CN104531900B - 鉴定或辅助鉴定h6n1亚型禽流感病毒的成套试剂及其应用 - Google Patents

鉴定或辅助鉴定h6n1亚型禽流感病毒的成套试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定H6N1亚型禽流感病毒的成套试剂及其应用。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H6N1亚型禽流感病毒的成套试剂，由成套DNAH6‑T和成套DNAN1‑T组成；H6‑T由PCR引物对H6和探针H6‑P组成；H6由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；H6‑P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；N1‑T由PCR引物对N1和探针N1‑P组成；N1由序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成；N1‑P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。

Description

鉴定或辅助鉴定H6N1亚型禽流感病毒的成套试剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定H6N1亚型禽流感病毒的成套试剂及其应用。
背景技术
禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)根据表面糖蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性差异分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，HA和NA的组合可产生至少135种亚型，其中，H5和H7亚型中的部分组合(H5N1、H7N7和H7N9等)称为高致病性AIV，可感染人类并致死。低致病性AIV感染虽然无任何症状或表现温和的、轻微的不典型症状，对畜禽和人类的健康不具威胁性，但当不同亚型的低致病性AIV毒株混合感染畜禽时，可以在动物体内互相交换基因，从而产生无法预测致病性和传染性的新变异株，这将对禽类和人类健康存在很大的威胁。
H6亚型AIV属于低致病性AIV，但有报道表明1997年在香港爆发感染人的高致病性H5N1病毒，除HA基因外，其余7个基因片段都与A/teal/Hong Kong/W312/97(H6N1)病毒高度相似，因此H6亚型AIV很可能成为高致病性H5亚型AIV的基因供体。2013年6月，台湾发现了第一例人感染型H6N1亚型AIV，是一种低致病性禽流感病毒，其HA基因由台湾H6亚型AIV支内进化而来。
雁形目(鸭子、鹅、天鹅)和鸻形目(岸禽类鸟、鸥、燕鸥、海雀)是AIV潜伏的主要自然宿主，其中特别是水禽，是所有亚型AIV的储存库，并经粪便排毒污染水系，通过直接传播或候鸟的南北迁徙将病毒进一步散播开来，感染其它禽类和哺乳动物，因此水禽被认为是流感病毒的天然储存库和新毒株的重要来源，在流感病毒的遗传进化和生态分布中具有重要作用。低致病性AIV在健康鸭群中潜伏、繁殖和排毒，也可通过基因重排导致高致病性禽流感的爆发，危害养禽业的安全，亦可能进化为可突破种间屏障的人禽流感病毒，危害人类健康。目前，H6亚型AIV受到广泛地关注，对养禽业和公共卫生有重要的影响。
病毒分离与鉴定是经典的流感检测方法，即先将样品接种SPF鸡胚增殖病毒2-5天，再收集鸡胚尿囊液进行血凝试验和血凝抑制试验，结果准确可靠，但存在检测周期长的缺点。酶联免疫吸附试验虽可检测禽流感病毒的抗原，但需要特定的标准阳性血清。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定H6N1亚型禽流感病毒，即确定HA亚型是否为H6亚型及其NA亚型是否为N1亚型。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H6-T的成套DNA和名称为N1-T的成套DNA组成；
所述H6-T由名称为H6的PCR引物对和名称为H6-P的探针组成；所述H6由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA(H6-F)和SEQ ID No.2所示的单链DNA(H6-R)组成；所述H6-P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述N1-T由名称为N1的PCR引物对和名称为N1-P的探针组成；所述N1由序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA(N1-F)和SEQ ID No.5所示的单链DNA(N1-R)组成；所述N1-P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了成套DNA。
本发明所提供的成套DNA，为鉴定或辅助鉴定H6亚型禽流感病毒的成套DNA或鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的成套DNA；所述鉴定或辅助鉴定H6亚型禽流感病毒的成套DNA为所述成套DNA H6-T；所述鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的成套DNA为所述成套DNA N1-T。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套引物。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套引物，由所述PCR引物对H6和所述PCR引物对N1组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对。
本发明所提供的PCR引物对，为鉴定或辅助鉴定H6亚型禽流感病毒的引物对或鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的引物对；所述鉴定或辅助鉴定H6亚型禽流感病毒的引物对为所述H6；所述鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的引物对为所述N1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的系统(产品和/或设备)，为下述H-M中的任一种：
H、含有所述成套试剂的系统；
I、含有所述H6-T的系统；
J、含有所述N1-T的系统；
K、含有所述成套引物的系统；
L、含有所述PCR引物对H6的系统；
M、含有所述PCR引物对N1的系统。
上述系统中，所述探针可标记有荧光染料。所述标记有荧光染料具体可为FAM和/或Eclipse和/或ROX。
在本发明的一个实施例中，所述H6-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Ecl ipse；所述N1-P的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。
上述系统，还可包括荧光PCR所需的试剂和仪器。具体来说，所述系统可包括所述成套试剂、所述H6-T、所述N1-T、所述成套引物、所述PCR引物对H6或所述PCR引物对N1以及荧光PCR所需要的其它试剂和仪器。
上述系统还可仅包括所述成套试剂、所述成套DNA H6-T、所述成套DNA N1-T、所述成套引物、所述PCR引物对H6或所述PCR引物对N1。
所述成套试剂、所述成套DNA H6-T、所述成套DNA N1-T、所述成套引物、所述PCR引物对H6或所述PCR引物对N1以及荧光PCR所需要的其它试剂均可独立包装。所述成套试剂、所述成套DNA H6-T、所述成套DNA N1-T、所述成套引物、所述PCR引物对H6和所述PCR引物对N1中的各引物对和/或各引物对的两条单链DNA和/或探针均可独立包装。
荧光PCR所需要的其它试剂可包括DNA聚合酶和/或PCR缓冲液和/或dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物和/或MgCl2。所述DNA聚合酶具体可为Taq聚合酶。
上述系统中，所述H还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或cDNA)为模板，用所述成套试剂进行荧光PCR；FAM通道和ROX通道的结果均呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)，所述待测样品含有H6N1亚型禽流感病毒；FAM通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)、ROX通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)，所述待测样品含有HxN1(x≠6)亚型禽流感病毒；FAM通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)、ROX通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品含有H6Nx(x≠1)亚型禽流感病毒；FAM通道和ROX通道的结果均呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品含有HxNy亚型禽流感病毒(x≠6，y≠1)或所述待测样品不含禽流感病毒。
上述系统中，每20μL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对H6(H6的每条引物在反应体系中的终浓度均为0.4μM)，所述探针H6-P(H6-P在反应体系中的终浓度为0.2μM)，所述PCR引物对N1(N1的每条引物在反应体系中的终浓度均为0.2μM)，所述探针N1-P(N1-P在反应体系中的终浓度为0.4μM)，2×PCR缓冲液10μL，MgCl2(MgCl2在反应体系中的终浓度为0.25mM)，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物(dATP、dTTP、dCTP和dGTP在反应体系中的终浓度均为100μM)，Taq聚合酶(Taq聚合酶在反应体系中的终浓度为0.075U/μL)，浓度为10ng/μL的待测病毒核酸1μL，无菌蒸馏水补足20μL。
上述系统中，所述I还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或cDNA)为模板，用所述成套试剂进行荧光PCR；FAM通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)，所述待测样品含有H6亚型禽流感病毒；FAM通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品含有Hx(x≠6)亚型禽流感病毒或所述待测样品不含禽流感病毒。
上述系统中，每20μL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对H6(H6的每条引物在反应体系中的终浓度均为0.4μM)，所述的探针H6-P(H6-P在反应体系中的终浓度为0.2μM)，2×PCR缓冲液10μL，MgCl2(MgCl2在反应体系中的终浓度为0.25mM)，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物(dATP、dTTP、dCTP和dGTP在反应体系中的终浓度均为100μM)，Taq聚合酶(Taq聚合酶在反应体系中的终浓度为0.075U/μL)，浓度为10ng/μL的待测病毒核酸1μL，无菌蒸馏水补足20μL。
上述系统中，所述J还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或cDNA)为模板，用所述成套试剂进行荧光PCR；ROX通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)，所述待测样品含有N1亚型禽流感病毒；ROX通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品含有Nx(x≠1)亚型禽流感病毒所述待测样品不含禽流感病毒。
上述系统中，每20μL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对N1(N1的每条引物在反应体系中的终浓度均为0.2μM)，所述探针N1-P(N1-P在反应体系中的终浓度为0.4μM)，2×PCR缓冲液10μL，MgCl2(MgCl2在反应体系中的终浓度为0.25mM)，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物(dATP、dTTP、dCTP和dGTP在反应体系中的终浓度均为100μM)，Taq聚合酶(Taq聚合酶在反应体系中的终浓度为0.075U/μL)，浓度为10ng/μL的待测病毒核酸1μL，无菌蒸馏水补足20μL。
上述系统中，所述FAM通道可为在530nm激发光下的FAM通道；所述ROX通道可为在610nm激发光下的ROX通道。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂或所述成套DNA或所述成套引物或所述PCR引物对的制备方法。
本发明所提供的所述成套试剂或所述成套DNA或所述成套引物或所述PCR引物对的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA和/或各引物对和/或各探针和/或各其他试剂分别单独包装的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂或所述成套DNA或所述成套引物或所述PCR引物对在制备鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的系统中的应用。
本发明中，所述成套试剂的所述成套DNA H6-T和所述成套DNA N1-T一起使用时，所述H6-F、所述H6-R、所述H6-P、所述N1-F、所述N1-R和所述N1-P的摩尔数可为2:2:1:1:1:2。所述成套DNA H6-T单独使用时，所述成套DNA H6-T的所述H6-F、所述H6-R和所述H6-P的摩尔数可为2:2:1。所述成套DNA N1-T单独使用时，所述成套DNA N1-T的所述N1-F、所述N1-R和所述N1-P的摩尔数可为1:1:2。所述PCR引物对H6的所述H6-F和所述H6-R的摩尔数可为1:1。所述PCR引物对N1的所述N1-F和所述N1-R的摩尔数可为1:1。
本发明中的Taq聚合酶可为大连宝生物工程有限公司产品，货号为R500A。本发明中的2×PCR缓冲液可为大连宝生物工程有限公司产品，货号为RR390A。本发明中的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物可为大连宝生物工程有限公司产品，货号为4019。本发明中的MgCl2可为美国Sigma产品，货号为M8787-1.5ML。
实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂具有较高的灵敏度、特异性和重复性：本发明的成套试剂可特异鉴定H6亚型禽流感病毒和N1亚型禽流感病毒，并且重复性好；本发明的成套试剂能检测出10拷贝/20μL的H6亚型禽流感病毒；本发明的成套试剂能检测出100拷贝/20μL的N1亚型禽流感病毒。实验证明，利用本发明的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂鉴定H6亚型禽流感病毒和N1亚型禽流感病毒，反应结束时即可根据扩增曲线判定待测样品是否含有H6亚型禽流感病毒和/或N1亚型禽流感病毒，具有特异性强、假阳性低、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、操作简单、交叉污染和污染环境的机会少(不需要EB染色)等优点，而且整个反应可在30min左右完成，省时省力，并且还可同时检测多个毒株(如H6亚型和N1亚型禽流感病毒)。实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂可用来鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒。
附图说明
图1为H6亚型禽流感病毒多重荧光PCR的特异性实验(FAM通道)。其中，1为H6N1亚型禽流感病毒，2为H6N2亚型禽流感病毒，3为H6N5亚型禽流感病毒，4为H6N6亚型禽流感病毒，5为H6N8亚型禽流感病毒，6为H1N1亚型禽流感病毒，7为H5N1亚型禽流感病毒，8为H3N2亚型禽流感病毒，9为H4N5亚型禽流感病毒，10为H7N2亚型禽流感病毒，11为H8N4亚型禽流感病毒，12为H9N2亚型禽流感病毒，13为H10N3亚型禽流感病毒，14为H11N9亚型禽流感病毒，15为H12N5亚型禽流感病毒，16为H13N5亚型禽流感病毒，17为阴性对照。
图2为N1亚型禽流感病毒多重荧光PCR的特异性实验(ROX通道)。其中，1为H6N1亚型禽流感病毒，2为H6N2亚型禽流感病毒，3为H6N5亚型禽流感病毒，4为H6N6亚型禽流感病毒，5为H6N8亚型禽流感病毒，6为H1N1亚型禽流感病毒，7为H5N1亚型禽流感病毒，8为H3N2亚型禽流感病毒，9为H4N5亚型禽流感病毒，10为H7N2亚型禽流感病毒，11为H8N4亚型禽流感病毒，12为H9N2亚型禽流感病毒，13为H10N3亚型禽流感病毒，14为H11N9亚型禽流感病毒，15为H12N5亚型禽流感病毒，16为H13N5亚型禽流感病毒，17为阴性对照。
图3为H6亚型禽流感病毒多重荧光PCR的敏感性实验(FAM通道)。其中，1为107拷贝/μL的T-H6溶液，2为106拷贝/μL的T-H6溶液，3为105拷贝/μL的T-H6溶液，4为104拷贝/μL的T-H6溶液，5为103拷贝/μL的T-H6溶液，6为102拷贝/μL的T-H6溶液，7为10拷贝/μL的T-H6溶液，8为1拷贝/μL的T-H6溶液，9为阴性对照。
图4为N1亚型禽流感病毒多重荧光PCR的敏感性实验(ROX通道)。其中，1为107拷贝/μL的T-N1溶液，2为106拷贝/μL的T-N1溶液，3为105拷贝/μL的T-N1溶液，4为104拷贝/μL的T-N1溶液，5为103拷贝/μL的T-N1溶液，6为102拷贝/μL的T-N1溶液，7为10拷贝/μL的T-N1溶液，8为阴性对照。
图5为H6亚型禽流感病毒多重荧光PCR的重复性实验(FAM通道)。其中，1-5均为H6N1亚型禽流感病毒，6为阴性对照。
图6为N1亚型禽流感病毒多重荧光PCR的重复性实验(ROX通道)。其中，1-5均为H6N1亚型禽流感病毒，6为阴性对照。
其中，图1-6中横坐标为荧光PCR扩增的循环数，纵坐标为荧光信号值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的H1N1亚型禽流感病毒、H3N2亚型禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、H7N2亚型禽流感病毒、H8N4亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒和H12N5亚型禽流感病毒(Yi Peng.et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses byreverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.VirologyJournal,2011,8:337)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。其中，H5N1亚型禽流感病毒和H7N2亚型禽流感病毒均为灭活病毒。
下述实施例中的H6N1亚型禽流感病毒、H6N2亚型禽流感病毒、H6N5亚型禽流感病毒、H6N6亚型禽流感病毒和H6N8亚型禽流感病毒(周辰瑜，H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速检测方法的研究，广西大学2012年硕士毕业论文，2012-06-01.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H4N5亚型禽流感病毒、H10N3亚型禽流感病毒和H11N9亚型禽流感病毒(罗思思，谢芝勋，刘加波，等.H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2013,34(12)：1-5.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H13N5亚型禽流感病毒(Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al.Amultiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiationof avian H5,H7and H9hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes，2006，20(3-4)：245-249.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的新城疫病毒毒株F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02(陈安莉,谢芝勋,周辰瑜,等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41(09):917-922.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的传染性支气管炎病毒毒株:Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02(谢志勤,谢芝勋,吕华刚等.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报,2008,21(6):1733-1736.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的传染性喉气管炎病毒北京株、台湾疫苗株、美国标准株、以色列疫苗株、广西分离株(谢芝勋,谢志勤,庞耀珊等.采用二温氏聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究[J].中国兽医科技,2000,30(9):5-7)公众可从广西壮族自治区兽医研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的Taq聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品，货号为R500A。下述实施例中的2×PCR缓冲液为大连宝生物工程有限公司产品，货号为RR390A。下述实施例中的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物为大连宝生物工程有限公司产品，货号为4019。下述实施例中的MgCl2为美国Sigma产品，货号为M8787-1.5ML。
实施例1、鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂的制备
鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H6-T的成套DNA和名称为N1-T的成套DNA组成；所述H6-T由名称为H6的PCR引物对和名称为H6-P的探针组成；所述H6由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA(H6-F)和SEQID No.2所示的单链DNA(H6-R)组成；所述H6-P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；所述N1-T由名称为N1的PCR引物对和名称为N1-P的探针组成；所述N1由序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA(N1-F)和SEQ ID No.5所示的单链DNA(N1-R)组成；所述N1-P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。
所述H6-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse，根据其在FAM通道(在530nm激发光下)的荧光信号，鉴定H6亚型禽流感病毒；所述N1-P的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse，根据其在ROX通道(在610nm激发光下)的荧光信号，鉴定N1亚型禽流感病毒。
实施例2、实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂的特异性实验
1、检测样品的制备
实验中用到的病毒分别是16株不同亚型禽流感病毒(H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8、H1N1、H3N2、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N9、H12N5和H13N5亚型)、10株新城疫病毒(F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株(Massachussetts41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02)和5株传染性喉气管炎病毒毒株(北京株、台湾疫苗株、美国标准株、以色列疫苗株和广西分离株)。
2、利用实施例1的成套试剂对病毒的核酸进行多重荧光PCR
1)模板的制备
分别抽提得到步骤1中16株不同亚型禽流感病毒(H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8、H1N1、H3N2、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N9、H12N5和H13N5亚型)、10株新城疫病毒(F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株(Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02)的总RNA；提取5株传染性喉气管炎病毒毒株(北京株、台湾疫苗株、美国标准株、以色列疫苗株和广西分离株)的DNA。
分别对上述16株不同亚型禽流感病毒(H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8、H1N1、H3N2、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N9、H12N5和H13N5亚型)、10株新城疫病毒(F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株(Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02)的总RNA进行反转录，分别得到禽流感病毒(H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8、H1N1、H3N2、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N9、H12N5和H13N5亚型)、10株新城疫病毒(F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株(Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02)的cDNA。
2)多重荧光PCR
分别以上述步骤1)中各个病毒的cDNA和DNA为模板，以无菌超纯水为阴性对照，利用实施例1中的成套试剂进行多重荧光PCR。
每个多重荧光PCR的20μL反应体系均为：实施例1的PCR引物对H6(H6的每条引物在反应体系中的终浓度均为0.4μM)，实施例1的探针H6-P(H6-P在反应体系中的终浓度为0.2μM)，实施例1的PCR引物对N1(N1的每条引物在反应体系中的终浓度均为0.2μM)，实施例1的探针N1-P(N1-P在反应体系中的终浓度为0.4μM)、2×PCR缓冲液，MgCl2(MgCl2在反应体系中的终浓度为0.25mM)，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物(dATP、dTTP、dCTP和dGTP在反应体系中的终浓度均为100μM)，Taq聚合酶(Taq聚合酶在反应体系中的终浓度为0.075U/μL)，步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水(每个反应体系中一种步骤1)的cDNA或DNA或无菌蒸馏水，无菌蒸馏水作为阴性对照)，无菌蒸馏水补足20μL。
将上述反应体系放入Roche公司的LightCycler 2.0PCR仪中，设置如下条件进行反应：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸8s，50个循环。反应结束后得到不同病毒的扩增曲线。FAM通道(在530nm激发光下)的结果见图1，结果显示，H6N1亚型禽流感病毒(图中1)、H6N2亚型禽流感病毒(图中2)、H6N5亚型禽流感病毒(图中3)、H6N6亚型禽流感病毒(图中4)和H6N8亚型禽流感病毒(图中5)的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)；H1N1亚型禽流感病毒(图中6)、H5N1亚型禽流感病毒(图中7)、H3N2亚型禽流感病毒(图中8)、H4N5亚型禽流感病毒(图中9)、H7N2亚型禽流感病毒(图中10)、H8N4亚型禽流感病毒(图中11)、H9N2亚型禽流感病毒(图中12)、H10N3亚型禽流感病毒(图中13)、H11N9亚型禽流感病毒(图中14)、H12N5亚型禽流感病毒(图中15)、H13N5亚型禽流感病毒(图中16)和阴性对照(图中17)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)。10株新城疫病毒(F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株(Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02)、5株传染性喉气管炎病毒毒株(北京株、台湾疫苗株、美国标准株、以色列疫苗株和广西分离株)的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线均为直线，即结果均呈阴性。结果表明，利用实施例1的成套试剂得到的H6亚型禽流感病毒和Hx(x≠6)亚型禽流感病毒的扩增曲线在FAM通道(在530nm激发光下)中有明显的不同，表明实施例1的成套试剂可用来鉴定H6亚型禽流感病毒，并且该成套试剂中的引物具有较高的特异性。
ROX通道(在610nm激发光下)的检测结果见图2，结果显示，H6N1亚型禽流感病毒(图中1)、H1N1亚型禽流感病毒(图中6)和H5N1亚型禽流感病毒(图中7)的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)；H6N2亚型禽流感病毒(图中2)、H6N5亚型禽流感病毒(图中3)、H6N6亚型禽流感病毒(图中4)、H6N8亚型禽流感病毒(图中5)、H3N2亚型禽流感病毒(图中8)、H4N5亚型禽流感病毒(图中9)、H7N2亚型禽流感病毒(图中10)、H8N4亚型禽流感病毒(图中11)、H9N2亚型禽流感病毒(图中12)、H10N3亚型禽流感病毒(图中13)、H11N9亚型禽流感病毒(图中14)、H12N5亚型禽流感病毒(图中15)、H13N5亚型禽流感病毒(图中16)和阴性对照(图中17)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)。10株新城疫病毒(F48E9株、Mukteswar株、C30株、V4株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株(Massachussetts 41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、JMK、H52和广西分离株GXIB/02)、5株传染性喉气管炎病毒毒株(北京株、台湾疫苗株、美国标准株、以色列疫苗株和广西分离株)的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线均为直线，即结果均呈阴性。结果表明，利用实施例1的成套试剂得到的N1亚型禽流感病毒和Ny(y≠1)亚型禽流感病毒的扩增曲线在ROX通道(在610nm激发光下)中有明显的不同，表明实施例1的成套试剂可用来鉴定N1亚型禽流感病毒，并且该成套试剂中的引物具有较高的特异性。
根据上述结果可得知，利用实施例1的成套试剂得到的病毒的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线和ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)，表明该病毒为H6N1亚型禽流感病毒；利用实施例1的成套试剂得到的病毒的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线为直线(即结果呈阴性)、ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线为S型曲线(即结果呈阳性)，表明该病毒为HxN1(x≠6)亚型禽流感病毒；利用实施例1的成套试剂得到的病毒的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线为S型曲线(即结果呈阳性)、ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线为直线(即结果呈阴性)，表明该病毒为H6Nx(x≠1)亚型禽流感病毒；利用实施例1的成套试剂得到的病毒的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线和ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)，表明该病毒为HxNy亚型禽流感病毒(x≠6，y≠1)或非禽流感病毒。该实验结果说明实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂能特异性地检测H6N1亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和N1亚型禽流感病毒。
实施例3、实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂的敏感性实验
按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction试剂盒说明书，从H6N1亚型禽流感病毒抽提得到浓度为10ng/μL的H6N1亚型禽流感病毒总RNA(简称H6N1RNA)。
分别用文献Hoffmann E,Stech J,Guan Y,et al.Universal primer set forthe full-length amplification of all influenza A viruses[J].Arch Virol,2001,146:2275–2289中HA和NA基因引物，以H6N1RNA为模板进行RT-PCR扩增，反应体系如下：2×1Step Buffer 12.5μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，HA或NA基因的上游引物(25μM)0.5μL，HA或NA基因的下游引物(25μM)0.5μL，H6N1RNA(10ng/μL)1μL，以无RNA酶的超纯水补足25μL；反应程序如下：94℃5min，94℃1min、52℃1.5min、72℃1.5min、35个循环，72℃8min,10℃终止反应。RT-PCR扩增结束后分别得到1744bp的HA基因片段和1458bp的NA基因片段，将这两个基因片段分别连接至pGEM T-easy载体上，将含有HA基因片段的正确序列的重组载体命名为T-H6，将含有NA基因片段的正确序列的重组载体命名为T-N1。
将上述T-H6用无菌蒸馏水按10倍递减稀释成浓度分别为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL和1拷贝/μL的T-H6溶液；将上述T-N1用无菌蒸馏水按10倍递减稀释成浓度分别为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL和1拷贝/μL的T-N1溶液。
按照实施例2步骤2的2)中的多重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为上述浓度分别为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL和1拷贝/μL的T-H6溶液各1μL和无菌蒸馏水(阴性对照)1μL，其他步骤均不变，分别得到107拷贝/20μL、106拷贝/20μL、105拷贝/20μL、104拷贝/20μL、103拷贝/20μL、102拷贝/20μL、10拷贝/20μL和1拷贝/20μL的T-H6的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线和阴性对照的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线(图3)。
FAM通道(在530nm激发光下)的结果显示，107拷贝/20μL(图中1)、106拷贝/20μL(图中2)、105拷贝/20μL(图中3)、104拷贝/20μL(图中4)、103拷贝/20μL(图中5)、102拷贝/20μL(图中6)和10拷贝/20μL(图中7)的T-H6的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)；1拷贝/20μL(图中8)的T-H6的扩增曲线和阴性对照(图中9)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)。结果表明，实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂最低能检测到浓度为10拷贝/20μL的H6亚型禽流感病毒。
按照实施例2步骤2的2)中的多重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为上述浓度分别为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL和10拷贝/μL的T-N1溶液各1μL和无菌蒸馏水(阴性对照)1μL，其他步骤均不变，分别得到107拷贝/20μL、106拷贝/20μL、105拷贝/20μL、104拷贝/20μL、103拷贝/20μL、102拷贝/20μL和10拷贝/20μL的T-N1的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线和阴性对照的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线(图4)。
ROX通道(在610nm激发光下)的结果显示，107拷贝/20μL(图中1)、106拷贝/20μL(图中2)、105拷贝/20μL(图中3)、104拷贝/20μL(图中4)、103拷贝/20μL(图中5)、102拷贝/20μL(图中6)的T-N1的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)；10拷贝/20μL(图中7)的T-N1的扩增曲线和阴性对照(图中8)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)。结果表明，实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂最低能检测到浓度为102拷贝/20μL的N1亚型禽流感病毒。
实施例4、实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂的重复性实验
按照实施例2步骤2的2)中的多重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为实施例2步骤2的1)中的H6N1亚型禽流感病毒的cDNA和无菌蒸馏水(阴性对照)，其他步骤均不变，分别得到H6N1亚型禽流感病毒和阴性对照的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线(图5)和ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线(图6)。H6N1亚型禽流感病毒设置5个重复实验(图5和图6)。
FAM通道(在530nm激发光下)的结果显示(图5)，H6N1亚型禽流感病毒的五个重复的扩增曲线(图中1-5)均为S型曲线(即结果呈阳性)；阴性对照的扩增曲线(图中6)为直线(即结果呈阴性)。ROX通道(在610nm激发光下)的结果显示(图6)，H6N1亚型禽流感病毒的五个重复的扩增曲线(图中1-5)均为S型曲线(即结果呈阳性)；阴性对照的扩增曲线(图中6)为直线(即结果呈阴性)。结果表明，实施例1的鉴定或辅助鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒的成套试剂鉴定H6亚型和/或N1亚型禽流感病毒时的重复性好。

Claims (10)

1.鉴定或辅助鉴定H6亚型和N1亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H6-T的成套DNA和名称为N1-T的成套DNA组成；
所述H6-T由名称为H6的PCR引物对和名称为H6-P的探针组成；所述H6由序列表中SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述H6-P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述N1-T由名称为N1的PCR引物对和名称为N1-P的探针组成；所述N1由序列表中SEQID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成；所述N1-P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。
2.鉴定或辅助鉴定H6亚型和N1亚型禽流感病毒的成套引物，由权利要求1所述的PCR引物对H6和权利要求1所述的PCR引物对N1组成。
3.鉴定或辅助鉴定H6亚型和N1亚型禽流感病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1所述的成套试剂。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：所述探针标记有荧光染料。
5.根据权利要求3或4所述的系统，其特征在于：所述系统还包括DNA聚合酶。
6.鉴定或辅助鉴定H6亚型和N1亚型禽流感病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求2所述的成套引物。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：所述系统还包括DNA聚合酶。
8.权利要求1所述的成套试剂的制备方法，包括将所述成套试剂的各引物对的所述两条单链DNA和各探针分别单独包装的步骤。
9.权利要求2所述的成套引物的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
10.权利要求1所述的成套试剂或权利要求2所述的成套引物在制备鉴定或辅助鉴定H6亚型和N1亚型禽流感病毒的系统中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071263A (zh) * 2010-12-07 2011-05-25 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒
CN103667519A (zh) * 2012-09-14 2014-03-26 聊城大学 鉴定h9亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071263A (zh) * 2010-12-07 2011-05-25 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒
CN103667519A (zh) * 2012-09-14 2014-03-26 聊城大学 鉴定h9亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of a Low Pathogenic Avian Influenza Virus (H6N1) Isolated from Turkeys;I. Shkoda et al.;《Influenza Research and Treatment》;20101230;第2011卷;第1-7页 *

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