CN102071263A

CN102071263A - 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN102071263A
Application number: CN2010105766964A
Authority: CN
Inventors: 杨素; 沙才华; 廖明; 徐海聂; 廖秀云
Original assignee: ZHUHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Current assignee: ZHUHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2030-12-07
Also published as: CN102071263B

Abstract

本发明公开了一种高效率、敏感性高的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。该方法利用两套PCR引物（1对外侧引物和1对内侧引物）进行两轮PCR扩增的方法，即将外侧引物进行PCR扩增后的产物作为内侧引物进行PCR扩增的模板，内侧引物与模板DNA的结合位点处于外侧引物扩增出的DNA片段内侧，套式PCR对减少或消除非特异性扩增及提高灵敏度非常有效。本发明相比于普通检测方法具有良好的特异性，可准确地检测H5N1、H5N2亚型AIV，而H1N1、H3N2、H6、H9NDVLasata及EDSV检测为阴性,十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板的扩增，能完全满足鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性的要求。

Description

禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒的分离鉴定需要从禽鸟采集咽喉拭子或泄殖腔拭子，或从发病及死亡禽鸟采集内脏器官，用鸡胚进行病毒分离培养，再鉴定血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），最后通过鸡人工感染进行致病力的测定，这种经典的禽流感病毒检测方法因敏感性高，被OIE推荐为国际参考方法，但由于诊断周期长，且需要在生物安全三级实验室中进行，因此不能用于快速检测，而现有的禽流感病毒检测方法，如常规RT-PCR技术、胶体金免疫检测和ELISA等因敏感性较低，不能直接用于禽类和禽类产品的AIV检测。

特别在鱼类养殖水体中的禽流感病毒（avian influenza viruses，AIV）含量十分低，例如AIV H5N1亚型其含量远远低于普通禽类组织，禽流感病毒的检测较普通禽类组织困难许多，现有的较为敏感的鸡胚病毒分离，以及常规的RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）及荧光RT-PCR (real-time RT-PCR)检测方法均无法满足鱼类养殖水体禽流感病毒快速检测和高敏感性的需求，另外对于禽流感病毒设计的的通用型引物及探针无法准确检测和确定禽流感病毒的特定类型，需要进一步进行检测，给后续的研究带来不便，因此目前缺少一种高敏感性、能快速准确的检测禽流感病毒H5N1、H5N2等亚型的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效率、敏感性高的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案是：本发明涉及的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

A：提取待检样品RNA；

B：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（P1、P2）进行一步法RT-PCR，所述外引物（P1、P2）的序列分别为：

P1：5’-AGCAAAAGCAGGGGT C/A T/C A/G ATCT-3’

P2：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACA-3’；

C：以上述一步法RT-PCR产物为模板，将内引物（P3、P4）及探针和反应组分置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物（P3、P4）及探针序列分别为：

P3：5’-CAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-3’

P4：5’-TCCATTGGAGCACATCCATAAA-3’

探针：Fam-5’-TGGCAATCATGGTGGCTGGTCTAT-3’-Tamara；

D：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。

为了提高荧光PCR反应的灵敏度和特异性，确定最佳退火温度和PCR循环次数，上述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为：50℃ 30min，94℃ 3min，1个循环；94℃ 60s，53℃ 60s，72℃ 120s，30个循环；72℃延伸8min。

上述步骤C中荧光PCR的反应参数为：94℃ 10s，45℃ 30 s，72℃ 60s，3个循环；94℃ 10s，58℃ 35s，45个循环后收集荧光。

所述步骤B中阳性对照设立方法为：选取AIV H5N1的RNA为模板，经过克隆筛选正确的重组克隆质粒，然后抽取所述重组克隆质粒对目的片段进行体外反转录，按一定浓度稀释后作为阳性对照；采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性对照。

进一步反应体系中的优选方案为，内引物P3的引物浓度为0.9 μmol/L，内引物P4的引物浓度为0.9 μmol/L，探针浓度为0.25 μmol/L。

本发明所涉及的检测试剂盒包括RNA提取试剂、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂、质粒抽提试剂和PCR反应体系试剂等，其中的PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系；

所述一步法RT-PCR反应体系的组分包括：10μmol/L的外引物P1 0.5μL，10μmol/L的外引物P2 0.5μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0μL，2×1 Step Buffer 10.0μL，模板RNA溶液 2.0μL，DEPC H2O 6.0μL；

所述荧光PCR反应体系包括如下组分：

1×RT-PCR缓冲液含10 mmol/L Tris-Cl，50 mmol/L KCl，pH8.3

dNTPs 0.2 mmol/L each

MgCl2 2.5 mmol/L

DTT 2 mmol/L

甘油 5%

Ex TagDNA酶 1U/μL

内引物P3 0.9 μmol/L

内引物P4 0.9 μmol/L

探针 0.25 μmol/L。

本发明的有益效果是：实时荧光RT-PCR是20世纪90年代末发展起来的一种的检测方法，其敏感性较常规RT-PCR技术、胶体金免疫检测和ELISA等方法均较高，与经典的鸡胚病毒分离方法相当，与常规方法相比，在特异、快速、高通量等方面具有巨大的优势，可快速检测大批量样品。上世纪80年代发展起来的套式PCR技术，多用于普通检测方法难以检测到的浓度极低的模板（1个或数个copies），能大大增加扩增的效率和忠实性，对环境样品中极微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板的扩增。为提高鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性，本发明建立了敏感性高于常规荧光RT-PCR的高通量、快速检测方法——禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR方法，将套式PCR技术与荧光RT-PCR技术相结合，叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的优势，同时具有荧光RT-PCR快速、高通量的优点，其先进性主要体现在以下几点：

1、套式PCR内引物的使用有效地避免了引物设计而产生的非特异性扩增，这样在第二轮中错误扩增的可能性极低，减少了引物的非特异性扩增，增加了检测的可靠性，因此套式PCR比普通PCR更特异。荧光探针经去羟基化处理，不会在Taq酶作用下发生延伸。它只有与待测模板完全匹配的结合，才会发生荧光报告基团的切割，产生荧光的信号，排除了引物的非特异性扩增而导致的假阳性。一般情况下，Tagman探针与模板之间的碱基错配超过4个以上就无法与模板结合，而正式PCR循环（收集荧光步骤）较高的退火温度（55℃～60℃），排除了模板的非特异性扩增，使得本方法具有较好的特异性，可准确检测H5亚型AIV。通过本发明的试验表明，本发明的方法具有良好的特异性，可准确地检测H5N1、H5N2亚型AIV，而H1N1、H3N2、H6、H9NDV Lasata及EDSV检测为阴性。

2、套式PCR外引物和内引物的使用，使得靶基因经过两次信号放大，大大增加了检测的灵敏度，套式PCR比普通PCR更敏感，敏感性一般是普通PCR的100～1000倍，因此套式PCR技术对环境样品中极微量靶基因的扩增非常有效，多用于普通检测方法难以检测到的浓度极低的模板（1个或数个copies），能大大增加扩增的效率和忠实性，对于鱼塘养殖水体中的禽流感病毒这样微量模板的扩增十分有利。

荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度，灵敏度大约是肉眼观察电泳条带的100倍，的因此用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度，另外由于本方法在正式PCR循环（收集荧光）之前设置了3个低温（退火温度为45℃）PCR循环（反应参数为92℃ 10s，45℃ 30s，72℃ 60s），使得模板在较低的退火温度下得到了大量的扩增，因此大大提高了本方法的敏感性。

3、流感病毒为RNA病毒，如果用病毒作为阳性对照抽提RNA，RNA极不稳定，容易裂解，在日常检验中容易造成环境污染和病毒扩散，生物安全的风险非常高，不符合生物安全管理的相关规定。本发明成功构建了扩增目的片段重组质粒，标号为pGEM-H5，测序结果证实为扩增特异性相关目的片段。抽提质粒后用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7体外转录试剂盒分别进行体外反转录，按一定浓度进行稀释作为阳性对照，为避免阳性对照Ct值太高，造成样品之间的污染，Ct值控制在18~25之间，实际检测中应用方便、避免了生物安全风险。

4、核酸提取需要60 min左右，一步法RT-PCR需要180 min左右，实时荧光PCR需要60 min左右，因此从收到样品到得到检验结果的时间仅为5h，与需耗时半个月才能完成的鸡胚病毒分离方法相比，大大节省了时间，能快速、高通量的对样品进行检测。

附图说明

图1是本发明引物、探针设计示意图；

图2是本发明引物及探针套式荧光RT-PCR扩增曲线；

其中A：A/Duck/Wushang/2003（H5N1）株；B：重组质粒pGEM-H5体外反转录片段；C：阴性对照；

图3是本发明引物及探针特异性试验荧光曲线结果；

其中A：A/Duck/Wushang/2003（H5N1）；B：H5N2；C：H3N2；D：H1N1；E：H6N2；F：H9N2；G：重组质粒pGEM-H5体外反转录片段；H：NDV；I：EDSV；J：阴性对照；

图4是本发明引物及探针特异性试验电泳结果；

其中M：DNA Marker DL-2000；1：A/Duck/Wushang/2003（H5N1）；2：H5N2；3：重组质粒pGEM-H5体外反转录片段；4：H3N2；5：H1N1；6：H9N2；7：H6 N2；8：NDV；9：EDSV；10：阴性对照；

图5是本发明引物及探针检测H5N1病毒的敏感性试验结果。

具体实施方式

下面就对本发明的具体构建步骤作进一步详细阐述，主要包括以下几个步骤：

1、AIV H5亚型套式荧光RT-PCR引物和探针的设计合成：

用Lasergene基因分析软件，对从NCBI下载的H3亚型AIV，NDV、EDSV的核苷酸序列进行比对，寻找高度保守的区域，选取适当的AIV HA基因相关序列，导入探针设计软件Primer Express 2.0设计AIV H5亚型套式荧光RT-PCR引物和Tagman探针，用DEPC处理水溶解，-80℃避光保存。其外引物P1、P2，内引物P3、P4以及探针的示意图如图1所示，其序列分别见下表：

Figure 2010105766964100002DEST_PATH_IMAGE002

2、套式荧光RT-PCR反应体系的建立与优化：

（1）内引物和探针浓度的优化：将荧光PCR反应中的引物和探针浓度从0.1 μmol/L至1 μmol/L以0.05 μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其他条件完全一致。试验结果显示引物浓度在0.8 μmol/L、0.9 μmol/L和1.0 μmol/L都较为合适，探针的浓度在0.15 μmol/L、0.25 μmol/L和0.3 μmol/L，都较合适，考虑到经济的原因，选择0.9 μmol/L的引物和0.25 μmol/L的探针作为荧光RT-PCR检测方法的引物和探针浓度。

（2）MgCl₂浓度的优化：MgCl₂会影响荧光PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其他反应成分不变的情况下，采用MgCl₂浓度梯度，对MgCl₂浓度进行了优化，MgCl₂浓度从1.0 mmol/L开始，以0.5 mmol/L递加，直到8 mmol/L。荧光RT-PCR检测结果表明MgCl₂浓度越低PCR产物的荧光信号强度越低，而随着MgCl₂浓度的增高，扩增效率有所提高，但随着浓度的不断升高，PCR的扩增受到抑制。经比较结果后最终选定PCR反应体系中的MgCl₂浓度为2.5mmol/L。

（3）dNTPs浓度的优化：dNTPs浓度的高低会影响荧光PCR产物的含量，在固定其他反应成分不变的情况下，采用dNTPs浓度梯度，对dNTPs浓度进行了优化，dNTPs浓度从0.1 mmol/L开始，以0.05 mmol/L递加，直到0.8 mmol/L。荧光RT-PCR检测结果表明采用MgCl₂浓度为2.5mmol/L时，采用0.2mmol/L的dNTP为最适。

（4）Taq DNA聚合酶（Taq酶）的选择和优化：Taq酶（以单位Unit计，简写U）优化实验酶的用量分别采用0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U和3.5U。荧光PCR检测结果表明Taq酶用量在1U、1.25U、1.5U和2.5U都较合适，从经济和效果双重考虑，最终选择1U作为RT-PCR反应体系的最适酶量。

（5）最佳退火温度和PCR循环数的确定：为了提高荧光PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物退火温度，以55℃为基础，以0.5℃递加，直到62℃。将细菌DNA模板采用极限梯度稀释法进行PCR实验，采用循环次数为35、40和45。实验结果显示58℃作为退火温度较为合适，扩增循环数45个循环即可达到检测的极限。

（6）优化后的套式荧光RT-PCR检测条件：经优化，确定了同时适合于AIV通用型套式荧光RT-PCR检测的总体积为20μl的最佳反应体系及反应参数，各组分及浓度见下表。

荧光素设定：Report Dye设定分别为FAM，Quench Dye都设定为Tamara，Reference dye设定为None。

Figure 2010105766964100002DEST_PATH_IMAGE004

3、阳性对照或者阴性对照的建立：

以AIV H5N1的RNA为模板，用外引物P1和P2进行一步法RT-PCR，将纯化回收的的RT-PCR产物连接到pGEM Vector的T克隆位点。经筛选获得重组质粒命名为：pGEM-H5。用外引物P1和P2对重组质粒进行PCR扩增，结果可扩增出与目的片段大小相似的特异性条带（约1776bp）。将筛选到的阳性质粒送出测序，用Lasergene基因分析软件对测序结果进行分析后表明：重组质粒的插入片段长度和扩增目的片段长度一致，为1776bp，与引物设计时的预计扩增长度相符，重组质粒测序结果如下：

AGCAAAAGCAGGGGTTCAATCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAGTCAGCCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTGATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGCCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAATTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATACAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCAGGGAAGTTCCTCCTTTTtCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAATGCATACCCAACAATAAAGAGAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTCTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGAGGCAGAGCAGACAAGGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGATTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGAGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAAGTGGAATATGGTAACTGCAGCACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGTCCCAAATATGTGAAATCAAACAAATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTCCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAAATTTGTGAGTTCAGATTGTAGTTAAAAACACCCTTGTTTCTACT

将序列提交NCBI BLAST Server进行检索，检索结果显示：本试验所扩增的片段GenBank中H5N1亚型AIV H5基因的相应片段同源性最高。由此表明：扩增目的片段cDNA已经正确地插入到pGEM载体中，成功地构建了重组质粒pGEM-H5。然后抽提质粒pGEM-H5，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7体外转录试剂盒分别进行体外转录，DNase消化后的RNA经稀释保存在75%的乙醇中，稀释至一定浓度作为阳性对照。

采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性对照。

4、AIV通用型套式荧光RT-PCR：

（1）套式荧光RT-PCR步骤1：一步法RT-PCR

取待检样品抽提RNA模板及上述制备的阳性对照和阴性对照，提取样品RNA可参见Trizol试剂盒说明书，以抽提的RNA为模板，按下表配制反应混合物，用编号为H5的外引物P1和P2进行一步法RT-PCR，反应参数为：50℃ 30 min，94℃ 3 min，1个循环；94℃ 60 s，53℃ 60 s，72℃ 120 s，30个循环；72℃延伸8 min。

Figure 2010105766964100002DEST_PATH_IMAGE006

（2）套式荧光RT-PCR步骤２：荧光PCR

以（1）中一步法RT-PCR的产物为模板，按上述优化后的反应体系中的内引物（P3、P4）及探针和反应组份于Eppendoff管中充分混匀后分别加入ABI荧光PCR仪专用管中，然后放入ABI荧光PCR仪，记录样本摆放顺序，在96孔板内设置被检样品后进行扩增，反应参数见下表。

Figure 2010105766964100002DEST_PATH_IMAGE008

检测结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。反应结束后保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出Ct值及循环图像。当阴性对照的检测结果无数值或Ct值>30，阳性对照的Ct值≤28.0时，Ct值≤30.0的样本判为阳性，Ct值无数值或Ct值>30的样品判为阴性。H5亚型探针检测结果见图2所示。

5、特异性试验：

分别提取A/Duck/Wushang/2003（H5N1）株，H5N2、H1N1、H3N2、H6、H9亚型AIV以及NDV Lasata和EDSV的核酸，按上面步骤4的方法进行特异性试验，同时设阳性对照（步骤3中制备的体外反转录片段）和阴性对照。如下表，编号为H5的引物、探针检测A/Duck/Wushang/2003（H5N1）株，H5N2亚型AIV和阳性对照（重组质粒pGEM-H5体外反转录片段）观察到荧光增加信号曲线，而H1N1、H3N2、H6、H9亚型AIV以及NDV Lasata、EDSV株和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线，试验结果见图3及图4（图4为电泳结果图）所示。

6、敏感性实验：

将灭活AIV H5N1作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，分别提取各浓度病毒稀释液RNA，配制反应混合物后进行套式荧光RT-PCR，同时设阳性对照（步骤3中制备的体外反转录片段）和阴性对照，对梯度稀释的样本进行荧光PCR检测。结果表明探针检测A/Duck/Wushang/2003（H5N1）的最低稀释度为10^-7，试验结果见图5。

本发明的PCR反应中利用两套PCR引物（1对外侧引物和1对内侧引物）进行两轮PCR扩增的方法，即将外侧引物进行PCR扩增后的产物作为内侧引物进行PCR扩增的模板，内侧引物与模板DNA的结合位点处于外侧引物扩增出的DNA片段内侧，套式PCR对减少或消除非特异性扩增及提高灵敏度非常有效，通过上述的试验表明，本发明建立的AIV通用型套式荧光RT-PCR方法具有良好的特异性，可准确地检测A/Duck/Wushang/2003（H5N1）株，H5N2亚型AIV，而H1N1、H3N2、H6、H9亚型AIV以及NDV Lasata、EDSV株检测为阴性。AIV H5亚型套式荧光RT-PCR能检测A/Duck/Wushang/2003（H5N1）株的最低稀释度分别为10^-7具有很高的敏感性，可满足鱼类养殖水体禽流感病毒快速检测和高敏感性的需求。

SEQUENCELISTING

<110> 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局

<120> 禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentInversion3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 外引物P1

<400> 1

agcaaaagcaggggtc/at/ca/gatct 22

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<223> 外引物P2

<400> 2

agtagaaacaagggtgtttttaactaca 28

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 内引物P3

<400> 3

cagtggcgagttccctagca 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 内引物P4

<400> 4

tccattggagcacatccataaa 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> 探针

<400> 5

tggcaatcatggtggctggtctat 24

<210> 6

<211> 1776

<212> DNA

<213> 重组质粒（AIVH5N1）

<400> 6

agcaaaagcaggggttcaatctgtcaaaatggagaaaatagtgcttcttcttgcaatagt 60

cagccttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagca 120

ggttgacacaataatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaa 180

gacacacaacgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctgattttaagagattg 240

tagtgtagctggatggctcctcggaaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtgccgga 300

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tccataccagggaagttcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacaa 540

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tagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggatttcttctggacaattttaaaacc 780

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cggattcctagatgtctggacttataatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagag 1380

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Claims

1.一种禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A：提取待检样品RNA；

P1：5’-AGCAAAAGCAGGGGT C/A T/C A/G ATCT-3’

P2：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACA-3’；

P3：5’-CAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-3’

P4：5’-TCCATTGGAGCACATCCATAAA-3’

探针：Fam-5’-TGGCAATCATGGTGGCTGGTCTAT-3’-Tamara；

2.根据权利要求1所述的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为：50℃ 30min，94℃ 3min，1个循环；94℃ 60s，53℃ 60s，72℃ 120s，30个循环；72℃延伸8min。

3.根据权利要求1所述的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤C中荧光PCR的反应参数为：94℃ 10s，45℃ 30s，72℃ 60s，3个循环；94℃ 10s，58℃ 35s，45个循环后收集荧光。

4.根据权利要求1所述的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤B中阳性对照设立方法为：选取AIV H5N1的RNA为模板，经过克隆筛选正确的重组克隆质粒，然后抽取所述重组克隆质粒对目的片段进行体外反转录，按一定浓度稀释后作为阳性对照。

5.根据权利要求1所述的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤B中采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性对照。

6.根据权利要求1至5任一项所述的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，反应体系中内引物P3的引物浓度为0.9 μmol/L，内引物P4的引物浓度为0.9 μmol/L，探针浓度为0.25 μmol/L。

7.一种用于权利要求1所述的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中的PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系；

所述荧光PCR反应体系包括如下组分：

1×RT-PCR缓冲液含10 mmol/L Tris-Cl，50 mmol/L KCl，pH8.3

dNTPs 0.2 mmol/L each

MgCl2 2.5 mmol/L

DTT 2 mmol/L

甘油 5%

Ex TagDNA酶 1 U/μL

内引物P3 0.9 μmol/L

内引物P4 0.9 μmol/L

探针 0.25 μmol/L。