CN101302508A - 假单胞菌m18的rna快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的假单胞菌M18的RNA快速提取方法。包括如下步骤:收集106~107个细胞假单胞菌M18,加入变性液和氯仿,混匀,离心,菌液在管中分为三层;吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入异丙醇,离心;加入乙醇至硅膜柱中,离心;重复上一步;再离心,保证硅膜柱内无液体;加入双蒸水、洗脱液至硅膜柱内;离心,用一干净离心管收集洗脱液。本发明提取时间大大缩短,从提取RNA的方法中可以看出:提取的时间在6min之内;没有DNA污染;提取过程易于自动化。对过柱条件优化后,提取出的RNA纯度很高;通过分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.93。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法,特别是一种假单胞菌M18的RNA快速提取方法。
背景技术
目前许多微生物学研究需要快速提取假单胞菌M18的RNA。当前,检测内容主要集中在环境变量、宏观生物量和产品产率几个方面。在环境、宏观生物量参数和产品之间,还存在着菌体内产品合成和调控的生化过程,如产品合成基因和调控基因的DNA转录成为RNA,RNA翻译成为蛋白质,以及酶促生化反应至产品等中间过程环节。
国内外已有的提取RNA的方法多种多样,例如美国科学家Chomczynski P所发明的酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法(其文章出处为:Chomczynski P,Sacchi N,The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J],Nat Protoc,2006,1(2):581-585)。目前国内外认为酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法是最标准的方法,其基本原理是应用异硫氰酸胍裂解细胞,异硫氰酸胍同时还有保护RNA不被降解的功能,然后用异丙醇沉淀RNA。此方法耗时三小时,操作步骤繁琐,难以自动化,而且最重要的不足之处是用此方法提取出的RNA中常有DNA污染。Trizol商业试剂盒(《总RNA抽提试剂盒(Trizol法)》,技术手册No.GRX001上海博彩生物科技有限公司版本:20060815-1),其应用的原理也是用异硫氰酸胍裂解细胞,然后用异丙醇沉淀RNA,步骤繁琐,非常昂贵,用时大概一小时。快速提取RNA的应用越来越广泛,这些方法不能快速提取RNA,各个成分的浓度也没有达到最优化,pH值等参数的影响也被忽略。
发明内容
本发明的目的在于克服现有RNA提取技术中的DNA污染现象、缩短提取时间、实现提取过程易于自动化,提供一种假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法。本发明系统优化了变性液配方,利用硅膜柱吸附RNA代替异丙醇沉淀RNA,把整个提取时间缩短在6min之内。本发明优化了过柱的条件,采用此法提取的RNA的纯度高,OD260/280nm达到1.93,琼脂糖电泳条带中没有DNA污染。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明包括如下步骤:
①收集假单胞菌M18(约106~107个细胞),加入800μl~3000μl变性液,200μl~500μl氯仿,涡旋混匀,4℃12,000rpm离心0.5min~1min,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入100~500μl异丙醇,12,000rpm离心0.5min~1min;
③加入75%乙醇洗液500μl至硅膜柱中,12,000rpm离心0.5min~1min;
④重复上一步;
⑤再12,000rpm离心0.5min~1min,保证硅膜柱内无液体;
⑥加入双蒸水,甲酰胺或其他洗脱液50~100μl至硅膜柱内;
⑦12,000rpm离心1min,用一干净离心管收集洗脱液。
所述的变性液,其组分和重量百分比为:35.6%~71.2%异硫氰酸胍;0.2%~1.5%柠檬酸钠;0.5%~1.0%醋酸钠;0.2%~0.6%十二烷基肌氨酸钠;0.5%~1.0%β-巯基乙醇;20%~40%苯酚;1%~2%异戊醇。
所述的硅膜柱,是指:能透过溶液的、用硅材料或者玻璃纤维制成的过滤介质。
所述的变性液,其制备方法为:
①取一个80ml的瓶子,称取固体异硫氰酸胍(3.56~7.12)g,将其放入瓶子中;
②称取十二烷基肌氨酸钠(0.02~0.06)g,并将其倒入瓶子中;
③配制0.75M柠檬酸钠溶液,吸取(225~450)μl放入瓶子,配制2M醋酸钠溶液,吸取(300~600)μl加入到瓶子中;
④配制14.3M β-巯基乙醇,吸取(45~90)μl加入到瓶子之中;
⑤加入饱和苯酚(2~4)ml;
⑥加入异戊醇(100~200)μl;
⑦用双蒸水定容至10ml;
⑧60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到(3.5~4.0);
⑨放置在室温下备用。
本发明取六管假单胞菌M18菌体,编号A、B、C、D、E、F,A、B在提取RNA的步骤第②步中,吸取500μl上层液体转移至硅膜柱内管中,不加入250μl无水乙醇和250μl异丙醇,12,000rpm离心1min,C、D中加入250μl无水乙醇,E、F中加入250μl异丙醇,其他步骤按照以上提取RNA的步骤。对提取出的RNA测定A260/A280之值。其结果如下:
从以上结果可以看出,从吸光值A260/A280的比较中,可以看出,在硅膜柱上加无水乙醇后,纯度增加,在硅膜柱上加异丙醇,纯度比加无水乙醇好,一般认为纯的RNA其吸光值A260/A280的范围在1.7-2.0之间(其文章出处为:于寒松,彭帅,一种RNA提取试剂盒——TRIZOL的使用方法初探[J],食品科学,2005,26(11):39-42),因此经过改进后的方法提取出的RNA纯度较高。
RNA的琼脂糖凝胶电泳:
对于上面的提取出的六管RNA,进行琼脂糖凝胶电泳,电泳步骤为:
a)制水平胶板
准备好制胶板及配套梳子,洗净后贴好胶条,称0.5g琼脂糖,加入1×TAE至50ml,加热溶解后,室温冷却至40℃左右,倒入胶板内,保证无气泡,冷却至凝固。
b)加入样品
每个样加入2μl loading buffer和提取的10μl RNA样品,混匀;另一份加入5μl 1kb的DNA ladder和2μl loading buffer,依次加入胶孔中。
c)电泳
120V水平电泳20min左右。电泳缓冲液用1×TAE。用EB染色7min左右并拍照。
本发明加入无水乙醇或异丙醇和上清液混合后过柱,其提取的23s,16s条带的亮度比没加时的亮,而且小分子的RNA提取的量也增多了,表现为最下面的条带的亮度高于没加无水乙醇或异丙醇时的条带。一般认为23s的条带是16s条带亮度的两倍,就表明降解很少(其文章出处为:庞昕,周冬生,杨瑞馥,细菌mRNA的提取方法,生物技术通报,2003,1:30-33),在用变性液提取的RNA中,23s的条带是16s条带亮度的两倍,因此降解比较少。在上样孔和23S条带之间没有条带,说明提取出的RNA中没有DNA污染。
本发明的优点和效果如下:本发明提取时间大大缩短,从提取RNA的方法中可以看出:提取的时间在6min之内;没有DNA污染;提取过程易于自动化。对过柱条件优化后,提取出的RNA纯度很高;通过分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.93。
本发明所用研究材料为假单胞菌M18株,所述的假单胞菌M18菌株已由中国专利公开号CN1340609,专利名称为:生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法,专利号为:00119857.2全部公开;所用荧光假单胞菌株M18,已在中国专利局指定的保藏单位:北京,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号CGMCC NO.0462,2000.6.27。
附图说明
图1 1%琼脂糖凝胶电泳示意图;
其中:M为:1kb DNA标记。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
变形液配方:
异硫氰酸胍3.56g;0.75M柠檬酸钠溶液225μl;十二烷基肌氨酸钠0.02g;2M醋酸钠溶液600μl;0.1Mβ-巯基乙醇90μl;饱和苯酚2.0ml;异戊醇200μl;用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到4.0。放置在室温下备用。
提取RNA的步骤:
①制备好的菌体,加入1000μl变性液,240μl氯仿,涡旋混匀,4℃12,000rpm离心1min,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入250μl异丙醇,12,000rpm离心1min;
③加入75%乙醇洗液500μl至硅膜柱中,12,000rpm离心1min;
④重复上一步;
⑤再12,000rpm离心1min,保证硅膜柱中无液体;
⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中;
⑦12,000rpm离心1min,用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。
提取出的RNA的纯度高,分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.90,电泳后,RNA条带亮度高,没有DNA污染。
实施例2
变形液配方:
异硫氰酸胍4.75g;0.75M柠檬酸钠溶液333μl;十二烷基肌氨酸钠0.05g;2M醋酸钠溶液500μl;0.1M β-巯基乙醇45μl;饱和苯酚2.5ml;异戊醇100μl;用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到4.0。放置在室温下备用。提取RNA的步骤:
①制备好的菌体,加入1000μl变性液,240μl氯仿,涡旋混匀,4℃12,000rpm离心1min,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入250μl异丙醇,12,000rpm离心1min;
③加入75%乙醇洗液500μl至硅膜柱中,12,000rpm离心1min;
④重复上一步;
⑤再12,000rpm离心1min,保证硅膜柱中无液体;
⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中;
⑦12,000rpm离心1min,用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。
提取出的RNA的纯度高,分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.93,电泳后,RNA条带亮度高,没有DNA污染。
实施例3
变形液配方:
异硫氰酸胍7.12g;0.75M柠檬酸钠溶液450μl;十二烷基肌氨酸钠0.06g;2M醋酸钠溶液500μl;0.1Mβ-巯基乙醇70μl;饱和苯酚2.5ml;异戊醇100μl;用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到4.0。放置在室温下备用。
提取RNA的步骤:
①制备好的菌体,加入1000μl变性液,240μl氯仿,涡旋混匀,4℃12,000rpm离心1min,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入250μl异丙醇,12,000rpm离心1min;
③加入75%乙醇洗液500μl至硅膜柱中,12,000rpm离心1min;
④重复上一步;
⑤再12,000rpm离心1min,保证硅膜柱中无液体;
⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中;
⑦12,000rpm离心1min,用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。
提取出的RNA的纯度高,分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.95,电泳后,RNA条带亮度高,没有DNA污染。
实施例4
变形液配方:
异硫氰酸胍4.75g;0.75M柠檬酸钠溶液450μl;十二烷基肌氨酸钠0.05g;2M醋酸钠溶液300μl;0.1Mβ-巯基乙醇70μl;饱和苯酚4.0ml;异戊醇100μl;用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到3.5。放置在室温下备用。
提取RNA的步骤:
①制备好的菌体,加入1000μl变性液,240μl氯仿,涡旋混匀,4℃12,000rpm离心1min,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入250μl异丙醇,12,000rpm离心1min;
③加入75%乙醇洗液500μl至硅膜柱中,12,000rpm离心1min;
④重复上一步;
⑤再12,000rpm离心1min,保证硅膜柱中无液体;
⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中;
⑦12,000rpm离心1min,用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。
提取出的RNA的纯度高,分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.92,电泳后,RNA条带亮度高,没有DNA污染。
实施例5
变形液配方:
异硫氰酸胍4.75g;0.75M柠檬酸钠溶液225μl;十二烷基肌氨酸钠0.02g;2M醋酸钠溶液300μl;0.1M β-巯基乙醇45μl;饱和苯酚2.0ml;异戊醇100μl;用双蒸水定容至10ml。60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到3.7。放置在室温下备用。
提取RNA的步骤:
①制备好的菌体,加入1000μl变性液,240μl氯仿,涡旋混匀,4℃12,000rpm离心1min,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入250μl异丙醇,12,000rpm离心1min;
③加入75%乙醇洗液500μl至硅膜柱中,12,000rpm离心1min;
④重复上一步;
⑤再12,000rpm离心1min,保证硅膜柱中无液体;
⑥加入双蒸水50μl至硅膜柱中;
⑦12,000rpm离心1min,用一干净离心管收集双蒸水保存的RNA。
提取出的RNA的纯度高,分光光度计测定提取出的RNA其吸光值A260/A280=1.93,电泳后,RNA条带亮度高,没有DNA污染。
Claims (10)
1、一种假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征在于,包括如下步骤:
①收集106~107个细胞假单胞菌M18,加入变性液和氯仿,混匀,离心,菌液在管中分为三层;
②吸取500μl上层液体转移至硅膜柱中,并加入异丙醇,离心;
③加入乙醇至硅膜柱中,离心;
④重复上一步;
⑤再离心,保证硅膜柱内无液体;
⑥加入双蒸水、洗脱液至硅膜柱内;
⑦离心,用一干净离心管收集洗脱液。
2、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,步骤①所述的加入变性液,为800μl~3000μl。
3、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,步骤①所述的加入氯仿,为200μl~500μl。
4、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,步骤②所述的加入异丙醇为:100~500μl。
5、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,步骤③所述的乙醇,是指:75%乙醇洗液500μl。
6、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,所述的离心,是指:转速:12,000rpm,离心时间:0.5min~1min。
7、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,步骤⑥洗脱液,为甲酰胺50~100μl。
8、根据权利要求2所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,所述的变性液,其组分和重量百分比为:35.6%~71.2%异硫氰酸胍,0.2%~1.5%柠檬酸钠,0.5%~1.0%醋酸钠,0.2%~0.6%十二烷基肌氨酸钠,0.5%~1.0%β-巯基乙醇,20%~40%苯酚,1%~2%异戊醇。
9、根据权利要求1或者8所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,所述的变性液,其制备方法为:
①取一个80ml的瓶子,称取固体异硫氰酸胍3.56g~7.12g,将其放入瓶子中;
②称取十二烷基肌氨酸钠0.02g~0.06g,并将其倒入瓶子中;
③配制0.75M柠檬酸钠溶液,吸取225μl~450μl放入瓶子,配制2M醋酸钠溶液,吸取300μl~600μl加入到瓶子中;
④配制14.3Mβ-巯基乙醇,吸取45μl~90μl加入到瓶子之中;
⑤加入饱和苯酚2ml~4ml;
⑥加入异戊醇100μl~200μl;
⑦用双蒸水定容至10ml;
⑧60℃水浴加热至完全溶解,然后用纯乙酸调节pH到3.5~4.0;
⑨放置在室温下备用。
10、根据权利要求1所述的假单胞菌M18的RNA快速提取优化方法,其特征是,所述的硅膜柱,是指:能透过溶液的、用硅材料或者玻璃纤维制成的过滤介质。
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GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100915 Termination date: 20130612 |