CN112055748A

CN112055748A - 植物样品的裂解方法

Info

Publication number: CN112055748A
Application number: CN201980029581.2A
Authority: CN
Inventors: D·奥尼尔; P·史密斯
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2020-12-08
Also published as: AU2019266454A1; EP3790966A1; US20210238580A1; WO2019214988A1

Abstract

本发明提供一种从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸的裂解方法，包括使用至少两种固体破碎颗粒对液体裂解组合物中的植物样品进行机械破碎，其中：(i)由一个或多个尺寸至少为1.5mm的破碎颗粒来提供第一类型，并且(ii)由多个尺寸为1mm或更小的破碎颗粒来提供第二类型。还提供从植物样品中分离包括微生物核酸在内的核酸的方法和试剂盒。

Description

植物样品的裂解方法

背景技术

从植物分离核酸可以是非常具有挑战性的，其原因在于植物细胞难以裂解的性质以及存在着包括多糖和多酚化合物在内的大量抑制剂。此外，这些参数在植物种类和同一植物的不同部分之间可能会大幅变化。这经常导致分离出少量的低品质核酸、如DNA。

最常用的植物样品裂解方法是研钵和研杵，或用普通研磨介质(即金属或玻璃珠)进行机械破碎。当使用这种标准程序时，产量通常较低，并且取决于样品种类，DNA包括大量抑制剂的存在。

为了从植物中分离核酸、如DNA，通常采用的方法是将研钵和研杵与CTAB裂解缓冲液组合使用，用于植物材料的裂解和抑制剂的去除。研钵和研杵的使用非常耗时，效率低下，并且难以与多个样品一起使用。CTAB是有毒的试剂。市售的试剂盒将研钵和研杵、或球形陶瓷或金属珠的某些组合，与离液缓冲液和基于去污剂的缓冲液一起使用来进行裂解。这些方法的缺点是它们本质上是非标准的，不能应用于多种不同植物种类并获得类似的成功。这通常导致产量降低，抑制剂的存在增加以及(就研钵和研杵的情况而言)实验的耗时。

此外还需要允许从植物样品中也有效地分离微生物核酸的方法。许多植物样品包含微生物(例如在叶子上或在植物组织内)。需要使植物样品中所包含的微生物核酸可用于分析。随着新一代测序(NGS)的兴起，尤其是微生物组研究(细菌/真菌/病毒)的兴起，人们对分离可立即用于这些应用的高品质DNA的兴趣呈指数增长。对于植物生物学领域也是如此。旨在分离植物样品中所包含的微生物核酸时的主要挑战是植物宿主细胞与目标微生物细胞的混合物。难以裂解的性质以及大量PCR和酶抑制剂的存在使得常规的现有技术方法的使用不太有效。

需要用于从植物样品中分离核酸、特别是DNA的改进方法。

特别是需要这样的方法，其还允许从植物样品中所包含的微生物有效地释放微生物核酸，并且由此从存在于植物样品自身之上、周围或内部的微生物有效地释放微生物核酸，从而可以从获得的裂解物中分离这些微生物核酸。特别是需要一种改进的裂解方法，其从植物样品中有效地释放核酸、如DNA，同时还从植物样品中所包含的微生物中有效地释放微生物核酸、如微生物DNA，以使其可用于后续分离。特别是需要改进的裂解和分离方法，其增加来自不同植物样品，特别是各种植物根的微生物核酸、如微生物DNA的量。

此外，还需要针对多种植物样品种类来提高核酸产量和去除抑制剂的方案。

本发明的目的是克服现有技术的至少一个缺点。特别是，本发明的一个目的是提供一种满足至少一个需求的方法。本发明的另一个目的是提供一种改进的裂解方法，其从各种植物样品中有效地释放核酸、如DNA，并且还从植物样品中所包含的微生物中有效地释放微生物核酸、如微生物DNA，以使其可用于后续分离。

发明内容

根据第一方面，提供一种从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸的裂解方法，包括使用至少两种固体破碎颗粒对液体裂解组合物中的植物样品进行机械破碎，其中：

(i)由一个或多个尺寸至少为1.5mm的破碎颗粒来提供第一类型，并且

(ii)由多个尺寸为1mm或更小的破碎颗粒来提供第二类型。

根据第二方面，提供一种从植物样品中分离包括微生物核酸在内的核酸的方法，包括：

(a)进行根据第一方面的裂解方法；

(b)从裂解并任选地经过进一步处理的样品中分离核酸；以及

(c)任选地对分离的核酸进行测序，优选对分离的DNA进行测序。

根据第三方面，提供一种裂解系统，优选为试剂盒，其用于从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸，包括：

(a)液体裂解组合物、

(b)至少两种固体破碎颗粒，其中：

(ii)由多个尺寸小于1mm的破碎颗粒来提供第二类型。

本发明还涉及这种裂解系统在裂解包含或疑似包含微生物的植物样品中的用途。

根据第四方面，本公开涉及根据第三方面的系统在根据第一方面的方法中的用途。

根据第五方面，本公开涉及根据第三方面的系统在裂解植物样品并从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸中的用途，其中，用户可以使用(i)第一和第二类型、或者(ii)第二类型的破碎颗粒进行植物样品裂解，以从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸、优选为DNA。

使用本文所公开的第一类型的破碎颗粒可提供高DNA产量，并且因此在匀浆并由此破碎各种植物样品方面特别有效。然而，单独的这种大破碎颗粒在机械破碎植物样品中所包含的细菌之类的微生物方面不太有效。至少一个根据第一类型的颗粒、例如球锥与多个第二类型的较小颗粒(例如锆珠粒)的组合使用可实现分离的总DNA的高总产量。此外，第一和第二类型的颗粒的组合使用可有效地释放植物样品中所含微生物中所包含的微生物核酸，如细菌DNA在分离的总DNA中所占的高百分比所示(参见实施例)。因此，如本文所教导的，第一和第二类型的破碎颗粒的组合使用是优选的，特别是在与本文所公开的裂解化学方法结合使用时。本发明可以有利地用于从各种植物样品中释放包括微生物核酸在内的核酸，所述植物样品包括难以裂解的样品、如根样品。

本文所述的组合机械裂解以高产量提供来自各种植物样品的DNA，其中所获得的DNA包含大量的微生物DNA，因此可用于分析。为了进行分析，可以使用各种方法，例如基于扩增的程序(例如PCR)以及测序(例如新一代测序)。

由以下描述和所附权利要求书，本申请的其他方面、目的、特征和优点对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和具体实施例尽管示出了本申请的优选实施方式，但是仅以示例的方式给出。

在以下描述中，本文提供的任何范围包括该范围内的所有值。

还应注意的是，术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用(即，意指替代物中的一个、两个或它们的任意组合)，除非上下文中另有说明。

并且，在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中另有说明。

术语“包括”、“具有”、“包含”和它们的变体被同义地使用并且被解释为非限制性的。

本文所用术语“其组合之一”是指该术语之前的所列项目的所有可能的组合之一。例如，“A、B、C或其组合之一”旨在指代以下任何一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC。类似地，本文所用术语“其组合”是指该术语之前的所列项目的所有可能的组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在指代以下所有：A、B、C、AB、AC、BC和ABC。

具体实施方式

本发明提供了用于裂解植物样品的改进的裂解方法，其从各种植物样品中所包含的微生物中有效地释放微生物核酸。总产量高，并且释放的核酸包含大量的微生物核酸，因此可用于后续的分离和分析。本文所公开的技术允许以高产量从植物样品中获得DNA，其中所获得的DNA不仅以良好的产量包含植物DNA，而且还包含大量的微生物DNA，因此可用于分析。

此外，本文所述的方法允许从植物样品中分离核酸，并同时从分离的核酸中去除抑制剂，从而允许对分离的核酸进行有效的下游分析。

根据第一方面的方法

(ii)由多个尺寸为1mm或更小的破碎颗粒来提供第二类型。

现在将详细描述各个步骤和优选实施方式。

根据本公开的方法将植物样品在液体裂解组合物中机械破碎。机械破碎中使用至少两种固体破碎颗粒。将一个或多个破碎颗粒如本文进一步描述的那样搅动、例如混合或涡旋，以便在接触时对植物样品和所包含的微生物施加破坏力。植物样品优选被匀浆。

第一类型和第二类型的固体破碎颗粒优选不仅在尺寸上、而且在形状和/或材料上彼此不同。优选地，用作第一类型的一个或多个破碎颗粒不是球形的并且具有至少一个不连续部分(优选边缘)，并且用作第二类型的多个颗粒基本上是球形的。

第一类型的固体破碎颗粒

为了机械破碎植物样品，使用至少一个固体破碎颗粒作为第一类型。

用作第一类型的至少一个破碎颗粒是非球形的，并且优选具有不规则形状。一个重要的优点在于用作第一类型的一个或多个破碎颗粒是非球形的。

在一个特别优选的实施方式中，用作第一类型的一个或多个破碎颗粒的表面具有至少一个不连续部分，特别优选边缘或峰。根据一个实施方式，所使用的破碎颗粒具有一个或多个斜角边缘。不连续部分提供以下优点：它可以用于在要破碎的植物材料上施加不规则的、优选是点或线的冲击。它还允许颗粒与植物材料之间的接触具有随机性质。不连续部分导致颗粒的运动与球形颗粒的运动相比更加不规则，并且可用于更加随机地攻击要破碎的植物材料。当不连续部分、如边缘或峰撞击要破碎的植物材料时，破坏力会增大。这甚至允许有效地破碎非常多种多样的植物材料，从而允许破碎许多不同的植物样品种类。如所公开的，可以使用单个这样的破碎颗粒作为第一类型。

在一个优选的实施方式中，颗粒的表面包含第一部分并包含第二部分，由此第一部分和第二部分通过形成边缘而相遇。优选地，边缘沿着一条线延伸。线可以是圆或弧。线也可以是直线。在一个优选的实施方式中，第一部分是截头圆锥体的表面，第二部分是截头圆锥体的表面。优选地，在第一部分是截头圆锥体的表面并且第二部分是截头圆锥体的表面的实施方式中，两个圆锥体均以其较大的底部彼此抵靠，在较大的底部相遇处形成边缘，较大的底部优选具有相同直径。颗粒优选具有一条对称线，在优选实施方式中仅具有一条对称线。优选地，颗粒围绕对称线具有旋转对称性。边缘可以以倾斜的中央凸缘的形式提供，例如图6至8所示。

用作第一类型的一个或多个颗粒可以具有由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分。

颗粒可以具有尖端。在一个实施方式中，尖端是截头圆锥体。根据一个实施方式，提供尖端的截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上。在该实施方式中，由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分可以抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上。在一个实施方式中，由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分是半球。优选为球锥的这种破碎颗粒的一个实施方式如图6所示。可以使用至少一个这种颗粒作为第一类型。

在一个实施方式中，颗粒包括至少两个尖端，其中优选地，两个尖端都是截头圆锥体。根据一个实施方式，提供第一尖端的截头圆锥体的较大的底部抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且提供第二尖端的截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上。具有两个尖端的这种颗粒的一个实施方式如图7所示。可以使用至少一个这种颗粒作为第一类型。

在一个实施方式中，颗粒具有两个子部分，其中每个子部分由球或椭圆的一块或一部分组成。在该实施方式中，由球或椭圆的一块或一部分组成的第一子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且由球或椭圆的一块或一部分组成的第二子部分抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上。具有两个半球的这种颗粒的一个实施方式如图8所示。可以使用至少一个这种颗粒作为第一类型。

用于破碎的用作第一类型的非球形颗粒可以具有一个或多个不连续部分、如边缘。它们可以是实心圆锥体、圆柱体、立方体、三角形、矩形形式和类似的合适几何形式。另一个例子是具有斜边的对角线。根据一个实施方式，用作第一类型的至少一个破碎颗粒具有不规则形状，并且可以选自球锥和卫星状(形状如土星、行星或UFO)，用于在将混合力或研磨力施加到本发明组合物中的植物样品上时实现植物组织材料的破碎。采用球锥对破碎植物样品特别有效，因此是优选的。应当考虑不影响或破坏所释放的细胞组分或分析物来选择固体破碎颗粒。

为了实现植物材料的充分破碎和匀浆、以及所需的核酸的无损释放以进行分离，优选用作第一类型的一个或多个固体破碎颗粒是固体惰性颗粒，即由不与组织材料反应、不与组合物的任何试剂反应、并且在任何情况下都不与基于破碎而释放的所需核酸反应的材料制成的颗粒。特别优选在所采用的裂解条件下，所释放的核酸不能吸附或粘附在用作第一类型的惰性固体破碎颗粒上。合适的惰性材料包括例如惰性金属、钢、不锈钢、塑料和陶瓷。优选地，用作第一类型的至少一个破碎颗粒由金属制成。优选地，其由钢、不锈钢、钨或其他重金属制成。其他例子有源于钽、铂等的金属和合金。钢材包括但不限于碳钢、不锈钢和铬钢。优选不锈钢之类的钢。其他合适的惰性破碎材料是从市售的惰性破碎颗粒中已知的。也可以使用一个或多个破碎颗粒的混合物，即，使用不同形式和/或由不同惰性材料制成的破碎颗粒作为第一类型。

进一步优选的是，用作第一类型的一个或多个破碎颗粒表现出足够的硬度，从而在碾磨或研磨过程中不发生磨损。

在一个实施方式中，用作第一类型的一个或多个非球形破碎颗粒的密度在选自5.0g/cc～20g/cc、5.5g/cc～15g/cc、6g/cc～12g/cc和6g/cc～10g/cc的范围内。

为了达到足够的破坏力以有效地将植物样品破碎、特别是匀浆，用作第一类型的破碎颗粒应当优选地具有相对大的尺寸。这是有利的，并且允许以高产量从各种植物样品种类中分离核酸、如DNA。

用作第一类型的一个或多个固体破碎颗粒的尺寸至少为1.5mm。其尺寸可以为至少2mm、至少2.5mm或至少3mm。此外，用作第一类型的一个或多个破碎颗粒可以具有至少3mm(≥3mm)、至少3.5mm或优选至少4mm的尺寸。用作第一类型的至少一个固体破碎颗粒可以具有至少4.5mm或至少5mm的尺寸。

用作第一类型的一个或多个破碎颗粒可以具有最大15mm、例如最大12mm、最大10mm或最大8mm的尺寸。

用作第一类型的一个或多个破碎颗粒可以具有1.5mm～15mm、例如2mm～15mm、2.5mm～15mm、3mm～15mm或4mm～15mm的尺寸。颗粒还可以具有1.5mm～12mm、例如2mm～12mm、2.5mm～12mm、3mm～12mm或4mm～12mm的尺寸。用作第一类型的一个或多个破碎颗粒还可以具有1.5mm～10mm、例如2mm～10mm、2.5mm～10mm、3mm～10mm或4mm～10mm的尺寸。用作第一类型的一个或多个破碎颗粒还可以具有1.5mm～7mm、例如2mm～7mm、2.5mm～7mm、3mm～7mm、3.5mm～7mm或4mm～7mm的尺寸。最优选3mm～7mm或4mm～7mm的尺寸。使用不止一个破碎颗粒作为第一类型的情况下，也可以使用该范围内的不同尺寸的破碎颗粒的混合物。

用作第一类型的一个或多个破碎颗粒的给定尺寸表示相应颗粒的两个相对点之间的最长距离。如所讨论的，优选使用在其表面具有至少一个不连续部分的不规则形状的颗粒、如卫星状或球锥作为第一类型。这里，两个相对点之间的最长距离通常是围绕此类颗粒的球形或球锥形部分的“土星状环”的直径。

取决于用作第一类型的一个或多个破碎颗粒的尺寸，可以使用一个或多个破碎颗粒。在非常大的颗粒的情况下，仅用一个颗粒(特别是一个球锥)就可以实现分析物的破碎和保存的理想结果。特别优选使用一个、即单个破碎颗粒作为第一类型。如本文所述，优选使用单个球锥来破碎植物样品材料。

优选的市售的不规则形状的颗粒、球锥形或卫星形的颗粒的示例具有以下尺寸：

表I

其中，钢球锥的一半是半球形(球)，另一半是圆锥体，两者都由倾斜的中央凸缘(环)隔开。在图中提供了一个球锥的例子。

如本文所讨论的，用作第一类型的至少一个固体破碎颗粒优选为重固体装置。根据一个实施方式，固体破碎颗粒的重量为至少300mg、例如至少400mg、至少500mg、至少600mg或至少700mg。在实施方式中，固体破碎颗粒的重量在300mg～1500mg、400mg～1250mg、500mg～1000mg和600mg～900mg的范围内。

优选500mg～1000mg或600mg～900mg的重量。如果将不规则形状的单个破碎颗粒(例如球锥)作为第一类型用于机械破碎，则尤其如此。如此重的破碎颗粒还可以具有1mm～10mm、例如1.5mm～9mm、2mm～8mm、2.5mm～7mm、3mm～7mm或4mm～7mm的尺寸。最优选的是尺寸为3mm～7mm、优选4mm～7mm，并且重量为500～1000mg、优选600mg～900mg。用作第一类型的不规则形状的破碎颗粒优选是球锥。如本文所讨论的，使用单个球锥是有利的。

如所公开的，优选使用单个非球形破碎颗粒(例如具有在3mm～7mm、优选4mm～7mm范围内的尺寸和500～1000mg、优选600mg～900mg的重量)、如单个球锥作为第一类型。

第二类型的固体破碎颗粒

与第一类型组合使用的第二类型的固体破碎颗粒由多个尺寸为1mm或更小的破碎颗粒来提供。因此，第二类型的颗粒比第一类型的颗粒小。此外，使用多个这种颗粒作为第二类型。第二类型的破碎颗粒特别支持植物样品中所包含的微生物的有效裂解，所述微生物例如是可能存在于植物样品之上、周围或内部的细菌和/或真菌。如在实施例中进一步证明和解释的，第一和第二类型的颗粒的组合使用提供了高核酸产量，其中进而，所包含的微生物核酸的量得到改善。

用作第二类型的多个颗粒的颗粒基本上是球形的。本领域中使用的常规珠粒通常被描述为“基本上”是球形的，因为那些珠粒不一定是数学上完美的球，而是可能包括影响其形状的较小缺陷。如本文中所讨论的，通过将一个或多个较大的非球形破碎颗粒作为第一类型(如上所述，例如球锥或类似物)与多个较小的基本上为球形的破碎颗粒的组合使用，对于总DNA产量和微生物核酸(例如细菌DNA)的产量提供了特别有利的结果。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒的颗粒是晶体颗粒。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒包含以下物质或者由以下物质构成：锆、锆石(硅酸锆)、氧化锆(二氧化锆)、钇稳定的锆、石英、氧化铝、碳化硅、陶瓷、玻璃(例如二氧化硅玻璃或二氧化硅)或上述物质的组合。根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒的颗粒基本上是球形的，并且包含以下物质或者由以下物质构成：锆、锆石(硅酸锆)、氧化锆(二氧化锆)或钇稳定的锆。根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒的颗粒由相同材料制成。

用作第二类型的多个破碎颗粒的颗粒比第一类型小，尺寸为1mm或更小。用作第二类型的一个或多个破碎颗粒的给定尺寸表示相应颗粒的两个相对点之间的最长距离。因为第二类型的颗粒基本上是球形的，所以这就是直径。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒的尺寸在选自0.05mm～0.9mm、例如0.07mm～0.8mm、0.08mm～0.75mm和0.09mm～0.7mm的范围内。如所讨论的，颗粒优选是球形的。供应商给出的珠粒尺寸通常是中值(平均值)。因为球形珠粒通常根据其尺寸来筛分，所以珠粒尺寸可能在所列值的+/-10％之间变化。如本文中所讨论的，可以使用具有至少两种不同尺寸的多个颗粒，但是其中，用作第二类型的颗粒的尺寸小于1mm，并且优选全部都落在给定范围内。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒具有至少两种不同的尺寸，其中(i)第一颗粒尺寸的平均值在选自0.05mm～0.25mm的范围内，并且(ii)第二颗粒尺寸的平均值在选自0.3mm～0.9mm的范围内。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒具有至少两种不同的尺寸，其中(i)第一颗粒尺寸的平均值在选自0.05mm～0.25mm、0.07mm～0.2mm、0.08mm～0.175mm和0.9mm～0.15mm的范围内，并且(ii)第二颗粒尺寸的平均值在选自0.3mm～0.9mm、0.35mm～0.8mm、0.4mm～0.7mm和0.45mm～0.6mm的范围内。合适且优选的实施方式如上所述。如所讨论的，用作第二类型的多个颗粒可以由相同材料制成。在一个实施方式中，使用两种不同尺寸的氧化锆珠粒作为第二类型。根据一个实施方式，将第一尺寸的颗粒和第二种类的颗粒以1:2～2:1、优选1:1的比例混合。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒基本上是球形的，并且包含以下物质或者由以下物质构成：锆、锆石(硅酸锆)、氧化锆(二氧化锆)或钇稳定的锆，并且平均尺寸在0.08mm～0.7mm、优选0.09mm～0.6mm的范围内。优选地，使用锆珠粒。

根据一个实施方式，用作第二类型的多个颗粒的颗粒的密度为至少2.0g/cc、例如至少2.5g/cc、至少3.0g/cc、至少3.5g/cc、至少4.0g/cc、至少4.5g/cc、至少5.0g/cc或至少5.5g/cc。其密度可以在选自2.0g/cc～15g/cc、例如2.5g/cc～12g/cc、3.0g/cc～10g/cc、3.5g/cc～9g/cc、4.0g/cc～8g/cc、4.5g/cc～7.5g/cc和5g/cc～7g/cc的范围内。

用作第二类型的多个颗粒的合适的量可以由本领域技术人员按照本文和实施例给出的指导来确定。根据一个实施方式，相对于每毫克植物材料使用5mg～500mg第二类型的颗粒。

根据一个实施方式，使用以下破碎颗粒的组合来机械破碎植物样品：

(i)使用至少一个非球形破碎颗粒作为第一类型，其具有以下特征：

-其具有包括第一部分和第二部分的表面，由此第一部分和第二部分通过形成边缘而相遇，其中第一部分是截头圆锥体的表面，第二部分是截头圆锥体的表面，其中两个圆锥体均以其较大的底部彼此抵靠，在较大的底部相遇处形成边缘，较大的底部具有相同直径，并且其中至少一个非球形颗粒选自具有以下特征的颗粒的组：

(aa)该颗粒包括至少一个尖端，该尖端是截头圆锥体，其中提供尖端的截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且其中颗粒包括由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分，该子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，其中优选地，由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分是半球，

(bb)该颗粒包括至少两个尖端，其中两个尖端都是截头圆锥体，其中截头圆锥体的较大的底部抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上，

(cc)该颗粒包括两个子部分，其中每个子部分由球或椭圆的一块或一部分组成，其中由球或椭圆的一块或一部分组成的第一子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且由球或椭圆的一块或一部分组成的第二子部分抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上，和/或

(dd)该颗粒包括两个半球，其中第一半球抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且第二半球抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上；

-其重量为至少300mg，优选至少400mg，更优选至少500mg；并且

-其尺寸为至少1.5mm，优选至少2mm，更优选至少3mm；

以及

(ii)由多个基本上为球形的氧化锆珠粒来提供第二类型，其尺寸优选在0.08mm～0.7mm、更优选0.09mm～0.6mm的范围内。用作第一类型的至少一个非球形破碎颗粒优选由钢、不锈钢、钨或其他重金属制成，如上文中所讨论的。如本文所公开的，用作第二类型的多个颗粒可以具有落在该宽范围内的至少两种不同的亚尺寸。在上文中已进行了详细描述。

根据一个实施方式，除了第一和第二类型的破碎颗粒外不使用其他类型的颗粒。

采用第一和第二类型的颗粒的机械破碎

可以依次或同时用第一和第二类型的破碎颗粒进行植物样品和植物样品中所包含的微生物的破碎。优选同时进行。

第一和第二类型的破碎颗粒可以包含在容器中，其优选还包含裂解溶液。在一个实施方式中，裂解溶液和第一和/或第二类型的破碎颗粒包含在容器的同一隔室中，并以组合物的形式提供。欲从中分离核酸的植物样品可以添加到容器中。然后关闭容器，并且可以开始机械破碎。如果第一和第二类型不在同一容器中提供，则缺少的那种可以随后添加，以允许用两种颗粒同时或依次进行破碎。

用于接收组织材料的容器可以是任何合适的容器或反应容器，其优选相对于在破碎处理中使用的试剂是惰性的，其表现出足够的机械稳定性以承受破碎颗粒的力而不会损坏或磨损，其具有适合接收植物样品材料、裂解溶液和一个或多个所选的破碎颗粒的尺寸，并且仍然提供合适的空间以允许插入的成分的搅动和移动来进行植物材料的破碎，进而进行植物材料的裂解，其可以适当地与用于通过破裂颗粒进行组织材料的碾磨或研磨的装置一起使用。合适的容器或反应容器(管)是已知的并且通常是可获得的。

根据一个实施方式，将植物样品匀浆以提供裂解物。如实施例所示证明的，本技术有效地匀浆多种植物样品。

采用第一和/或第二类型的破碎颗粒的机械破碎可以包括使用珠子打浆和/或匀浆装置。合适的装置可以包括但不限于高性能混合器或高速混合器，以及低功率混合器如普通实验室涡旋仪、台式涡旋仪或普通实验室振荡器(例如卧式振荡器)。破碎可以使用带有珠管适配器或搅拌装置的涡旋混合器来进行，如TissueLyzer II(凯杰公司(QIAGEN))、AMBION^TM涡旋仪适配器(Vortex Adapter)(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)和Omini Bead Rupter匀浆器(欧米尼国际公司(OMNIInt’l)，左治亚州肯尼索)、以及OPS诊断公司(OPS Diagnostics)的各种匀浆器。高功率或高性能混合器通常以15～60Hz的频率工作。低功率混合器、尤其如普通涡旋仪通常以150至最高3200rpm的力工作。例如由低功率混合器或涡旋仪施加降低的机械功率可以有利于保持所释放的核酸的品质并避免核酸的损坏或变质。在一个实施方式中，使用高速振荡器(例如15～60Hz)。在实施方式中，其达到150～2500、例如180～1800范围内的振荡数/分钟。对机械破碎而言的合适且有利的持续时间可以由技术人员确定。例如，一个破碎周期可以包括用一个或多个破碎颗粒进行的机械破碎，持续30sec～20min、1min～15min、1.5min～10min和2min～7min。如果需要，可以进行两个或多个破碎周期，以实现裂解物的良好匀浆。

优选的裂解条件

液体裂解组合物优选包含至少一种离液剂。根据一个实施方式，液体裂解组合物是溶液，优选水溶液。固体破碎颗粒可以包含在溶液中。

根据一个实施方式，离液剂是离液盐。

根据一个实施方式，离液剂选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合。这种离液剂可以用于产生裂解物。

根据一个实施方式，离液剂选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂及其组合。这种离液剂特别适合于产生裂解物。

根据一个实施方式，离液剂是离液盐。根据一个实施方式，裂解组合物仅包含一种离液剂，并且优选仅包含NaSCN作为离液剂。

NaSCN、Na₂CO₃、KSCN、NH₄SCN、LiSCN、LiClO₄、硫酸胍是相对温和的离液剂，这对于在实施方式中将这种温和裂解与使用第一和第二类型的破碎颗粒的机械破碎相结合的方法是有利的。优选地，相对温和的离液剂是NaSCN。

可以在液体裂解组合物中用作离液剂的相对温和的离液剂可以包括具有与可溶性蛋白质中弱于Mg²⁺的阳离子配对的强阴离子SCN^-的盐；具有与可溶性蛋白质中弱于Mg²⁺的阳离子配对的强阴离子ClO₄ ^-的盐；以及具有与可溶性蛋白质中强于NH₄ ⁺的阳离子配对的弱阴离子CO₃ ^2-的盐。

相对温和的离液剂(例如NaSCN)在较强的离液剂(如GuSCN或GuCl)和较弱的离液剂(如RbSCN)之间取得了理想的平衡。侵蚀性较小的离液剂可以在破碎过程中用破碎颗粒有效地溶解生物分子，使其可用于下游分离。另一方面，强离液剂和去污剂(例如SDS)可以实现完全的细胞裂解，但是以生物分子降解(例如核酸降解)为代价。优选与本方法结合使用的侵蚀性较小的离液剂在溶解生物分子(例如核酸)的同时最小化核酸降解的能力方面是独特的。因此，将这种温和的离液剂与使用本文所述的两种破碎颗粒的机械样品破碎过程相结合是特别有利的，并且提供了对现有技术方法的改进。

液体裂解组合物和/或裂解混合物(包含植物样品)中的至少一种离液剂的浓度可以为2.5M或更小、例如2M或更小、1.75M或更小、1.5M或更小、1.3M或更小、1.2M或更小或1.125M或更小。液体裂解组合物(其优选为裂解溶液和/或裂解混合物)中的至少一种离液剂的合适浓度可以在选自0.5～2.5M、例如0.6M～2M、0.7M～1.75M、0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内。如果在液体裂解组合物(其优选为裂解溶液)中存在多种离液剂，则液体裂解组合物、分别为裂解溶液中的离液剂的总浓度可以并且优选地在上述范围内。对于裂解混合物也是如此。确定浓度时不考虑固体破碎颗粒。

离液剂优选为如上所述的硫氰酸盐，更优选NaSCN。发现上述浓度特别适用于这种温和的硫氰酸盐、如NaSCN。特别优选的是液体裂解组合物中和/或裂解混合物中的NaSCN浓度在0.7M～1.75M、例如0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内。

根据一个实施方式，该方法还包括添加至少一种磷酸盐。如果使用这种抑制剂去除剂，则在使裂解样品与至少一种抑制剂去除剂接触之前，添加至少一种磷酸盐(见下文)。不希望受到理论的束缚，据信游离磷酸根基团(PO₄ ^3-)通过与抑制剂去除剂竞争性相互作用来防止或减少随后使用的抑制剂去除剂(例如AlCl₃)与核酸的磷酸二酯基之间的复合物形成。

优选地，在机械破碎过程中存在至少一种磷酸盐。优选地，至少一种磷酸盐包含在液体裂解组合物(如上所述，其优选为裂解溶液)中。因此，在有利的实施方式中，液体裂解组合物包含至少一种离液剂和至少一种磷酸盐。根据一个实施方式，液体裂解组合物包含硫氰酸钠和磷酸盐。

示例性的磷酸盐包括磷酸二氢盐、磷酸氢盐和磷酸盐、以及含有一个或多个游离磷酸根基团的其他化合物，例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸二氢锂、磷酸氢二锂、磷酸锂、磷酸三钠、聚(乙烯基膦酸)钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、三磷酸钠、聚磷酸钠、其他含磷的氧阴离子及其组合。磷酸盐中的阳离子部分包括但不限于铵、钠、钾和锂。在一个实施方案中，阳离子部分由碱金属离子提供，所述碱金属离子优选选自钠、钾和锂，更优选钠。优选地，磷酸盐是磷酸氢盐，更优选为磷酸氢二钠。

液体裂解组合物、裂解混合物(包含植物样品)和/或裂解样品中的至少一种磷酸盐的浓度可以选自0.05～0.75M、0.06M～0.6M、0.075M～0.5M、0.1M～0.3M和0.1M～0.25M，或者可以为0.125M～0.2M。如本文所公开的，优选在液体裂解组合物中包含至少一种磷酸盐。液体裂解组合物(其优选为裂解溶液)中的至少一种磷酸盐的浓度优选在0.1M～0.3M或0.1M～0.2M的范围内。

根据一个实施方式，液体裂解组合物包含硫氰酸钠和至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

根据一个实施方式，液体裂解组合物和/或液体裂解混合物以选自0.7M～1.75M、0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的浓度包含硫氰酸钠，并且以选自0.075M～0.3M、0.1～0.25M和0.1M～0.2M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。优选地，至少一种磷酸盐、优选磷酸氢二钠的浓度在0.1M～0.3M的范围内。

根据一个实施方式，液体裂解组合物和/或液体裂解混合物以0.7M～1.75M的浓度包含硫氰酸钠，并且以0.075M～0.3M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

根据一个实施方式，液体裂解组合物和/或液体裂解混合物以0.75M～1.5M的浓度包含硫氰酸钠，并且以0.1M～0.3M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

根据一个实施方式，液体裂解组合物和/或液体裂解混合物以0.8M～1.25M的浓度包含硫氰酸钠，并且以0.1M～0.25M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

裂解组合物(例如裂解试剂)可以在添加植物样品之前与破碎颗粒组合。然而，植物样品也可以在添加第一和/或第二类型的破碎颗粒之前与裂解试剂接触。

裂解试剂(其优选为裂解溶液)可以包含：

(i)一种或多种离液剂，选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合；以及

(ii)一种或多种磷酸盐。

上面已经描述了离液剂和至少一种磷酸盐的细节，并参考相应的公开内容。以上针对液体裂解组合物所描述的浓度也适用于裂解试剂(其优选为裂解溶液)。因此，根据一个实施方式，裂解试剂中的至少一种离液剂的浓度可以为2.5M或更小、例如2M或更小、1.75M或更小、1.5M或更小、1.3M或更小、1.2M或更小或1.125M或更小。裂解试剂中的至少一种离液剂的合适浓度可以在选自0.5～2.5M、例如0.6M～2M、0.7M～1.75M、0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内。如果裂解试剂中存在多种离液剂，则裂解试剂中的离液剂的总浓度可以并且优选地在上述范围内。离液剂优选为如上所述的硫氰酸盐，更优选NaSCN。特别优选的是裂解试剂中的NaSCN浓度在0.7M～1.75M、例如0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内。裂解试剂中的至少一种磷酸盐的浓度可以选自0.05～0.75M、例如0.06M～0.6M、0.075M～0.5M、0.1M～0.3M和0.1M～0.25M。参考以上公开内容。

根据一个实施方式，裂解试剂以选自0.7M～1.75M、0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的浓度包含硫氰酸钠，并且以选自0.075M～0.3M、0.1～0.25M和0.1M～0.2M、或0.125M～0.2M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。优选地，至少一种磷酸盐、优选磷酸氢二钠的浓度在0.1M～0.3M的范围内。参考以上公开内容。

优选地，裂解试剂包含磷酸氢二钠和硫氰酸钠。

一个或多个固体破碎颗粒可以包含在裂解试剂中。如本文所述，裂解试剂可以包含在容器中，该容器另外包含第一和/或第二类型的固体破碎颗粒。固体破碎颗粒可以包含在、例如浸渍在裂解试剂中。该实施方案是有利的，因为可以将植物样品添加至包含至少一种离液剂和第一和/或第二类型的破碎颗粒的液体裂解组合物中，并且可以开始机械破碎。

在某些其他实施方式中，液体裂解组合物不包含任何去污剂、如SDS。

液体裂解组合物(其可以是裂解溶液)可以任选地进一步含有一种或多种缓冲物质。

液体裂解组合物的pH可以为至少3、例如至少4或至少5。例如，液体裂解组合物的pH可以在pH 3～pH 10、例如pH 4～pH 9和pH 5～8.0的范围内。

液体裂解组合物(其优选为裂解溶液)可以包含一种或多种离液剂和一种或多种磷酸盐、基本上由一种或多种离液剂和一种或多种磷酸盐构成、或者由一种或多种离液剂和一种或多种磷酸盐构成，离液剂和磷酸盐均如上所述可以是水溶液。为了机械破碎，有如上所述的固体破碎颗粒包含在液体裂解组合物(其可以是裂解溶液)中。优选地，一种或多种相对温和的离液剂包含NaSCN或者是NaSCN。一种或多种磷酸盐优选包含磷酸氢二钠或者是磷酸氢二钠。

示例性的优选裂解溶液包含0.5～2M的NaSCN和0.1～0.2M的Na₂HPO₄、基本上由0.5～2M的NaSCN和0.1～0.2M的Na₂HPO₄构成、或者由0.5～2M的NaSCN和0.1～0.2M的Na₂HPO₄构成。

处理裂解物的其他优选步骤

下面描述用于处理裂解物的其他任选但优选的步骤：

澄清裂解物

本方法可以进一步包括澄清裂解物。如本文中所讨论的，破碎植物样品提供了裂解混合物，其可以包含来自植物样品的固体组分和包含所释放的核酸的液体级分。如本文所公开的，由使用的裂解化学方法支持的机械破碎有利地允许有效地匀浆不同种类的植物样品。优选从液体级分中分离固体组分，并进一步处理作为裂解样品的液体级分。

裂解物澄清步骤可以包括将在将植物样品破碎后得到的裂解混合物分离为固体级分和液体级分。液体级分包含核酸(并且可以仍包含一些植物颗粒)，并且液体级分作为裂解样品可以进一步处理。固体组分可以被舍弃。液体级分的分离可以通过沉降、离心或过滤、优选通过离心来辅助。也可以采用这些方法的组合。然后可以将分离的液体级分(例如上清液)作为裂解样品进一步处理。

使裂解样品与至少一种沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物

本方法还可以包括使(任选地澄清过的)裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物。

裂解样品可以与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物。该步骤可以包括例如通过涡旋来搅动混合物。

蛋白质沉淀剂

根据一个实施方式，至少一种蛋白质沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠和乙酸铯。

一些沉淀剂(例如乙酸铵)可以在相对高的浓度(例如，在包含裂解样品、沉淀剂和如下文所述的一种或多种抑制剂去除剂的混合物中以1～2M的浓度)下起到蛋白质沉淀剂的作用，但是在相对低的浓度(例如，比起到蛋白质沉淀剂的作用时的浓度低5至15倍的浓度)下起到分子筛的作用。优选使用乙酸铵。

根据一个实施方式，混合物中的至少一种沉淀剂的浓度在选自0.1～4M、例如0.2M～3M、0.3M～2.5M、0.4M～2.25M、0.5M～2M和0.6M～1.75M的范围内。根据一个实施方式，乙酸铵在这样的浓度范围内使用，优选以落在0.5M～2M或0.6M～1.75M范围内的浓度存在于步骤(b)的混合物中。

抑制剂去除剂

示例性的抑制剂去除剂包括硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁、氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)及其组合。

根据一个实施方式，抑制剂去除剂包含三价阳离子。优选地，抑制剂去除剂包括氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)及其组合。

因此，根据一个实施方式，至少一种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合，并且其中优选地，抑制剂去除剂是氯化铝。

特别优选使用三价铝盐、如氯化铝。使用氯化铝是有利的，因为其可以在较宽的pH范围内使用。

如本文所讨论的，可以添加、优选在样品裂解过程中添加至少一种磷酸盐。其起到防止核酸、特别是DNA从混合物中沉淀、以防止核酸材料的损失的目的。

混合物的pH可以为至少3、例如至少4或至少5。例如，步骤(b)中的pH可以在pH 3～pH 10、例如pH 4～pH 9和pH 5～8.0的范围内。

根据一个实施方式，混合物中的至少一种抑制剂去除剂的浓度在选自1～150mM、例如5mM～125mM、10mM～100mM、15mM～75mM和20mM～65mM的范围内。如以上所讨论的，特别优选使用三价铝盐、如氯化铝，并且在一个实施方式中以这样的浓度使用。特别优选的是选自15mM～75mM、例如20mM～65mM或25mM～55mM的氯化铝浓度。

裂解样品包含与一种或多种抑制剂去除剂形成复合物的污染物或抑制剂，该复合物通过一种或多种抑制剂去除剂而沉淀并被去除。如本文所述，植物样品通常包含包括多糖和多酚化合物在内的大量抑制剂。这种抑制剂在裂解样品中仍然存在。本方法允许有效地去除抑制剂，从而允许分离高品质的核酸、如DNA。

根据一个实施方式，沉淀剂是乙酸铵，抑制剂去除剂是氯化铝。

蛋白质沉淀步骤和抑制剂去除步骤可以依次实施。然而优选地，它们同时实施。

根据一个优选的实施方式，裂解样品在步骤(b)中与包含至少一种沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂的组合物接触。如所讨论的，裂解样品优选为澄清的裂解物。

一种或多种沉淀剂和一种或多种抑制剂去除剂可以以组合物的形式添加，所述组合物可以呈固体形式也可以呈溶液形式，优选呈溶液形式。优选地，组合物是水溶液。其可以添加至裂解样品中。

根据一个实施方式，组合物包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：

(i)一种或多种沉淀剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合，

(ii)一种或多种抑制剂去除剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合；以及

(iii)任选的水。

在其中组合物是溶液的实施方式中，添加的溶液中的一种或多种沉淀剂的总浓度在0.5M～10M、1～8M或1.5～7.5M、优选1M～6M、1.5M～5.5M、2M～5M、2.5～4.5M和3M～4M的范围内。当沉淀剂起到蛋白质沉淀剂的作用时，这是特别合适的。沉淀剂可以是乙酸铵，并且当使用乙酸铵时，所述浓度是特别合适的。组合物可以添加至裂解样品中。

在其中组合物是溶液的实施方式中，添加的溶液中的一种或多种抑制剂去除剂的总浓度在10～500mM、例如25mM～400mM、50mM～350mM、75mM～300mM、90mM～250mM、优选50mM或100mM～200mM、例如50mM～175mM或75mM～150mM的范围内。如以上所讨论的，特别优选使用三价铝盐、如氯化铝作为抑制剂去除剂，并且在一个实施方式中以这样的浓度包含在溶液中。根据一个实施方式，添加的溶液以50mM～250mM的浓度包含氯化铝。特别优选的氯化铝浓度包括50mM～200mM、50mM～175mM和75mM～150mM。

示例性的包含沉淀剂和抑制剂去除剂的优选溶液包括：

(1)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的氯化铝的溶液；

(2)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的氯化铝的溶液；

(3)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的氯化铝的溶液；

(4)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的乙酸铒(III)的溶液；

(5)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的乙酸铒(III)的溶液；

(6)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的乙酸铒(III)的溶液；

(7)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的氯化铒(III)的溶液；

(8)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的氯化铒(III)的溶液；

(9)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的氯化铒(III)的溶液；

(10)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的氯化钬的溶液；

(11)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的氯化钬的溶液；以及

(12)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的氯化钬的溶液。

根据一个实施方式，添加至裂解样品中的组合物中的沉淀剂选自乙酸铵、乙酸钠、乙酸铯或其组合，优选乙酸铵，并且抑制剂去除剂是氯化铝。

根据一个实施方式，在使裂解样品与至少一种沉淀剂接触和使裂解样品与至少一种抑制剂去除剂接触之间不进行沉淀、离心或过滤。如本文所公开的，优选同时添加沉淀剂和抑制剂去除剂，例如，通过添加包含至少一种沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂的液体组合物。

如本文所用，术语“抑制剂”特别指代任何干扰涉及从样品中分离的DNA和/或RNA的反应、并且对DNA和/或RNA的操作具有有害作用的物质。抑制剂包括例如以DNA或RNA为底物的酶促反应的抑制剂以及破坏DNA或RNA的杂交的污染物。抑制剂可以包括腐殖质。其包含与糖类、肽类和酚类连接的多环芳烃。其他示例性的抑制剂包括分解性植物材料、来自堆肥的有机化合物、酚类、酚类聚合物或低聚物、多酚、多糖和单宁。多糖抑制剂的例子包括但不限于果胶和木聚糖。如本文所讨论的，本发明方法改善了样品裂解，从而有利地增加了核酸、特别是DNA向裂解物中的释放。这种改善的裂解还可以将更多的抑制剂释放到裂解物中，因此可以如本文所述从裂解物中获得含DNA的上清液。因此，这对于有效地去除抑制剂以提供高品质的核酸来说是有利且重要的。

抑制剂去除剂能够基本上从裂解样品中去除一种或多种抑制剂。从混合物中获得液相后(见下文)，抑制剂已基本上被去除。

例如，将混合物分离为固相和液相之后，20％或更少、优选18％或更少、15％或更少、13％或更少、或10％或更少、更优选5％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的来自样品的抑制剂保留在液相中。

从混合物中获得液相

本方法还可以包括从混合物中获得液相。

在蛋白质沉淀和抑制剂去除期间或之后，产生固体组分，例如通过沉淀和络合过程。因此优选实施包括从混合物中获得液相的步骤。这又可以通过沉淀、过滤或优选离心来辅助。也可以使用这些技术的组合。

根据一个实施方式，该步骤因此包括将所提供的混合物中所包含的固体组分去除，以获得包含核酸的液相。液相可以以上清液的形式分别获得并提供。

可以对混合物进行离心、过滤、沉淀或以其他方式处理，以使其固相与其液相分离，其中一种或多种抑制剂去除剂主要(超过50％)位于固相中。固相可以以粒料的形式提供。一种或多种抑制剂去除剂与来自样品的抑制剂及其它污染材料形成复合物，该复合物在所述步骤中从液相中被沉淀出去或去除。

在某些实施方式中，多于60％、70％或80％、优选多于90％或更优选多于95％的一种或多种抑制剂去除剂在该步骤中从液相中被去除。

任选地从液相中分离核酸、优选为DNA

所得液相随后可以用于从中分离核酸。

本文所用术语“核酸”包括单链或双链核酸，并且可以选自DNA和RNA。可以采用适合于从溶液中分离DNA、RNA或两者的任何方法。适合的方法是本领域技术人员众所周知的，并且因此无需详细描述。优选地，从液相中分离的核酸是DNA。

本实施方式所实现的改进的裂解和抑制剂去除提供了一种液相，该液相包含大量包括微生物核酸在内的核酸(由于改进的裂解)并且有利地将抑制剂耗尽(由于使用了沉淀剂和抑制剂去除剂)。因此，能够以高产量和高纯度从所提供的液相中分离核酸、如DNA。基本上可以使用任何核酸分离方法以从所提供的液相中分离核酸，优选DNA。结合根据其所参考的第二方面的方法来描述示例性方法。

由本公开将认识到，该方法不需要使用苯酚和/或CTAB。因此，在实施方式中，该方法不涉及使用苯酚和/或CTAB。在实施方式中，不添加去污剂来辅助裂解。在实施方式中，该方法不涉及使用蛋白水解酶如蛋白酶K来辅助裂解。

根据第二方面的方法

(a)进行根据第一方面的裂解方法；

(b)从裂解并任选地经过进一步加工的样品中分离核酸；以及

上面已经描述了在步骤(a)中实施的裂解方法的细节和优选实施方式，并且参考相应的公开内容，其也适用于此。

此外，上面描述了用于进一步处理裂解样品的合适且优选的实施方式，并且参考相应的公开内容。优选地，步骤(a)包括：

-使(任选地澄清过的)裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；以及

-从混合物中获得液相。

可以从液相中分离核酸、例如优选为DNA。参考以上公开内容。

本文所用术语“核酸”包括单链或双链核酸，并且可以选自DNA和RNA。可以采用适合于从溶液中分离DNA、RNA或两者的任何方法。适合的方法是本领域技术人员众所周知的，并且因此无需详细描述。优选地，分离的核酸是DNA。

能够以高产量和高纯度从所提供的液相中分离核酸、如DNA。基本上，在步骤(b)中可以使用任何核酸分离方法以分离核酸、优选为DNA。

优选地，在核酸分离中使用核酸结合性固体支持物。示例性的固体支持物包括二氧化硅基质、玻璃颗粒、硅藻土、磁珠、硝化纤维素、尼龙和阴离子交换材料。固体支持物可以是疏松颗粒、过滤器、膜、纤维或织物或格栅的形式，并且包含在容器中，该容器包括管、柱，并且优选为离心柱。

为了促进或加强核酸与固体支持物的结合，可以使用结合溶液。可以在样品裂解期间(例如在裂解剂的存在下机械破碎样品之后)添加结合溶液，然后在抑制剂去除过程中使样品材料与蛋白质沉淀剂和抑制剂去除剂接触。或者，可以将结合溶液添加至抑制剂去除过程后得到的液相中。

示例性的DNA结合溶液可以包含离液剂(例如GuSCN或GuHCl)、醇(例如乙醇或异丙醇)或两者。其还可以包含缓冲物质、如Tris HCl。

在从样品中分离DNA和RNA两者的实施方式中，可以并行实施DNA分离和RNA分离。换言之，步骤(b)的液相被划分为至少两部分：一个用于DNA分离，一个用于RNA分离。DNA和RNA也可以依次分离。当目的是分离RNA时，可以在裂解步骤(a)中使用RNA酶抑制剂来保护所释放的RNA。

依次分离DNA和RNA的方法是已知的(参见例如美国专利第8,889,393号、WO 2004/108925)。优选地，使用用于结合DNA的固体支持物和用于结合RNA的固体支持物。用于结合DNA的固体支持物和用于结合RNA的固体支持物可以相同或不同。当使用相同的固体支持物来分离DNA和RNA时，可以通过调节结合混合物的成分和/或浓度来实现DNA和RNA与固体支持物的差异性结合。例如，可以先将一根硅胶离心柱用于结合DNA，而流出物可以与乙醇混合，然后将所得混合物加至第二硅胶离心柱以结合RNA(Triant和Whitehead,Journal ofHeredity 100:246-50,2009)。

与固相结合后，可以洗涤与固相结合的DNA或RNA，然后从固相洗脱。DNA洗涤溶液可以包含离液剂(例如GuHCl)、醇(例如乙醇、异丙醇)或两者。其还可以包含缓冲物质(例如Tris HCl)、螯合剂(例如EDTA(乙二胺四乙酸))和/或盐(例如NaCl)。DNA洗脱溶液可以使缓冲液(例如Tris缓冲液)或水。

RNA结合溶液可以包含醇(例如乙醇、异丙醇)和任选的另一种有机溶剂(例如丙酮)。RNA洗涤溶液可以包含以下一种或多种：缓冲物质(例如Tris HCl和Tris碱)、螯合剂(例如EDTA)、醇和盐(例如NaCl)。RNA可以用经DEPC处理的水或其他不含RNA酶的水从固体支持物上洗脱。

根据一个实施方式，至少分离DNA。根据一个实施方式，在实施该方法期间分离DNA并同时消耗RNA。此外，可以通过使用RNA酶来破坏RNA。

本方法还可以包括对在步骤中分离的核酸进行分析。这种分析分析可以包括任何常规的分析技术，例如PCR、qPCR、RT-PCR或核酸测序。通过本方法提供的DNA特别适合于测序应用，例如新一代测序。例如可以进行测序来鉴定植物微生物组。植物微生物组例如可以通过测序来确定，以观察共生和/或致病物种。

植物样品

本方法特别适合于加工各种植物样品种类。有利地，本方法可以用于不同种类的植物样品而在产量和纯度方面确保良好的结果。

术语“植物”特别指代整株植物、植物器官、植物组织、根、种子、植物细胞及其后代。植物材料包括但不限于：种子、胚胎、分生组织区域(meristematic region)、愈伤组织、叶、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、嫩枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的细胞，以及果实和花朵。

如上所述，术语“植物”也指代植物的一部分，如叶(叶片(基部、中脉、脉、边缘、先端)和叶柄(叶茎)、托叶)、茎、根(主根、侧根、根毛、根尖、根冠)、针、花朵(花萼、花丝、花药、花粉、花瓣、柱头、花柱、子房、胚珠)、果实、芽(腋芽、顶芽/顶生芽)、节、节间。例如，叶包括任何类型的叶，例如A)简单的羽状脉叶(橡树、桦木)；B)简单的掌状脉叶(甜胶)；C)羽状复脉(胡桃木)；D)掌状复叶(七叶树)；E)平行脉(草)；F)对生叶(枫木)；G)互生叶(榆木)；H)针叶：云杉(4面针－锡特卡云杉)、松木(2、3或5针束–黄松)、冷杉(扁针–铁杉)、鳞叶(红杉红木)。

根据一个实施方式，从中分离核酸的植物样品选自叶、针、根、茎和种子。此外，植物样品可以选自果实和花朵。根据一个实施方式，植物样品获自选自农业作物、如小麦、水稻、苹果、咖啡、烟草、玉米、向日葵、草等的植物。另一常见的植物样品是棉花。

可以从中分离核酸、特别是DNA的示例性常见样品包括但不限于：叶组织、例如软或纤维状叶组织、例如葡萄叶、草莓叶、棉叶、草叶、稻叶和/或薄荷叶，茎、例如番茄茎，针、例如松针，以及种子。

如果植物样品包含大量的酚类化合物，则在裂解过程中添加其他化合物以去除酚类化合物，这落在本方法的范围内。合适的例子是PVP。这对于诸如松针或草莓叶之类的样品可能是有利的。

植物样品包含或疑似包含微生物。植物样中所包含的微生物可以选自细菌和真菌，例如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、霉菌和孢子、或前述的组合。在一个实施方式中，微生物是细菌。在包含微生物的植物样品中，微生物可以存在于植物样品之上、周围或内部。微生物、如细菌可以任选地包含在根样品中、叶表面上和/或植物组织中的病变或肿瘤上。使用第一和第二类型的破碎颗粒的组合的本发明的方法在破碎各种植物样品中特别有效，从而也释放了植物样品中所包含的微生物，从而使它们可以被有效裂解。上面描述了合适的植物样品。

根据第三方面的系统

(a)液体裂解组合物、

(b)至少两种固体破碎颗粒，其中：

(ii)由多个尺寸小于1mm的破碎颗粒来提供第二类型。

上面结合根据第一方面的方法描述了第一和第二类型的固体破碎颗粒的细节以及优选的组合，并且参考相应的公开内容，其也适用于此。还结合第一方面描述了液体裂解组合物的细节，并将其作为参考。

第一和第二类型的破碎颗粒可以包含在分开的容器中或包含在同一容器中，并且优选包含在同一容器中。

根据一个实施方式，液体裂解组合物包含至少一种离液剂，优选选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合。离液剂优选为离液盐。其可以选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂及其组合。离液剂优选为NaSCN。

根据一个实施方式，裂解组合物具有以下一个或多个特征：

(i)液体裂解组合物中的至少一种离液剂的浓度选自2.5M或更小、例如2M或更小、1.75M或更小、1.5M或更小、1.3M或更小、1.2M或更小和1.125M或更小；

(ii)液体裂解组合物中的至少一种离液剂的浓度在选自0.5～2.5M、例如0.6M～2M、0.7M～1.75M、0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内；和/或

(iii)离液剂是NaSCN，液体裂解组合物中的NaSCN浓度在0.7M～1.75M、例如0.75M～1.5M或优选0.8～1.25M的范围内；

裂解系统还可以包括至少一种磷酸盐。磷酸盐优选包含在包含至少一种离液剂的裂解组合物中。根据一个实施方式，磷酸盐具有以下一个或多个特征：

(i)其是磷酸氢盐；

(ii)磷酸盐中的阳离子部分选自铵、钠、钾或锂；

(iii)其是磷酸氢二钠。

液体裂解组合物中的至少一种磷酸盐的浓度可以为0.05～0.75M。在一个实施方式中，液体裂解组合物中的至少一种磷酸盐的浓度选自0.05～0.75M、0.06M～0.6M、0.075M～0.5M、0.1M～0.3M和优选0.1～0.25M或0.15M～0.2M或0.125M～0.2M。

在一个实施方式中，液体裂解组合物包含硫氰酸钠和至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

在一个实施方式中，液体裂解组合物以选自0.7M～1.75M、0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的浓度包含硫氰酸钠，并且以选自0.075M～0.3M、0.1～0.25M和0.1M～0.2M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

在一个实施方式中，液体裂解组合物以0.7M～1.75M的浓度包含硫氰酸钠，并且以0.075M～0.3M、优选0.1～0.25M和更优选0.1M～0.2M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

裂解系统还可以包括至少一种沉淀剂。根据一个实施方式，沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠和乙酸铯，其中优选使用乙酸铵。

裂解系统还可以包括至少一种抑制剂去除剂，其优选选自氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)、硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁及其组合。

根据一个实施方式，至少一种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合，其中优选地，抑制剂去除剂是三价铝盐，例如氯化铝。

根据一个实施方式，裂解系统包括乙酸铵作为沉淀剂，并且包括三价铝盐、优选氯化铝作为抑制剂去除剂。

根据一个实施方式，沉淀剂和抑制剂去除剂包含在同一组合物、优选溶液、更优选水溶液中。根据一个实施方式，组合物具有以下一个或多个特征：

(aa)在步骤(b)中添加的溶液中的一种或多种沉淀剂的总浓度在0.5M～10M、例如1～8M或1.5～7.5M、优选1M～6M、1.5M～5.5M、2M～5M、2.5～4.5M和3M～4M的范围内；

(bb)在步骤(b)中添加的溶液中的一种或多种抑制剂去除剂的总浓度在10～500mM、例如25mM～400mM、50mM～350mM、75mM～300mM、90mM～250mM、优选50mM或100mM～200mM、例如50mM～175mM或75mM～150mM的范围内；

(cc)其包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：

(ii)一种或多种抑制剂去除剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合，以及

(iii)任选的水。

还结合根据第一方面的方法描述了其他实施方式。

根据一个实施方式，(i)由单个固体破碎颗粒来提供第一类型，并且(ii)由多个尺寸优选在0.08mm～0.7mm、更优选0.09mm～0.6mm的范围内的氧化锆珠粒来提供第二类型。

裂解系统还可以包括核酸结合性固体支持物。

裂解系统还可以包括选自DNA结合溶液、DNA洗涤溶液、DNA洗脱溶液、RNA结合溶液、RNA洗涤溶液和RNA洗脱溶液的一种或多种溶液。

本发明还涉及这种裂解系统(优选为试剂盒)在裂解包含或疑似包含微生物的植物样品中的用途。

根据第四和第五方面的用途

根据第四方面，本公开涉及根据第三方面的系统在根据第一方面的方法中的用途。参考以上公开内容。合适的植物样品也在上文中进行了描述，并且参考以上公开内容。

根据第五方面，本公开涉及根据第三方面的系统在裂解植物样品并从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸中的用途，其中，用户可以使用(i)第一和第二类型、或者(ii)第二类型的破碎颗粒进行植物样品裂解，以从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸、优选为DNA。这允许根据本方法的差异裂解。

本发明不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施方式的实践或测试。数值范围包括限定该范围的端值。本文提供的标题不是本发明的各种方面或实施方式的限制，可以参考说明书整体理解本发明的各种方面或实施方式。上文中已详细描述了本发明的方面的合适且优选的实施方式、例如各个步骤以及所使用的组分和试剂，并且本领域技术人员将理解，关于不同方面中的各个步骤、所使用的组分和试剂的公开内容可以相互组合。由各个特征的相应组合产生的主题也属于本公开的范畴。

本文所用术语“溶液”特别指代液体组合物，优选水性组合物。溶液可以是只有一个相的均质混合物，但是包含固体成分、特别是少量的固体成分的溶液也落在本发明的范围内。

对“本公开”和“本发明”等的引用包括本文所教导的单个或多个方面，等等。本文教授的方面由术语“发明”涵盖。

根据一个实施方式，本文描述的主题在方法的情况下包括某些步骤，或者在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包括某些成分是指由相应的步骤或成分构成的主题。优选选择并组合本文描述的优选实施方式，并且由优选实施方式的相应组合产生的具体主题也属于本公开的范畴。

附图说明

图1显示将不同的固体破碎颗粒及其组合用于植物样品的机械破碎、从而从松针样品中得到的总DNA产量(单位为μg)。

图2显示将单独的球锥或氧化锆珠粒或其组合用于植物样品的机械破碎、从而从根样品中得到的总DNA产量(单位为μg)。

图3显示将单独的球锥或氧化锆珠粒或其组合用于植物样品的机械破碎、从而从玫瑰叶样品中得到的微生物读数(图3a)和细菌读数(图3b)的百分比。

图4显示将单独的球锥或氧化锆珠粒或其组合用于植物样品的机械破碎、从而从枫叶样品中得到的微生物读数(图4a)和细菌读数(图4b)的百分比。

图5a显示稀疏曲线，通常用于显示样品中物种丰富度的量。图5a表明，将根据本发明的颗粒组合用于裂解的方法得到了最高的曲线，表明与其他方法中相比检测出了更多的细菌物种。图5b进一步支持，特别是在更深层测序中，该组合将比单独的锆珠粒提供更多信息。

图6显示破碎颗粒的一个实施方式，这里是球锥形颗粒。该设计结合了球体和圆锥体的打磨能力。可以应用于球锥形珠粒的A和B的示例性尺度列于下表II(单位为英寸)。

表II

图7和8显示固体非球形破碎颗粒的其他示例性形状，其具有包含第一部分和第二部分的表面，从而第一部分和第二部分通过形成边缘而相遇，这里是倾斜的中央凸缘的形式。图7显示具有两个锥形尖端的实施方式。图8显示具有两个半球的实施方式。

图9显示将本发明的裂解化学方法和单独的球锥或氧化锆珠粒或其组合用于植物样品的机械破碎、从而从苹果叶(50mg)中得到的总DNA产量(Qubit)。结果表明，与使用单独的氧化锆珠粒相比，将根据本公开的裂解化学方法以及氧化锆珠粒和球锥一起用于组织破碎时，从苹果叶样品中分离的总DNA(植物和微生物)的量大幅增加。

图10显示使用本申请的裂解化学方法以及球锥和氧化锆珠粒的混合物或单独的氧化锆珠粒从苹果根中得到的总DNA产量。用Qubit进行总DNA定量。此外还示出了用QuantiTect SYBR green试验评估的微生物DNA的产量。数据表明，通过将氧化锆珠粒和球锥组合用于植物样品材料的裂解，改善了微生物DNA的产量。

图11显示基于16S RNA标记基因的操作分类单元(OTU)聚类，其是用于对密切相关的微生物物种进行分类的操作定义。DNA是从苹果树根分离的。图中显示了来自不同微生物物种的读数百分比。可以看出，使用球锥可以更有效地裂解植物细胞，而氧化锆珠粒则可以更有效地裂解细菌细胞。使用组合将这些优点相结合。

实施例

应当理解，以下实施例仅用于说明目的，不应理解为以任何方式限制本发明。

I.材料和方法

在以下实施例中，测试了用作研磨介质的不同固体破碎颗粒通过机械破碎来帮助各种植物样品裂解的有效性。除其他外，测试了以下破碎颗粒和破碎颗粒的组合：

(1)两种不同尺寸的氧化锆珠粒(0.1mm和0.5mm(直径)；每份样品制剂中分别为0.75g)。氧化锆珠粒基本上为球形。

(2)球形不锈钢珠粒(约2.4mm；每份样品制剂中为3个)。

(3)球锥。球锥的尺寸在4mm～7mm的范围内，重量在600mg～900mg的范围内。所用的球锥由钢制成。

(4)氧化锆珠粒和球形钢珠粒((1)和(2)的组合)。

(5)氧化锆珠粒和球锥((1)和(3)的组合)。

除非另有说明，否则使用以下常规方案来分离植物DNA：

1.植物样品裂解

收集最多50mg的不同来源(例如松针、根、玫瑰叶、枫叶)的植物样品。

将各样品分别放入装有500μl裂解液的收集管(组织破碎管，QIAGEN)中。裂解溶液包含NaSCN和Na₂HPO₄。优选浓度如本文所述。例如，NaSCN可以以0.8M～1.25M范围内的浓度存在于裂解溶液中。Na₂HPO₄可以以0.1M～0.25M或0.15M～0.2M范围内的浓度存在。Na₂HPO₄优选包含在裂解溶液中，但也可以分开添加。以下实施例中使用了这样的裂解溶液。

此外，收集管包含用于机械破碎的如上所述的破碎颗粒或破碎颗粒的组合(参见(1)至(5))。将样品短暂涡旋而混合，并通过2个分别为2分钟(@24Hz)的匀浆循环匀浆(TissueLyzer II，QIAGEN)，以进行裂解。

处理富含酚类化合物的植物样品(例如松针，见实施例1)时，可以任选地使用450μl裂解溶液和50μl的包含PVP的酚类物质抑制(PSS)缓冲液。

将裂解物以12,000×g离心2分钟以澄清裂解物，并将上清液转移到干净的管中(约350～450μl)。上清液可以仍然包含一些植物颗粒。离心可以在组织破碎管中实施。

2.抑制剂去除

将200μl的IRT溶液添加到上清液中，并将样品短暂涡旋5秒钟。处理富含酚类化合物的植物时，可以在此步骤中添加PSS缓冲液来代替裂解步骤。如本文所公开的，这种缓冲液的使用是任选的。

样品以12,000g在室温下离心1分钟。避免粒料，将上清液(液相)转移到干净的管中。上清液的量约为400～500μl。

抑制剂去除溶液(IRT)包含乙酸铵作为沉淀剂和AlCl₃作为抑制剂去除剂。两种试剂的优选浓度均如本文所述。例如，乙酸铵可以以3M～4M范围内的浓度包含在IRT溶液中。氯化铝可以以100mM～150mM范围内的浓度包含在IRT溶液中。以下实施例中使用了这样的裂解溶液。

3.核酸的分离

如本文所述，基本上任何核酸分离方案都可以用于分离并因此回收所获得的液相(上清液)中包含的核酸。下文中，使用核酸分离方案来回收DNA，其中DNA在离液盐的存在下结合至固体二氧化硅支持物。以大致与上清液体积相对应的体积加入含有离液剂的市售缓冲液(缓冲液AVL，Qiagen)。将裂解物中的DNA结合到硅胶离心柱(例如QIAGEN)上，将含有样品的管离心并舍弃流出物。在将样品洗脱到洗脱缓冲液(QIAGEN)中之前，执行两个结合于柱的DNA的洗涤步骤。遵循以下方案：

添加500μl的溶液AVL并涡旋5秒钟。将650μl的裂解物上样到MB离心柱上，以12,000×g离心1分钟。舍弃流出物，并重复步骤以确保所有裂解物均已流过MB离心柱(MOBIO)。将MB离心柱小心地放入干净的2ml收集管中。避免将任何流出物溅到MB离心柱上。

将500μl的AW1(洗涤缓冲液，QIAGEN)添加至MB离心柱。以12,000×g离心1分钟。舍弃流出物，并将MB离心柱放回到同一2ml收集管中。将500μl的AW2(洗涤缓冲液，QIAGEN)添加至MB离心柱。以12,000×g离心1分钟。舍弃流出物，并将MB离心柱放入同一2ml收集管中。以最高16,000×g离心2分钟。将MB离心柱小心地放入新的1.5ml洗脱管中(已提供)。

将50～100μl的溶液EB(洗脱缓冲液，QIAGEN)添加到白色滤膜的中央。以12,000×g离心1分钟。舍弃MB离心柱。洗脱物包含洗脱的DNA。

然后对洗脱的DNA进行分析。

4.DNA定量

通过荧光方法(Qubit dsDNA，HS或BR检测试剂盒，英杰公司)对分离的DNA进行定量，使用从4个独立重复中得到的5μl洗脱物，即处理了4个独立样品。

还使用QuantiTect SYBR green试验(QIAGEN)进行了微生物DNA的特异性定量，其中使用了针对16S rRNA基因具有特异性的引物以及用于根据手册中的说明进行定量的标准参比样品。将来自4个独立重复的8μl洗脱物应用于试验，从而在试验中每个样品重复3次。通过与采用线性回归的标准曲线比较来确定浓度。

5.新一代测序

用400ng的分离DNA进行文库构建。文库构建遵循QIASeq FX DNA文库试剂盒的制造商说明书。在Illumina MiSeq上对文库进行测序，并用CLC微生物基因组学工作台(CLCMicrobial Genomics Workbench)进行分析。针对所有可及的细菌基因组对文库进行定位。通过将定位到该参考微生物数据库的读数数量除以文库中的读数总数，可以确定细菌读数的百分比。

II.结果

1.DNA产量

结果示于图1和图2。各柱表示4个独立重复的平均值，示出了标准偏差。

松针样品

图1显示从松针样品(50mg)中得到的DNA产量。可以看出，作为本发明中所用的不规则形状的破碎颗粒的优选实例的球锥提供了最高的DNA产量，因此在破碎植物样品组织方面最有效。反之，单独的氧化锆珠粒仅提供非常低的DNA产量。因此，单独的氧化锆珠粒不能充分地破碎植物组织，这反映在降低的DNA产量上。

尽管单独的球形钢珠粒可有效裂解样品，但使用球形钢珠粒和锆珠粒组合(4)时，DNA产量显著降低。组合的产量甚至低于由单独的氧化锆珠粒获得的产量。因此，球形钢珠粒和球形锆珠粒明显损害了彼此的机械细胞裂解的效率。球形钢珠粒可能会阻碍球形表面周围的氧化锆珠粒的移动，从而降低氧化锆珠粒打磨的效率。

反之，如分离的总DNA的高总产量所示，球锥和氧化锆珠粒的组合(5)在裂解样品方面非常有效。不规则的球锥形状允许有效的样品混合和氧化锆珠粒的自由移动，从而确保有效的机械植物样品以及微生物裂解。因此，根据本发明所用的球锥作为破碎颗粒的优选实例特别适合与多个小颗粒如氧化锆珠粒组合使用。值得注意的是，在球锥存在下，锆珠粒对细菌细胞进行机械裂解具有持续高效性。因此，不规则球锥形状和氧化锆珠粒的组合可提供非常高的DNA产量，并能有效裂解植物样品以及所含微生物(例如细菌和真菌)(也参见下文)。

根样品

将球锥和锆珠粒组合使用来处理难以裂解的植物样品时，也可以获得很高的总DNA产量。根样品的处理证明了这一点。根是特别富含细菌之类的的微生物的植物器官。为了有效地释放根样品中所包含的微生物核酸，重要的是实现根样品的彻底破碎和裂解，因为细菌之类的的微生物也可能包含在根样品内部。图2显示处理根样品(50mg)时得到的DNA产量。

从降低的DNA产量可以明显看出，单独的氧化锆珠粒不能有效地裂解和匀浆根样品。这是至关重要的，因为单独的氧化锆珠粒不能到达植物组织(在这里是根)内部的细菌之类的微生物。因此，当单独使用氧化锆珠粒时，分析中可能会丢失源自存在于植物样品内部的微生物的微生物核酸。

反之，球锥和氧化锆珠粒的组合可提供很高的DNA产量，从而表明当将这两种破碎颗粒组合使用时，根样品被有效裂解。结果还表明，当单独使用球锥时，可以有效地裂解根样品。然而，单独的球锥对根样品中所包含的微生物的裂解不是很有效，即，与球锥和氧化锆珠粒的组合使用相比，单独使用球锥时释放的微生物核酸更少(见下文)。

小结

使用球锥作为破碎颗粒可提供高DNA产量，并且因此在匀浆并由此破碎各种植物样品方面特别有效。然而，单独的这种大破碎颗粒在机械破碎植物样品中所包含的细菌之类的微生物方面不太有效(参见下文讨论的图3～5)。大颗粒通常对于裂解微生物不足够有效。

球锥和锆珠粒的组合使用可达到与单独使用球锥相同的总分离DNA的高总产量。与在裂解步骤中单独使用锆珠粒或使用氧化锆珠粒和球形金属珠的组合相比，使用此组合进行机械裂解所获得的总DNA产量明显更高。此外，球锥和锆珠粒的组合使用可有效地释放植物样品中所含微生物中所包含的微生物核酸，如细菌DNA在分离的总DNA中所占的高百分比所示(参见下文讨论的图3～5)。因此，球锥和锆珠粒的组合使用是优选的，特别是在与本文公开的裂解化学方法一起使用时。本发明可以有利地用于从各种植物样品中释放包括微生物核酸在内的核酸，所述植物样品包括难以裂解的样品、如根样品。

2.微生物读数的百分比

单独使用球锥尽管可有效地裂解各种植物样品，但不足以有效地裂解微生物(例如植物样品中所包含的细菌)。因此，将球锥单独用于植物样品裂解时，微生物核酸会有一定程度的丢失。

因此，除了植物DNA之外，为了进行有效地释放微生物核酸如细菌DNA的裂解，将球锥和氧化锆珠粒组合使用是有利的。从图3和4可以看出，该组合实现了高百分比的微生物(细菌和真菌)以及细菌读数，从而表明有效的植物样品裂解以及有效的微生物裂解。更高的微生物DNA释放反映在DNA分离后的新一代测序中获得的更高的微生物和/或细菌读数百分比上。

结果表明，与单独使用球锥相比，将球锥和氧化锆珠粒组合使用可获得更高的微生物DNA产量。此外，结果表明，与单独使用氧化锆珠粒相比，将球锥和氧化锆珠粒组合使用时，释放并因此可回收的微生物DNA的总量增加。如以上讨论的图1和2所示，单独的氧化锆珠粒不能有效地裂解植物样品，从而例如在某种程度上丢失了植物样品中所包含的微生物、如细菌。在这方面要注意的是，如果存在大量植物来源的DNA，则分离的DNA中细菌或微生物DNA总量的增加仍然可以导致较低的微生物/细菌读数百分比。

由于颗粒的组合提供了明显更高的总DNA产量，并提供了例如在植物样品内部(例如，在根的情况下)的可利用的微生物，与单独使用氧化锆珠粒相比，微生物DNA的总量得到了改善。植物样品中所含微生物中所包含的微生物核酸被另外释放，因此当使用本发明的方法时可随后分离。这反映在测序结果中，该结果表明，与单独的氧化锆珠粒或球锥相比，使用根据本发明的颗粒的组合进行裂解的样品具有更高的16S序列多样性(见图5a)。

小结

使用本文所述的非球形破碎颗粒(例如球锥)和多个小球形颗粒(例如锆珠粒)的组合机械裂解提供了来自植物样品的DNA的高产量，其中所获得的DNA包含大量微生物的DNA，因此可用于分析。为了进行分析，可以使用各种方法，例如基于扩增的程序(例如PCR)以及测序(例如新一代测序)。

所提供的测序结果还表明，与单独使用球锥相比，获得的微生物(例如细菌)读数的百分比显著提高。细菌读取的百分比基本上对应于单独使用锆珠粒，但是总DNA产量有所提高(见上文)。通过将固体非球形破碎颗粒(例如球锥)和锆珠粒组合使用进行机械裂解而获得的总DNA中的细菌DNA的高百分比的实现是很重要的，其原因在于，单独的氧化锆珠粒无法充分破碎植物细胞，所以单独的氧化锆珠无法有效地到达存在于植物细胞内的细菌(见上文)。因此，球锥和锆珠粒的组合使用是非常有利的，特别是在采用本文公开的裂解化学方法时。

3.总DNA产量和微生物DNA产量

用其他样品来分析当单独或组合使用球锥或氧化锆珠粒时的效果(参见I.材料和方法)。

苹果叶和苹果根样品

将根据本发明的裂解方法和由球锥、球状锥与氧化锆珠粒、或单独的氧化锆珠粒提供的机械裂解组合使用，从苹果叶样品(50mg)中分离DNA。用Qubit试验确定总DNA产量。结果示于图9，表明与单独的氧化锆相比，使用球锥和氧化锆时可提高总DNA产量(植物和微生物)。

对于图10，用两种不同的测试确定了苹果根样品的总DNA(Qubit)和微生物DNA的产量。图10证明了，与单独的氧化锆珠相比，通过球锥和氧化锆珠粒的组合，来自苹果根样品中所含微生物的微生物DNA的产量提高。用QuantiTect-based qPCR试验确定微生物DNA。这些数据强调了苹果根样品以及样品内部所含微生物的彻底破碎和裂解，这在某些情况下可能会大大提高总产量。数据表明，相比于单独使用氧化锆珠粒，球锥和氧化锆的混合物能够从样品中有效释放细胞内微生物，从而提高微生物DNA的产量。

小结

通过使用本文所述的非球形破碎颗粒(例如球锥)和多个小球形颗粒(例如氧化锆珠粒)的组合机械裂解，从植物样品中释放出高产量的包含大量微生物DNA的DNA。为了进行分析，可以使用各种方法，例如基于扩增的程序(例如PCR)以及测序(例如新一代测序)，进一步实现了样品中所含微生物DNA的基于扩增的定量。

4.根相关植物微生物群

为了研究植物样品中所含的微生物群的多样性以及植物相关细菌的破碎效率，使用本发明的方法，用球锥、球锥和小氧化锆珠粒的混合物、或单独的氧化锆珠粒从50mg苹果树根中分离DNA(参见实施例IV)。使用QIAseq FX DNA文库试剂盒制备了16S rRNA基因文库，用Illumina MiSeq系统测序(运行2×250bp)，并使用CLC基因组学工作台(CLC GenomicWorkbench)(QIAGEN Microbial Genomics Pro Suite)分析了所得读数。根据结果，进行了操作分类单元(OTU)聚类(图11)。结果表明，使用球锥可以更有效地裂解植物细胞，而小氧化锆珠粒可以更有效地裂解细菌细胞。对于某些应用，球锥和氧化锆珠粒的组合使用具有重要的优势。使用本文所述的非球形破碎颗粒(例如球锥)和多个小球形颗粒(例如氧化锆珠粒)的组合机械裂解提供了来自植物样品的DNA的高产量，其中所获得的DNA包含大量微生物的DNA和高微生物多样性。

Claims

1.一种从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸的裂解方法，包括使用至少两种固体破碎颗粒对液体裂解组合物中的植物样品进行机械破碎，其中：

(ii)由多个尺寸为1mm或更小的破碎颗粒来提供第二类型。

2.如权利要求1所述的方法，其中第一类型和第二类型的固体破碎颗粒在形状和/或材料上彼此不同，并且其中优选地，第一类型不是球形的并且具有至少一个不连续部分、优选具有边缘，并且由多个基本上是球形的颗粒来提供第二类型。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中由一个或多个非球形破碎颗粒来提供第一类型，并且其中一个或多个破碎颗粒的表面包含第一部分并包含第二部分，由此第一部分和第二部分通过形成边缘而相遇。

4.如权利要求3所述的方法，其中由具有以下一个或多个特征的一个或多个非球形破碎颗粒来提供第一类型：

(i)第一部分是截头圆锥体的表面并且第二部分是截头圆锥体的表面，其中两个圆锥体均以其较大的底部彼此抵靠，在较大的底部相遇处形成边缘，较大的底部优选具有相同直径；

(ii)破碎颗粒具有由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分；

(iii)破碎颗粒具有至少一个尖端，其优选是截头圆锥体；

(iv)破碎颗粒具有至少两个由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分；

(v)一个或多个破碎颗粒具有选自圆锥体、圆柱体、立方体、三角形、矩形、球锥和卫星的形状。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中第一类型选自下组的具有如下特征的颗粒：

(aa)该颗粒包括至少一个尖端，该尖端是截头圆锥体，其中提供尖端的截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且其中颗粒包括由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分，该子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，其中优选地，由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分是半球；

(bb)该颗粒包括至少两个尖端，其中两个尖端都是截头圆锥体，其中截头圆锥体的较大的底部抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上；

(cc)该颗粒包括两个子部分，其中每个子部分由球或椭圆的一块或一部分组成，其中由球或椭圆的一块或一部分组成的第一子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且由球或椭圆的一块或一部分组成的第二子部分抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上；

(dd)该颗粒包括两个半球，其中第一半球抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且第二半球抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上。

6.如权利要求1～5中一项或多项所述的方法，其中由一个或多个非球形破碎颗粒来提供第一类型，所述非球形破碎颗粒的重量在500mg～1000mg、任选地为600mg～900mg的范围内，并且具有3mm～10mm、任选地为3mm～7mm或4mm～7mm的尺寸。

7.如权利要求1～6中一项或多项所述的方法，其中由单个固体破碎颗粒、优选如权利要求3～6中任一项所限定、优选地如权利要求5或6所限定的单个固体破碎颗粒来提供第一类型。

8.如权利要求1～7中一项或多项所述的裂解方法，其中第二类型具有以下一个或多个特征：

(i)多个颗粒是晶体颗粒；

(ii)多个颗粒包含以下物质或者由以下物质构成：锆、锆石(硅酸锆)、氧化锆(二氧化锆)、钇稳定的锆、石英、氧化铝、碳化硅、陶瓷、玻璃(例如二氧化硅玻璃或二氧化硅)或上述物质的组合；

(iii)多个颗粒基本上是球形的；

(iv)多个颗粒的尺寸在选自0.05mm～0.9mm、0.07mm～0.8mm、0.08mm～0.75mm和0.09mm～0.7mm的范围内；

(v)多个颗粒基本上是球形的，并且包含以下物质或者由以下物质构成：平均尺寸在0.08mm～0.7mm、优选0.09mm～0.6mm的范围内的锆、锆石(硅酸锆)、氧化锆(二氧化锆)或钇稳定的锆，其中优选使用锆珠粒；

(vi)多个颗粒的密度为至少2.0g/cc、至少2.5g/cc、至少3.0g/cc、至少3.5g/cc、至少4.0g/cc、至少4.5g/cc、至少5.0g/cc或至少5.5g/cc；

(vii)多个颗粒的密度在选自2.0g/cc～15g/cc、2.5g/cc～12g/cc、3.0g/cc～10g/cc、3.5g/cc～9g/cc、4.0g/cc～8g/cc、4.5g/cc～7.5g/cc和5g/cc～7g/cc的范围内；

(viii)多个颗粒具有至少两种不同的尺寸，其中(i)第一颗粒尺寸的平均值在选自0.05mm～0.25mm、0.07mm～0.2mm、0.08mm～0.175mm和0.9mm～0.15mm的范围内，并且(ii)第二颗粒尺寸的平均值在选自0.3mm～0.9mm、0.35mm～0.8mm、0.4mm～0.7mm和0.45mm～0.6mm的范围内。

9.如权利要求1～8中一项或多项所述的裂解方法，其中(i)由如权利要求3～6中任一项所限定、优选地如权利要求5或6所限定的单个固体破碎颗粒来提供第一类型，其中优选地，单个破碎颗粒是球锥，并且(ii)由多个尺寸优选在0.08mm～0.7mm、更优选0.09mm～0.6mm的范围内的基本上为球形的氧化锆珠粒来提供第二类型。

10.如权利要求1～9中一项或多项所述的裂解方法，其中采用第一和第二类型的破碎颗粒的破碎依次或同时实施，优选同时实施。

11.如权利要求1～10中一项或多项所述的裂解方法，其中液体裂解组合物包含至少一种离液剂。

12.如权利要求11所述的裂解方法，其中(i)离液剂选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂及其组合，其中优选地，离液剂是硫氰酸钠；和/或

(ii)液体裂解组合物和/或裂解混合物中的至少一种离液剂的浓度在0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内，其中优选地，离液剂是NaSCN。

13.如权利要求1～12中一项或多项所述的裂解方法，其还包括：

-澄清裂解物。

14.如权利要求1～13中一项或多项所述的裂解方法，其还包括：

-使任选地澄清过的裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；以及

-从混合物中获得液相；

-任选地从液相中分离核酸、优选为DNA。

15.如权利要求14所述的裂解方法，其具有以下一个或多个特征：

(i)沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠和乙酸铯，其中优选使用乙酸铵，和/或其中混合物中的至少一种沉淀剂的浓度在选自0.1～4M、0.2M～3M、0.3M～2.5M、0.4M～2.25M、0.5M～2M和0.6M～1.75M的范围内；

(ii)至少一种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合，其中优选地，抑制剂去除剂是三价铝盐，更优选氯化铝，和/或其中混合物中的至少一种抑制剂去除剂的浓度在选自1～150mM、5mM～125mM、10mM～100mM、15mM～75mM和20mM～65mM的范围内；

(iii)沉淀剂是乙酸铵，并且抑制剂去除剂是三价铝盐，优选氯化铝；

(iv)沉淀剂和抑制剂去除剂包含在同一组合物、优选液体溶液中，与裂解样品接触以提供混合物；和/或

(v)该方法包括在使裂解样品与至少一种抑制剂去除剂接触之前添加至少一种磷酸盐，其中优选地，至少一种磷酸盐包括在裂解组合物中，并且其中任选地，磷酸盐具有以下一个或多个特征：

(aa)其是磷酸氢盐；

(bb)磷酸盐中的阳离子部分选自铵、钠、钾或锂；

(cc)其是磷酸氢二钠。

16.如权利要求1～15中一项或多项所述的裂解方法，其中：

(aa)植物样品选自叶、针、根、茎、种子、果实和花朵，并且其中优选地，植物样品是根样品；和/或

(bb)植物样品中所包含的微生物具有以下一个或多个特征：

(i)微生物选自细菌和真菌，如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、霉菌和孢子、或前述的组合；

(ii)微生物是细菌；

(iii)微生物存在于植物样品之上、周围或内部，并且任选地包含在根样品中、叶表面上和/或植物组织中的病变或肿瘤上。

17.如权利要求1～16中一项或多项所述的方法，

-其中由一个或多个非球形破碎颗粒来提供第一类型的固体破碎颗粒，并且优选地，由多个基本上是球形的颗粒来提供第二类型的固体破碎颗粒；并且

-其中液体裂解组合物以1.5M或更小的浓度包含至少一种离液剂，并且其中离液剂选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂，并且其中优选地，离液剂是硫氰酸钠；并且

-其中所述方法还包括：

o澄清裂解物，其中澄清裂解物包括将在将植物样品破碎后得到的裂解混合物分离为固体级分和液体级分，其中，将液体级分作为裂解样品进行后续处理；

o使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；以及

o从混合物中获得液相；

其中任选地，该方法还包括在使裂解样品与至少一种抑制剂去除剂接触之前，添加至少一种磷酸盐。

18.如权利要求17所述的方法，其中至少一种蛋白质沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠和乙酸铯，并且其中优选地，蛋白质沉淀剂是乙酸铵，并且其中至少一种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合，并且其中优选地，抑制剂去除剂是三价铝盐，如更优选地为氯化铝。

19.如权利要求14～18中一项或多项、尤其是权利要求17或18所述的方法，其中液体裂解组合物包含硫氰酸钠作为离液剂，并且其中该方法包括使裂解样品与作为沉淀剂的乙酸铵和作为抑制剂去除剂的三价铝盐、优选氯化铝接触。

20.如权利要求1～19中一项或多项、尤其是权利要求17～19中任一项所述的方法，其中液体裂解组合物以0.7M～1.5M的浓度包含硫氰酸钠，并且以0.075M～0.3M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

21.如权利要求1～20中一项或多项、尤其是权利要求17～19中任一项所述的方法，其中液体裂解组合物以0.8～1.25M的浓度包含硫氰酸钠，并且以0.1M～0.25M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。

22.如权利要求14～21中一项或多项、尤其是权利要求17～20中任一项所述的方法，其中该方法包括使裂解样品与作为沉淀剂的乙酸铵和作为抑制剂去除剂的三价铝盐、优选氯化铝接触，其中在所提供的混合物中，乙酸铵的浓度在0.5M～2M的范围内，三价铝盐的浓度在15mM～75mM的范围内。

23.如权利要求14～22中一项或多项、尤其是从属于权利要求14时的权利要求17～22中任一项所述的方法，其还包括从液相中分离核酸、优选为DNA。

24.从植物样品中分离包括微生物核酸在内的核酸的方法，包括：

(a)进行如权利要求1～23中一项或多项所述的裂解方法：

(b)从裂解并任选地经过进一步加工的样品中分离核酸；以及

25.一种裂解系统，优选为试剂盒，其用于从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸，包括：

(a)液体裂解组合物、

(b)至少两种固体破碎颗粒，其中：

(ii)由多个尺寸小于1mm的破碎颗粒来提供第二类型，

其中优选地，第一类型的固体破碎颗粒具有如权利要求2～4中一项或多项所限定的一个或多个特征，并且第二类型的固体破碎颗粒具有如权利要求5或6所限定的一个或多个特征，并且其中第一和第二类型的破碎颗粒包含在分开的容器中或包含在同一容器中，优选包含在同一容器中。

26.如权利要求25所述的裂解系统，其中液体裂解组合物包含至少一种磷酸盐，其任选地如权利要求15(v)(aa)、(bb)或(cc)所限定和/或如权利要求11、12、17、20和21中一项或多项所限定。

27.如权利要求25或26所述的裂解系统，包括至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂。

28.如权利要求27所述的裂解系统，其中至少一种蛋白质沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠和乙酸铯，并其中优选地，蛋白质沉淀剂是乙酸铵，并且其中至少一种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合，并且其中优选地，抑制剂去除剂是三价铝盐，例如更优选地为氯化铝。

29.如权利要求27或28所述的裂解系统，其中液体裂解组合物包含硫氰酸钠作为离液剂，并且其中至少一种蛋白质沉淀剂是乙酸铵，并且其中抑制剂去除剂是三价铝盐，优选氯化铝。

30.如权利要求25～29中任一项所述的系统在如权利要求1～24中任一项所述的方法中的用途。

31.如权利要求25～29中任一项所述的系统在裂解植物样品并从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸中的用途，其中，用户任选地使用(i)第一和第二类型、或者(ii)第二类型的破碎颗粒进行植物样品裂解，以从植物样品中所包含的微生物中释放微生物核酸、优选为DNA。