CN102628039B - 一种通用植物总rna提取法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通用的植物总RNA提取的方法。RNA样品中不含有破坏RNA和抑制逆转录和PCR反应的因子。该方法广泛的适用于各类植物总RNA的提取、纯化及制备之用。而且可以对不同来源、不同生长期、不同处理、不同组织样本的RNA进行分离、纯化。尤其是普通方法难以提取的富含多糖、多酚的植物的总RNA的理想提取方法。

Description

一种通用植物总RNA提取法
技术领域
本发明属于植物分子生物学，具体涉及植物总RNA的提取，纯化方法。
背景技术
植物不仅是整个地球生态系统的重要组成部分，而且还是人类食物和工业原材料的重要来源。随着生活水平的提高，居住环境日益恶化，有限非再生资源的逐渐耗竭，不同领域的研究人员在分子水平上对植物进行着深入研究，以解决当前人类所面临的粮食、环境和能源问题。由此，各种形式的植物分子生物学研究在世界范围内展开。RNA是植物体内重要生物大分子之一，参与植物结构组成、蛋白合成、基因表达调控等，因此众多植物分子实验需对不同来源、不同生长期、不同处理、不同组织样本的RNA进行分离、纯化，如EST和全长cDNA文库构建，RT-和实时定量PCR，基因芯片分析，SAGE, RACE, Northern杂交等等。而分离、纯化RNA的质量则是这些实验成败的关键。目前市场上出售的植物RNA提取试剂及试剂盒种类很多，但这些试剂盒和试剂往往都存在提取效率低，广谱性差，提取的总RNA有多糖、蛋白和多酚的污染，降解，价格昂贵等缺点。因此，提取植物完整的总RNA往往成为各大高校、研究院等研究人员最头疼的问题。本发明解决的技术问题是从各种植物材料（尤其是含多糖、多酚）的任何组织中提取完整的总RNA。
发明内容
该方法提取液主要由两种特殊的变性剂组成，两种变性剂相互作用，能有效地抑制提取体系中的RNA酶活性，一种变性剂在氯仿和酚混合液存在条件下不稳定容易沉淀，并且可以与多糖多酚形成复合物，另一种变性剂在氯仿和酚混合液存在条件下相当稳定，但不与多糖和多酚形成复合物，优化后的提取液使蛋白的可溶性大大降低。因此，通过样品、提取液、氯仿和酚相互混合剧烈振荡条件下能彻底破坏植物细胞组织，有效地去除多糖、多酚和蛋白。再在优化后的沉淀剂的作用下特异地沉淀体系中的总RNA。提取的具体过程如下：
1.在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350μl Tris-饱和酚，350μl氯仿，700μl提取液。
2.向离心管中加入液氮中粉碎后的植物材料0.1-0.25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25分钟。 (PVPP粉末可加可不加，加后有利于改善提取后总RNA的质量)
3. 13000rpm, 4℃离心 6-8分钟。
4.向另一1.5ml离心管加：350μl Tris-饱和酚和350μl氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5分钟。
5. 13000rpm, 4℃离心 5分钟。
6.取上清至另一含700μl氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5分钟。
7. 13000rpm, 4℃离心6-8分钟。
8.取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450μl沉淀剂。将步骤7离心后的上清液（700μl)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8分钟。
9. 10000rpm(约 9000-10000Xg)，4℃离心 10分钟。
10.弃上清,加1ml 75%乙醇,涮洗管壁后14000rpm, 4℃离心5分钟。
11.弃乙醇,气干后加100μlRNase-free水,充分溶解沉淀,取2μl电泳检测。（如果需要，可加1倍体积的氯仿处理一次，去除残余蛋白，用1/10体积乙酸钠和3倍体积乙醇沉淀回收总RNA，260/280比值一般都能大于2.0)。
其中提取液包含的物质及浓度范围：SDS：2.5％-10％，CHAPS：0.1-2％，NaCl：0.25M-1.5M，KAc：0.25-1.5M，K2HPO4：0.25M，KH2PO4：0.25M，PEG4000：0.01-10％，(NH4)2SO4：0.1-1M，Glycerol：0.5％-5％，其中：K2HPO4、KH2PO4为缓冲剂pH 7.5。
沉淀剂包含的物质及浓度范围：LiCl：4-10M，乙醇：5-50％，PEG8000：1％-20％。
该方法与以往技术相比有益效果。
该方法提取的植物总RNA无蛋白污染、多糖、多酚污染，并且不存在降解问题，0D260/0D280一般在2.0-2.2之间，电泳图谱中28S和18S rRNA条带的亮度比值大于2。
实例1提取杨树花芽总RNA
以杨树花芽为材料提取总RNA，杨树花芽富含多糖、多酚和黄酮类物质，用好多商业化的试剂盒很难提取无多糖、多酚和蛋白污染的总RNA。
1.在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350μl Tris-饱和酚，350μl氯仿，700μl溶液I和100μl2-巯基乙醇。
2.向离心管中加入液氮中粉碎后的杨树花芽粉末0.1-0.25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25分钟.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨过程中可加1/5质量的PVPP粉末)。
3. 13000rpm，4℃离心 6-8分钟。
4.向另一1.5ml离心管加：350μl Tris-饱和酚和350μl氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5分钟。
5. 13000rpm, 4℃离心5分钟。
6.取上清至另一含700μl氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5分钟。
7. 13000rpm，4℃离心 6-8分钟。
8.取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450μl溶液II。将步骤7离心后的上清液（700μl)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8分钟。
9. 10000rpm(约 9000-10000X g)，4℃离心 I0分钟。
10.弃上清，加1ml 75%乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5分钟。
11.弃乙醇,气干后加100μlRNase-free水,充分溶解沉淀,取1μl电泳检测。
实例2提取月季叶片总RNA
以为月季叶片材料提取总RNA，月季叶片富含多糖、多酚和黄酮类物质，用商业化的试剂盒很根本提取不出总RNA。
1.在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350μl Tris-饱和酚，350μl氯仿，700μl溶液I和100μl2-巯基乙醇。
2.向离心管中加入液氮中粉碎后的月季叶片粉末0.1-0.25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25分钟.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨过程中可加1/5质量的PVPP粉末)。
3. 13000rpm, 4℃离心 6-8分钟。
4.向另一 1.5ml离心管加：350μl Tris-饱和酚和350μl氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5分钟。
5. 13000rpm, 4℃离心 5分钟。
6.取上清至另一含700μl氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5分钟。
7. 13000rpm，4℃离心 6-8分钟。
8.取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450μl溶液II。将步骤7离心后的上清液（700μl)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8分钟。
9. 10000rpm(约 9000-10000X g)，4℃离心 I0分钟。
10.弃上清，加1ml 75%乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5分钟。
11.弃乙醇,气干后加100μlRNase-free水,充分溶解沉淀,取1μl电泳检测。

Claims (3)

1.一种提取杨树花芽或月季叶片总RNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350μl Tris-饱和酚，350μl氯仿，700μl提取液，其中提取液包含的物质及浓度如下，
SDS  10％、CHAPS 2％、NaCl 1.5M、KAc 1.5M，
K2HPO4 0.25M、KH2PO4 0.25M、PEG4000 10％、(NH4)2SO4 1M，
甘油 5％，
其中，K2HPO4、KH2PO4为缓冲剂，pH为 7.5；
2)向离心管中加入0.1-0.25g的液氮中粉碎后的植物材料，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25分钟；
3)13000rpm，4℃离心6-8分钟；
4)向另一1.5ml离心管加：350μl Tris-饱和酚和350μl氯仿，将步骤3）离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5分钟；
5)13000rpm，4℃离心5分钟；
6)取上清至另一含700μl氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5分钟；
7)13000rpm，4℃离心6-8分钟；
8)取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450μl沉淀剂，将步骤7）离心后的上清液700μl转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8分钟，其中沉淀剂包含的物质及浓度如下：
LiCl 10M，
乙醇 50％，
PEG8000 20％；
9)10000rpm，4℃离心10分钟；
10)弃上清，加1ml 75％乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5分钟，弃乙醇，气干后加100μl RNase-free水，充分溶解沉淀，取2μl电泳检测。
2.按照权利要求1的方法，在步骤2）的离心管中加入PVPP粉末。
3.按照权利要求1的方法，在步骤10）之后，还需要加1倍体积的氯仿处理一次，去除残余蛋白，然后用1/10体积乙酸钠和3倍体积乙醇沉淀回收总RNA。
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