CN1884524A - 一种提取植物rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取植物RNA的方法。该方法，包括以下步骤：1)在植物材料中加入60％－80％的丙酮和1％－3％的巯基乙醇，进行抽提，弃上清液，保留抽提过的植物材料；2)加入提取液I，并加入蛋白酶K，40－45℃水浴0.5－2小时；3)加入KCl，使其终浓度为150－180mol/L，－1～1℃放置1－3小时后，9000－13000g离心15－30分钟，收集上清溶液；4)加入LiCl，使其终浓度为1.5－2mol/L，0－5℃放置3－10小时后，9000－13000g，15－30分钟，收集沉淀；5)加入LiCl，使其终浓度为1－1.8mol/L mol/L，9000－13000g，15－25分钟，重复1－3次，得到的沉淀即为提取的RNA。该方法解决了RNA中多糖、酚类等化合物氧化问题；获得的RNA纯度高，操作过程中不易降解；RNA在提取过程中损失少。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种提取植物RNA的方法。
背景技术
从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。有些植物组织中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物和大量的油脂，特别是富含多糖、酚类等化合物和一些目前尚无法确定的次级代谢物，当组织被研磨碎时，酚类化合物被氧化后与RNA不可逆结合，导致RNA活性丧失，有时在用苯酚氯仿抽提时会丢失部分或全部RNA，另外，酚类等次生物质极易与RNA形成不溶性物质而共沉淀，多糖也会形成难溶性的胶状物，与RNA共沉淀下来。因此一般常规方法及一些试剂盒都不能有效地提取到纯度较好的总RNA，而阻碍了分子生物学方面的研究进展。
目前，常用的RNA提取方法有TRIZOL试剂快速提取法、SDS-KAc法、苯酚法、异硫氰酸胍法、CTAB法，LiCl法等。用上述这些方法，Rnase和蛋白质以及酚类等次生物质污染都是RNA提取过程中造成RNA提取质量下降的主要原因。例如用TRIZOL试剂快速提取法和异硫氰酸胍法提取的总RNA，条带能够达到清晰，但杂质多，不溶物多，酚类物质去除不彻底，如果纯化mRNA时，酚类物质就会导致纤维素变褐，被氧化的酚类化合物能与RNA稳定地结合，所纯化的mRNA在反转录过程中变褐，无法进行反转录。在大多数RNA提取方法中都是通过利用酚、氯仿进行多次抽提去除样品中的蛋白质，但是RNA的损耗较大。用单纯LiCl沉定法也不能有效去除其中的酚类物质，而且多次沉淀会使RNA的获得量大大减少。
发明内容
本发明的目的是提供一种特别适合富含多糖及多酚类物质植物材料的总RNA提取的方法。
本发明所提供的提取植物RNA的方法，包括以下步骤：
1)在植物材料中加入含有体积百分含量为60％-80％的丙酮和体积百分含量为1％-3％的巯基乙醇混合液，进行抽提，9000-13000g离心10-20分钟，弃上清液，保留抽提过的植物材料；
2)在步骤1)抽提过的植物材料中加入70℃预热的提取液I，并加入蛋白酶K，40-45℃水浴0.5-2小时；
提取液I的pH为8-10，可按如下方法配制：取SDS 0.2-1g，硼砂1-2g，脱氧胆酸(盐)0.2-0.6g和EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸)0.27-0.5g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC(焦碳酸二乙酯)振荡混匀，37℃放置4-10小时，灭菌后加入100-200μl 1M DTT(二硫代苏糖醇)、100-200μl Nonidet P-40(乙基苯基聚乙二醇)(湿润剂P40)和0.2-0.5g PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)，混匀后使用；
3)加入KCl，使其终浓度为150-180mmol/L，-1～1℃放置1-3小时后，4℃，9000-13000g离心15-30分钟，收集上清溶液；
4)在步骤3)收集的上清溶液中加入LiCl，使其终浓度为1.5-2mol/L，0-5℃放置3-10小时后，9000-13000g离心15-30分钟，收集沉淀；
5)在步骤4)收集的沉淀中加入LiCl，使其终浓度为1-1.8mol/L，9000-13000g离心15-25分钟，重复1-3次，得到的沉淀即为提取的RNA。
所述步骤2)中，所述提取液I的pH为9，具体按如下方法配制：取SDS 0.2g，硼砂1.52g，脱氧胆酸或脱氧胆酸盐0.2g和EGTA 0.27g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC振荡混匀，37℃放置4-10小时，灭菌后加入200μl 1M DTT、200μlNonidetP-40、0.4g PVP-40，混匀后使用。
所述步骤2)中，提取液I的用量为1-10ml/g植物材料，蛋白酶K的用量为0.5-1mg/g植物材料；
所述提取液I的用量优选为1-3ml/g植物材料。
上述方法中，得到的沉淀可用70％乙醇清洗2次，室温晾干。可加水溶解，也可于65℃水浴以加速溶解，但时间不要超过20分钟。
为了近一步纯化，可将水溶液在9000-13000g下离心10-20分钟，去除部分不溶性杂质。
如果发现所提取的RNA中仍有大量杂质，可加入NaCl，使其终浓度为1.25-2.5mol/L，再用1倍体积的氯仿抽提1次，离心取上清；或加入KCl，使其终浓度为0.15-0.25mol/L，放于冰上15分钟，离心取上清。然后再加入是上清体积的1/10的3MNaAc和100％的乙醇，-20℃放置3小时以上沉淀RNA。可再重复70％乙醇清洗、加水溶解，将水溶液在9000-13000g离心10-20分钟，去除部分不溶性杂质。
本发明的方法特别适合一些富含多糖、酚类等化合物的植物材料，例如：花生、棉花、芒果和一些针叶类植物的针叶。
本发明的方法采取丙酮抽提配合还原剂、螯合剂来解决酚类物质氧化问题，再加上高浓度LiCl沉定、低浓度LiCl清洗等方法，不仅能够很好地防止酚类物质氧化，还可达到去除多糖及次生代谢物的效果。加入蛋白酶K和SDS可有效去除植物组织中蛋白质的干扰。本发明的方法沉淀次数少，可省去酚、氯仿抽提的步骤，如果组织中含多糖过多，最后用高浓度NaCl配合酚、氯仿抽提一次就可起到较好的去除多糖的效果。本发明解决了RNA中多糖、酚类等化合物氧化问题；获得的RNA纯度高，操作过程中不易降解；RNA在提取过程中损失少；提取过程中有效抑制了Rnase的活性；操作步骤简单。
附图说明
图1A为用异硫氰酸胍法提取的花生总RNA电泳图谱
图1B为用本发明的方法提取的花生总RNA电泳图谱
图2A为从异硫氰酸胍法提取的花生总RNA中所纯化的mRNA电泳图谱
图2B为从本发明方法提取的花生总RNA中所纯化的mRNA电泳图谱
图3A为用从异硫氰酸胍法提取的花生总RNA中所纯化的mRNA合成的双链cDNA电泳图谱
图3B为用从本发明方法提取的花生总RNA中所纯化的mRNA合成的双链cDNA电泳图谱
图4为用本发明的方法提取的棉花总RNA电泳图谱
图5为从本发明方法提取的棉花总RNA中所纯化的mRNA电泳图谱
图6为用从本发明方法提取的棉花总RNA中所纯化的mRNA合成的双链cDNA电泳图谱
图7为用本发明的方法提取的油松总RNA电泳图谱
图8为从本发明方法提取的油松总RNA中所纯化的mRNA电泳图谱
图9为用从本发明方法提取的油松总RNA中所纯化的mRNA合成的双链cDNA电泳图谱
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、提取花生的RNA
1、称取液氮中研磨好的花生种子材料3克放入50ml离心管中，加入70％(V/V)丙酮与2％(V/V)巯基乙醇混合液，混匀抽提3次以上，每次用1-4ml，混匀，9000-13000g离心10-20分钟，弃上清液，保留抽提过的植物材料。
2、加入6ml 70℃预热的提取液I，并加入2mg的蛋白酶K(一般配成20mg/ml的溶液)。
3、42℃水浴1.5小时，中间混匀几次。
4、加入2M KCl 542μl，冰上放置2小时。
5、4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，取上清于一新管中。
6、加2ml 8M LiCl，轻混冰上沉淀过夜(8-10小时)。
7、4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，弃上清。
8、加0.6ml 2M LiCl，4℃，12000g(10000rpm)离心，重复2-3次。
9、用适量70％乙醇清洗2次，室温晾干。
10、加适量水溶解，可于65℃水浴以加速溶解，但时间不要超过20分钟。
11、为了近一步纯化，将水溶液置于1.5ml小管中，4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，去除不溶性杂质，取上清于新管中。
其中，提取液I(pH为9)的配制(20ml)方法如下：
取SDS 0.2g，硼砂1.52g，脱氧胆酸(盐)0.2g和EGTA 0.27g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC振荡混匀37℃过夜，灭菌后加入200μl 1M DTT(用DEPC水配制)、200μl Nonidet P-40(湿润剂P40)、0.4g PVP-40，混匀后使用。
注意：以上操作中使用的离心管等容器要用0.5-1‰的DEPC水浸泡37℃过夜，试剂要用DEPC水配制，均灭菌后使用。
同时用异硫氰酸胍法提取花生的总RNA作为对照。将本发明的方法提取的总RNA和异硫氰酸胍法提取的总RNA均按照invitrogen公司mRNA纯化试剂盒方法纯化mRNA，将两种方法纯化的mRNA用ZAP Express cDNA Synthesiss Kit and ZAPExpress cDNA Gigapack III Gold cloning Kit catalog#200403文献方法构建cDNA文库。
结果如图1A、1B、2A、2B、3A和3B所示，图1A中的泳道1和2为用异硫氰酸胍法提取的总RNA，虽条带较清晰，但纯化mRNA时会出现变褐现象，影响以后的实验进行。图2A中的泳道1和2为从异硫氰酸胍法提取的总RNA中所纯化的mRNA，杂质很多，而且在反转录时随着时间的加长，褐化会进一步加重，且在构建cDNA文库的氧化步骤中褐化更为严重，最终导致合成双链时无法正常进行。图3A中的泳道1为用从异硫氰酸胍法提取的总RNA中所纯化的mRNA合成双链cDNA时的电泳图，表明在1kb以上无双链产物。
图1B中的泳道1和2为用本发明的方法提取的总RNA，条带清晰。图2B中的泳道1和2为从本发明方法提取的总RNA中所纯化的mRNA，在质和量上都能达到较好的标准。图3B中的泳道1为用从本发明方法提取的总RNA中所纯化的mRNA构建cDNA文库合成双链时的图像，1kb附近及1kb以上均有双链产物，能达到实验要求。图1A、1B、2A、2B、3A和3B中，M为DNA分子量标准，箭头示1kb条带。
本发明的方法可以达到去除花生种子材料中多糖、酚类等化合物及蛋白质的效果，得到质量较好的总RNA，也可以顺利纯化得到mRNA，在操作的过程中不会发生氧化变色现象。
实施例2、提取棉花的RNA
1、称取液氮中研磨好的棉花叶子3克放入50ml离心管中，加入80％(V/V)丙酮与2％(V/V)巯基乙醇混合液，混匀抽提3次以上，每次用1-4ml，混匀，9000-13000g离心10-20分钟，弃上清液，保留抽提过的植物材料。
2、加入10ml 70℃预热的提取液I，并加入3mg的蛋白酶K(一般配成20mg/ml的溶液)。
3、42℃水浴1.5小时，中间混匀几次。
4、加入2M KCl 542μl，冰上放置2小时。
5、4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，取上清于一新管中。
6、加3.4ml 8M LiCl，轻混冰上沉淀过夜(8-10小时)。
7、4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，弃上清。
8、加0.8ml 2M LiCl，4℃，12000g(10000rpm)离心，重复2-3次。
9、用适量70％乙醇清洗2次，室温晾干。
10、加适量水溶解，可于65℃水浴以加速溶解，但时间不要超过20分钟。
11、为了近一步纯化，将水溶液置于1.5ml小管中，4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，去除部分不溶性杂质，取上清于新管中。
将步骤11提取的RNA进行电泳，结果表明该RNA中还存在杂质。因此，向步骤11的管中加入1/2体积的5M NaCl再用1倍体积的氯仿抽提1次，离心取上清。再加入是上清体积的1/10的3M NaAc与100％的乙醇，-20℃放置3小时以上沉淀RNA，再重复上述步骤9-11即可得到质量较好的总RNA。
其中，提取液I(pH为9)的配制(20ml)方法如下：
取SDS 0.2g，硼砂1.52g，脱氧胆酸(盐)0.2g和EGTA 0.27g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC振荡混匀37℃过夜，灭菌后加入200μl 1M DTT(用DEPC水配制)、200μl Nonidet P-40(湿润剂P40)、0.4g PVP-40，混匀后使用。
注意：以上操作中使用的离心管等容器要用0.5-1‰的DEPC水浸泡37℃过夜，试剂要用DEPC水配制，均灭菌后使用。
将本发明的方法提取的总RNA按照invitrogen公司mRNA纯化试剂盒方法纯化mRNA，将两种方法纯化的mRNA用ZAP Express cDNA Synthesiss Kit and ZAPExpress cDNA Gigapack III Gold cloning Kit catalog #200403文献方法构建cDNA文库。
结果如图4、图5和图6所示，图4中的泳道1和2为本发明的方法所提总RNA电泳图谱，图5中的泳道1和2为其mRNA电泳图谱，图6中的泳道1为用从本发明方法提取的总RNA中所纯化的mRNA合成的双链cDNA电泳图谱。图4、图5和图6中，M为DNA分子量标准，箭头示1kb条带。
表明用本发明的方法能有效地从棉花中提取到质量良好的总RNA，并能顺利纯化mRNA，在操作的过程中不会发生氧化变色现象，保证实验的顺利进行。
实施例3、提取油松的RNA
1、称取液氮中研磨好的油松针叶3克放入50ml离心管中，加入60％(V/V)丙酮与1％(V/V)巯基乙醇混合液，混匀抽提3次以上，每次用1-4ml，混匀，9000-13000g离心10-20分钟，弃上清液，保留抽提过的植物材料。
2、加入6ml 70℃预热的提取液I，并加入1.5mg的蛋白酶K(一般配成20mg/ml的溶液)。
3、42℃水浴1.5小时，中间混匀几次。
4、加入2M KCl 522μl，冰上放置2小时。
5、4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，取上清于一新管中。
6、加1.8ml 8M LiCl，轻混冰上沉淀过夜(8-10小时)。
7、4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，弃上清。
8、加1.2ml 2M LiCl，4℃，12000g(10000rpm)离心，重复2-3次。
9、用适量70％乙醇清洗2次，室温晾干。
10、加适量水溶解，可于65℃水浴以加速溶解，但时间不要超过20分钟。
11、为了近一步纯化，将水溶液置于1.5ml小管中，4℃，12000g(10000rpm)离心20分钟，去除部分不溶性杂质，取上清于新管中。
将步骤11提取的RNA进行电泳，结果表明该RNA中还存在杂质。因此，向步骤11的管中加入1/10体积的2M KCl，放于冰上15分钟，离心取上清。再加入是上清体积的1/10的3M NaAc与2-3倍体积的100％的乙醇，-20℃放置1小时以上沉淀RNA，再重复上述步骤9-11即可得到质量较好的总RNA。
其中，提取液I(pH为9)的配制(20ml)方法如下：
取SDS 0.2g，硼砂1.52g，脱氧胆酸(盐)0.2g和EGTA 0.27g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC振荡混匀37℃过夜，灭菌后加入200μl 1M DTT(用DEPC水配制)、200μl Nonidet P-40(湿润剂P40)、0.4g PVP-40，混匀后使用。
注意：以上操作中使用的离心管等容器要用0.5-1‰的DEPC水浸泡37℃过夜，试剂要用DEPC水配制，均灭菌后使用。
将本发明的方法提取的总RNA按照invitrogen公司mRNA纯化试剂盒方法纯化mRNA，将两种方法纯化的mRNA用ZAP Express cDNA Synthesiss Kit and ZAPExpress cDNA Gigapack III Gold cloning Kit catalog #200403文献方法构建cDNA文库。
结果如图7、图8、图9所示，图7中的泳道1和2为本发明方法所提总RNA电泳图谱，图8中的泳道1和2为其mRNA电泳图谱，图9中的泳道1为用从本发明方法提取的总RNA中所纯化的mRNA合成的双链cDNA电泳图谱。图7、图8和图9中，M为DNA分子量标准，箭头示1kb条带。
表明用本发明方法能有效地从油松中提取到质量良好的总RNA，有效防止了酚类物质的干扰，并能顺利纯化mRNA，在操作的过程中不会发生氧化变色现象，保证实验的顺利进行。
Claims (10)
1、一种提取植物RNA的方法，包括以下步骤：
1)在植物材料中加入含有体积百分含量为60％-80％的丙酮和体积百分含量为1％-3％的巯基乙醇混合液，进行抽提，9000-13000g离心10-20分钟，弃上清液，保留抽提过的植物材料；
2)在步骤1)抽提过的植物材料中加入提取液I，并加入蛋白酶K，40-45℃水浴0.5-2小时；
所述提取液I的pH为8-10，按如下方法配制：取SDS 0.2-1g，硼砂1-2g，脱氧胆酸或脱氧胆酸盐0.2-0.6g和EGTA 0.27-0.5g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC振荡混匀，37℃放置4-10小时，灭菌后加入100-200μl 1M DTT、100-200μl Nonidet P-40和0.2-0.5g PVP-40，混匀后使用；
3)加入KCl，使其终浓度为150-180mmol/L，-1～1℃放置1-3小时后，4℃，9000-13000g离心15-30分钟，收集上清溶液；
4)在步骤3)收集的上清溶液中加入LiCl，使其终浓度为1.5-2mol/L，0-5℃放置3-10小时后，9000-13000g离心15-30分钟，收集沉淀；
5)在步骤4)收集的沉淀中加入LiCl，使其终浓度为1-1.8mol/L，9000-13000g离心15-25分钟，重复1-3次，得到的沉淀即为提取的RNA。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述提取液I的pH为9，具体按如下方法配制：取SDS 0.2g，硼砂1.52g，脱氧胆酸或脱氧胆酸盐0.2g和EGTA 0.27g，加水定溶至20ml后用20μlDEPC振荡混匀，37℃放置4-10小时，灭菌后加入200μl 1M DTT、200μlNonidet P-40和0.4g PVP-40，混匀后使用。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述提取液I的用量为1-10ml/g植物材料，蛋白酶K的用量为0.5-1mg/g植物材料；
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述提取液I的用量为1-3ml/g植物材料。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，LiCl的终浓度为1-1.5mol/L。
6、根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将得到的沉淀用70-75％乙醇清洗、用水溶解，再离心去除部分不溶性杂质的步骤。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括以下纯化步骤：1)在得到的RNA中加入NaCl，使其终浓度为1.25-2.5mol/L，再用1倍体积的氯仿抽提，离心取上清；
2)然后再加入是上清体积的1/10的3M，NaAc和1倍体积的100％的乙醇，-20℃放置3小时以上沉淀RNA。
8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括以下纯化步骤：1)在得到的RNA中加入KCl，使其终浓度为0.15-0.25mol/L，放于冰上15分钟，离心取上清；
2)然后再加入是上清体积的1/10的3M，NaAc和1倍体积的100％的乙醇，-20℃放置3小时以上沉淀RNA。
9、根据权利要求1至5中任一所述的方法，所述植物材料为富含多糖及多酚类物质植物材料。
10、根据权利要求9所述的方法，所述富含多糖及多酚类物质植物为花生、棉花、芒果或针叶类植物。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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