d u ra n te u n a n oche (u /n ) (m ás de 8 ho ra s ) con d ig e s tió n e n z im á tic a so la .
El experim ento tam b ién m uestra la e fectiv idad del nuevo m étodo con m ateria l de te jido m uy difícil, com o la co la de un ratón.
C. E v a lu a c ió n d e l re n d im ie n to c o n d ife re n te s p a rtíc u la s d is ru p tiv a s
La e fica c ia de l m é to do de la p re se n te inve n c ió n se ha e va lu a d o a la v is ta de d ife re n te s p a rtícu la s d is ru p tiva s , a p lica n d o las co n d ic io n e s de p ru e b a in d ica d a s a n te rio rm e n te .
R e s u lta d o s de la p ru e b a
T a b la 7
Figure imgf000020_0002
La n u e va q u ím ica no se lim ita a u n a fo rm a e sp e c ífica de p a rtícu la d is rup tiva .
Se ha d e m o s tra d o q u e con la co m p o s ic ió n de la p re se n te inve nc ión , la ca lid a d de l A D N fu e ig u a lm e n te a lta cu a n d o se usa n p erla s re d o n d a s de 5 mm o B o la - con o de 5 /32 ” .
C u a n d o se usan p e rla s re d o n d a s de 5 m m , la ro tu ra te n d ía a d is m in u ir y q u e d a b a n m ás o m ás re s idu os de te jid o en c o m p a ra c ió n con la ro tu ra de B o la - con o de 5 /32 ” .
Los tie m p o s de lis is fu e ro n e se n c ia lm e n te los m ism os , sin e m b a rg o , la ru p tu ra con el a g ita d o r v ó rte x co n s ig u ió re n d im ie n to s lig e ra m e n te m ás b a jo s , d e p e n d ie n d o d e l m a te ria l de te jid o usado .
D. E v a lu a c ió n d e d ife re n te s tip o s d e te jid o s
La e fic a c ia d e l m é to do de la p re se n te inve nc ión se ha e va lu a d o a la v is ta de d ife re n te s m a te ria le s de te jid o , a p lica n d o las co n d ic io n e s de p ru e b a ind ica d a s a n te rio rm e n te .
R e s u lta d o s de la p ru e b a
T a b la 8
Figure imgf000021_0001
T a b la 9
Figure imgf000021_0002
Las m e jo ra s q ue se d e sc rib e n en e l p re se n te d o c u m e n to se p ue de n c o n s e g u ir con d ife re n te s tip o s de m u e s tra s de te jid o , co m o m a te ria le s de te jid o b la n d o e inc lu so con m a te ria le s de te jid o d u ro s co m o la co la de ra tón .
E. E v a lu a c ió n d e e fe c to s s in é rg ic o s
Se ha e va lu a d o la e fic a c ia de la c o m b in a c ió n de lis is m e cá n ica y q u ím ica (e n z im á tica ) c o m p a ra d a con los tra ta m ie n to s in d iv id u a le s , a p lica n d o las co n d ic io n e s de e n sa yo in d ica d a s a n te rio rm e n te .
R e s u lta d o s de la p ru e b a :
T a b la 10
Figure imgf000022_0001
Los re n d im ie n to s e s tá n en m ic ro g ra m o s , m e d id o s m e d ia n te un e n sa yo f lu o re sc e n te e sp e c ífico de DN (Q ub it 2.0 ) Se p u e d e o b s e rva r un e fe c to s in é rg ico (m e jo ra x v e c e s s u p e r io r a la su m a de a m b o s m é to d o s in d iv id u a le s ):
H íg a d o 10 mg M ú scu lo 10 mg
3 ,87 2 ,12
F. E v a lu a c ió n d e la m e jo ra en c o m p a ra c ió n c o n los k its d e p ru e b a d is p o n ib le s c o m e rc ia lm e n te
Se ha e va lu a d o la e fic a c ia de la co m p o s ic ió n de la p re se n te inve nc ión c o m p a ra d o s con v a r io s k its de p ru e b a d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te .
R e s u lta d o s de la p rue b a :
T a b la 11
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
a b la 12
Figure imgf000023_0002
Tabla 13
Figure imgf000024_0001
La co m p o s ic ió n de la p re se n te in ve n c ió n c o n s ig u e re n d im ie n to s m e jo ra d o s con u n a d e g ra d a c ió n m ín im a o n u la del A D N (ca lida d m e jo ra d a d e l A D N ) con un e s fu e rzo de tie m p o m e jo ra d o en c o m p a ra c ió n con los k its d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te .
T a b la 12 (co n tin u a c ió n )
Figure imgf000024_0002
Tabla 13
Figure imgf000025_0001
T a b la 14
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
La co m p o s ic ió n de la p re se n te in ve n c ió n c o n s ig u e re n d im ie n to s m e jo ra d o s con u n a d e g ra d a c ió n m ín im a o n u la del A D N (ca lida d m e jo ra d a de l A D N ) con un e s fu e rzo de tie m p o m e jo ra d o s co m p a ra d o con los k its d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te .

Claims (15)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. U so de u na co m p o s ic ió n q u e co m p re n d e
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiv a s só lid as ;
- al m e no s u na e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m e no s un a g e n te c a o tró p ico en u na co n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M; y p re fe rib le m e n te
- al m enos un ta m p ó n
p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s .
2. El uso de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 1, d o n d e la c o m p o s ic ió n co m p re n d e a d e m á s uno o m ás a ge n tes se le cc io n a d o s de
- al m enos un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos ;
- al m enos un in h ib id o r de n uc lea sas ;
- al m enos un a g e n te a n tie sp u m a n te ;
- al m enos un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico ;
- al m enos un a g e n te re du c to r;
y m e zc la s de los m ism os.
3. El uso de a cu e rd o con u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s a n te rio re s , d o n d e la co m p o s ic ió n co m p re n d e a de m ás al m e no s u n a e n z im a ad ic ion a l, d is tin ta de la e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica , p re fe rib le m e n te u n a R N asa .
4. El u so de a cu e rd o con u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s a n te rio re s , d o n d e la c o m p o s ic ió n co m p re n d e al m enos u na e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica , q u e e s tá s e le cc io n a d a de l g ru p o de p ro te a sa s, p re fe rib le m e n te p ro te in a s a K.
5. El uso de a cu e rd o con u na cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s a n te rio re s , d o n d e e l te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s e s tá c a ra c te r iza d o p o r q u e co m p re n d e in te rm e d io s a n ive l de o rg a n iza c ió n c e lu la r e n tre cé lu la s y un ó rg a n o co m p le to , u n a e s tru c tu ra fib ro s a y /o m e m b ra n o sa , y p re fe rib le m e n te e s tá s e le cc io n a d o de te jid o con ec tivo , te jid o m u scu la r, te jid o n erv io so , te jid o e p ite lia l y te jid o m in e ra liza d o , ta l co m o p re fe rib le m e n te p ie l, m ú scu lo , te n d o n e s , fila m e n to s , n e rv io s , ca rtíla g o , hueso , co la , a s í co m o ó rg a n o s , ta le s co m o in te s tin o , g á s trico , h íg ad o , bazo , ce reb ro , lin fa , m é d u la ó se a , riñón , co ra zó n .
6. El uso de a cu e rd o con u na cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s p re ce d e n te s , d o n d e la co m p o s ic ió n co m p re n d e p a rtícu la s d is ru p tiv a s só lid a s q u e tie n e n un ta m a ñ o de al m e no s 1 m m , p re fe rib le m e n te de > 2 m m , m ás p re fe rib le m e n te de > 3 m m .
7. U na co m p o s ic ió n p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h u m a n o s y a n im a le s , que co m p re n d e
- u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiv a s só lid as ;
- al m e no s u na e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- h id ro c lo ru ro de g u a n id in io en u n a c o n ce n tra c ió n igua l o m e n o r de 1 M; y p re fe rib le m e n te
- al m e no s un ta m p ó n .
8. La co m p o s ic ió n de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 7, q ue co m p re n d e a d e m á s u no o m ás a g e n te s s e le cc io n a d o s de - al m e no s un te n s io a c tivo , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o d e l g ru p o de te n s io a c tiv o s no ión icos ;
- al m e no s un in h ib id o r de n uc lea sas ;
- al m e no s un a g e n te a n tie sp u m a n te ;
- al m e no s un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico ;
- al m e no s un a g e n te re du c to r;
- al m e no s u na e n z im a a d ic io n a l, d is tin ta de la e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica , p re fe rib le m e n te u na R N a sa y m e zc la s de los m ism os.
9. Un k it p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s , co m p re n d ie n d o e l kit - u n a o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lid as ;
- al m enos u na e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica ;
- al m enos un ta m p ó n ;
- h id ro c lo ru ro de g u a n id in io en u n a c o n ce n tra c ió n igua l o m e n o r de 1 M;
y o p c io n a lm e n te uno o m ás a g e n te s se le cc io n a d o s de
- al m enos un te n s io a c tivo ;
- al m enos un in h ib id o r de n uc lea sas ;
- al m enos un a g e n te a n tie sp u m a n te ;
- al m enos un e s ta b iliz a d o r o sm ó tico ;
- al m enos un a g e n te re du c to r;
- al m enos u na e n z im a a d ic io n a l, d is tin ta de la e n z im a p a ra la lis is e n z im á tica , p re fe rib le m e n te u na R N asa ; - al m enos un d iso lve n te o rg á n ico , p re fe rib le m e n te un a lco h o l; y
- o p c io n a lm e n te un re c ip ie n te p a ra re c ib ir el m a te ria l de te jid o ;
- y un fo lle to con in s tru cc io n e s p a ra p ro c e sa r e l m a te ria l de te jid o .
10. U na co m b in a c ió n q u e co m p re n d e la co m p o s ic ió n co m o se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 7 u 8 o e l k it co m o se d e fine en la re iv in d ica c ió n 9 y un d isp o s itivo p a ra e fe c tu a r la m o lie n d a de l m a te ria l de te jid o , p re fe rib le m e n te un m o lino de m e zc la de a lta p o te n c ia , u na m e zc la d o ra de a lta ve lo c id a d o u n a m e zc la d o ra de b a ja p o ten c ia , q ue inc lu ye un a g ita d o r de v ó rte x y q ue o p c io n a lm e n te co m p re n d e a d e m á s un m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s p a ra su d is ru p c ió n .
11. Un m é to d o p a ra la d is ru p c ió n de m a te ria l de te jid o só lid o d e riv a d o de se res h um a n o s y a n im a le s , d o n d e e l m a te ria l de te jid o só lid o se so m e te a un tra ta m ie n to s im u ltá n e o de
- d is ru p c ió n m e cá n ica p o r tr itu ra c ió n , m o lie n d a o p o r m e d io de g o lp e s y
- d is ru p c ió n q u ím ic a p o r lis is e n z im á tica ,
tr itu ra n d o , m o lie n d o o g o lp e a n d o e l m a te ria l de te jid o en u n a so lu c ió n de lis is q ue co m p re n d e u na o m ás p a rtícu la s d is ru p tiv a s só lid as , al m e no s u n a e n z im a p a ra la lis is e n z im á tic a y al m e no s un a g e n te ca o tró p ic o en u n a co n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1M.
12. El m é to d o de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 11, d o n d e el al m e no s un a g e n te c a o tró p ico es h id ro c lo ru ro de g ua n id in io .
13. El m é to d o de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 11 o 12, d o n d e la d is ru p c ió n se lleva a ca b o u sa n d o m e zc la d o re s de b a ja p o te n c ia q ue inc luyen a g ita d o re s de vó rte x , p re fe rib le m e n te u sa n d o a g ita d o re s de vó rte x .
14. El m é to do seg ún u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 11 a 13, q u e se lleva a ca b o u sa n d o la co m p o s ic ió n según se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 7 u 8, el k it según se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 9 o la co m b in a c ió n seg ún se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 10.
15. El m é to d o de a cu e rd o con u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 11 a 14, q u e co m p re n d e las e ta pa s :
(i) a ñ a d ir a un m a te ria l de te jid o só lid o d e riva d o de se res h um a n o s y a n im a le s en un re c ip ie n te a de cu ad o a) la u na o m ás p a rtícu la s d is ru p tiva s só lidas , e l al m enos un ta m p ó n , la al m e no s u na e n z im a p a ra lis is e n z im á tica , e l al m enos un a g e n te c a o tró p ico en u na co n ce n tra c ió n to ta l igua l o m e n o r de 1 M, o p c io n a lm e n te u n a R N a sa y o p c io n a lm e n te u no o m á s a g e n te s se le cc io n a d o s de te n s io a c tivo s , e s ta b iliz a d o re s o sm ó tico s , a g e n te s re du c to re s , in h ib id o re s de n uc lea sas , a g e n te s a n tie sp u m a n te s o m e zc la s de los m ism os , o b) la co m p o s ic ió n co m o se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 7 u 8;
(ii) o p c io n a lm e n te c e rra r e l re c ip ie n te ;
(iii) la d is ru p c ió n d e l m a te ria l de te jid o só lid o en e l re c ip ie n te u sa n d o un m o lino m e zc la d o r de a lta p o te n c ia , un m e zc la d o r de a lta v e lo c id a d o un m e zc la d o r de b a ja p o te n c ia , in c lu ye n d o un a g ita d o r de vó rte x , p re fe rib le m e n te u sa n d o un a g ita d o r de vó rte x ;
(iv) in c u b a r la m e zc la de la e ta p a (iv) a u n a te m p e ra tu ra s u p e r io r a 24°C ;
(v) o p c io n a lm e n te re p e tir las e ta p a s (iii) y (iv);
(vi) o p c io n a lm e n te p ro p o rc io n a r la m e zc la re su lta n te p a ra las e ta p a s p o s te rio re s d e l p ro ce so de p u rifica c ió n , s e p a ra c ió n , e x tra cc ió n y /o a ná lis is .
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