CN1900278A - 小麦籽粒总rna的提取方法 - Google Patents

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CN1900278A CN 200610043087 CN200610043087A CN1900278A CN 1900278 A CN1900278 A CN 1900278A CN 200610043087 CN200610043087 CN 200610043087 CN 200610043087 A CN200610043087 A CN 200610043087A CN 1900278 A CN1900278 A CN 1900278A
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高梅
张国权
赵亚兰
魏益民
张继澍
欧阳韶辉
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Northwest A&F University
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Abstract

本发明公开了小麦籽粒总RNA的提取方法，将小麦籽粒置于研钵中，加入相当于籽粒重量2倍硅藻土和相当于籽粒重量10倍的提取缓冲液，研磨成匀浆，匀浆液转入离心管，吸取上清液，量取上清液体积，并加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液振荡萃取后，离心；再吸取上清液，量取上清液体积，并加入等体积的氯仿/异戊醇混合液振荡萃取后，离心；离心后的上清液用冰醋酸调pH至5.0(V1)，再加入相当于1/3V1体积的5mol·L－1KAc溶液，计算并加入无水乙醇，使总溶液的乙醇浓度为70％，充分混匀后，－20℃沉淀30min；离心去除上清液，沉淀即为RNA产物。该方法应简便、快速、低成本，能够实现标准化。

Description

小麦籽粒总RNA的提取方法
技术领域
本发明涉及一种小麦籽粒总RNA的提取方法。
背景技术
植物组织总RNA提取是进行cDNA文库构建、Northern杂交、RNA差异显示等试验的基本技术。相对于动物、微生物而言，高等植物的总RNA提取难度是比较大的，主要原因是不同植物种类、同种植物的不同器官所含蛋白质、脂类、多糖及次生物质的组成、含量均不相同，而这些物质在植物细胞破碎之后对RNA的纯度和得率将造成不同程度的影响。因此，高等植物总RNA的提取技术路线因植物种类、提取部位的不同而异。
淀粉是小麦籽粒的主要贮藏物质，占籽粒总重量的70％以上。在小麦籽粒总RNA提取的过程中，淀粉与RNA结合而共沉淀，造成RNA提取失败。目前国内对于小麦籽粒RNA提取技术尚未见报导，以小麦籽粒为材料的分子生物学研究亦较难开展，造成该领域研究的局限。
在已报导的植物总RNA提取方法中，基本是在经典“一步法”的基础上采用各种不同方法去除杂质，以使所提取的RNA达到纯度要求。涉及到多糖类物质的去除方法有以下几种：①KAC(醋酸钾)沉淀法：报导植物为葡萄。经试验，该方法对于去除少量多糖类物质比较有效，但对于淀粉类材料只能起到辅助作用，不能满足提取纯度的要求；②CTAB(溴代十六烷基三甲铵)法：报导植物为紫丁香和糖槭。该方法将CTAB加入提取后的RNA溶液中。经试验，类似技术路线对小麦籽粒的RNA纯化无任何效果；③反复冻融法：报导植物为非洲菊花瓣。将提取后的RNA成品反复冻融容易造成RNA的降解，不适合在大量制备时使用。以上各植物含有的多糖杂质以小分子量杂糖为主，淀粉仅占非常微小的比例，所以以上各方法仅能提供部分参考作用，对小麦籽粒总RNA的提取需专用方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、低成本的小麦籽粒总RNA的提取方法。
实现上述发明目的的技术方案是小麦籽粒总RNA的提取方法，具体实施步骤如下：
1)在提取缓冲液(50mM Tris-Hcl pH8.0，10mM EDTA、1％SDS、100mM NaCl)中加入CTAB至浓度为1％(w/v)；
2)称取新鲜小麦籽粒或干籽粒，置于已灭菌的研钵中，加入相当于籽粒重量2倍的硅藻土和相当于籽粒重量10倍体积的步骤1)制备的提取缓冲液，充分研磨成匀浆，将匀浆液转入离心管，用旋涡混合器振荡1min，然后在室温下静置浸提5min；
3)在4℃、13,000×g条件下离心15min；
4)吸取上清液，量取上清液体积，并加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(v/v/v＝24∶24∶1)混合液振荡萃取后，在4℃、13,000×g条件下离心15min；
5)再吸取上清液，量取上清液体积，并加入等体积的氯仿/异戊醇(v/v＝24∶1)混合液振荡萃取后，在4℃、13,000×g条件下离心15min；
6)离心后的上清液用冰醋酸调pH至5.0(V1)，再加入相当于1/3 V1体积的5mol·L-1KAc溶液，计算并加入无水乙醇，使总溶液的乙醇浓度为70％，充分混匀后，-20℃沉淀30min；
7)在4℃、13,000×g条件下离心15min，去除上清液，沉淀即为RNA产物。用预冷的无水乙醇洗涤沉淀3次，用DEPC水重新悬浮沉淀，于-20℃贮存。若长期贮存可置于无水乙醇中，-80℃保存。
注意事项：操作时皮肤表面、唾液不能接触样品，否则易造成RNA的降解，可使用口罩、一次性PE手套。
该方法首先应保证将籽粒中的淀粉与RNA有效分离，使提取出的总RNA纯度达到要求；其次，该方法应简便、快速、低成本，能够实现标准化。
附图说明
图1小麦籽粒总RNA的琼脂糖电泳图。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方案
实施例1
1)在2mL提取缓冲液中加CTAB 0.02g，摇匀；
2)称取0.1g小麦籽粒，置于已灭菌的研钵中。加入200mg硅藻土、1mL含CTAB的提取缓冲液，研磨成匀浆，转入1.5ml离心管中，用漩涡混合器振荡1min，置室温下静置浸提5min；
3)在4℃、13,000×g条件下离心15min；
4)离心后，吸取上清液700μL，加入700μL的酚/氯仿/异戊醇混合液振荡萃取，再离心，操作方法与步骤3)相同；
5)离心后，吸取上清液600μL，加入600μL氯仿/异戊醇混合液振荡萃取，再离心，操作方法与步骤3)相同；
6)离心后的上清液分装2个离心管，每管200μL，各加入冰醋酸约2.5μL调pH至5.0，再分别加入5mol·L-1的KAc溶液67μL和预冷的无水乙醇614μL，混匀，-20℃沉淀30min；
7)离心后弃上清液，沉淀即为RNA产物。用预冷的无水乙醇洗沉淀3次，然后每管用50μL DEPC水重悬浮沉淀，得到RNA待测液。
8)快速电泳检测：使用1％含EB的琼脂糖凝胶，负极点样，上样量为5μL，在100V电压下电泳10～15min。电泳后凝胶成像仪检测。结果显示电泳条带有5S、18S、28S三条RNA条带。5S的亮度较浅，28S∶18S的宽度比或亮度比接近2∶1(见附图1)，并且DNA带不明显，这说明所提取的RNA达到纯度要求。以常规一步提取法为对照，对照样品的RNA有明显的降解现象，DNA残留较多。
9)紫外法检测：将石英比色杯用盐酸∶甲醇(1∶1，v/v)浸泡至少30min，然后用去离子水洗净。步骤6)重悬浮的RNA待测液用pH8.0的TE缓冲液稀释100倍，用紫外分光光度计分别测定OD260、OD280、OD230。
计算得率：OD260＝1时，RNA的浓度为40ug/ml。
RNA得率(ug/gFW)
＝0.04ug/uL×OD260×稀释倍数×RNA总溶解体积(uL)/样品鲜重(g)
＝800×OD260/样品鲜重(g)。
检测结果：
  籽粒总 OD260/OD280 OD260/OD230   得率(μg·100mgFW-1)
  RNA   1.96   2.06   100.60
OD260/OD280的比值越接近于2.0，说明所提取的RNA纯度越高。
当OD260/OD230＞2.0时，说明所提取的RNA样品中没有盐类污染。使用本发明方法提取的RNA得率较高，纯度符合要求。

Claims (1)

1.一种小麦籽粒总RNA的提取方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)在提取缓冲液(50mM Tris-Hcl pH8.0，10mM EDTA、1％SDS、100mM NaCl)中加入CTAB至浓度为1％(w/v)；
2)称取新鲜小麦籽粒或干籽粒，置于已灭菌的研钵中，加入相当于籽粒重量2倍的硅藻土和相当于籽粒重量10倍体积的步骤1)制备的提取缓冲液，充分研磨成匀浆，将匀浆液转入离心管，用旋涡混合器振荡1min，然后在室温下静置浸提5min；
3)在4℃、13,000×g条件下离心15min；
4)吸取上清液，量取上清液体积，并加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(v/v/v＝24∶24∶1)混合液振荡萃取后，在4℃、13,000×g条件下离心15min；
5)再吸取上清液，量取上清液体积，并加入等体积的氯仿/异戊醇(v/v＝24∶1)混合液振荡萃取后，在4℃、13,000×g条件下离心15min；
6)离心后的上清液用冰醋酸调pH至5.0(V1)，再加入相当于1/3V1体积的5mol·L-1KAc溶液，计算并加入无水乙醇，使总溶液的乙醇浓度为70％，充分混匀后，-20℃沉淀30min；
7)在4℃、13,000×g条件下离心15min，去除上清液，沉淀即为RNA产物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302508B (zh) * 2008-06-12 2010-09-15 上海交通大学 假单胞菌m18的rna快速提取方法
CN104593356A (zh) * 2015-01-30 2015-05-06 浙江省农业科学院 一种提取草莓rna的方法
CN110760508A (zh) * 2019-05-08 2020-02-07 漯河市农业科学院 一种提取小麦总rna的方法

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