CN104593356A - 一种提取草莓rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物学技术领域，公开了一种提取草莓RNA的方法，包括以下步骤：用裂解液裂解植物组织样品，用氯仿/异戊醇混合液纯化裂解样品，用沉淀液沉淀裂解样品，用溶解液溶解沉淀，用氯仿/异戊醇混合液纯化含沉淀的溶解液，用乙醇沉淀纯化过的溶解液，用DEPC水溶解沉淀，沉淀在无菌工作台吹干，然后向沉淀中加入DEPC水，即为草莓RNA溶液。本发明综合应用了CTAB和SDS的高裂解能力，LiCl和无水乙醇的沉淀方法，最终得到高糖多酚类植物草莓高质量的RNA。本发明解决了草莓次生物含量高导致的高质量RNA提取困难的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，尤其涉及一种提取草莓RNA的方法。
背景技术
RNA的提取是分子生物学的基本技术之一，高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达研究等的前提。但由于RNA很容易被RNase降解，而且RNase广泛存在而且不易变性失活。因此，高质量RNA的分离已经成为分子生物学实验关键的技术之一。
草莓的叶片、果实、花等部位均含丰富的酚类物质、多糖等多种次生代谢物，在提取RNA的过程中难以完全去除，会干扰RNA的分离。因此，能否在提取过程中尽量去除这些干扰物质是获得高质量RNA的关键。目前提取RNA的主要方法有酸酚法、CTAB法、热酚法、冷酚法、SDS酸酚法、异硫氢酸胍法和Trizol法等。这些方法都能提取到草莓的RNA，提取效果不太理想，特别是对于老的叶片和成熟的果实。因此，发展一种适用于草莓RNA提取的高质量方法对于提高实验效率非常必要。
发明内容
本发明针对现有中的缺点，公开了一种提取草莓RNA的方法，解决了草莓次生物含量高导致的高质量RNA提取困难的问题，本发明对常用的CTAB-LiCl方法加以改良，同时加入对核糖核酸酶有抑制作用的SDS，获得了一种草莓RNA提取的有效方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
一种提取草莓RNA的方法，包括以下步骤，
(1)将裂解液预热到55～65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5～10ml预热后的裂解液，在55～65℃下保温1～5分钟，其间晃动1～2次使其混合，得到混合物Ⅰ；本发明在传统CTAB-LiCl提取的方法上进行了改良，在裂解液中加入了SDS，不仅增加了核酸的裂解效率，还能使蛋白质变性、去除多糖，对Rnase有较强的抑制作用，避免了高温可能导致的RNA降解。
(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；
(3)再加入8-14M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/6-1/3，加入无水乙醇的体积是上清液的1/10-4/10；在1～4℃放置1h～12h，2-5℃离心后，收集沉淀；用沉淀液沉淀裂解样品；在LiCl中加入了适量的无水乙醇，增加了RNA的沉淀效率，一定程度上增加了RNA得率。
(4)将溶解液预热到55-70℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；
(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，2-5℃离心分离得到上清液；用氯仿/异戊醇混合液纯化含沉淀的溶解液。
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入乙醇，加入乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的2～3倍，-15至-25℃放置30min以上，2-5℃离心，收集沉淀；用乙醇沉淀纯化过的溶解液。
(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有75-85％乙醇的DEPC水，加入含有75-85％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的0.5-1.5倍，2-5℃离心收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA；
其中，步骤(1)中，裂解液包括1-5％(m/V)的CTAB和1-5％的SDS。
作为优选，步骤(1)中，裂解液用0.1-0.5％的DEPC水配置，裂解液包括1-5％(m/V)的CTAB，1-5％的SDS，1-5％的PVP-K30，80-120mM的Tris·Cl，20-30mM的EDTA，1-5M的NaCl，0.01-0.08％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7.5-8.5。
作为优选，将裂解液在110-125℃灭菌20-40min，使用时在每100ml裂解液中加入1-3ml的β-巯基乙醇。
作为优选，步骤(1)中，裂解液用0.1％的DEPC水配置，裂解液包括2％(m/V)的CTAB，2％的SDS，2％的PVP-K30，100mM的Tris·Cl，25mM的EDTA，2M的NaCl，0.05％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7。
作为优选，步骤(4)中，溶解液包括0.5-2M的NaCl，体积百分比为0.2-1％的SDS，8-15mM的Tris，0.5-2mM的EDTA；且溶解液的pH值为7.5-8.5。
作为优选，步骤(6)中加入的乙醇为无水乙醇。
作为优选，氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明在传统CTAB-LiCl提取的方法上进行了改良，在裂解液中加入了SDS，不仅增加了核酸的裂解效率，还能使蛋白质变性、去除多糖，对Rnase有较强的抑制作用，避免了高温可能导致的RNA降解。在LiCl中加入了适量的无水乙醇，增加了RNA的沉淀效率，一定程度上增加了RNA得率。经过LiCl和乙醇沉淀RNA后，加入的溶解液中含有SDS，减少了后续纯化过程中RNA的降解，保证了提取RNA的完整性。经检测用本发明方法得到的草莓RNA质量较高，用本专利方法提取RNA，逆转录后扩增草莓Actin基因。
附图说明
图1是异硫氢酸胍法提取的草莓RNA凝胶电泳检测图片。
图2是Trizol法提取的草莓RNA凝胶电泳检测图片。
图3是本发明方法提取的草莓RNA凝胶电泳检测图片。
图4是本发明方法提取果实RNA后扩增草莓Actin基因的凝胶电泳检测图片。
具体实施方式
实施例1
一种提取草莓RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将裂解液预热到55℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5ml预热后的裂解液，在55℃下保温1分钟，其间晃动1次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；
(3)再加入8M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/3，加入无水乙醇的体积是上清液的1/10；在1℃放置1h，2℃离心后，收集沉淀；(4)将溶解液预热到55℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；
(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，2℃离心分离得到上清液；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入乙醇，加入乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的2倍，-15℃放置30min以上，2℃离心，收集沉淀；
(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有75％乙醇的DEPC水，加入含有75％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的0.5倍，2℃离心收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA。
其中，步骤(1)中，裂解液包括1％(m/V)的CTAB和1％的SDS。
步骤(4)中，溶解液包括0.5M的NaCl，体积百分比为0.2％的SDS，8mM的Tris，0.5mM的EDTA；且溶解液的pH值为7.5。
氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
图1和图2分别是异硫氢酸胍法和Trizol法提取草莓叶片RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图片。从图1和图2可以看出用这两种方法提取的RNA降解比较严重，点样孔也亮，DNA污染也比较严重，表明所提取的RNA纯度不高，质量也不高，多糖物质含量高。图3是用本发明方法提取的RNA，从图中可以看出，所提取的RNA质量高，DNA污染轻，点样孔比较干净，28S/18S≈2:1，是一种理想提取草莓RNA的方法。图4是用所提取的RNA逆转录后用Actin基因扩增的结果。
实施例2
一种提取草莓RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将裂解液预热到65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入10ml预热后的裂解液，在65℃下保温5分钟，其间晃动2次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；
(3)再加入14M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/6，加入无水乙醇的体积是上清液的4/10；在4℃放置12h，5℃离心后，收集沉淀；
(4)将溶解液预热到70℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；
(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，5℃离心分离得到上清液；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入无水乙醇，加入无水乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的3倍，-25℃放置30min以上，5℃离心，收集沉淀；
(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有85％乙醇的DEPC水，加入含有85％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的1.5倍，5℃离心收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA。
其中，步骤(1)中，裂解液用0.5％的DEPC水配置，裂解液包括5％(m/V)的CTAB，5％的SDS，5％的PVP-K30，120mM的Tris·Cl，30mM的EDTA，5M的NaCl，0.08％的亚精胺；裂解液的pH值控制在8.5。将裂解液在125℃灭菌40min，使用时在每100ml裂解液中加入3ml的β-巯基乙醇。
步骤(4)中，溶解液包括2M的NaCl，体积百分比为1％的SDS，15mM的Tris，2mM的EDTA；且溶解液的pH值为8.5。
氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
实施例3
一种提取草莓RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将裂解液预热到60℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入8ml预热后的裂解液，在58℃下保温3分钟，其间晃动2次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；
(3)再加入12M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/5，加入无水乙醇的体积是上清液的3/10；在3℃放置8h，4℃离心后，收集沉淀；
(4)将溶解液预热到65℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；
(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，4℃离心分离得到上清液；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入乙醇，加入乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的2～3倍，-20℃放置30min以上，4℃离心，收集沉淀；
(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有80％乙醇的DEPC水，加入含有80％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的0.5-1.5倍，4℃离心收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA。
其中，步骤(1)中，裂解液用0.5％的DEPC水配置，裂解液包括5％(m/V)的CTAB，5％的SDS，5％的PVP-K30，120mM的Tris·Cl，30mM的EDTA，5M的NaCl，0.08％的亚精胺；裂解液的pH值控制在8.5。将裂解液在125℃灭菌40min，使用时在每100ml裂解液中加入3ml的β-巯基乙醇。
步骤(4)中，溶解液包括1M的NaCl，体积百分比为0.5％的SDS，10mM的Tris，1mM的EDTA；且溶解液的pH值为8。
氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
实施例4
一种提取草莓RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将裂解液预热到58℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入6ml预热后的裂解液，在59℃下保温2分钟，其间晃动2次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；
(3)再加入8M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/3，加入无水乙醇的体积是上清液的2/10；在2℃放置10h，3℃离心后，收集沉淀；
(4)将溶解液预热到60℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；
(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，3℃离心分离得到上清液；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入乙醇，加入乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的2.5倍，-18℃放置30min以上，3℃离心，收集沉淀；
(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有78％乙醇的DEPC水，加入含有78％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的0.5-1.5倍，3℃离心收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA；
其中，步骤(1)中，裂解液用0.1％的DEPC水配置，裂解液包括2％(m/V)的CTAB，2％的SDS，2％的PVP-K30，100mM的Tris·Cl，25mM的EDTA，2M的NaCl，0.05％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7。将裂解液在110-125(121)℃灭菌20-40(15)min，使用时在每100ml裂解液中加入1-3(2)ml的β-巯基乙醇。
步骤(4)中，溶解液包括0.8M的NaCl，体积百分比为0.6％的SDS，11mM的Tris，0.9mM的EDTA；且溶解液的pH值为8。
氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
实施例5
(1)用液氮将成熟草莓果实研麿成粉末。按每1g样品粉末加入5ml含2％β-巯基乙醇裂解液的量，在粉末中加入65℃预热的裂解液，在65℃下保温1分钟，其间晃动1次，使其充分混匀；
(2)再加入5ml的氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，15℃，10000rpm离心15min，取上清4.8ml；再加入4.8ml的氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，15℃，10000rpm离心15min，取上清4.5ml；
(3)向步骤(2)所得上清液中加0.9ml的12M LiCl和0.45ml的无水乙醇，4℃放置12h，4℃12000rpm离心15min离心后去除上清液，收集沉淀；
(4)向步骤(3)所得的沉淀物中加入65℃预热的溶解液600μl，充分混匀，完全溶解沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的含沉淀的溶解液中加入600μl氯仿/异戊醇混合液，在4℃下12000rpm下离心15分钟，取上清550μl；向所得的上清液中加入550μl的氯仿/异戊醇混合液，在4℃下12000rpm下离心15分钟，取上清500μl；
(6)将步骤(5)所得的上清液中1ml的无水乙醇，-20℃下放置60min，然后在4℃下12000rpm下离心15分钟，去上清，收集沉淀；
(7)向步骤(6)所得的沉淀物中加入1ml的含有80％乙醇的DEPC水，4℃下12000rpm下离心洗涤沉淀2次，收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，然后加100μlDEPC水，溶解后所得混合物即为草莓RNA。
实施例6
(1)用液氮将草莓叶片研麿成粉末。按每1g样品粉末加入10ml含2％β-巯基乙醇裂解液的量，在粉末中加入65℃预热的裂解液，在65℃下保温2分钟，其间晃动2次，使其充分混匀；
(2)再加入10ml氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，25℃，12000rpm离心10min，取上清9.8ml；加入9.8ml的氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，25℃，12000rpm离心10min，取上清液；
(3)再加入1.9ml的12M LiCl和0.95ml的无水乙醇，4℃放置1h，4℃12000rpm离心15min离心后，收集沉淀；
(4)向步骤(3)所得的沉淀物中加入65℃预热的溶解液1200μl，充分混匀，完全溶解沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的含沉淀的溶解液中加入1200μl氯仿/异戊醇混合液，在4℃下10000rpm下离心10分钟，取上清1150μl；向所得的上清液中加入1150μl的含沉淀的溶解液，在4℃下10000rpm下离心10分钟，取上清液；
(6)将步骤(5)所得的上清液中加入3ml的无水乙醇，-20℃下放置30min，然后在4℃下12000rpm下离心10分钟，收集沉淀；
(7)向步骤(6)所得的沉淀物中加入2ml含有80％乙醇的DEPC水，4℃下12000rpm下离心洗涤沉淀2次，收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，然后加200μlDEPC水，溶解后所得混合物即为草莓RNA。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种提取草莓RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将裂解液预热到55～65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5～10ml预热后的裂解液，在55～65℃下保温1～5分钟，其间晃动1～2次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；
(3)再加入8-14M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/6-1/3，加入无水乙醇的体积是上清液的1/10-4/10；在1～4℃放置1h～12h，2-5℃离心后，收集沉淀；
(4)将溶解液预热到55-70℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；
(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，2-5℃离心分离得到上清液；
(6)向步骤(5)得到的上清液中加入乙醇，加入乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的2～3倍，-15至-25℃放置30min以上，2-5℃离心，收集沉淀；
(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有75-85％乙醇的DEPC水，加入含有75-85％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的0.5-1.5倍，2-5℃离心收集沉淀物；
(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA；
其中，步骤(1)中，裂解液包括1-5％(m/V)的CTAB和1-5％的SDS。
2.根据权利要求1所述的提取草莓RNA的方法，其特征在于：步骤(1)中，裂解液用0.1-0.5％的DEPC水配置，裂解液包括1-5％(m/V)的CTAB，1-5％的SDS，1-5％的PVP-K30，80-120mM的Tris·Cl，20-30mM的EDTA，1-5M的NaCl，0.01-0.08％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7.5-8.5。
3.根据权利要求2所述的提取草莓RNA的方法，其特征在于：将裂解液在110-125℃灭菌20-40min，使用时在每100ml裂解液中加入1-3ml的β-巯基乙醇。
4.根据权利要求3所述的提取草莓RNA的方法，其特征在于：步骤(1)中，裂解液用0.1％的DEPC水配置，裂解液包括2％(m/V)的CTAB，2％的SDS，2％的PVP-K30，100mM的Tris·Cl，25mM的EDTA，2M的NaCl，0.05％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7。
5.根据权利要求1所述的提取草莓RNA的方法，其特征在于：步骤(4)中，溶解液包括0.5-2M的NaCl，体积百分比为0.2-1％的SDS，8-15mM的Tris，0.5-2mM的EDTA；且溶解液的pH值为7.5-8.5。
6.根据权利要求1所述的提取草莓RNA的方法，其特征在于：步骤(6)中加入的乙醇为无水乙醇。
7.根据权利要求1所述的提取草莓RNA的方法，其特征在于：氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150506 |