CN101492485B - 一种提取裸子植物组织中rna的方法 - Google Patents

一种提取裸子植物组织中rna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取裸子植物组织中RNA的方法。该方法包括以下步骤：1)用RNA提取缓冲液处理植物材料；2)去蛋白：用等体积的氯仿/异戊醇抽提两次；3)用LiCl沉淀RNA和用SSTE回溶RNA；4)去除多糖：将无水乙醇和醋酸钾加入到步骤3)得到的回溶溶液中，放入冰浴中沉淀多糖；5)再次经氯仿/异戊醇抽提；6)再次沉淀RNA和DEPC·H2O回溶RNA。为了去除DNA，还可进行以下步骤：a)用无RNase污染的DNase去除DNA；b)用氯仿/异戊醇抽提去除DNase；c)重复步骤6)。其中，所述RNA提取缓冲液中含有100mmol/L Tris HCl(pH 8.0)、2g/100mlCTAB、2g/100mlPVP、2mol/LNaCl、25mmol/L EDTA，使用前加入终浓度10mmol/L二硫苏糖醇和2％(体积百分比)的β-巯基乙醇。这样解决了多糖、多酚等干扰，得到的RNA纯度高。

Description

一种提取裸子植物组织中RNA的方法
技术领域
本发明涉及一种提取树木类植物组织中RNA的方法，特别涉及一种提取裸子植物组织中RNA的方法。
背景技术
裸子植物和被子植物同属于种子植物，作为地球上的重要植物类群，裸子植物在进化史上更原始，具有生长周期长，花粉管生长缓慢、易分叉等特点，因而被认为具有不同于被子植物花粉发育的独特发育模式而逐渐受到重视。裸子植物与人类生产和国民经济建设休戚相关，具有较高的生态、社会和经济效益，对于维持全球的生态平衡，改善环境污染具有十分重要的作用。裸子植物多为重要林木，尤其在北半球，大的森林80％以上是裸子植物，是很好的建筑、车船、造纸用材。因此开展裸子植物生长发育及代谢、抗逆等相关的各种分子机制研究和林木生物技术发展与应用研究就显得尤为必要。
相对于一年生植物而言，树木类植物组织中酚类和多糖等次生物质含量较多，且该类物质对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，导致林木尤其裸子植物分子生物学研究明显滞后。研究裸子植物生长发育及代谢、抗逆等相关的各种分子机制以及林木转基因研究，均涉及到其组织中RNA的提取。但由于裸子植物遗传背景的复杂性及分子操作上的实际困难导致裸子植物分子生物学和基因工程包括林木抗性、生殖发育、材性改良等明显落后。目前，RNA的提取方法很多，采取Trizol试剂盒、SDS、常规CTAB等方法均不能有效地从木本裸子植物组织中提取高质量的RNA。迄今为止还没有提取木本裸子植物各种组织中高质量RNA的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的分子生物学研究和生物技术的发展与应用相对于被子植物和一年生作物滞后许多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取裸子植物组织中RNA的方法。
本发明所提供的方法包括以下步骤：
1)裂解细胞释放内含物；
2)去蛋白：用氯仿/异戊醇抽提步骤1)得到的混合液，收集上清液；
3)沉淀RNA和回溶RNA：将步骤2)得到的上清液中的RNA沉淀，然后回溶RNA；
4)去除多糖：将步骤3)得到的回溶溶液去除多糖成分；
5)再次沉淀RNA和回溶RNA：将步骤4)得到的溶液中的RNA沉淀，然后回溶RNA。
为了更好地纯化RNA，去除DNA污染，还可在步骤5)后进行进一步纯化RNA的步骤，包括以下步骤：
a)去除DNA：将无RNase污染的DNase加入到步骤5)得到的回溶溶液中；
b)去除DNase：将步骤a)得到的溶液用氯仿/异戊醇抽提，离心收集上清液；
c)再次沉淀RNA和回溶RNA：将步骤b)得到的溶液中的RNA沉淀，清洗沉淀、干燥，回溶。
为了清除蛋白，步骤2)可重复1-2次。
为了进一步清除蛋白，在步骤4)之后，步骤5)之前，可再次去除蛋白：将步骤4)得到的上清液经氯仿/异戊醇抽提，然后离心，收集上清液。
上述氯仿/异戊醇体积比为24∶1。
步骤1)裂解细胞释放内含物，可用液氮将植物材料速冻研磨后，加入预热过的RNA提取缓冲液，迅速涡旋，放回水浴中温浴。
所述RNA提取缓冲液含有浓度为80-120mmol/L，pH 8.0的Tris HCl、1-3g/100mlCTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、1-3g/100ml PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、1.3-2.5mol/LNaCl、20-30mmol/L EDTA，使用前加入终浓度为5-15mmol/L二硫苏糖醇和终浓度为1-3％(体积百分比)的β-巯基乙醇。
所述RNA提取缓冲液含有浓度为90-110mmol/L，pH 8.0的Tris HCl、1.5-2.5g/100ml CTAB、1.5-2.5g/100ml PVP、1.4-2.3mol/L NaCl、23-27mmol/LEDTA，使用前加入终浓度为10mmol/L二硫苏糖醇和终浓度为2％(体积百分比)的β-巯基乙醇。
步骤3)中的所述沉淀RNA和回溶RNA是往步骤2)中得到的上清液中加入LiCl，过夜，离心，回收沉淀，洗涤沉淀，干燥，回溶；其中LiCl的终浓度为1.5-2.5mol/L，在4℃下放置8-16小时。
步骤4)中的去除多糖是将多糖去除液加入到步骤3)得到的回溶溶液中，放入冰浴中沉淀多糖，然后离心，收集上清液；其中，多糖去除液包括无水乙醇和醋酸钾，无水乙醇在反应体系中终浓度为10％-30％(体积百分比)，优选为20％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.4-0.6mol/L。
步骤4)中的冰浴时间优选为10分钟。
所述步骤5)或步骤c)用RNA沉淀液来沉淀RNA，所述RNA沉淀液包括无水乙醇和醋酸钾，其中无水乙醇在反应体系中终浓度为60-80％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.4-0.6mol/L。
步骤a)中DNase在37℃下处理20-30分钟，优选30为分钟。
所述裸子植物为松杉纲松科植物，所述松杉纲松科植物为青杄或白皮松。
本发明的方法中，提取缓冲液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)可以去除多酚类物质对RNA分离的干扰破坏作用，与PVP结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在氯仿抽提时除去。在RNA溶液中加入无水乙醇至终浓度10％～30％以及醋酸钾，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。用无RNase污染的DNase处理RNA溶液，可以有效去除RNA中的基因组污染，得到高纯度的RNA。本发明克服了木本裸子植物组织中多糖、多酚类物质含量高所带来的不利影响，能从其中提取得到高质量的RNA，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1为青杄针叶组织未去基因组DNA的RNA经1.2％变性琼脂糖凝胶电泳图；
图2为青杄针叶组织去除基因组DNA的RNA经1.2％变性琼脂糖凝胶电泳图；
图3为白皮松花粉组织未去基因组DNA的RNA经1.2％变性琼脂糖凝胶电泳图；
图4为白皮松花粉组织去除基因组DNA的RNA经1.2％变性琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用试剂：
1.提取缓冲液：100mmol/L Tris HCl(pH 8.0)、2g/100mlCTAB、2g/100mlPVP、2mol/LNaCl、25mmol/L EDTA，使用前加入终浓度为10mmol/L二硫苏糖醇和终浓度为2％(体积百分比)的β-巯基乙醇；
2.SSTE：1mol/L NaCl、0.5g/100mlSDS、10mmol/LTris-HCl(pH 8.0，灭菌后加)、1mmol/LEDTA；
3.1mol/L Tris HCl(pH8.0)：100ml DEPC·H2O(灭菌)加12.114g Tris，用浓盐酸调pH值至8.0；
4.0.5mol/L EDTA：将18.61g EDTANa·2H2O用DEPC·H2O(未灭菌)溶解，定容至100ml，用NaOH颗粒调节溶液pH值至8.0，高压灭菌；
5.10％SDS：100ml DEPC·H2O(未灭菌)中加入10gSDS，加热溶解，高压灭菌；
6.4mol/L LiCl：16.956g无水LiCl溶于DEPC·H2O(未灭菌)中，定容至100ml，高压灭菌；
7.5mol/L醋酸钾：49.07g醋酸钾溶于DEPC·H2O(未灭菌)，定容至100ml，高压灭菌。
实施例1、提取青杄针叶组织总RNA(未去DNA)
提取青杄针叶组织总RNA(未去DNA)包括以下步骤：
1、将提取缓冲液用前加入2％(体积百分比)的β-巯基乙醇和10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，放在65℃水浴中温浴15分钟，样品与提取液的量为1∶5(g/mL)；
2、液氮中研磨2～3g青杄针叶，加入80mL离心管中，迅速涡旋30～60秒，65℃加热15分钟，加入15mL氯仿/异戊醇，混匀；
3、10000rpm，室温离心15分钟，上清转移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提一次；
4、上层水相转移至另一离心管中，加入等体积的4mol/L的LiCl，使其终浓度为2mol/L，4℃过夜；
5、12000rpm、4℃离心20分钟，完全去除上清，以回收RNA沉淀；
6、沉淀先用500μL 70％(体积百分比)乙醇洗，再用500μL无水乙醇洗；
7、将RNA沉淀用500μL SSTE重新溶解，转至1.5mL的离心管中，加入1/4体积的无水乙醇和1/10体积的5mol/L醋酸钾充分混匀后，无水乙醇的终浓度为20％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.5mol/L，置于冰浴中保持10分钟，12000rpm离心10分钟，上清转移至一新的1.5mL离心管中；
8、加等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，12000rpm室温离心15分钟；
9、上清转移至一新的1.5mL离心管中，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积5mol/L醋酸钾，无水乙醇的终浓度为70％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.5mol/L，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；
10、12000rpm、4℃离心20分钟，沉淀用400μL 70％(体积百分比)乙醇洗，再用400μL无水乙醇洗，干燥后，加50μL DEPC·H2O溶解沉淀，于-80℃保存。
实施例2、提取青杄针叶组织总RNA(去除DNA)
提取青杄针叶组织总RNA(去除DNA)包括以下步骤：
实施例2是在实施例1步骤10)后面，增加去除DNA的步骤，其它步骤完全相同。去除DNA的步骤包括如下：
a)用无RNase污染的DNase去除RNA中的基因组DNA(50μL反应体系中含有5μL的10×DNaseI buffer、10U DNase、20U RNaseInhibitor、20～50μg RNA)37℃反应30分钟；
b)用等体积的氯仿/异戊醇抽提去除RNA中的酶等杂质，12000rpm离心30分钟；
c)上层水相转移新1.5ml离心管中，用2倍体积无水乙醇和1/10体积5mol/L醋酸钾，无水乙醇的终浓度为70％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.5mol/L，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；12000rpm、4℃离心30分钟回收沉淀，用70％(体积百分比)乙醇洗沉淀，干燥，加50μL DEPC·H2O溶解沉淀，于-80℃保存。
电泳检测RNA的完整性
分别将实施例1和实施例2的RNA经甲醛变性，然后在1.2％(g/ml)琼脂糖凝胶上电泳，其结果见图1和图2。
从图中可以看出，经过本发明的方法，提取到的RNA，不论是去除DNA还是未去除DNA，电泳检测28s和18s条带均非常清晰，说明RNA保持了较好的完整性。但是，不经过去除DNA的步骤，得到的RNA尚有基因组DNA的污染。
提取的RNA的纯度检测
取少量实施例2得到的RNA样品，用TE或蒸馏水稀释50倍，用TE或蒸馏水做空白，在230nm、260nm、280nm处调节紫外分光光度计的读数至零，然后读出待测样品在三个波长处的OD值。
结果显示：紫外分光光度计测得OD260/OD280和OD260/OD230比值均介于1.8～2.2之间，表明RNA纯度符合要求。
实施例3、提取白皮松花粉组织总RNA(未去除DNA)
提取白皮松花粉组织总RNA(未去除DNA)的具体步骤如下：
1、将提取缓冲液用前加入2％(体积百分比)的β-巯基乙醇10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，放在65℃水浴中温浴15分钟，样品与提取液的量为1∶5(g/mL)；
2、液氮中研磨2g白皮松成熟花粉，加入80mL离心管中，迅速涡旋30～60秒，65温浴15分钟，加入15mL氯仿/异戊醇，混匀；
3、10000rpm，室温离心15分钟，上清转移至另一管中，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提一次；
4、上层水相转移至另一离心管中，加入等体积的4mol/L的LiCl，使其终浓度为2mol/L，4℃过夜；
5、12000rpm，4℃离心20分钟，完全去除上清，用500μL 70％乙醇清洗沉淀，再用500μL无水乙醇清洗沉淀；
6、加500μL SSTE溶解沉淀，转至1.5mL离心管中，加入1/4体积的无水乙醇和1/10体积的5mol/L醋酸钾充分混匀后，无水乙醇的终浓度为20％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.5mol/L，置于冰浴中保持10分钟，12000rpm离心10分钟，上清转移至一新的1.5ml离心管中；
7、加等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，12000rpm室温离心15分钟；
8、上清转移至另一1.5mL离心管中，加入1/10体积的5mol/L醋酸钾和2倍体积的无水乙醇，无水乙醇的终浓度为70％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.5mol/L，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；
9、13000rpm，4℃离心20分钟，用400μL 70％乙醇清洗沉淀，再用400μL无水乙醇清洗沉淀，干燥后，加50μL DEPC·H2O溶解沉淀，于-80℃保存。
实施例4、提取白皮松花粉组织总RNA(去除DNA)
实施例4是在实施例3的步骤9的后面增加去除DNA的步骤，其它步骤完全相同。去除DNA步骤如下：
a、用无RNase污染的DNase去除RNA中的基因组DNA(50μL反应体系中含有5μL的10×DNaseI buffer、10U DNase、20U RNaseInhibitor、20～50μg RNA)37℃反应30分钟；
b、用等体积的氯仿/异戊醇抽提去除RNA中的酶等杂质，12000rpm离心30分钟；
c、上层水相转移新1.5离心管中，用2倍体积无水乙醇和1/10体积5mol/L醋酸钾，无水乙醇的终浓度为70％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.5mol/L，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；12000rpm、4℃离心30分钟回收沉淀，用70％(体积百分比)乙醇洗沉淀，干燥，加50μL DEPC·H2O，65℃加热10分钟，溶解沉淀，于-80℃保存。
电泳检测RNA完整性
将实施例3和实施例4的RNA经甲醛变性，然后在1.2％(g/ml)琼脂糖凝胶上电泳，其结果见图3和图4。
从图中可以看出，经过本发明的方法，提取到的RNA，不论是去除DNA还是未去除DNA，电泳检测28s和18s条带均非常清晰，说明RNA保持了较好的完整性。但是，不经过去除DNA的步骤，得到的RNA尚有基因组DNA的污染。
提取的RNA的纯度检测
取少量实施例4得到的RNA样品，用TE或蒸馏水稀释50倍，用TE或蒸馏水做空白，在230nm、260nm、280nm处调节紫外分光光度计的读数至零，然后读出待测样品在三个波长处的OD值。
结果显示：紫外分光光度计测得OD260/OD280和OD260/OD230比值均介于1.8～2.2之间，表明RNA纯度符合要求。

Claims (8)

1.一种提取裸子植物组织中RNA的方法，包括以下步骤：
1)裂解细胞释放内含物；
所述裂解细胞释放内含物是用液氮将植物材料速冻研磨后，加入预热过的RNA提取缓冲液，迅速涡旋，放回水浴中温浴，所述RNA提取缓冲液含有浓度为80-120mmol/L，pH 8.0的Tris HCl、1-3g/100mlCTAB、1-3g/100mlPVP、1.3-2.5mol/LNaCl、20-30mmol/LEDTA，使用前加入终浓度为5-15mmol/L二硫苏糖醇和终浓度为1-3％(体积百分比)的β-巯基乙醇；
2)去蛋白：用氯仿/异戊醇抽提步骤1)得到的混合液，收集上清液；
3)沉淀RNA和回溶RNA：将步骤2)得到的上清液中的RNA沉淀，然后回溶RNA；
4)去除多糖：将步骤3)得到的回溶溶液去除多糖成分；
5)再次沉淀RNA和回溶RNA：将步骤4)得到的溶液中的RNA沉淀，然后回溶RNA；
所述方法还包括在步骤5)后进行进一步纯化RNA的步骤，包括以下步骤：
a)去除DNA：将无RNase污染的DNase加入到步骤5)得到的回溶溶液中；
b)去除DNase：将步骤a)得到的溶液用氯仿/异戊醇抽提，离心收集上清液；
c)再次沉淀RNA和回溶RNA：将步骤b)得到的溶液中的RNA沉淀，清洗沉淀、干燥，回溶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)重复1-2次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤4)之后，步骤5)之前，再次去除蛋白：将步骤4)得到的上清液经氯仿/异戊醇抽提，然后离心，收集上清液。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述氯仿/异戊醇体积比均为24∶1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中的所述沉淀RNA和回溶RNA是往步骤2)中得到的上清液中加入LiCl，在4℃下放置8-16小时，离心，回收沉淀，洗涤沉淀，干燥，回溶；其中LiCl的终浓度为1.5-2.5mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中的去除多糖是将多糖去除液加入到步骤3)得到的回溶溶液中，放入冰浴中沉淀多糖，然后离心，收集上清液；其中，多糖去除液包括无水乙醇和醋酸钾，无水乙醇在反应体系中终浓度为10％-30％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.4-0.6mol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5)或步骤c)用RNA沉淀液来沉淀RNA，所述RNA沉淀液包括无水乙醇和醋酸钾，其中无水乙醇在反应体系中终浓度为60-80％(体积百分比)，醋酸钾的终浓度为0.4-0.6mol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裸子植物为松杉纲松科植物，所述松杉纲松科植物为青杆或白皮松。
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李菁芳，等.一种适用于RT-PCR的杉树类植物中总RNA提取的方法.《武汉植物学研究》.2004,第22卷(第6期),551-556. *

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