KR101743110B1 - 계면 활성제의 첨가 없이 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 계면 활성제의 첨가 없이 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법 및 식물체 염색질 추출용 키트에 관한 것이다. 최근 들어 유전자로부터 단백질의 발현을 연구하기 위해 염색질을 분리하여 연구하는 경우가 점점 늘어나고 있는데 이 경우 대부분의 염색질 추출이 계면활성제의 첨가 방법에 의해 이루어지기 때문에 다음 단계의 연구에서 많은 제약이 따른다. 그러나 본 발명의 방법을 이용하면 계면활성제의 처리없이 식물체로부터 염색질을 분리할 수 있기 때문에, 식물체에서 유전자의 발현관련 연구 범위를 보다 폭넓게 할 수 있는 장점이 있다.

Description

계면 활성제의 첨가 없이 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법{Method for extracting chromatin from plants without adding surfactants}

본 발명은 계면 활성제의 첨가 없이 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법 및 식물체 염색질 추출용 키트에 관한 것이다.

동물 또는 식물체로부터 핵산을 포함하는 염색질(chromatin)을 추출할 때, 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate)이나 트리톤(triton)과 같은 계면활성제를 처리하는 것이 일반적이다(비특허문헌 1; 비특허문헌 2; 비특허문헌 3; 비특허문헌 4).

특히 일본 공개특허공보 제2004-290028호는 '식물 DNA 용출 시약 및 식물 DNA 추출 키트'에 관한 것으로, 음이온성 계면활성제 및/또는 비이온성 계면활성제로 구성되는 계면활성제를 포함하는 식물 DNA 용출 시약을 개시하고 있으며(특허문헌 1), 일본 공개특허공보 제1999-169170호는 '식물 DNA의 추출 정제 방법'에 관한 것으로, 식물 재료에 계면 활성제 및 단백질 변성제를 포함하는 용해액을 혼합하는 단계를 포함하는 식물 재료로부터 DNA를 추출 정제하는 방법을 개시하고 있다(특허문헌 2).

그러나 염색질을 추출하기 위하여 이러한 계면활성제를 사용하는 경우, 계면활성제가 시료에 잔류되어 있든가 또는 염색질에 결합된 단백질이 변성되어 단백질의 미세구조 또는 활성도 등에 영향을 미치게 된다는 등의 문제가 있다(비특허문헌 5; 비특허문헌 6; 비특허문헌 7; 비특허문헌 8). 그러므로 계면활성제를 사용하는 경우, 이에 의해 추출된 염색질을 이용한 다음 단계의 각종 생화학 실험에 많은 제약이 따르게 마련이다.

이에 본 발명자들은 계면활성제를 첨가하지 않고도 식물체로부터 성공적으로 염색질을 분리시키는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

일본 공개특허공보 제2004-290028호 일본 공개특허공보 제1999-169170호

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본 발명의 목적은 계면활성제의 첨가 없이 셀룰라제, 프로테나제 K 및 수산화암모늄을 이용하여 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 셀룰라제, 프로테나제 K, 수산화암모늄 및 완충용액을 포함하는 식물체 염색질 추출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법을 제공하며, 보다 구체적으로 셀룰라제, 프로테나제 K 및 수산화암모늄을 이용한 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법, 더욱 구체적으로

1) 식물체 시료를 분쇄하여 균질화하는 단계;

2) 상기 균질화된 시료에 셀룰라제를 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 회수된 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조하고, 제조된 현탁액에 프로테나제 K를 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계;

4) 상기 단계 3)에서 회수된 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조하고, 제조된 현탁액에 수산화암모늄을 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)에서 회수된 침전물로부터 잔여 색소체를 제거하고, 염색질을 분리하는 단계;를 포함하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법을 제공한다.

상기 식물체는 그 종류에 제한되지 않고 염색질을 추출하고자 하는 식물체라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서는 애기장대, 토마토를 사용하였으나, 본 발명이 이러한 예에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어, "염색질(chromatin)"은 DNA(deoxyribonucleic acid)와 히스톤 및 기타 단백질들이 결합한 핵단백질로 구성되어 있는 물질을 말한다. 용어 "핵산(nucleic acid)"이란 세포의 핵 내에 존재하는 핵단백질의 비단백 부분으로서, DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)라는 두 종류가 존재한다.

상기 구체예에 따른 방법은 계면활성제를 첨가하지 않는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 용어, "계면활성제(surfactant)"란 용액 속에서 계면에 흡착하여 그 표면장력을 감소시키는 물질로서 표면활성제라고도 한다. 계면활성제의 종류로는 예를 들어, 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate), 트리톤(triton) 등이 있다. 종래에는 생물 시료로부터 염색질을 추출하기 위해 계면활성제를 첨가하는 방법이 이용되었으나, 계면활성제가 시료에 잔류되어 있거나 단백질 변성 등의 문제를 일으켜 다음 단계의 각종 생화학 실험에 제약이 따르는 문제가 있었다. 그러나, 본 발명의 방법을 이용하면 계면활성제를 사용하지 않으므로, 계면활성제의 사용에 따른 문제가 발생하지 않을 수 있다.

상기 구체예에 따른 방법에서, 단계 1)을 수행하기 전에 식물체를 고정하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 식물체의 고정은 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 식물체를 증류수에 용해된 포름알데히드 용액에 담그고 감압장치에서 배양하는 단계; 증류수로 세척하는 단계; 식물체를 증류수에 용해된 글라이신 용액에 담그고 감압장치에서 배양하는 단계; 및 증류수로 세척하는 단계에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 균질화는 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 식물체 시료를 원심분리하여 수분을 제거하는 단계; 수분이 제거된 식물체를 막자 사발에 넣고 액체 질소를 이용하여 분쇄하는 단계; 완충용액(Tris-HCl pH7.2, 10 mM)을 첨가하여 현탁액을 제조하는 단계; 및 제조된 현탁액을 균질기에서 균질화(homogenization)하는 단계에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 2)에서 셀룰라제를 첨가하기 전에 균질화된 식물체 시료를 여과지에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계; 회수된 여과액을 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계; 및 회수된 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 완충용액은 인산 완충용액(K-phosphate)을 이용할 수 있고, 구체적으로 20~30 mM K-phosphate, pH5.5~6.5, 3~7 mM MgCl₂를 이용할 수 있고, 예를 들어 25 mM K-phosphate, pH6.0, 5 mM MgCl₂를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "셀룰라제(cellulase)"란 셀룰로오스를 가수분해하는 효소를 의미하며, 시판되는 공지의 셀룰라제를 이용할 수 있다.

상기 단계 2)의 셀룰라제는 0.2~0.5 mg/ml의 농도로 80분 이상 처리할 수 있고, 0.2~0.5 mg/ml의 농도로 80~200분 동안 처리할 수 있으며, 바람직하게는 0.4 mg/ml의 농도로 120분 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 2)의 원심분리는 7000~9000 rpm으로 10~30분 동안 수행할 수 있고, 예를 들어 8000 rpm으로 20분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 2)에서 셀룰라제 처리 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 것에 의하여 세포벽 분해산물과 잔여 효소들을 제거할 수 있다.

상기 단계 3)의 완충용액은 10~100 mM Tris-HCl, pH7.0~8.0에 1~10 mM MgCl₂을 추가적으로 포함하는 것을 이용할 수 있고, 예를 들어 50 mM Tris-HCl, pH7.5, MgCl₂ 5 mM을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "프로테나제 K(proteinase K)"는 단백질 분해효소의 한 종류로 단백질 또는 펩티드에 작용해서 펩티드결합의 가수분해를 촉매하는 효소를 의미하며, 시판되는 공지의 프로테나제 K를 이용할 수 있다.

상기 단계 3)의 프로테나제 K는 0.1~0.3 mg/ml의 농도로 50분 이상 처리할 수 있고, 0.1~0.3 mg/ml의 농도로 50~150분 동안 처리할 수 있으며, 바람직하게는 0.2 mg/ml의 농도로 60분 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 3)의 원심분리는 7000~9000 rpm으로 10~30분 동안 수행할 수 있고, 예를 들어 8000 rpm으로 20분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 3)의 원심분리에 의하여 잔존 프로테나제 K를 제거할 수 있다. 상기 단계 3)의 프로테나제 K의 처리는 핵막의 단백질을 분해시켜 핵막을 약하게 만들고, 이에 따라 약해진 핵막이 보다 쉽게 파괴될 수 있게 하기 위한 것이다. 따라서 프로테나제 K의 처리 후 원심분리하여 잔존 프로테나제 K를 제거하는 것이 바람직하며, 만약 프로테나제 K가 잔존하면 염색질의 단백질을 분해시킬 수 있다.

상기 단계 3)에서 프로테나제 K 처리 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 것에 의하여 세포벽 분해산물과 잔여 효소들을 제거할 수 있다.

상기 단계 3)에서 회수한 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계를 2~5회 반복하여 세포벽 분해산물과 잔여 효소들을 완전히 제거할 수 있다. 상기 완충용액은 Tris-HCl을 이용할 수 있다.

상기 단계 3)을 수행한 이후에, 엽록체 및 색소를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 엽록체 및 색소를 제거하는 단계는 i) 상기 단계 3)의 수행 이후 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조한 후, 균질화하는 단계; ii) 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 회수하는 단계; 및 iii) 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 단계 i)의 완충용액은 Tris-HCl을 이용할 수 있다.

상기 단계 i)의 균질화는 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 균질기를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 ii)의 원심분리는 7000~9000 rpm으로 15~30분 동안 수행할 수 있고, 예를 들어 8000 rpm으로 20분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단계 ii)의 수행 이후에 흰색이나 회색을 띠는 핵은 남기고, 초록색을 띠는 부분을 제거하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다.

상기 단계 iii)의 완충용액은 Tris-HCl에 수크로오즈(sucrose)를 추가적으로 포함하는 것을 이용할 수 있고, 예를 들어 Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM에 수크로오즈를 25중량% 포함하는 것을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 iii)의 원심분리는 7000~9000 rpm으로 15~30분 동안 수행할 수 있고, 예를 들어 8000 rpm으로 20분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 색소체 제거는 원심분리 또는 여과를 수행하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 방향족 화합물의 유도체가 주성분인 식물체의 각종 색소체(클로로필 등)들이 대부분 물에 녹지 않는 성질을 이용하여 식물체 침전물을 동결 후 다시 해동시키는 과정에서 응집된 색소체를 여과지에 통과시켜 제거하는 방법을 이용하였으나, 본 발명이 이러한 실시예에 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 4)의 완충용액은 5~15 mM Tris-HCl, pH7.0~7.5에 1~5 mM EDTA를 추가적으로 포함하는 것을 이용할 수 있고, 예를 들어 10 mM Tris-HCl, pH7.2, 2 mM EDTA를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "수산화암모늄(ammonium hydroxide, Na₄OH)"이란 암모니아를 물에 용해한 알칼리성 용액을 의미하며, 시판되는 공지의 수산화암묘늄을 이용할 수 있다.

상기 단계 4)의 수산화암모늄의 처리에 의하여 핵막을 추가적으로 약화시킬 수 있다.

상기 단계 4)의 수산화암모늄은 0.05~0.15 N의 농도로 80분 이상 처리할 수 있고, 구체적으로 0.05~0.15 N의 농도로 80~250분 동안 처리할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 N의 농도로 120분 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 4)의 원심분리는 9000~11000 rpm으로 5~15분 동안 수행할 수 있고, 예를 들어 10000 rpm으로 10분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 4)의 원심분리는 1~3회 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 4)에서 수산화암모늄 처리 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 것에 의하여 세포벽 분해산물과 잔여 수산화암모늄을 제거할 수 있다.

상기 단계 5)에서 염색질의 분리는 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 시료에 모래를 넣고 갈아준 후, 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조한 다음, 현탁액을 필터를 부착시킨 의료용 주사기를 이용하여 투과시키는 방법에 의해 잔여 색소체 및 모래를 제거할 수 있다. 상기 완충용액은 Tris-HCl에 MgCl₂를 추가적으로 포함하는 것을 이용할 수 있고, 예를 들어 Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM에 MgCl₂ 5mM을 추가적으로 포함하는 것을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예는 셀룰라제, 프로테나제 K, 수산화암모늄 및 완충용액을 포함하는 식물체 염색질 추출용 키트를 제공한다.

상기 셀룰라제는 0.2~0.5 mg/ml의 농도이고, 상기 프로테나제 K는 0.1~0.3 mg/ml의 농도이고, 상기 수산화암모늄은 0.05~0.15 N의 농도이고, 상기 완충용액은 1~100 mM의 농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 완충용액은 Tris-HCl일 수 있고, Tris-HCl에 MgCl₂ 또는 EDTA를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

최근 들어 유전자로부터 단백질의 발현을 연구하기 위해 염색질을 분리하여 연구하는 경우가 점점 늘어나고 있는데 이 경우 대부분의 염색질 추출이 계면활성제의 첨가 방법에 의해 이루어지기 때문에 다음 단계의 연구에서 많은 제약이 따른다. 그러나 본 발명의 방법을 이용하면 계면활성제의 처리없이 식물체로부터 염색질을 분리할 수 있기 때문에, 식물체에서 유전자의 발현관련 연구 범위를 보다 폭넓게 할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 애기장대 시료의 셀룰라제 처리 농도에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 토마토 시료의 셀룰라제 처리 농도에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 애기장대 시료의 셀룰라제 처리 시간(분)에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 토마토 시료의 셀룰라제 처리 시간(분)에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 애기장대 시료의 프로테나제(proteinase) K 처리 농도에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 토마토 시료의 프로테나제(proteinase) K 처리 농도에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 애기장대 시료의 프로테나제(proteinase) K 처리 시간(분)에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 토마토 시료의 프로테나제(proteinase) K 처리 시간(분)에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 애기장대 시료의 수산화암묘늄 처리 농도에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 토마토 시료의 수산화암묘늄 처리 농도에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 애기장대 시료의 수산화암묘늄 처리 시간(분)에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 토마토 시료의 수산화암묘늄 처리 시간(분)에 따른 시트르산 합성효소(citrate synthase) 활성도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 애기장대로부터 분리된 염색질의 양을 나타낸 도이다:
M, 사이즈 마커;
1, 셀룰라제 및 수산화암묘늄 처리(프로테나제 K 무처리);
2, 프로테나제 K 및 수산화암모늄 처리(셀룰라제 무처리);
3, 셀룰라제 및 프로테나제 K 처리(수산화암묘늄 무처리); 및
4, 셀룰라제, 프로테나제 K 및 수산화암묘늄을 모두 처리.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 식물체로부터 염색질의 추출

<1-1> 식물체의 고정

본 실험을 위하여 애기장대 또는 토마토를 온실에서 약 4주간 배양하였다.

수확된 식물체는 증류수를 이용하여 세척한 후 증류수를 이용하여 희석시킨 포름알데히드 1.0% 용액에 담그고 감압장치에 보존하였다. 약 30분간의 반응 후 꺼내어 증류수를 이용하여 3차례 세척하였다. 이어서 역시 증류수를 첨가하여 제조한 글라이신 0.2 M 용액에 식물체를 담그고 20분간 추가로 감압장치에 보존히였다. 이후 식물체를 꺼내어 증류수를 이용하여 3차례 세척하였다.

<1-2> 식물체 재료의 균질화

식물체 재료를 균질화 시키기 전에 50 ml 코니칼 튜브의 밑 부분에 종이 (가정용 키친 타올)를 1-2장 채운 후 남은 공간에 고정이 완료된 식물체를 넣었다. 이어서 원심분리 (5000 rpm, 10분)를 하여 식물체의 수분이 종이에 흡수되게 하였다. 수분이 흡수된 종이는 버리고 다시 다른 종이로 교체하여 원심분리하는 방법을 수차례하면 종이에 묻어 나오는 수분의 량이 점점 적어지게 되고 따라서 식물체의 수분 함량은 최소가 된다. 수분이 충분히 제거된 식물체는 막자 사발에 넣고 액체 질소를 이용하여 갈아서 분말처럼 만들었다. 미리 차갑게 해둔 완충용액 (Tris/HCl pH 7.2, 10 mM)을 막자 사발에 천천히 부어서 잘 섞어 현탁시켰다. 식물체 현탁 용액은 균질기(가정용 믹서기) 에 옮긴 다음 2분 동안 균질화(homogenization)를 시켜주었다.

<1-3> 셀룰라제 ( cellulase ) 및 프로테나제( proteinase ) K 처리

균질화된 식물체 용액은 여과지 (Miracloth, Calbiochem) 2겹을 이용하여 걸러서 50 ml의 원추형 튜브에 모았다. 여과지를 통과한 용액은 원심분리 (8000 rpm, 20 분)를 시켜주었다. 이 단계까지만 처리하여도 보통 핵이 포함된 것으로 추정되는 흰색 침전이 조금씩 육안으로 보이기 시작한다. 참고로 동·식물의 핵은 일반적으로 흰색/회색을 띄고 있으며 원심분리를 하면 일반적으로 튜브의 밑 부분에 침전되어 있다 (Ram J. Singh, 2002). 원심분리 이후 상등액은 버리고 침전물은 완충용액(K-phosphate, pH 6.0, 25 mM, MgCl₂ 5 mM)에 천천히 현탁 시켰다. 이어서 상업용 셀룰라제(제조사: Sigma, U.S.A) (10 unit) 분말을 0.4 mg/ml 농도로 천천히 첨가한 다음 37℃에서 2시간 동안 배양하며 반응 튜브를 거꾸로 뒤집어 흔드는 방식으로 효소 반응의 중간 중간에 잘 섞어주었다. 2 시간의 배양이 끝난 후, 원심분리 (8000 rpm, 20분)를 하여 상등액을 버리고 다른 완충용액 (Tris/HCl, pH 7.5, 50 mM, MgCl₂ 5 mM)으로 바꾸어 주었다. 이어서 프로테나제(proteinase) K(제조사: (주)바이오니아) (5 unit) 를 0.2 mg/ml 농도로 식물체 현탁액에 천천히 첨가한 다음 37℃ 에서 1 시간 동안 추가로 배양하였다. 효소 배양이 끝나면 원심분리 (8000 rpm, 20분)를 한 후 상등액을 제거하였다. 이어서 완충액 (Tris/HCl, pH 7.2, 10 mM)을 이용하여 현탁 시킨 후 같은 방법으로 원심분리하고 상등액을 버리는 과정을 2회 이상 반복하여 세포벽 분해산물 들과 잔여 효소들을 완전히 제거하였다.

<1-4> 엽록체 및 색소의 제거

효소 처리가 끝난 식물체 침전물은 완충액 (Tris/HCl, pH 7.2, 10 mM) 에 현탁을 시킨 후 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 다시 균질화를 시켜주었다. 원심 분리 (8000 rpm, 20분)를 하여 상등액을 제거하였다. 동·식물의 핵은 일반적으로 흰색/회색을 띄며 원심 분리 이후 아래쪽 한 곳에 모이는 점을 이용하여 핵이 아닌 초록색 부분의 상당 부분을 수작업으로 조심스럽게 제거해주었다. 이 과정만 처리하여도 전체 침전물 중에서 상대적으로 핵이 차지하는 비율이 상당히 높고 색소 등이 차지하는 비율이 낮아지게 된다. 다음에 완충용액 (Tris/HCl, pH 7.2 10 mM + sucrose 25%)에 현탁시킨 후 잘 섞어 준 다음 원심분리 (8000 RPM, 20 분)를 하였다. 원심분리 이후 상등액을 버리는 단계에서 엽록체, 색소 등이 다시 상당히 제거 된다.

방향족 화합물의 유도체가 주성분인 식물체의 각종 색소체(chlorophyll 등) 들은 대부분 물에 녹지가 않으며, 식물체 세포를 파괴시키면 이들이 상당히 많이 나오게 된다. 이러한 성질을 이용하여 식물체 침전물을 3차원 증류수에 현탁시킨 후 -20℃에 보존하여 얼렸다. 얼어버린 후 녹인 상태에서는 각종 색소들의 용해도가 더욱 떨어져 응집되는 현상을 관찰할 수가 있는데, 이를 여과지 (Miracloth) 에 통과시켜 상당량의 색소체들이 다시 제거되게 하였다. 이와 같이 얼리고 색소를 제거하는 방식을 2회 반복하여 색소들이 더욱 제거되도록 하였다.

<1-5> 수산화 암묘늄의 처리

시료들은 2 ml 의 에펜도르프 튜브에 옮기고 완충용액 (Tris/HCl, pH 7.2, 10 mM, 2 mM EDTA) 으로 현탁시킨 후, 수산화암모늄 (NH₄OH) 0.1 N을 첨가한 후 상온 (22-25℃) 에서 4시간 동안 보존하였다. 이어서 원심분리 (RPM 10,000, 10분)를 한 후 상층액을 제거하였다. 다시 완충용액 (Tris/HCl, pH 7.2, 10 mM, 2 mM EDTA) 을 첨가한 후 같은 조건의 원심분리를 한번 더 하고 상층액을 제거하였다.

<1-6> 염색질의 분리

시료가 침전되어 있는 에펜도르프 튜브에 모래 (white quartz, 50-70 mesh)를 전체부피의 10% 가 되도록 넣어주었다. 이어서 유리봉 등으로 모래가 섞인 시료에 힘을 주어 갈아주었다. 이어서 완충용액 (Tris/HCl, pH 7.2, 10 mM, MgCl₂ 5 mM)을 넣어 현탁 시켰다. 현탁된 용액은 필터 (0.45 um pore size)를 부착시킨 의료용 주사기를 이용하여 투과시켰다. 이렇게 하여 잔여 색소체, 모래 등이 걸러지고, 원하는 염색질을 분리하였다.

< 실험예 1> 식물체 세포벽 파괴 효과 검정

본 발명에서는 계면 활성제를 첨가하지 않고 효소(셀룰라제, 프로테나제 K) 및 수산화암모늄을 처리하여 세포벽의 파괴를 수월하게 하였기 때문에, 각각의 효소 또는 수산화암모늄 처리에 의한 세포벽의 약화 정도를 측정하는 실험을 하였다.세포의 파괴 정도를 확인하기 위해 거의 모든 생물체에 들어있는 시트르산 합성효소(citrate synthase)의 활성도를 측정하는 일반적인 방법을 이용하였다.

구체적으로, 애기장대 또는 토마토 시료에 셀룰라제, 프로테나제 K 또는 수산화암묘늄을 처리한 후 원심분리에 의해 얻어진 상등액의 시트르산 합성효소 활성도를 측정함으로써 세포벽의 파괴 효율을 측정하였다. 이를 위해 각각의 상등액 100 ul은 시트르산 합성효소 활성도 측정 키트(제조사: Sigma, U.S.A)에서 제공하는 활성도 측정 용액과 섞어 최종 부피가 1 ml이 되도록 하였다. 이를 잘 섞은 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 분광광도법(spectrophotometry)을 이용하여 효소 활성도를 측정하였다. 이는 DTNB(5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))의 산화 결과 생성된 TNB(5,5-thiobis-(2-nitrobenzoic acid))가 412 nm을 흡광하는 원리를 이용하였다.

<1-1> 셀룰라제 ( cellulase ) 처리 시간 및 농도에 따른 식물체 세포벽 파괴 효과 검정

애기장대의 시료에 셀룰라제를 처리하였을 경우 무처리에 비하여 시트르산 합성효소(citrate synthase)의 효소활성도가 약 80% 가량 상승하였다 (도 1). 또한 토마토 시료에 대하여도 비슷한 결과를 나타내었다 (도 2). 따라서 셀룰라제의 처리에 의해서 세포벽이 상당히 약화된 것을 알 수 있었다.

셀룰라제를 처리하는데 있어서 어느 정도의 시간이 적당한지를 확인하기 위해 효소 반응 시간(0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140분)을 각각 다르게 하였다. 그 결과, 애기장대 (도 3) 및 토마토 (도 4)에서 모두 셀룰라제를 80분 이상 처리하였을 때 세포벽 파괴 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

<1-2> 프로테나제 ( proteinase ) K 처리 시간 및 농도에 따른 식물체 세포벽 파괴 효과 검정

프로테나제 K를 여러 농도로 처리해 본 결과, 애기장대의 경우 약 3 unit 이상의 처리 조건에서 시트르산 합성효소(citrate synthase)의 활성도가 최대 57% 가량 증대됨을 알 수 있었다 (도 5). 또한 토마토의 경우는 약 70% 가량 증대됨을 알 수 있었다 (도 6). 따라서 프로테나제 K의 처리에 의해 세포벽이 어느 정도 약화됨을 알 수 있었다.

또한, 프로테나제 K의 적정 처리 시간을 시험해 본 결과, 애기장대 (도 7) 및 토마토 (도 8)에서 프로테나제 K를 60분 이상 처리하였을 때 세포벽 파괴 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

<1-3> 수산화암모늄 처리 시간 및 농도에 따른 식물체 세포벽 파괴 효과 검정

수산화 암모늄을 여러 농도로 처리해본 결과, 애기장대의 경우 수산화암모늄 0.1 N 의 처리에 의해 시트르산 합성효소(citrate synthase)의 활성도가 무처리 대비 약 185% 가량 상승하였다 (도 9). 따라서 수산화암모늄의 처리에 의하여 세포벽이 상당히 약화됨을 알 수 있었다. 또한 수산화암모늄의 처리 시간을 다르게 해본 결과 약 2시간 이상의 처리가 효과적임을 알 수 있었다 (도 11).

또한, 애기장대에서의 경향과 유사하게 토마토에 대하여서도 세포벽이 약화되는 특성을 보였다 (도 10 및 12).

< 실험예 2> 셀룰라제 , 프로테나제 K 및 수산화암모늄 처리에 의한 염색질 분리 효과 검정

셀룰라제, 프로테나제 K 및 수산화암모늄을 모두 이용하여 염색질을 추출하는 경우, 이 중 어느 하나를 이용하지 않는 경우와 비교하여 염색질 추출 효과가 우수한지 확인하는 실험을 하였다.

구체적으로, 애기장대와 토마토를 시료로 하여 상기 실시예 1에 따라 셀룰라제, 프로테나제 K 및 수산화암묘늄을 모두 이용하여 염색질을 추출하였다. 또한, 대조군으로 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하나 셀룰라제 및 수산화암모늄만 이용한 '프로테나제 K 무처리군', 프로테나제 K 및 수산화암모늄만 이용한 '셀룰라제 무처리군', 셀룰라제 및 프로테나제 K만 이용한 '수산화암모늄 무처리군'을 사용하였다. 분리된 염색질의 양은 전기영동 상의 밴드 강도 이외에도 일반적인 흡광도 측정(260 nm) 방법을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 애기장대의 경우 셀룰라제, 프로테나제 K 및 수산화암묘늄을 모두 처리하였을 때 대조군에 비해 우수한 염색질 분리 효과를 확인할 수 있었으며, 일반적인 계면활성제의 처리 없이도 상당량의 염색질을 추출할 수 있음을 확인하였다(도 13).

Claims (11)

1) 식물체 시료를 분쇄하여 균질화하는 단계;
2) 상기 균질화된 시료에 셀룰라제를 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 회수된 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조하고, 제조된 현탁액에 프로테나제 K를 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 회수된 침전물에 완충용액을 첨가하여 현탁액을 제조하고, 제조된 현탁액에 수산화암모늄을 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 회수된 침전물로부터 잔여 색소체를 제거하고, 염색질을 분리하는 단계;를 포함하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법 으로서,
상기 방법은 계면활성제를 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법.

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제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 셀룰라제는 0.2~0.5 mg/ml의 농도로 80~200분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 완충용액은 10~100 mM Tris-HCl, pH7.0~8.0에 1~10 mM MgCl₂을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 프로테나제 K는 0.1~0.3 mg/ml의 농도로 50~150분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 완충용액은 5~15 mM Tris-HCl, pH7.0~7.5에 1~5 mM EDTA를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 수산화암모늄은 0.05~0.15 N의 농도로 80~250분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 염색질을 추출하는 방법.

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