CN113278610B - 一种秋茄rna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RNA提取的生物科学技术领域，特别是一种秋茄RNA的提取方法。它包含液氮磨样、水浴裂解、沉淀去杂、低速离心、磁珠吸附、洗涤、干燥、转移等步骤，它通过改良磁珠纯化核酸的方法实现秋茄RNA的纯化，其目的是为了提供一种能够提取高质量的秋茄RNA的提取方法，与现有技术相比，它不需要使用氯仿等管制危险化学品，同时，提取率和纯度都有大幅度提高。

Description

一种秋茄RNA的提取方法
技术领域
本发明涉及RNA提取的生物科学技术领域，特别是一种秋茄RNA的提取方法。
背景技术
秋茄是红树科秋茄树属植物，红树林的常见品种，果实形状似笔，成熟后跟茄子非常相似。由于受到海水周期性浸淹，秋茄富含单宁酸，被砍伐后会氧化变成红色。秋茄也是最能够耐寒的红树林种类之一，兼具陆地植物群落和海洋植物群落的双重特性，在自然生态平衡中有特殊作用。红树林群落除了在湿地生态系统中具有促进土壤沉积物形成、过滤有机物和污染物以及净化水质等重要作用外，还有抵抗潮汐和洪水冲击、减缓风浪、调节水流以及保护堤岸等功能。
随着现代分子生物学技术的发展，对秋茄的研究越来越深入。秋茄基因组序列已经公布，秋茄转录组测序、基因克隆及表达分析已成为秋茄分子生物学研究的热点，而这些研究的重要前提条件是纯化获得高质量的RNA，因此，建立秋茄高质量RNA提取的方法具有重要意义。
实验室曾采用传统Trizol法对秋茄RNA进行提取，但由于红树林植物的共性特征，秋茄叶片及根系含有大量的多糖多酚类及单宁等次生代谢产物，在核酸分离纯化时，RNA容易被降解，导致难以提取高质量的秋茄RNA(如图1、图2所示)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有RNA提取方法的不足，开发一种秋茄RNA的提取方法，使之能够提取高质量的秋茄RNA。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术解决方案：一种秋茄RNA提取的方法，其特征在于其包含以下步骤：
(1)液氮磨样：取秋茄根系或叶片，放入液氮研磨成粉末，迅速转移不少于100mg粉末至无RNA酶的第一EP管中；加600ul Buffer A，立即涡旋混匀；
所述Buffer A按重量百分比由以下组分组成：
PVP401％-3％，巯基乙醇1％-2％，Na2S2O51％-2％，NaCl 2％-3％，Tris 1％-1.8％，EDTA-2Na 1.5％-2％，SDS 1％-2％，余量为水溶剂，室温保存；
(2)水浴裂解：将所述第一EP管在50℃水浴30分钟，每隔10分钟颠倒20次。水浴也可以使用一个转子放入50℃烘箱，可以使裂解液充分均匀。
(3)沉淀去杂：加200μl Buffer B，上下颠倒所述第一EP管20次，充分混合；所述Buffer B为5M KAc溶液，保存温度4℃。
(4)低速离心：离心机预冷至4℃，所述第一EP管在5000g离心10min，采用低速离心在去除固体杂质的同时，尽可能保证秋茄RNA不被破坏。
(5)取上清液：转移上清液约450μl到第二EP管，不触动沉淀；
(6)磁珠吸附：加450μl的Buffer C和25μl的磁珠，混合倒管20次，将所述第二EP管在室温孵育5分钟，轻离心1s，放置在磁力架上大约3min，直到溶液变清；吸去上清液，不触动磁珠；
所述Buffer C按重量百分比由以下组分组成：PEG8000 20％-25％，NaCl 15％-20％，余量为水溶剂，室温保存；
(7)洗涤：向所述第二EP管加入1ml Wash Solution，从所述磁力架上取下所述第二EP管，颠倒20次，轻离心1s，将所述第二EP管放置在所述磁力架上约30s，吸去上清液，不触动磁珠；
所述Wash Solution为DEPC水配置的80％EtOH，现配现用；
(8)重复步骤(7)一次；
(9)干燥：开盖，让磁珠空气干燥1-2min。干燥时间不宜太长或太短，均可能降低洗脱效率。
(10)洗脱：向所述第二EP管中的磁珠加80μl经50℃预热的RNase-free ddH2O，缓慢吸打悬浮磁珠，避免磁珠聚集成团显著降低洗脱效率，轻离心1s后，放置在磁力架上约2min，直到溶液变清；
(11)转移：将洗脱后的溶液转移75μl至一个新的第三EP管中，-70℃保存备用。
本发明为了进一步提取高质量的秋茄RNA，对所述技术方案进行进一步设置：所述秋茄根系优先选用幼嫩根系，或所述秋茄叶片为秋茄任一新鲜叶片，或所述秋茄根系或叶片为鲜样液氮速冻后保存于-70℃的样品。
本发明为了进一步提高秋茄根系或叶片研磨粉末的裂解效果，对所述技术方案进行进一步设置：所述Buffer A各组分按以下份量进行配制：1g PVP40，1ml巯基乙醇，1gNa2S2O5，2.5g NaCl，20ml 0.5M Tris，20ml 0.25M EDTA-2Na，1g SDS，加水定容至100ml。
本发明为了进一步提高秋茄根系或叶片研磨粉末的裂解效果，对所述技术方案进行进一步设置：所述Buffer A各组分按以下份量进行配制：2g PVP40，2ml巯基乙醇，2gNa2S2O5，3g NaCl，25ml 0.5M Tris，2，2ml 0.25M EDTA-2Na，2g SDS，加水定容至100ml。
本发明为了进一步提高秋茄根系或叶片研磨粉末的裂解效果，对所述技术方案进行进一步设置：所述Buffer A各组分按以下份量进行配制：3g PVP40，1.5ml巯基乙醇，1.5gNa2S2O5，2g NaCl，30ml 0.5M Tris，24ml 0.25M EDTA-2Na，1.5g SDS，加水定容至100ml。
本发明为了进一步提高核酸纯化效果，对所述技术方案进行进一步设置：所述Buffer C各组分按以下份量进行配制：20g PEG8000，15g NaCl，加水定容至100ml，室温保存。
本发明为了提高洗脱效率，对所述技术方案进行进一步设置：在所述步骤(10)中，所述RNase-free ddH2O在50℃预热后使用。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA胶图，其中：
1-4为传统Trizol法提取的4个秋茄根系RNA样品RNA_1……RNA_4；
5-8为本实施例1--实施例4提取的4个秋茄根系RNA样品RNA_5……RNA_8，5-6样品量少，7-8样品量多。
M为1kb DNA ladder(即用型DNA分子量标准)，由下往上DNA片段大小分别为1Kb、2Kb、3Kb……10Kb。
图2为Nanodrop 2000检测RNA浓度及质量。
图3为Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA质量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例1主要包括以下步骤：
(1)液氮磨样：本实施例1使用的组织样品为-70℃冻存秋茄根系，放入液氮研磨成粉末，迅速转移100mg粉末(作为样品RNA_5)或200mg粉末(作为样品RNA_7)至无RNA酶的1.5ml第一EP管中；加600ul Buffer A，立即涡旋混匀；
所述Buffer A按以下组分与份量进行配制：1g PVP40，1ml巯基乙醇，1g Na2S2O5，2.5g NaCl，20ml 0.5M Tris，20ml 0.25M EDTA，1g SDS，加水定容至100ml，室温保存。
(2)水浴裂解：将所述第一EP管在50℃水浴30分钟，每隔10分钟颠倒20次；
(3)沉淀去杂：加200μl Buffer B，上下颠倒所述第一EP管20次，充分混合；
所述Buffer B为5M KAc溶液，保存温度4℃；
(4)低速离心：离心机预冷至4℃，所述第一EP管在5000g离心10min；
(5)取上清液：转移上清液约450μl到2ml第二EP管，不触动沉淀；
(6)磁珠吸附：加450μl的Buffer C和25μl的磁珠，混合倒管20次，将所述第二EP管在室温孵育5分钟，轻离心1s，放置在磁力架上大约3min，直到溶液变清；吸去上清液，不触动磁珠；
所述Buffer C按以下组分与份量进行配制：20g PEG8000，15g NaCl，加水定容至100ml；室温保存。
(7)洗涤：向所述第二EP管加入1ml Wash Solution，从所述磁力架上取下所述第二EP管，颠倒20次，轻离心1s，将所述第二EP管放置在所述磁力架上约30s，吸去上清液，不触动磁珠；
所述Wash Solution为DEPC水配置的80％EtOH，现配现用；
(8)重复步骤(7)一次；
(9)干燥：开盖，让磁珠空气干燥1-2min；
(10)洗脱：向所述第二EP管中的磁珠加80μl RNase-free ddH2O，缓慢吸打悬浮磁珠，轻离心1s后，放置在磁力架上约2min，直到溶液变清；
(11)转移：将洗脱后的溶液转移75μl至一个新的1.5ml第三EP管中，-70℃保存备用。
本实施例1获得的RNA样品RNA_5、RNA_7琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000检测结果如图1及图2所示，Agilent 2100 bioanalyzer检测结果如图3所示。
实施例2
本实施例2的提取步骤与实施例1基本相同，本实施例2秋茄根系研磨粉末的组织样品量为100g，作为样品RNA_6，不同点在于Buffer A配制份量不同：本实施例2中所述Buffer A各组分按以下份量进行配制：2g PVP40，2ml巯基乙醇，2g Na2S2O5，3g NaCl，25ml0.5M Tris，22ml 0.25M EDTA-2Na，2g SDS，加水定容至100ml。
本实施例2获得的RNA样品RNA_6琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000检测结果如图1及图2所示，Agilent 2100 bioanalyzer检测结果如图3所示。
实施例3
本实施例3的提取步骤与实施例1基本相同，不同点在于以下几方面：
1、秋茄根系研磨粉末的组织样品量为200g，作为样品RNA_8。
2、Buffer A配制份量不同：本实施例3中所述Buffer A各组分按以下份量进行配制：3g PVP40，1.5ml巯基乙醇，1.5g Na2S2O5，2g NaCl，30ml 0.5M Tris，24ml 0.25M EDTA-2Na，1.5g SDS，加水定容至100ml。
本实施例3获得的RNA样品RNA_8琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000检测结果如图1及图2所示，Agilent 2100 bioanalyzer检测结果如图3所示。
从图1琼脂糖凝胶电泳结果中可以看出，传统Trizol法提取秋茄RNA失败，而本发明提取的RNA样品能明显检测到RNA特征条带。从图2的Nanodrop 2000检测结果说明，本发明提取的RNA样品浓度较高且污染少。从图3的Agilent 2100 bioanalyzer检测结果说明本发明提取的RNA样品主带明显，RNA丰富高，能满足转录组建库测序需求。本发明的秋茄RNA提取方法获得了高质量的秋茄RNA样品。
综上所述，本发明相比现有技术具有以下优点：本发明通过改良磁珠纯化核酸的方法实现秋茄RNA的纯化，秋茄由于存在多糖多酚及单宁等易氧化次生代谢产物，传统Trizol法很难提取到高质量的秋茄RNA。使用本发明方法提取秋茄RNA不需要使用氯仿等管制危险化学品，同时，提取率和纯度都有大幅度提高。

Claims (7)

1.一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于其包含以下步骤：
(1)液氮磨样：取秋茄根系或叶片，放入液氮研磨成粉末，迅速转移不少于100mg粉末至无RNA酶的第一EP管中，加600ul Buffer A，立即涡旋混匀；
所述Buffer A按重量百分比由以下组分组成：
PVP40 1％-3％，巯基乙醇1％-2％，Na2S2O51％-2％，NaCl 2％-3％，Tris 1％-1.8％，EDTA-2Na 1.5％-2％，SDS 1％-2％，余量为水溶剂，室温保存；
(2)水浴裂解：将所述第一EP管在50℃水浴30分钟，每隔10分钟颠倒20次；
(3)沉淀去杂：加200μl Buffer B，上下颠倒所述第一EP管20次，充分混合；
所述Buffer B为5M KAc溶液，保存温度4℃；
(4)低速离心：离心机预冷至4℃，所述第一EP管在5000g离心10min；
(5)取上清液：转移上清液约450μl到第二EP管，不触动沉淀；
(6)磁珠吸附：加450μl的Buffer C和25μl的磁珠，混合倒管20次，将所述第二EP管在室温孵育5分钟，轻离心1s，放置在磁力架上大约3min，直到溶液变清；吸去上清液，不触动磁珠；
所述Buffer C按重量百分比由以下组分组成：PEG8000 20％-25％，NaCl 15％-20％，余量为水溶剂，室温保存；
(7)洗涤：向所述第二EP管加入1ml Wash Solution，从所述磁力架上取下所述第二EP管，颠倒20次，轻离心1s，将所述第二EP管放置在所述磁力架上约30s，吸去上清液，不触动磁珠；
所述Wash Solution为DEPC水配置的80％EtOH，现配现用；
(8)重复步骤(7)一次；
(9)干燥：开盖，让磁珠空气干燥1-2min；
(10)洗脱：向所述第二EP管中的磁珠加80μl RNase-free ddH2O，缓慢吸打悬浮磁珠，轻离心1s后，放置在磁力架上约2min，直到溶液变清；
(11)转移：将洗脱后的溶液转移75μl至一个新的第三EP管中，-70℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于所述秋茄根系优先选用幼嫩根系，或所述秋茄叶片为秋茄任一新鲜叶片，或所述秋茄根系或叶片为鲜样液氮速冻后保存于-70℃的样品。
3.根据权利要求2所述的一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于所述BufferA按以下组分与份量进行配制：1g PVP40，1ml巯基乙醇，1g Na2S2O5，2.5g NaCl，20ml 0.5M Tris，20ml0.25M EDTA-2Na，1g SDS，加水定容至100ml。
4.根据权利要求2所述的一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于所述Buffer A按以下组分与份量进行配制：2g PVP40，2ml巯基乙醇，2g Na2S2O5，3g NaCl，25ml 0.5M Tris，22ml0.25M EDTA-2Na，2g SDS，加水定容至100ml。
5.根据权利要求2所述的一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于所述Buffer A按以下组分与份量进行配制：3g PVP40，1.5ml巯基乙醇，1.5g Na2S2O5，2g NaCl，30ml 0.5M Tris，24ml 0.25M EDTA-2Na，1.5g SDS，加水定容至100ml。
6.根据权利要求3或4或5所述的一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于所述Buffer C按以下组分与份量进行配制：20g PEG8000，15g NaCl，加水定容至100ml，室温保存。
7.根据权利要求6所述的一种秋茄RNA的提取方法，其特征在于在所述步骤(10)中，所述RNase-free ddH2O在50℃预热后使用。
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