CN103421764B - 一种真菌病毒双链rna快速提取试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种真菌病毒双链RNA快速提取试剂盒及应用。包含细胞裂解液、核酸吸附液、核酸洗涤液和双链RNA琼脂糖凝胶电泳试剂。采用新的缓冲溶液系统，以硅膜替代纤维素粉作吸附介质，无需苯酚等有机试剂，通过细胞裂解液和核酸吸附液的反应将蛋白质及绝大部分DNA、多糖等杂质以化学沉淀方式除去，最后通过乙醇调整吸附条件使双链RNA有效结合于硅膜上并洗脱得到纯化的双链RNA。可从低至0.3克菌丝样品中制备高质量双链RNA。整个提取过程在1小时内。本发明省去了传统方法中有机试剂抽提及吸取上清的步骤，涉及过柱等操作均以离心方式完成，适用于大量样品的高通量处理。

Description

一种真菌病毒双链RNA快速提取试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于试剂盒制备技术领域，具体涉及一种从真菌中快速提取病毒双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)的试剂盒及其应用方法。

背景技术

单链RNA病毒在增殖过程中需要对自身的核酸进行复制，进而组装形成新的病毒粒子，完成对寄主的系统性侵染。双链RNA是病毒在这一复制过程中产生的一类特殊的RNA。其存在往往预示着病毒的侵染和复制。故而病毒双链RNA已经成为判断及鉴定未知单链RNA病毒的重要依据。此外，由于双链RNA直接含有病毒的基因组序列，故其对于病毒的分子生物学研究也具有重要意义。因此，双链RNA的提取在这一过程中显得尤为重要，其质量将直接影响后续实验结果。

现有的双链RNA提取方法均基于纤维素粉在一定条件下对双链RNA的吸附作用(Bar-Joseph et al.，1983；Valverde et al.，1990；邱立友等，专利公开号：CN101086011)。其主要步骤为：使用含十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液裂解细胞后，用中性酚对蛋白质等杂质进行抽提。向抽提后的细胞裂解液中加入无水乙醇至体积/体积比达到15％-18％时，使用纤维素粉制成的填充柱进行过滤吸附。最后对填充柱进行洗涤，并加入去离子水或TE(Tris-EDTA)缓冲溶液进行洗脱回收双链RNA。这类方法虽然已经证明对真菌及植物病毒双链RNA的提取具有较好效果，然而也存在以下问题：首先，由于纤维素粉对双链RNA的吸附效率并不高，为了得到足够的双链RNA用于后续实验，此类方法往往需要较多的生物材料用于双链RNA的提取。一些稀有的珍贵样品可能因为样品量不够而无法得到满足后续实验要求的足够的双链RNA。其次，此类方法的实验周期较长。由于真菌菌丝及一些植物样品中多糖含量较高，往往使得细胞裂解液较为粘稠。在过柱吸附时往往造成溶液无法顺利通过纤维素柱，而只能由其在重力作用下缓慢渗透通过。造成操作时间的延长并增加了双链RNA降解和污染的风险。此外，由于最后回收双链RNA需要较大体积的洗脱液，得到的双链RNA还需要进一步进行乙醇沉降浓缩，才能最终用于后续实验。进一步延长了实验时间，使得整个实验过程需要1-2天时间才能完成。再次，由于提取所要求的样品量较大，则整个实验操作无法在微量离心管中完成。限制了一次实验中所能处理的样品数量，不利于大量样品的高通量处理。近年来，一些研究者先后对植物及真菌病毒双链RNA的提取方法进行了改进。与上述方法相比，改进后的方法省略了用酚对细胞裂解液进行抽提的步骤，缩短了操作时间(Tzanetakis and Martin，2008；Balijja et al.，2008)。然 而，这些改进仍然没有从根本上解决传统方法操作步骤多、样品起始量大、处理样品数量有限的问题。此外，由于改进后的方法中并没有添加额外的步骤除去蛋白质等杂质，势必对双链RNA的质量造成不利影响。综上所述，一种操作步骤更为简单、更适合于在微量离心管中完成的高通量提取方法将为双链RNA的提取及病毒的分子生物学鉴定带来更大的便利。

发明内容

本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种高通量的简单快捷的真菌病毒双链RNA提取试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的应用。本发明的试剂盒具有操作步骤更为简单，更适合于在微量离心管中完成的高通量提取方法将为双链RNA的提取及病毒的分子生物学鉴定带来更大的便利，所获得双链RNA可用于相关的病毒分子生物学的后续研究中。

实现本发明的技术方案如下所述。

一种适用于真菌病毒双链RNA快速提取试剂盒，其包含以下试剂组合物：

(1)细胞裂解液，由阴离子去污剂、无机盐、pH缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂组成，具体是：

a.按重量/体积计十二烷基硫酸钠(SDS)2％；

b.按重量/体积计聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)4％；

c.氯化钠0.5mol/L；

d.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.0)(Tris-HCl，pH8.0)50mmol/L；

e.乙二胺四乙酸钠(pH8.0)(EDTA，pH8.0)25mmol/L；

f.按体积/体积计巯基乙醇1％；

(2)核酸吸附液，由离液盐、无机盐、pH缓冲剂组成，具体是：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.氯化钾1.5mol/L；

c.氯化铵0.5mol/L；

d.乙酸钠(pH5.9)100mmol/L；

(3)双链RNA吸附介质为：含硅膜的微量吸附柱(spin column)

(4)核酸洗涤液，由离液盐、无机盐、pH缓冲剂、乙醇组成，具体是：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.氯化钠1.5mol/L；

c.乙酸钾(pH5.6)50mmol/L；

d.按体积/体积计乙醇37％；

(5)双链RNA琼脂糖电泳试剂：

a.TAE2M三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1M醋酸，100mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)；

b.S1核酸酶(S1nuclease)500U；

c.DNA酶I(DNase I，RNase-free)1000U；

d.DNA分子量标记1.5ml；

e.6倍上样缓冲液(6×loading buffer)，(购自宝大连生物工程有限公司，由20mM EDTA，pH8.0、按体积/体积计37％甘油和按重量/体积计0.5％溴酚蓝组成)；

本发明的试剂盒可用于真菌病毒双链RNA快速提取，其具体应用方法包括样品采集、双链RNA提取及双链RNA检测，步骤如下：

(1)样品采集：将疑似感染病毒的菌种于铺有玻璃纸的固体培养基表面进行培养，待菌丝长满玻璃纸后用刀片刮下并称重；或将液体培养的菌丝经去离子水清洗后用纱布过滤，冻干保存后后称重；

(2)配制细胞裂解液所使用的溶剂为去离子水。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(pH8.0)(Tris-HCl，pH8.0)配制为1mol/L贮存液，使用时按配制细胞裂解液所需要的用量进行取用。乙二胺四乙酸钠(pH8.0)(EDTA，pH8.0)使用氢氧化钠水溶液调整pH值，并配制为0.5mol/L的贮存液，使用时按配制细胞裂解液所需要的用量进行取用；

(3)配制核酸吸附液所使用的溶剂为去离子水；

(4)配制核酸洗涤液所使用的溶剂为去离子水，核酸洗涤液中将异硫氰酸胍、氯化钠、乙酸钾等调整至上述浓度后，待溶液冷却至室温后加入乙醇至体积/体积比37％；

(5)S1核酸酶为180U/μl，其反应体系：1×S1nuclease buffer，S1核酸酶；

(6)DNA酶I反应体系为：1×DNase buffer，DNA酶I；

(7)双链RNA的提取：

(a)取0.3克样品，使用液氮研磨成干粉后，加入含800μl细胞裂解液的离心管中，剧烈震荡匀浆；

(b)65℃水浴10分钟，每隔5分钟上下颠倒混匀数次；

(c)室温条件下，12000rcf离心5分钟；

(d)加入1.5倍体积核酸吸附液(即1200μl核酸吸附液)于离心管中，轻柔颠倒混匀，此时离心管内有沉淀产生；

(e)室温下放置2分钟后，16000rcf离心5分钟；

(f)取上清至新离心管中，加入上清一半体积的无水乙醇，震荡混匀后加入含硅膜的吸附柱中；

(g)室温下，12000rcf离心30秒使混有乙醇的上清通过吸附柱中的硅膜并弃去滤过的溶液；

(h)向吸附柱中加入800μl核酸洗涤液；

(i)室温下，12000rcf离心30秒，弃去滤过的洗涤液；

(j)向吸附柱中加入80％乙醇溶液800μl；

(k)室温下，12000rcf离心30秒并弃去滤过的乙醇；

(l)室温下，12000rcf离心1分钟，除去吸附膜上残留的乙醇；

(m)将吸附柱转移至新的离心管上，向吸附膜中心加入65℃预热的不含RNA酶的去离子水50μl溶解双链RNA；

(n)室温放置1分钟后12000rcf离心2分钟收集双链RNA溶液，保存于-20℃；

(8)双链RNA的检测：

(a)酶切反应体系：

(a.1)DNA酶I(DNase I，RNase free)反应体系如表1

表1：DNA酶I反应体系如表

(a.2)S1核酸酶反应体系如表2：

表2S1核酸酶反应体系

(b)使用苯酚对反应体系进行抽提，加入等体积异丙醇和体积/体积比1/10的乙酸钠水溶液(pH5.2)于-20℃双链RNA进行沉降；

(c)琼脂糖凝胶电泳检测；

S1核酸酶在较低的酶浓度条件下仅消化单链RNA，而在高浓度下则可连同双链RNA一同消化，故应控制S1核酸酶的用量，以保证双链RNA不被消化。推荐用量为50μl消化体系中加入10U S1核酸酶

由于双链RNA经酶消化后引入了酶蛋白及缓冲液盐离子的污染，为了不影响后续分子生物学实验，故应通过苯酚抽提及异丙醇沉降除去这些污染。

由于真菌及植物病毒双链RNA的提取方法相同，故本发明的试剂盒亦可应用于植物病毒双链RNA的提取。采用本发明的试剂盒及其应用不需要使用特殊的设备和仪器，RNA提取步骤在室温下即可完成，可以广泛地应用于病毒双链RNA的检测及后续的分子生物学研究。此外，由于细胞裂解液中的SDS可以与蛋白质结合。而在加入核酸吸附液后，SDS通过与氯化钾的反应及在高浓度的离液盐条件下以沉淀形式析出而被除去。在此过程中与蛋白质结合的DNA及多糖也被除去，故本发明可以从多糖含量高的真菌中提取得到双链RNA。

综上所述，本发明的双链RNA提取技术与已经报道的提取方法相比具有以下优点：

(1)无需苯酚等有机试剂抽提处理，整个双链RNA提取操作在1小时内即可完成。

(2)使用硅膜吸附柱替代传统方法中的纤维素粉作为双链RNA的吸附介质，使得对双链RNA的吸附可以在极短的时间内(约30秒)通过离心完成，节省了操作时间。

(3)所需要的起始样品量少，可以从低至0.3克样品中提取得到高纯度的双链RNA，更适合于珍贵样品的提取。

(4)操作小型化，在微量离心管中即可完成，适合大量样品的高通量处理。

(5)采用了独特的沉降方法，大大减少了双链RNA中DNA及多糖的污染。

(6)基于本发明所述的双链RNA提取方式和现有的核酸自动化分离平台的基本原理，本发明所述的提取步骤拥有良好的自动化应用前景。

附图说明

图1：从梨树轮纹病EW2322菌菌丝中提取得到的双链RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.0％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，Marker III)，2为未经DNA酶I及S1核酸酶消化的双链RNA，3为经过DNA酶I及S1核酸酶消化后的双链RNA。

图2：从核盘菌Ep-1PNA367菌株中提取得到的双链RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.0％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，DNA ladder D15000)，2为未经DNA酶I及S1核酸酶消化的双链RNA。

图3：从核盘菌Sunf-M菌株液体培养的菌丝中提取得到的双链RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.0％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，DNA ladder D15000)，2为未经DNA酶I及S1核酸酶消化的双链RNA，3为经过DNA酶I及S1核酸酶消化后的双链RNA。

具体实施方式：

实施例1试剂盒制备(组装)实施例

1、细胞裂解液配制：

a.按重量/体积计十二烷基硫酸钠2％；

b.按重量/体积计聚乙烯吡咯烷酮-404％；

c.氯化钠0.5mol/L；

d.pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mmol/L；

e.pH8.0的乙二胺四乙酸钠25mmol/L；

f.按体积/体积计巯基乙醇1％；

将十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠等药品准确称量后，按试剂1需配制的总体积分别加入1M pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和0.5M pH8.0的乙二胺四乙酸钠溶液至试剂1上述终浓度，以去离子水为溶剂溶解上述药品后定容至所需体积。临用前按体积/体积计加入巯基乙醇至1％；

2、核酸吸附液配制：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.氯化钾1.5mol/L；

c.氯化铵0.5mol/L；

d.pH5.9的乙酸钠100mmol/L；

准确称取异硫氰酸胍、氯化钠、氯化铵等药品后，以去离子水为溶剂将其溶解，按试剂2所需配制的总体积加入3M pH5.9的乙酸钠溶液至其终浓度为100mmol/L，定容至试剂2所需体积；

3、双链RNA吸附介质为：含硅膜的微量吸附柱(购自武汉摩尔肽生物工程有限公司)；

4、核酸洗涤液配制：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.氯化钠1.5mol/L；

c.pH5.6乙酸钾50mmol/L；

d.按体积/体积计乙醇37％；

准确称量异硫氰酸胍、氯化钠等药品，以去离子水为溶剂溶解后，按试剂4所配制的体积加入3M pH5.6的乙酸钾至50mmol/L。定容至所需体积后，加入乙醇至体积/体积计37％；

5、双链RNA琼脂糖凝胶检测试剂配制：

(a)50倍TAE100ml；

(b)S1核酸酶500U；

(c)50次消化反应的DNA酶I1000U；

(d)1.5ml的6倍体积的上样缓冲液；

将采用本发明及其应用得到的双链RNA经过S1核酸酶和DNA酶I消化后取5μl与1μl6倍体积上样缓冲液混合后于1倍的TAE中进行琼脂糖凝胶电泳。电泳完毕后经溴化乙锭(EB)染色后于琼脂糖凝胶系统下观察并确认双链RNA条带。

本实施例中的试剂盒是以0.3克菌丝为标准的配制的，一次配制可使用50次。

6、下列试剂在试剂盒中的计量如下：

(1)细胞裂解液40ml；

(2)核酸吸附液60ml；

(3)核酸洗涤液40ml；

(4)硅膜吸附柱50个；

(5)双链RNA琼脂糖凝胶检测试剂：

(a)50倍TAE100ml；

(b)S1核酸酶500U；

(c)50次消化反应的DNA酶I1000U；

(d)1.5ml的6倍体积的上样缓冲液；

将上述药物总装于试剂盒。按试剂盒的操作说明书(试剂盒的操作说明书的内容参照本发明实施例2-4的方法撰写)操作。

实施例2使用本发明的试剂盒及其应用从梨轮纹病菌菌丝中提取病毒双链RNA(应用实施例1)

本实施例中梨树轮纹病(Botryosphaerin.dothidae)病菌(EW2322)来源于湖北省武汉市江夏区湖北省农业科学院果树茶叶研究所梨园，从金水1号梨的枝条中分离获得，现保存于华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心，分离该梨树轮纹病菌方法为报道的常规方法，这些方法从植物病理学，果树病理学教科书、操作手册或公开出版物中都可以获得指导，分离梨树轮纹病菌对地域没有限制，凡是有梨树栽培的果园都可以分离得到，本发明的实施不限于该菌株。

(1)菌丝的培养和收集：将梨树轮纹病菌株接种于铺有玻璃纸的PDA培养基(Booth，1971)表面，待菌丝长满培养皿表面后用刀片将菌丝刮下；

(2)双链RNA提取：

(a)称取0.3克菌丝，用液氮研磨后加入800μl细胞裂解液。65℃水浴10分钟，每5分钟颠倒混匀数次；

(b)室温12000rcf离心5分钟；

(c)加入1.5倍体积，即1200μl核酸吸附液，轻柔颠倒混匀后，室温放置2分钟；

(d)室温16000rcf离心5分钟；

(e)取上清至新离心管中，加入上清一半体积的无水乙醇，震荡混匀后加入含硅膜的吸附柱中；

(f)室温下，12000rcf离心30秒使混有乙醇的上清通过吸附柱中的硅膜并弃去滤过的溶液；

(g)向吸附柱中加入800μl核酸洗涤液；

(h)室温下，12000rcf离心30秒，弃去滤过的洗涤液；

(i)向吸附柱中加入80％乙醇溶液800μl；

(j)室温下，12000rcf离心30秒并弃去滤过的乙醇；

(k)室温下，12000rcf离心1分钟，除去吸附膜上残留的乙醇；

(l)将吸附柱转移至新的离心管上，向吸附膜中心加入65℃预热的不含RNA酶的去离子水50μl溶解双链RNA；

(m)室温放置1分钟后12000rcf离心2分钟收集双链RNA溶液，保存于-20℃；

(3)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测：采用1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，电压强度为5V/cm。电泳30分钟后，将凝胶用溴化乙锭水溶液染色10分钟，于琼脂糖凝胶系统中观察双链RNA条带。如图1所示为梨树轮纹病菌菌丝中提取得到的双链RNA凝胶电泳图像。图1中的第一泳道为分子量标记D1500 (购自北京天根生化有限公司)；第二泳道为未经DNA酶I及S1核酸酶消化的双链RNA；第三泳道为经过DNA酶I及S1核酸酶消化后的双链RNA。

实施例3使用本发明的试剂盒从核盘菌Ep-1PNA367菌株中提取病毒双链RNA(应用实施例2)

(1)核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)Ep-1PNA367菌株2009年从华中农业大学发病油菜田间菌核病植株中分离得到，参见文献：Huiquan Liu，Yanping Fu，Daohong Jiang，Guoqing Li，Jun Xie，Youliang Peng，Xianhong Yi，and Said A.Ghabrial.A Novel Mycovirus That Is Related to the Human Pathogen Hepatitis E Virus and Rubi-Like Viruses.JOURNAL OF VIROLOGY，Feb.2009，1981-1991，专利文献：专利申请号201110321570.7，分离核盘菌是一种通用方法，一般从油菜栽培的田里都能分离得到，对地域性没有限制，另外，本发明的试验验证不限于上述核盘菌菌株。

(2)菌丝的培养和收集：将步骤(1)的菌株接种于铺有玻璃纸的固体培养基(Booth，1971)(成分按实施例1)表面，待菌丝长满培养皿表面后用刀片将菌丝刮下；

(3)双链RNA提取：

(a)称取0.3克菌丝，用液氮研磨后加入800μl细胞裂解液。65℃水浴10分钟，每5分钟颠倒混匀数次；

(b)室温下12000rcf离心5分钟；

(c)加入1.5倍体积，即1200μl核酸吸附液，轻柔颠倒混匀后，室温放置2分钟；

(d)室温下16000rcf离心5分钟；

(e)取上清至新离心管中，加入上清一半体积的无水乙醇，震荡混匀后加入含硅膜的吸附柱中；

(f)室温下，12000rcf离心30秒使混有乙醇的上清通过吸附柱中的硅膜并弃去滤过的溶液；

(g)向吸附柱中加入800μl核酸洗涤液；

(h)室温下，12000rcf离心30秒，弃去滤过的洗涤液；

(i)向吸附柱中加入80％乙醇溶液800μl

(j)室温下，12000rcf离心30秒并弃去滤过的乙醇；

(k)室温下，12000rcf离心1分钟，除去吸附膜上残留的乙醇；

(l)将吸附柱转移至新的离心管上，向吸附膜中心加入65℃预热的不含RNA酶的去离子水50μl溶解双链RNA；

(m)室温放置1分钟后12000rcf离心2分钟收集双链RNA溶液，保存于-20℃；

(4)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测：采用1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，电压强度为5V/cm。电泳30分钟后，将凝胶用溴化乙锭水溶液染色10分钟，于琼脂糖凝胶系统中观察双链RNA条带。图1所示为梨轮纹病菌菌丝中提取得到的双链RNA凝胶电泳图像。第一泳道为分子量标记D1500(北京天根生化有限公司)；第二泳道为未经DNA酶I及S1核酸酶消化的双链RNA。

实施例4使用本发明的试剂盒从核盘菌Sunf-M菌株中提取病毒双链RNA(应用实施例3)

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)Sunf-M菌株2006年从华中农业大学发病油菜田间菌核中分离得到，参见文献：Xie Jun，Wei Dongmei，Jiang Daohong，Fu Yanping et al.Characterization of debilitation-associated mycovirus infecting the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum.Journal of General Virology.2006，87，241-249，专利文献：专号为ZL201010755826.3，公开号：CN101864449A；授权日：2011-11-16。分离核盘菌是一种通用方法，一般从油菜栽培的田里都能分离得到，对地域性没有限制，另外，本发明的试验验证不限于上述核盘菌菌株。

(1)菌丝的培养和收集：将液体培养基(Booth，1971)培养的菌丝用去离子水洗涤并用纱布过滤后进行冻干处理，保存于-70℃。

(2)双链RNA提取：

(a)称取0.3克菌丝，用液氮研磨后加入800μl细胞裂解液。65℃水浴10分钟，每5分钟颠倒混匀数次；

(b)室温下12000rcf离心5分钟；

(c)加入1.5倍体积，即1200μl核酸吸附液，轻柔颠倒混匀后，室温放置2分钟；

(d)室温16000rcf离心5分钟；

(e)取上清至新离心管中，加入上清一半体积的无水乙醇，震荡混匀后加入含硅膜的吸附柱中；

(f)室温下，12000rcf离心30秒使混有乙醇的上清通过吸附柱中的硅膜并弃去滤过的溶液；

(g)向吸附柱中加入800μl核酸洗涤液；

(h)室温下，12000rcf离心30秒，弃去滤过的洗涤液；

(i)向吸附柱中加入80％乙醇溶液800μl

(j)室温下，12000rcf离心30秒并弃去滤过的乙醇；

(k)室温下，12000rcf离心1分钟，除去吸附膜上残留的乙醇；

(l)将吸附柱转移至新的离心管上，向吸附膜中心加入65℃预热的不含RNA酶的去离子水50μl 溶解双链RNA；

(m)室温放置1分钟后12000rcf离心2分钟收集双链RNA溶液，保存于-20℃；

(3)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测：采用1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，电压强度为5V/cm。电泳30分钟后，将凝胶用溴化乙锭水溶液染色10分钟，于琼脂糖凝胶系统中观察双链RNA条带。图1所示为梨轮纹病菌菌丝中提取得到的双链RNA凝胶电泳图像。第一泳道为分子量标记D1500(购自北京天根生化有限公司)；第二泳道为未经DNA酶I及S1核酸酶消化的双链RNA；第三泳道为经过DNA酶I及S1核酸酶消化后的双链RNA。

实施例5使用本发明的试剂盒与常规纤维素粉吸附法得到的双链RNA在纯度与得率方面的比较

分别采用本发明的方法和已报道的纤维素粉吸附法对上述实施例中的菌株进行了双链RNA的提取，并对不同方法的得率(每克真菌菌丝得到的双链RNA量)及所分离双链RNA的纯度(OD_260/230以及OD_260/280)进行了比较。结果表明：虽然不同菌株中病毒双链RNA的含量不尽相同，但本发明所述方法的得率是传统方法的2倍左右，表现出明显差异。本方法与纤维素粉吸附法所得到的双链RNA在纯度上未表现出明显差异，但OD_260/280的测值表明表明本方法所得到的双链RNA所含的蛋白质污染更少，完全可以替代传统方法对真菌病毒双链RNA进行有效的提取。结果见表3.

表3本发明的试剂盒与常规纤维素粉吸附法得到双链RNA的纯度与得率的比较

以上实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的技术人员应该可以理解，依然可以参照本发明的原理对本发明进行修改或替换，如按照样品量对反应进行等比例的放大等。

参考文献

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5.Balijja A，Kvarnheden A，Turchetti T.A non-phenol-chloroform extraction of double-stranded RNA from plant and fungal tissues.J Virol Methods2008；152：32-37.

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7.Liu H，FuY，Jiang D，Li G，Xie J，Peng Y，Yi X，Ghabrial SA.A novel mycovirus that is related to the human pathogen Hepatitis E virus and rubi-like viruses.J Virol2009；83：1981-1991.

8.Xie J，Wei D，Jiang D，Fu Y.Characterization of debilitation-associated mycovirus infecting the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum.J Gen Virol.2006；87：241-249。

Claims (1)

1.包含下列试剂组合物的试剂盒在快速提取真菌病毒双链RNA中的应用，其特征在于所述的试剂盒由下列试剂组成：：

(1)细胞裂解液：

a.按重量/体积计十二烷基硫酸钠2％；

b.按重量/体积计聚乙烯吡咯烷酮-40 4％；

c.氯化钠0.5mol/L；

d.pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mmol/L；

e.pH 8.0的乙二胺四乙酸钠25mmol/L；

f.按体积/体积计巯基乙醇1％；

(2)核酸吸附液：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.氯化钾1.5mol/L；

c.氯化铵0.5mol/L；

d.pH 5.9的乙酸钠100mmol/L；

(3)双链RNA吸附介质：含硅膜的微量吸附柱；

(4)核酸洗涤液：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.氯化钠1.5mol/L；

c.pH 5.6的乙酸钾50mmol/L；

d.按体积/体积计乙醇37％；

(5)双链RNA琼脂糖电泳试剂：

a.TAE：2M三羟甲基氨基甲烷，1M醋酸，100mmol/L乙二胺四乙酸二钠；

b.S1核酸酶500U；

c.DNA酶I 1000U；

d.DNA分子量标记1.5ml；

e.6倍上样缓冲液pH8.0。