CN103952398A - 一种从肝素制品中提取基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法，属于核酸纯化领域。首先向肝素制品中加入特异性的裂解结合液，待充分裂解结合后对混合物进行离心分离，取离心后上清液转入硅膜吸附柱中，使DNA与硅膜吸附柱特异性结合后进行离心，然后依次加入漂洗液1、漂洗液2进行去蛋白，去多分多糖类物质离心，再加入漂洗液3进行脱盐离心，最后干燥离心后，加入无核糖核酸酶的水洗脱离心，得到含有基因组DNA溶液。本发明方法具有高效、快速、简洁的特点，提取所得基因组DNA纯度高，极大的消除了肝素对PCR实验的抑制，所得基因组DNA可进行聚合酶链式反应（PCR），实时荧光定量聚合酶链式反应（Real Time PCR）等下游实验。
Description
技术领域
本发明涉及一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法，属于核酸纯化领域。
背景技术
肝素是由猪、牛或羊的肠粘膜等组织中提取的黏多糖硫酸酯类物质，被世界公认为“生物黄金”，是很多重大疾病及手术治疗的重要临床用药，并在科研中用途广泛。目前年市场额近100亿美元，全球60%以上的肝素钠原料由中国提供。
上世纪90年代以来，受疯牛病、口蹄疫等严重威胁人类健康的传染病影响，牛羊源的肝素制品在生产及使用上被严格控制，各制剂厂均要求药用肝素钠必须单一来源于猪小肠粘膜，一般要求牛羊等基因比例不得超过0.1%。2011年美国食品药品监督管理局（FDA）对肝素钠粗品检测的指导意见为能够对肝素钠物种来源进行定量测定，并具有足够准确性和特异性。
目前，动物源性成分的检测方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法（即聚合酶链式反应，PCR法）（以下使用简称PCR）。PCR法通过特异检测肝素制品中残留的基因组脱氧核糖核酸（DNA）（以下简称DNA），可以快速灵敏的对肝素的物种来源进行鉴定。但由于肝素对PCR反应具有较强的抑制作用，若要使得这一便捷的测定方法得到广泛推广使用，需要在从肝素制品中提取残留的基因组DNA时有效清除肝素的残留对PCR的影响。现有的清除肝素的主要方法一般是使用肝素酶消化处理样本，但该过程处理时间较长，一般为18小时左右，且由于肝素酶价格昂贵，也在一定程度上限制了PCR测定法的使用。
发明内容
本发明的目的是提出一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法，采用一种特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的裂解体系，以快速简单的从肝素制品中提取残存的基因组DNA，极大地消除了肝素对PCR的抑制，所得产物可方便的用于后续PCR检测。
本发明提出的从肝素制品中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：
（1）称取20毫克肝素钠样品置于1.5毫升离心管中，加入400微升裂解液，振荡混匀后放入65℃水浴锅中保持20分钟，每隔5分钟振荡一次，以使样品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明状；注意裂解液中含有不溶性树脂，使用前应充分振荡混悬。
（2）将上述混合液置于离心机中进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为5分钟；
（3）取出步骤（2）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，将硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，将离心管置于离心机中，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（4）向步骤（3）的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80℃水浴中，保持10分钟，然后在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（5）向步骤（4）的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（7）重复步骤（6）2～4次；
（8）将步骤（7）的硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，开盖离心分离2分钟；
（9）将步骤（8）的硅膜吸附柱放入一个新的1.5毫升离心管中，向吸附柱中间悬空加入50微升去离子水，静置2分钟；
（10）将步骤（9）中装有硅膜吸附柱的离心管在12000转/分钟的转速下离心分离1分钟，收集洗脱液，洗脱液为基因组DNA溶液。
上述方法中，所述的裂解液的配方为：
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，用盐酸将混合液pH值调整为8.3～8.5，定容混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的第一漂洗液的配方为：
异丙醇 450～700毫升
氯化钠 80～160克
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，定容混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的第二漂洗液的配方为：
异丙醇 500～800毫升
聚乙二醇6000 70～120克
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的第二漂洗液的配方为：
三羟甲基氨基甲烷 0.7～1.8克
无水乙醇 800毫升
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。
本发明提出的从肝素制品中提取基因组DNA的方法，其优点是：
1、本发明采用特异性结合DNA的离心硅膜吸附柱和独特的裂解体系，可以快速简单的从肝素制品中提取残留的基因组DNA，与目前普遍使用的肝素酶消化处理的方法，大大缩短了时间，如实施例1中从肝素钠粗品提取残留基因组DNA仅需45分钟，并且费用也大大降低。
2、使用本发明的双重沉淀系统提取的基因组DNA纯度高、提取得率高，极大地消除了肝素对PCR的抑制，所得产物可方便的用于聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real Time PCR）等后续检测实验。
附图说明
图1所示是实施例1中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA的电泳检测图。图1中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准，泳道2：使用本发明方法提取的基因组DNA。
图2所示是实施例1中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA进行的PCR扩增结果。其中，引物1、2、3分别是根据GenBank提供的猪、羊、牛的线粒体基因序列设计的三对特异性引物，图中1，2所示为不同的上样模板量。
图3所示是实施例2中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA的电泳检测图。其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准，泳道2：使用本发明方法提取的基因组DNA。
图4所示是实施例1中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA进行的Real Time PCR扩增结果，其中1、2、3分别是猪、羊、牛的线粒体基因的扩增结果（方法采用SybrGreen荧光定量法，其中每张图中所示四条扩增曲线为100ng-0.1ng梯度稀释结果）。
具体实施方式
本发明提出的从肝素制品中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：
（1）称取20毫克肝素钠样品置于1.5毫升离心管中，加入400微升裂解液，振荡混匀后放入65℃水浴锅中保持20分钟，每隔5分钟振荡一次，以使样品充分溶解，溶解后 得到的混合液呈透明状；注意裂解液中含有不溶性树脂，使用前应充分振荡混悬。
（2）将上述混合液置于离心机中进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为5分钟；
（3）取出步骤（2）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，将硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，将离心管置于离心机中，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（4）向步骤（3）的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80℃水浴中，保持10分钟，然后在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（5）向步骤（4）的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（7）重复步骤（6）2～4次；
（8）将步骤（7）的硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，开盖离心分离2分钟；
（9）将步骤（8）的硅膜吸附柱放入一个新的1.5毫升离心管中，向吸附柱中间悬空加入50微升去离子水，静置2分钟；
（10）将步骤（9）中装有硅膜吸附柱的离心管在12000转/分钟的转速下离心分离1分钟，收集洗脱液，洗脱液为基因组DNA溶液。
上述方法中，所述的裂解液的配方为：
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，用盐酸将混合液pH值调整为8.3～8.5，定容混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的第一漂洗液的配方为：
异丙醇 450～700毫升
氯化钠 80～160克
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，定容混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的第二漂洗液的配方为：
异丙醇 500～800毫升
聚乙二醇6000 70～120克
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的第二漂洗液的配方为：
三羟甲基氨基甲烷 0.7～1.8克
无水乙醇 800毫升
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。
以下介绍本发明方法的实施例。
实施例1：从肝素钠粗品中提取残留的基因组DNA，并进行PCR检测
（1）称取20毫克肝素钠样品置于1.5毫升离心管中，加入400微升裂解液，振荡混匀后放入65℃水浴锅中保持20分钟，每隔5分钟振荡一次，以使样品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明状；注意裂解液中含有不溶性树脂，使用前应充分振荡混悬。
（2）将上述混合液置于离心机中进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为5分钟；
（3）取出步骤（2）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，将硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，将离心管置于离心机中，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（4）向步骤（3）的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80℃水浴中，保持10分钟，然后在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（5）向步骤（4）的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（7）重复步骤（6）2～4次；
（8）将步骤（7）的硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，开盖离心分离2分钟；
（9）将步骤（8）的硅膜吸附柱放入一个新的1.5毫升离心管中，向吸附柱中间悬空加入50微升去离子水，静置2分钟；
（10）将步骤（9）中装有硅膜吸附柱的离心管在12000转/分钟的转速下离心分离1分钟，收集洗脱液，洗脱液为基因组DNA溶液。
图1所示是实施例1中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA的电泳检测图，图中泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准，泳道2：使用本发明方法提取的基因组DNA。图2所示 是实施例1中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA进行的PCR扩增结果（其中引物1、2、3分别是根据GenBank提供的猪、羊、牛的线粒体基因序列设计的三对特异性引物，图中1，2所示为不同的上样模板量）
实施例2：从肝素钠粗品中提取残留的基因组DNA，并进行Real Time PCR检测。
（1）称取20毫克肝素钠样品置于1.5毫升离心管中，加入400微升裂解液，振荡混匀后放入65℃水浴锅中保持20分钟，每隔5分钟振荡一次，以使样品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明状；注意裂解液中含有不溶性树脂，使用前应充分振荡混悬。
（2）将上述混合液置于离心机中进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为5分钟；
（3）取出步骤（2）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，将硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，将离心管置于离心机中，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（4）向步骤（3）的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80℃水浴中，保持10分钟，然后在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（5）向步骤（4）的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（7）重复步骤（6）2～4次；
（8）将步骤（7）的硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，开盖离心分离2分钟；
（9）将步骤（8）的硅膜吸附柱放入一个新的1.5毫升离心管中，向吸附柱中间悬空加入50微升去离子水，静置2分钟；
（10）将步骤（9）中装有硅膜吸附柱的离心管在12000转/分钟的转速下离心分离1分钟，收集洗脱液，洗脱液为基因组DNA溶液。
图3所示是实施例2中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA的电泳检测图，图中泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准，泳道2：使用本发明方法提取的基因组DNA。图4所示是实施例1中从20毫克肝素钠样品提取基因组DNA进行的Real Time PCR扩增结果（其中1、2、3分别是猪、羊、牛的线粒体基因的扩增结果，方法采用SybrGreen荧光定量法，其中每张图中所示四条扩增曲线为100ng-0.1ng梯度稀释结果）。
Claims (5)
1.一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法，其特征在于该方法包括以下各步骤：
（1）称取20毫克肝素钠样品置于1.5毫升离心管中，加入400微升裂解液，振荡混匀后放入65℃水浴锅中保持20分钟，每隔5分钟振荡一次，以使样品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明状；注意裂解液中含有不溶性树脂，使用前应充分振荡混悬。
（2）将上述混合液置于离心机中进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为5分钟；
（3）取出步骤（2）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，将硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，将离心管置于离心机中，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（4）向步骤（3）的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80℃水浴中，保持10分钟，然后在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液；
（5）向步骤（4）的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液；
（7）重复步骤（6）2～4次；
（8）将步骤（7）的硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，开盖离心分离2分钟；
（9）将步骤（8）的硅膜吸附柱放入一个新的1.5毫升离心管中，向吸附柱中间悬空加入50微升去离子水，静置2分钟；
（10）将步骤（9）中装有硅膜吸附柱的离心管在12000转/分钟的转速下离心分离1分钟，收集洗脱液，洗脱液为基因组DNA溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的裂解液的配方为：
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，用盐酸将混合液pH值调整为8.3～8.5，定容混合液体积为1000毫升。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第一漂洗液的配方为：
异丙醇 450～700毫升
氯化钠 80～160克
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，定容混合液体积为1000毫升。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第二漂洗液的配方为：
异丙醇 500～800毫升
聚乙二醇6000 70～120克
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第三漂洗液的配方为：
三羟甲基氨基甲烷 0.7～1.8克
无水乙醇 800毫升
将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140730 |