CN102605102A - 用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，属于生物中核酸应用技术领域。首先配制裂解液，将裂解液和磁珠加入到联排管中，将病毒核酸样本加入到该联排管中，充分混匀，使病毒核酸被磁珠充分吸附；再将磁珠混合液放到磁力架上，静止数秒，使磁珠与溶液分开；再进行去蛋白漂洗和去盐漂洗，室温晾干。本发明方法简单、快速，不易引起污染，而且灵敏度高。使用本发明方法提取效率高、核酸纯度高、检测重复性好、对扩增试剂的兼容性好，不但节约了生产成本而且还提高了操作的准确性，极大的方便了临床诊断以及法医鉴定等方面的工作。

Description

用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法

技术领域

本发明涉及一种用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，属于生物中核酸应用技术领域。

背景技术

核酸研究是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体的生长发育繁殖等生命活动中有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。在医学上对于临床诊断和治疗监测越来越重视，同时相应的对病毒核酸的提取及定量检测的方法也越来越受关注。目前用于病毒核酸定量检测的方法基本上是利用荧光定量检测技术来测定，这种实时定量检测方法不但方便简单且不易引起污染，所以应用越来越广泛。而对于病毒核酸的提取方法主要有以下几种：一步法、煮沸法、过柱法和磁珠法。据调查研究表明：磁珠法自动化程度高，提取速度快，提取效率高，可重复性好，抗干扰能力及对扩增试剂的兼容能力强。因而磁珠法被广泛应用于常规科研、基因组学、疾控系统、食品安全、法医等领域。

目前病毒核酸的磁珠法提取及检测流程为：样品裂解—磁珠与待分离病毒核酸(以下简称DNA)特异性结合—磁珠-DNA混合物的洗涤—磁珠与待分离DNA的洗脱分离—取洗脱液进行定量检测(即裂解-结合-洗涤-洗脱-检测五步)。该方法整个过程分为五步，其中第四步需要孵育洗脱分离，对于想快速提取并检测的使用者较为繁琐。

发明内容

本发明的目的是提出一种用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，采用特殊的病毒裂解液提取病毒核酸，以使提取工艺简单、高效、快速，方便地进行病毒核酸的提取和检测。

本发明提出的用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，包括以下步骤：

(1)将10～50微升待测样本加入到联排管中，联排管中含有：体积为待测样本体积3倍的病毒裂解液以及10微升磁珠，混匀，使核酸释放，磁珠与核酸结合，得到核酸和磁珠的混合物，其中所述的病毒裂解液的成分为：摩尔浓度为5～6摩尔/升的异硫氰酸胍、摩尔浓度为50～100毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、摩尔浓度为1～10毫摩尔/升的乙二胺四乙酸二钠、摩尔浓度为50～65毫摩尔/升的二硫苏糖醇、25～30微克/毫升的糖原、体积比为1％的聚乙二醇辛基苯基醚、体积比为2％的非离子表明活性剂-NP40、体积比为0.5％的吐温80；

(2)将上述含有核酸和磁珠的混合物的联排管置于磁力架上，通过磁力作用将吸附有核酸的磁性颗粒与溶液分开，弃掉溶液，取下联排管；

(3)向上述步骤(2)的联排管中加入100微升去蛋白缓冲液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(4)向上述步骤(3)的联排管中加入100微升去盐漂洗液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(5)将上述步骤(4)的联排管置于室温，晾干2分钟，充分挥发管中残余液体。

本发明提出的用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，其优点是：

1、本发明提出的病毒核酸的提取方法中，在裂解时使用了特殊的病毒裂解液，这种裂解液不仅增加了细胞裂解效果，裂解彻底而且快速，更重要的是它能够屏蔽磁珠对荧光定量检测的抑制作用，从而可以直接进行检测。

2、本发明提出的病毒核酸的提取方法中，省去了磁珠与待分离DNA的洗脱分离，操作更为方便快捷，省去了长时间孵育的过程。

3、使用本发明的病毒核酸的提取方法，提取得到磁珠核酸混合物用于荧光定量检测，可以极大的提高荧光检测灵敏度，即使微量的核酸病毒样本也可以进行检测，节省了检测成本，提高了检测效率。

4、本发明提出的病毒核酸的提取方法中，每个样品的提取和检测过程在一管中完成，不仅不易引起污染，而且简化了操作步骤，这不但节约了生产成本而且还提高了操作的准确性。

5、使用本发明的病毒核酸提取方法，提取核酸的效率高，得到的核酸纯度高，检测重复性好，对荧光检测中的扩增试剂的兼容性好，极大的方便了临床诊断以及法医鉴定等方面的工作。

附图说明

图1是利用本发明方法提取的病毒核酸与已有的洗脱法(DP327)提取的病毒核酸进行荧光定量检测的扩增曲线比较图。

图2是本发明方法的实施例中样本浓度梯度稀释后提取并荧光定量检测的扩增曲线图。

具体实施方式

本发明提出的用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，包括以下步骤：

(1)将10～50微升待测样本加入到联排管中，联排管中含有：体积为待测样本体积3倍的病毒裂解液以及10微升磁珠，混匀，使核酸释放，磁珠与核酸结合，得到核酸和磁珠的混合物，其中所述的病毒裂解液的成分为：摩尔浓度为5～6摩尔/升的异硫氰酸胍、摩尔浓度为50～100毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(即Tris-Hcl，PH为6.5)、摩尔浓度为1～10毫摩尔/升的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、摩尔浓度为50～65毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)、25～30微克每毫升的糖原(glycogen)、体积比为1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、体积比为2％的非离子表明活性剂-NP40、体积比为0.5％的吐温80；

(2)将上述含有核酸和磁珠的混合物的联排管置于磁力架上，通过磁力作用将吸附有核酸的磁性颗粒与溶液分开，弃掉溶液，取下联排管；

(3)向上述步骤(2)的联排管中加入100微升去蛋白缓冲液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(4)向上述步骤(3)的联排管中加入100微升去盐漂洗液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(5)将上述步骤(4)的联排管置于室温，晾干2分钟，充分挥发管中残余液体。

以下介绍本发明方法的实施例。

在本发明的实施例中，所用的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)和非离子表明活性剂NP40均由北京索莱宝科技有限公司生产。

本发明方法的实施例中，所用的特异性磁珠、病毒裂解液、去蛋白缓冲液、去盐漂洗液和荧光定量检测试剂盒以及DP327提取试剂盒均由天根生化科技(北京)有限公司提供。所用引物探针由美国英俊公司合成。

实施例一：

分别用此方法与磁珠洗脱法对乙肝病毒核酸样本(HBV-DNA)进行提取并荧光定量检测。

一、乙肝病毒核酸样本(HBV-DNA)进行提取：

1、本发明方法进行提取：

(1)将50微升乙肝病毒血清加入到预制的联排管(用于荧光定量检测)中。其中管中成分为150微升特殊的病毒裂解液和10微升特异性磁珠，充分混匀，从而达到核酸充分释放，进而使磁珠与核酸充分的结合；

(2)将上述含有吸附有核酸的磁珠的联排管置于磁力架上，通过磁力作用将吸附有核酸的磁性颗粒与溶液分开，然后弃掉溶液，取下联排管；

(3)向上述步骤(2)的联排管中加入100微升去蛋白缓冲液，充分混匀，然后再在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(4)向上述步骤(3)的联排管中加入100微升去盐漂洗液，充分混匀，然后再在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(5)将从上述步骤(4)中得到的联排管置于室温晾干2分钟，充分挥发管中残余液体；

(6)向上述步骤(5)中的联排管中加入已经配制好的PCR反应液，然后直接进行荧光定量检测。

2、传统的磁珠提取后洗脱法进行提取：

提取流程参照天根生化科技(北京)有限公司的DP327试剂盒进行提取：提取样本量与上述方法相同，这样可以保证最后结果可以进行定量比较；提取产物用54μl水洗脱，取6ul洗脱液进行荧光定量检测。

二、对提取产物进行荧光定量检测：

检测实例：对两种方法提取的产物进行荧光定量检测：

以实例中得到的HBV-DNA为模板，用HBV上游引物和下游引物以及探针进行检测，用天根生化科技(北京)有限公司的FP203进行荧光定量检测：

HBV上游引物为HBVF：5’TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3’；

HBV下游引物为HBVR：5’GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’；

HBV探针序列为HBVP：5’FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’.

荧光定量PCR的检测体系为：

(1)本发明方法进行荧光定量检测(可以配成Mix)：

将20μl反应液分别加入提取后的联排管中，并用移液器吹吸，使磁珠均匀分散在PCR反应液中。

(2)传统的磁珠提取后洗脱法进行荧光定量检测：

试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。

PCR反应程序为：

94℃2分钟，1循环

检测结果：

模板	平均CT值
		磁珠法：一管式全部进行定量检测	23.5
洗脱法：54μl洗脱，取6μl进行定量	25.81

图1所示是利用本实施例提取的病毒核酸与已有的洗脱法(DP327)提取的病毒核酸进行荧光定量检测的扩增曲线比较图。结果表明：两种方法提取样本量是相同的，理论上两者的得率是一样的。我们通过上述结果可以看出两者得率基本相当(注：洗脱法洗脱体积不可以低于50μl，所以为了便于计算洗脱法用54μl水洗脱后取6μl进行定量检测，相当于原液的1/9，所以25.81个CT换算后与23.5个CT是相当的)。由此可得，两种方法在提取得率上是相当的，本发明为一管式磁珠法病毒核酸的提取并荧光定量检测的方法，省去了洗脱过程且不需倒管，提取和检测在一管中完成方便快捷。

实施例二：

用本发明方法对梯度稀释后的乙肝病毒核酸样本(HBV-DNA)进行提取并荧光定量检测。

一、乙肝病毒核酸样本(HBV-DNA)进行提取：

1.本发明方法进行提取：

(1)分别将50微升梯度稀释后的乙肝病毒血清加入到预制的联排管(用于荧光定量检测)中。其中管中成分为150微升特殊的病毒裂解液和10微升特异性磁珠，充分混匀，从而达到核酸充分释放，进而使磁珠与核酸充分的结合；

(2)将上述含有吸附有核酸的磁珠的联排管置于磁力架上，通过磁力作用将吸附有核酸的磁性颗粒与溶液分开，然后弃掉溶液，取下联排管；

(3)向上述步骤(2)的联排管中加入100微升去蛋白缓冲液，充分混匀，然后再在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(4)向上述步骤(3)的联排管中加入100微升去盐漂洗液，充分混匀，然后再在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(5)将从上述步骤(4)中得到的联排管置于室温晾干2分钟，充分挥发管中残余液体；

(6)向上述步骤(5)中的联排管中加入已经配制好的PCR反应液，然后直接进行荧光定量检测。

二、提取产物进行荧光定量检测：

检测实例：对提取的产物进行荧光定量检测：

以实例中得到的HBV-DNA为模板，用HBV上游引物和下游引物以及探针进行检测，用天根生化科技(北京)有限公司的FP203进行荧光定量检测：

HBV上游引物为HBVF：5’TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3’；

HBV下游引物为HBVR：5’GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’；

HBV探针序列为HBVP：5’FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’.

荧光定量PCR的检测体系为：

本发明方法进行荧光定量检测(可以配成Mix)：

将20μl反应液分别加入提取后的联排管中，并用移液器吹吸，使磁珠均匀分散在PCR反应液中。

PCR反应程序为：

94℃2分钟，1循环

检测结果：

图2所示是本实施例中样本浓度梯度稀释后提取并荧光定量检测的扩增曲线图，结果表明：提取产物纯度较好，对荧光定量不存在抑制。

Claims (1)

1.一种用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)将10～50微升待测样本加入到联排管中，联排管中含有：体积为待测样本体积3倍的病毒裂解液以及10微升磁珠，混匀，使核酸释放，磁珠与核酸结合，得到核酸和磁珠的混合物，其中所述的病毒裂解液的成分为：摩尔浓度为5～6摩尔/升的异硫氰酸胍、摩尔浓度为50～100毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、摩尔浓度为1～10毫摩尔/升的乙二胺四乙酸二钠、摩尔浓度为50～65毫摩尔/升的二硫苏糖醇、25～30微克/毫升的糖原、体积比为1％的聚乙二醇辛基苯基醚、体积比为2％的非离子表明活性剂-NP40、体积比为0.5％的吐温80；

(2)将上述含有核酸和磁珠混合物的联排管置于磁力架上，通过磁力作用将吸附有核酸的磁性颗粒与溶液分开，弃掉溶液，取下联排管；

(3)向上述步骤(2)的联排管中加入100微升去蛋白缓冲液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(4)向上述步骤(3)的联排管中加入100微升去盐漂洗液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(5)将上述步骤(4)的联排管置于室温，晾干2分钟，充分挥发管中残余液体。

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