CN107267497A

CN107267497A - 一种通用型总rna提取试剂盒及方法

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Publication number: CN107267497A
Application number: CN201610220261.3A
Authority: CN
Inventors: 于祥春; 冯晓燕; 林挺; 王文利; 龚建
Original assignee: Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2036-04-08
Also published as: CN107267497B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，主要涉及到一种简单高效通用型总RNA提取试剂盒方法及。此试剂盒适用于从植物、动物、微生物、血液等多数生物样本以及植物根、茎、叶、花、果实不同组织部位提取高纯度、高完整性、高产量的总RNA，具有快速、方便、高效、通用等诸多优点，并且因为是薄型吸附柱而能够简便地最大限度的去除RNA提取过程中存在的色素油脂等杂质。提取的总RNA可以直接用于反转录及其他下游的分子生物学实验操作。

Description

一种通用型总RNA提取试剂盒及方法

技术领域

本发明专利属于分子生物学领域。涉及一种简单高效的通用型总RNA提取试剂盒及方法。此试剂盒及方法适用于从植物、动物、微生物、血液等多数生物样本以及植物根、茎、叶、花、果实不同组织部位提取高纯度、高完整性、高产量的总RNA，并且提取的总RNA可以直接用于反转录及其他下游的分子生物学实验操作。

背景技术

随着转录组学、蛋白组学、代谢组学等组学的不断涌现，生物学研究已经跨入后基因组时代，转录组学作为一个率先发展起来的技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。转录组学(transcriptomics)，是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。从生物材料中获得高质量的RNA不仅是转录组学研究的前提，也是后续RT-PCR、Northern杂交、cDNA文库构建等分子生物学研究的基础。目前，提取总RNA的方法有Trizol提取法、苯酚法、异硫氰酸胍法和CTAB法。但是由于RNA酶的广泛存在和难以灭活的顽固本性，使得RNA的抽提纯化和后续工作特别困难。虽然Trizol试剂和各类RNA抽提纯化试剂盒的广泛应用使得RNA抽提和纯化不再特别困难，但是这些提取方法普遍存在提取耗时、提取纯度不高、提取产量低或提取失败等各种问题。到目前为止，涉及RNA提取的工作仍然是分子生物学研究中最难以克服的难题。其中，植物材料总RNA的提取更是一个有待解决的分子生物学上的难题。这是因为植物材料尤其是植物的果实中存在大量的多酚和多糖化合物，它们和植物中的RNA结合形成一种复合物，从而严重影响到RNA的提取质量和产量。曾有报道指出有些RNA的提取方法可运用于富含多酚和多糖的材料，包括使用PVP和乙醇沉淀，盐酸胍，异丙醇等。但是，我们用这些方法在提取植物果实的RNA时，仍不能得到满意的结果。因此迫切需要一种简便、高效、经济且通用性较好的适用于总RNA的提取方法。我们通过多次实验，最终研制出酚-异硫氰酸胍结合硅基质柱的方法的试剂盒，使用本试剂盒不仅成功地从植物各种组织包括果实中提取到了高质量的总RNA，而且还可以从抗凝全血等多种材料中提取高纯度高质量的总RNA。提取的总RNA经过检测显示，完整性和纯度可以满足进一步RT-PCR的实验要求以及相关的下游分子生物学实验要求。

发明内容

本发明专利目的之一是提供一种应用于植物总RNA提取的试剂盒及方法；

本发明专利目的之二是提供一种应用于富含多糖多酚等杂质的植物总RNA提取试剂盒及方法；

本发明专利目的之三是提供一种应用于植物根、茎、叶、花、果实不同部位的总RNA提取试剂盒；

本发明专利目的之四是提供一种应用于动物组织总RNA提取试剂盒及方法；

本发明专利目的之五是提供一种应用于微生物(主要包括酵母菌和细菌)总RNA提取试剂盒及方法；

本发明专利目的之六是提供一种应用于抗凝全血总RNA提取试剂盒及方法；

本发明专利的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

细胞中的RNA大多与蛋白质结合在一起。因此，提取RNA的一个重要步骤就是除去与之结合的蛋白质。高浓度蛋白质变性剂(如异硫氰酸胍、盐酸胍等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽提最重要的是快速裂解细胞，释放出RNA。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，继而迅速抑制住细胞内的RNA酶，确保了RNA的完整性。本试剂盒主要采用了高浓度的异硫氰酸胍作为蛋白质变性剂。除此之外，我们还使用了其他的蛋白质变性剂，目前经常使用的离子型蛋白质变性剂主要有十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠(SLS)，在提取RNA的过程中为了抑制生物材料自身体内RNA的降解，一般都采用低温进行提取，但是由于SDS在低温不能溶解于缓冲液体系而不能充分发挥作用，因此一般选择可在低温溶解而且对蛋白质变性作用较弱的SLS作为离子型去垢剂使用可以大大提高蛋白质的提取效率，使用浓度一般不能高于2％。因此，我们在本试剂盒RNA裂解RAP1中添加了0.2％十二烷基肌氨酸钠(SLS)作为加强性的蛋白质变性剂。酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA，有机层(黄色)主要为DNA何蛋白质。本试剂盒采用了总量为50％的水饱和酚作为RNA分离剂。高浓度的醋酸钠促进核酸的聚集以及与硅基质柱的结合，在明显增加RNA结合量的同时大大降低了生产成本。进一步，本发明专利产品提供了一种薄型的并可最大限度吸附RNA的硅基质吸附柱。我们制作的RNA硅基质吸附柱是采用新型的硅基质材料制成薄型RNA吸附柱，在高盐、低pH缓冲系统下可以高效、专一地吸附RNA；在低盐、高pH值缓冲液体系中释放RNA，在几分钟之内即可回收RNA。具有快速、方便、避免有机溶剂的污染等诸多优点，并且因为是薄型吸附柱而能够简便地最大限度的去除RNA提取过程中存在的色素油脂等杂质。从而得到纯度很高的总RNA。

综上所述，针对现有的总RNA提取所存在的各种缺陷，本发明人进行了深入研究，并经过长期，反复多次试验，提供了独特的并可最大限度抑制RNA酶活性并浸提出生物样本组织中的总RNA的提取缓冲液体系(即RAP1)及薄型并可最大限度吸附RNA的硅基质吸附柱。基于以上技术方案研制出的通用型总RNA提取试剂盒，提取的RNA总量平均≥10μg，OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.8，大大满足分子生物学下游实验操作中对总RNA产量及质量的要求。此外，本试剂盒操作非常简单方便快速，30分钟即可从生物样本中成功提取高质量的总RNA。

参考文献

张晓丽代红军植物RNA提取方法的研究进展《北方园艺》2014年08期

附图说明

图1、使用本公司研发的简单高效通用型RNA提取试剂盒提取不同植物种类大麦叶片、玉米叶片、水稻叶片(日本腈)、高粱叶片、大豆叶片、泡桐叶片、番茄叶片、蒲公英叶片、绿萝叶片总RNA后的琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道1：M代表DNA分子量标准，条带对应的分子量标准分别为15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：大麦叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道3：玉米叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道4：水稻叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道5：高粱叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道6：大豆叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道7：泡桐叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道8：番茄叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道9：蒲公英叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道10：绿萝叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

图2、使用本公司研发的简单高效通用型RNA提取试剂盒提取的植物不同部位水稻根、水稻茎、蒲公英花、番茄果实的RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道2：水稻根提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道3：水稻茎提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道4：水稻叶片提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道5：蒲公英花提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道6：番茄果实提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

图3、使用本公司研发的简单高效通用型RNA提取试剂盒提取的动物组织牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝组织、小鼠肺组织、大鼠胰腺组织、大鼠腮腺、猪肉、羊肉的RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道1：M代表RNA分子量标准，条带对应的分子量标准分别为15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；

泳道2：牦牛肺组织提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道3：牦牛肝组织提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道4：小鼠肝组织提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道5：小鼠肺组织提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道6：大鼠胰腺组织提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道7：大鼠腮腺组织提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道8：猪肉提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道9：羊肉提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

图4、使用本公司研发的简单高效通用型RNA提取试剂盒提取的微生物的总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道2：大肠杆菌1提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道3：大肠杆菌2提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道4：酵母菌1提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道5：酵母菌2提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

图5、使用本公司研发的简单高效通用型RNA提取试剂盒提取的抗凝全血总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道2：抗凝全血1提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

泳道3：抗凝全血2提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

表1、使用本公司研发的简单高效通用型RNA提取试剂盒提取的全部总RNA浓度检测表；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明专利，本发明专利的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明专利构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明专利的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均属于本发明专利的保护范围内。

1、实验材料：大麦叶片、玉米叶片、水稻叶片(日本腈)、高粱叶片、大豆叶片、泡桐叶片、番茄叶片、蒲公英叶片、绿萝叶片、水稻根、水稻茎、蒲公英花、番茄果实、牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝组织、小鼠肺组织、大鼠胰腺组织、大鼠腮腺、猪肉、羊肉、小鼠抗凝全血、酵母菌、细菌

2、实验试剂

水饱和酚：美国Amresco公司

DNA分子量标准：宝生物工程(大连)有限公司

西班牙琼脂糖biowest Agarose：北京欣经科生物技术有限责任公司

冰醋酸：国药集团化学试剂北京有限公司

Gelgreen荧光染料：美国Biotium公司

Tris盐：北京欣经科生物技术有限责任公司

盐酸：国药集团化学试剂北京有限公司

氢氧化钠：国药集团化学试剂北京有限公司

异硫氰酸胍：美国Amresco公司

醋酸钠：美国Amresco公司

硅基质膜：杭州莱枫生物科技有限公司

无水乙醇：国药集团化学试剂北京有限公司

EDTA-Na₂(乙二胺四乙酸二钠)：美国MP Biomedicals公司

氯化钠：国药集团化学试剂北京有限公司

十二烷基肌氨酸钠(SLS)：美国Amresco公司

焦碳酸二乙酸(DEPC)：美国Amresco公司

3、主要实验仪器：

小型台式高速离心机：美国Sigma公司

NanoQ^TM微型分光光度计：博奥生物有限公司

凝胶成像系统：美国Biorad公司

水平电泳槽：北京百晶生物技术有限公司

4、主要试剂的配制

RAP1缓冲液：50％饱和酚，2～4.5M异硫氰酸胍，0.2％十二烷基肌氨酸钠(SLS)，0.2MNaAC(pH5.2)。

RAPW漂洗液：70～80％无水乙醇。

RNA洗脱缓冲液：0.1％DEPC浓度的去离子水37℃孵育过夜后，121℃条件下灭菌20分钟。

实施例1

1、实验方法

将大麦叶片、玉米叶片、水稻叶片(日本腈)、高粱叶片、大豆叶片、泡桐叶片、番茄叶片、蒲公英叶片、绿萝叶片在液氮中研磨成粉状。

取0.05g粉末置于加有1mL RAP1裂解液的离心管中，涡旋混匀，室温放置10分钟，其间涡旋3-4次。

加入200μL三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置10分钟。其间涡旋3-4次。13000rpm，4℃离心15分钟。

吸取500μL上清，加入500μL异丙醇，轻柔混匀。

将上一步所得混合物(溶液和可能出现的絮状沉淀)都加入一个吸附柱RB(RNA吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，吸附柱RB放入收集管中。

向吸附柱RB中加入700μL RAW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱RB放入收集管中。

向吸附柱RB中加入500μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱RB放入收集管中。

将吸附柱RB放入收集管中，13,000rpm离心2分钟，倒掉废液，此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的实验。

将吸附住RB转入一个干净的离心管中，打开管盖并于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

向吸附柱的膜中央部位滴加50μL加热至65℃的RNA洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

RNA提取完成后取1μL使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定RNA浓度及纯度。

配制0.8％的琼脂糖凝胶，上样量1μL进行电泳，电压100V检测RNA。

2、实验结果

通过实施例1中所述的方法一次性提取了不同植物材料叶片的总RNA并测定了RNA浓度和纯度以及采用琼脂糖凝胶电泳检测了RNA的完整性。RNA凝胶电泳检测实验结果显示，RNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图1)。使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定RNA纯度及浓度结果显示，代表RNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.8，大大满足分子生物学下游实验操作中对总RNA产量及质量的要求。。数据显示结果为，使用本发明专利即一种简单高效通用型总RNA提取试剂盒可以从不同种类的植物叶片材料中提取到高纯度高质量的RNA(表1中编号1-9数据)。

实施例2、

1、实验方法

取水稻叶片、水稻根、水稻茎、蒲公英花、番茄果实粉末0.05g置于加有1mL RAP1裂解液的离心管中，涡旋混匀，室温放置10分钟，其间涡旋3-4次。

吸取500μL上清，加入500μL异丙醇，轻柔混匀。

将上一步所得混合物(溶液和可能出现的絮状沉淀)都加入一个吸附柱RB(RNA吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，吸附柱RB放入收集管中；

向吸附柱RB中加入700μL RAW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱RB放入收集管中；

向吸附柱RB中加入500μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱RB放入收集管中；

将吸附柱RB放入收集管中，13,000rpm离心2分钟，倒掉废液，此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的实验；

将吸附住RB转入一个干净的离心管中，打开管盖并于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；

向吸附柱的膜中央部位滴加50μL加热至65℃的RNA洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；

RNA提取完成后取1μL使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定RNA浓度及纯度；

2、实验结果

通过实施例2中所述的方法一次性提取了水稻叶片、水稻根、水稻茎、蒲公英花、番茄果实的总RNA并采用琼脂糖凝胶电泳检测了RNA的完整性及测定了RNA浓度和纯度。RNA凝胶电泳检测实验结果显示，所有材料提取的RNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图2)。使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定所提取到的RNA浓度及纯度，代表RNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.8，大大满足分子生物学下游实验操作中对总RNA产量及质量的要求(表1中编号10-14数据)，这个结果表示出本试剂盒适用于植物不同部位的总RNA提取。

实施例3、

1、实验方法

取牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝组织、小鼠肺组织、大鼠胰腺组织、大鼠腮腺、猪肉、羊肉组织在液氮中研磨成粉末，取0.05g置于加有1mL RAP1裂解液的离心管中，涡旋混匀，室温放置10分钟，其间涡旋34次。

吸取500μL上清，加入500μL异丙醇，轻柔混匀。

2、实验结果

通过实施例3中所述的方法一次性提取了牦牛肺、牦牛肝、小鼠肝组织、小鼠肺组织、大鼠胰腺组织、大鼠腮腺、猪肉、羊肉组织的总RNA并采用琼脂糖凝胶电泳检测了RNA的完整性及测定了RNA浓度和纯度。RNA凝胶电泳检测实验结果显示，所有材料提取的RNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图2)。使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定所提取到的RNA浓度及纯度，代表RNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.8，大大满足分子生物学下游实验操作中对总RNA产量及质量的要求(表1中编号15-22数据)，这个结果表示出本试剂盒适用于不同动物组织及的部位的总RNA提取。

实施例4、

1、实验方法

将酵母菌和细菌在液氮中研磨成粉状，取0.05g粉末置于加有1mL RAP1裂解液的离心管中，涡旋混匀，室温放置10分钟，其间涡旋3-4次。

吸取500μL上清，加入500μL异丙醇，轻柔混匀。

2、实验结果

通过实施例4中所述的方法一次性提取了酵母菌和细菌总RNA并采用琼脂糖凝胶电泳检测了RNA的完整性及测定了RNA浓度和纯度。RNA凝胶电泳检测实验结果显示，所有材料提取的RNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图4)。使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定所提取到的RNA浓度及纯度，代表RNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.8，大大满足分子生物学下游实验操作中对总RNA产量及质量的要求(表1中编号23-26数据)，这个结果表示出本试剂盒适用不同种类的微生物总RNA提取。

实施例5、

1、实验方法

小鼠全抗凝血液100μL中加入900μL RAP1裂解液的离心管中，涡旋混匀，室温放置10分钟，其间涡旋3-4次。

吸取500μL上清，加入500μL异丙醇，轻柔混匀。

将上一步所得混合物都加入一个吸附柱RB(RNA吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，吸附柱RB放入收集管中；

2、实验结果

通过实施例5中所述的方法一次性提取了小鼠抗凝全血总RNA并采用琼脂糖凝胶电泳检测了RNA的完整性及测定了RNA浓度和纯度。RNA凝胶电泳检测实验结果显示，所有材料提取的RNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图5)。使用NanoQ^TM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定所提取到的RNA浓度及纯度，代表RNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.8，大大满足分子生物学下游实验操作中对总RNA产量及质量的要求(表1中编号27-28数据)，这个结果表示这种简单高效通用型总RNA提取试剂盒适用于全抗凝血的总RNA提取。

Claims

1.一种通用型总RNA提取试剂盒及方法。

2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用于多种生物材料的总RNA提取。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用于植物材料总RNA提取。

4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用于植物材料的根、茎、叶、花、果实组织部位的总RNA提取。

5.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用于动物材料总RNA提取。

6.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用于微生物总RNA提取。

7.按照权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用的微生物主要包括酵母菌和细菌。

8.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒及方法适用于抗凝全血总RNA提取。

9.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型总RNA提取试剂盒由提取缓冲液RAP1、漂洗液RAPW、RNA洗脱液及RNA结合柱(RB)四个部分组成。

10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的一种通用型植物总RNA提取试剂盒中提取缓冲液(RAP1)组成成分及浓度分别为：30％饱和酚，4.5M异硫氰酸胍，0.2％十二烷基肌氨酸钠(SLS)，0.2MNaAC(pH5.2)。