CN102533737A - 一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法 - Google Patents
一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，属于核酸纯化领域。首先向液氮研磨的多糖多酚植物材料加入多糖多酚植物裂解液，对混合物进行离心分离，取出离心分离的上清液，转入过滤柱中进行过滤，向滤液中加入无水乙醇后混匀，转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，加入去蛋白液和脱氧核糖核酸酶溶液，进行两次去蛋白离心，加入漂洗液进行脱盐离心，最后干燥离心后，加入无核糖核酸酶的水洗脱离心，得到核糖核酸溶液。本发明方法具有高效、快速、简洁的特点，纯化的RNA可用于芯片分析、体外翻译和分子克隆等等多种下游实验。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，属于核酸纯化领域。
背景技术
植物RNA的提取是进行植物分子生物学研究的一个重要前提。RT-PCR、Northern、Real-time PCR、cDNA文库构建等分子生物学研究的开展都需要纯度高、完整性好的总RNA。很多植物或植物器官体内含有大量的多糖类、酚类以及次级代谢产物，或内源RNase含量较高，使得提取这些植物的RNA相对比较困难。多糖的理化性质与RNA相似，在提取过程中容易与RNA一起形成胶状沉淀，在后续的反转录等实验中明显影响实验效果。而酚类物质在提取过程中容易氧化成醌类物质并与RNA形成不可逆的结合，从而大大降低RNA的活性。在植物果实的发育过程中，包括RNase在内的各种水解酶大量积累，同时富集多种次级代谢产物。这些都严重影响RNA提取的质量和得率。
目前提取RNA的方法较多，有TRIzol法、CTAB-LiCl法、异硫氰酸胍法和热硼酸法等。TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用，但是该法操作步骤繁琐，提取富含多糖多酚植物材料RNA的效果不佳。CTAB-LiCl法常被用来提取富含多糖多酚材料的RNA，CTAB可与RNA以及DNA形成不溶的复合物，有利于去除多糖，但CTAB法通常要结合其它操作，如再经LiCl沉淀等步骤，使得该法操作繁琐。硅胶膜吸附法为大多数生物公司所采用，它的裂解液主要基于高浓度的胍盐充分裂解细胞，β-巯基乙醇抑制RNase活性，保护RNA不被降解。如国外知名生物公司Qiagen的RNeasy PlantMini Kit，该试剂盒对大部分植物材料都适用，具有得率高，速度快，纯度高等特点，但对富含多糖材料RNA的提取效果不理想。因此，开发一种应用范围广、快速、成功率高的提取多糖多酚植物RNA的方法对于提高实验效率非常必要。
发明内容
本发明的目的是提出一种采用新的多糖多酚植物裂解液并结合硅胶膜法从多糖多酚植物中纯化总核糖核酸的方法，该多糖多酚植物裂解液可以有效抑制RNase活性，多酚氧化酶活性，沉淀多糖，并可以提供一种有利于和硅胶膜结合的高盐低pH环境。
本发明提出的利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，包括以下各步骤：
(1)向50～100毫克经液氮研磨的植物组织中加入500微升多糖多酚植物裂解液，涡旋剧烈震荡混匀；
(2)将上述混合物室温放置5分钟后进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为2分钟，取出离心分离的上清液；
(3)将步骤(2)中的上清液转入过滤柱中，进行过滤离心，离心过滤时间为1分钟，吸取收集管中的上清液至无核糖核酸酶的离心管中；
(4)在步骤(3)的溶液中加入200微升无水乙醇，混匀后转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
(5)向步骤(4)的硅胶膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(6)向步骤(5)的硅胶膜吸附柱中加入活性单位为0.375库尼茨的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(7)向步骤(6)的硅胶膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
(8)对步骤(7)的硅胶膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅胶膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
本发明方法中，所述的多糖多酚植物裂解液中的各组分为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，使混合液体积为1000毫升。
本发明提出利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，其优点是：
1、本发明的目的是提出一种采用新的多糖多酚植物裂解液并结合硅胶膜法从多糖多酚植物中纯化总核糖核酸的方法，该多糖多酚植物裂解液可以有效抑制RNase活性，多酚氧化酶活性，沉淀多糖，并可以提供一种有利于和硅胶膜结合的高盐低pH环境。使用专利中所述方法可以从多种多糖多酚植物材料分离纯化总核糖核酸。
2、使用本发明方法纯化的总核糖核酸完整性好，纯度高，可用于反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(Real Time RT-PCR)、芯片分析、核糖核酸印记杂交(Northern blot)、点杂交(Dot blot)、体外翻译、核糖核酸酶保护分析和分子克隆等多种下游实验中。
附图说明
图1是根据本发明方法的实施例1，从100毫克白松松针中提取总核糖核酸的电泳检测图。
图1中，MⅢ：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerⅢ)
泳道1：根据实施例1纯化的总核糖核酸
图2是根据本发明方法的实施例2，从100毫克棉花叶片中提取总核糖核酸的电泳检测图。
MⅢ：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerⅢ)
泳道1：根据实施例2纯化的总核糖核酸
具体实施方式
本发明提出的利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，包括以下各步骤：
(1)向50～100毫克经液氮研磨的植物组织中加入500微升多糖多酚植物裂解液，涡旋剧烈震荡混匀；
(2)将上述混合物室温放置5分钟后进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为2分钟，取出离心分离的上清液；
(3)将步骤(2)中的上清液转入过滤柱中，进行过滤离心，离心过滤时间为1分钟，吸取收集管中的上清液至无核糖核酸酶的离心管中；
(4)在步骤(3)的溶液中加入200微升无水乙醇，混匀后转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
(5)向步骤(4)的硅胶膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(6)向步骤(5)的硅胶膜吸附柱中加入活性单位为0.375库尼茨的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(7)向步骤(6)的硅胶膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
(8)对步骤(7)的硅胶膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅胶膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
本发明方法中，所述的多糖多酚植物裂解液中的各组分为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，使混合液体积为1000毫升。
以下介绍本发明方法的实施例。
实施例一：从白松松针中提取总RNA。
1、向100毫克经液氮研磨的白松松针中加入500微升多糖多酚植物裂解液，涡旋剧烈震荡混匀；
2、室温放置5分钟，对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为2分钟，取出离心分离的上清液；
3、将步骤(2)中的上清液转入过滤柱中，进行过滤离心，离心过滤时间为1分钟，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
4、在上述溶液中加入200微升无水乙醇，混匀后转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
5、向步骤(4)的硅胶膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
6、向步骤(5)的硅胶膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
7、向步骤(6)的硅胶膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
8、对步骤(7)的硅胶膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
9、在步骤(8)的硅胶膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
上述方法中，所述的多糖多酚植物裂解液的各组分的质量为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，使混合液体积为1000毫升。
实施例二：从棉花叶片中提取总RNA。
1、向100毫克经液氮研磨的棉花叶片中加入500微升多糖多酚植物裂解液，涡旋剧烈震荡混匀；
2、室温放置5分钟，对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为2分钟，取出离心分离的上清液；
3、将步骤(2)中的上清液转入过滤柱中，进行过滤离心，离心过滤时间为1分钟，小心吸取收集管中的上清至无核糖核酸酶的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
4、在上述溶液中加入200微升无水乙醇，混匀后转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
5、向步骤(4)的硅胶膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
6、向步骤(5)的硅胶膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
7、向步骤(6)的硅胶膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
8、对步骤(7)的硅胶膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
9、在步骤(8)的硅胶膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
上述方法中，所述的多糖多酚植物裂解液的各组分的质量为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，使混合液体积为1000毫升。
图1是根据上述实施例1，从100毫克白松松针中提取总核糖核酸的电泳检测图。图1中，MⅢ：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerⅢ)，泳道1：根据实施例1纯化的总核糖核酸。
图2是根据上述实施例2，从100毫克棉花叶片中提取总核糖核酸的电泳检测图。图2中，MⅢ：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerⅢ)，泳道1：根据实施例2纯化的总核糖核酸。
Claims (2)
1.一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法，其特征在于该方法包括以下各步骤：
(1)向50～100毫克经液氮研磨的植物组织中加入500微升多糖多酚植物裂解液，涡旋剧烈震荡混匀；
(2)将上述混合物室温放置5分钟后进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为2分钟，取出离心分离的上清液；
(3)将步骤(2)中的上清液转入过滤柱中，进行过滤离心，离心过滤时间为1分钟，吸取收集管中的上清液至无核糖核酸酶的离心管中；
(4)在步骤(3)的溶液中加入200微升无水乙醇，混匀后转入硅胶膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
(5)向步骤(4)的硅胶膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(6)向步骤(5)的硅胶膜吸附柱中加入活性单位为0.375库尼茨的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(7)向步骤(6)的硅胶膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
(8)对步骤(7)的硅胶膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅胶膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的多糖多酚植物裂解液中的各组分为：
将上述各组分称重后混合，加去离子水，使混合液体积为1000毫升。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |