CN101360825A - 甲型流感病毒的检测方法和用于检测甲型流感病毒的试剂盒 - Google Patents
甲型流感病毒的检测方法和用于检测甲型流感病毒的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于简单地、特异地和/或灵敏地检测甲型流感病毒的存在的寡核苷酸。本发明尤其提供了一种用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的引物、探针、和/或测试方法。还提供了一种包括用于测试的探针和/或引物的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测甲型流感病毒感染的寡核苷酸、方法和试剂盒。特别地，本发明提供了一种用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的核酸分析方法。
背景技术
甲型流感(influenza A)是由甲型流感病毒株引起的动物传染性疾病，所述甲型流感病毒株通常感染鸟类而很少感染猪。甲型流感病毒(influenza Avirus)有多种亚型。这些亚型基于血凝素(HA)片段4和神经氨酸苷酶(NA)片段6，所述血凝素片段4具有14种变体，所述神经氨酸苷酶片段6具有9种变体。正是病毒的这两个片段导致了毒性。甲型流感病毒是一种正粘病毒类的RNA病毒。
甲型流感病毒的H5N1亚型是尤其令人关注的，因为H5N1变异快，并且已被证明具有很高的致病性，能够在人类中引发严重的疾病。
甲型流感病毒的H5N1亚型或者禽流感的传播和影响已得到了很好的研究。禽流感已从东南亚传播到中国和俄罗斯的部分地区的家禽，并且现在已传播到欧洲国家如土耳其和罗马利亚的家禽。人患禽流感的病例已在香港、印尼、越南、柬埔寨和泰国得到证实。
目前，检测甲型流感病毒感染的实验室方法通常包括抗原检测、细胞培养物的分离、或者通过逆转录酶-聚合酶的链式反应(RT-PCR)。
通过使用确定引物的RT-PCR技术，可以对病毒进行检测并确定病毒的亚型。在1997年由甲型流感病毒的H5N1株引发的流感爆发时，香港大学就设计出了用于甲型流感病毒的H5N1亚型或禽流感病毒的PCR引物。然而，甲型流感病毒的亚型易于变异，因此，选自H5N1序列的任何检测序列很可能发生变化。这可能降低目前可用的各种检测方法的灵敏性和特异性。
由于检测方法比较简单，因此目前可用的检测方法不够灵敏并且特异性不高；由于其它类似或者相关的亚型，上述缺陷将导致甲型流感病毒的H5N1亚型或者禽流感的检测可能存在假阳性。
因此，需要一种具有特异性和灵敏性的用于检测甲型流感病毒感染的方法。尤其是一种对H5N1亚型或者禽流感具有特异性的检测方法。
发明内容
本发明涉及一种用于确定在生物样品中或者从生物样品中分离出的和/或纯化出的生物材料中是否存在流感型病毒的方法和试剂盒。
本发明提供一种简单的、灵敏的和/或特异的诊断测试方法。通过使用本文所述的探针和/或引物、方法和/或试剂盒，使得测试的灵敏性和/或特异性比现有的检测方法高。所述测试可以通过悬浮阵列技术进行。选择性地，所述测试可以通过一步PCR方法或者两步PCR方法进行。
本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。尤其是，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸主要包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。更尤其是，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸由选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列所组成：SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：54所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括至少一个如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：37到SEQ ID NO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：45到SEQ ID NO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
因此，本发明提供一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQID NO：51和SEQ ID NO：52所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
本发明还提供一种用于确定甲型流感病毒的H5N1亚型在生物样品中的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供生物样品；
(b)使至少一种寡核苷酸与所述生物样品中的至少一种核酸接触，或者使所述寡核苷酸与从所述生物样品中提取的、纯化的和/或扩增的至少一种核酸接触，其中，所述寡核苷酸包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列；和
(c)对由步骤(b)的接触所获得的任何结合进行检测，检测到该结合则表明存在有甲型流感病毒的H5N1亚型。
所述寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：54所组成的组中的至少一个核苷酸序列。步骤(c)中的检测可以包括对未结合的寡核苷酸与结合到核酸上的寡核苷酸进行区分。
所述寡核苷酸可以固定到如微珠在内的颗粒上。所述寡核苷酸可以为探针，并且所述方法包括：
(i)提供生物样品；
(ii)使用至少一种报告标记对所述生物样品中的至少一种核酸或者从所述生物样品中提取的、纯化的或扩增的至少一种核酸进行标记；
(iii)将至少一种探针固定到含有至少一种荧光染料的至少一种微珠上；
(iv)使所述至少一种探针与所述至少一种核酸进行接触以使该探针与核酸结合；
(v)根据用第一激光并基于至少一种荧光染料的荧光强度来识别微珠；并且使用第二激光并基于报告标记，对核酸与探针的结合进行检测，所述探针固定在识别出的微珠上；检测到该核酸与探针的结合则表明存在有甲型流感病毒的H5N1亚型。
所述至少一种颗粒(如，微珠)可以包括至少两种荧光染料。所述至少两种荧光染料能够基于所述至少两种荧光染料的荧光强度使一种微珠与另一种微珠区别开。步骤(ii)中对至少一种核酸进行标记可以在步骤(iv)中的接触之后进行，步骤(c)中的检测可以通过使用悬浮阵列技术而进行。
根据本发明的一个方面，步骤(b)中的接触可以包括形成引物对的至少两种寡核苷酸与所述核酸进行接触，并且步骤(c)中的检测是通过聚合酶链式反应进行的。尤其是，所述检测可以通过确定由聚合酶链式反应所获得的至少一种扩增子的分子量来实现。更尤其是，所述检测可以通过使至少一种探针与由聚合酶链式反应所获得的至少一种扩增子进行结合来实现。
所述引物对能够与所述核酸进行结合，并且能够扩增包括SEQ ID NO：6序列的至少一种扩增子。所述引物对可以包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，所述正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：25，所述反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：26。尤其是，所述正向引物可以包括SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列，所述反向引物可以包括由SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
所述引物对能够与所述核酸进行结合，并且能够扩增包括SEQ ID NO：7序列的至少一种扩增子。所述引物对可以包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，所述正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：18，所述反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：19。尤其是，所述正向引物可以包括选自由SEQ IDNO：37到SEQ ID NO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列，所述反向引物可以包括选自由SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列。包括选自由SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的所组成的组中的至少一个核苷酸序列的探针可以与扩增子结合。
所述引物对能够与所述核酸进行结合，并且能够扩增NA-300基因的SEQ ID NO：7序列的至少一部分。所述引物对可以包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，所述正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：8，所述反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：9。尤其是，所述反向引物可以包括选自由SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所组成的组中的至少一个核苷酸序列。包括SEQ ID NO：60的探针可以与扩增子结合。
在聚合酶链式反应后可以进行电泳，以对扩增子进行检测和/或纯化。
根据本发明的方法，步骤(b)中的接触和/或步骤(c)中的结合的时间和条件足以使寡核苷酸(如探针)与核酸之间发生特异性的接触或特异性的结合。
所述生物样品可以源自疑为被乙型流感病毒(influenza B virus)所感染的人类或者非人类动物。所述寡核苷酸可以被标记。所述核酸可以被标记。
本发明还提供一种用于检测乙型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。尤其是，所述寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：54所组成的组中的至少一个核苷酸序列。至少一种寡核苷酸可以被标记。使用悬浮阵列技术的用于检测的试剂盒可以包括至少一种微珠、至少一种荧光染料、和/或至少一种报告标记。
附图说明
图1为凝胶电泳图，该图证实了，与甲型流感的其它亚型相比，本发明的试剂盒2的引物与H5N1亚型的结合更具有特异性；泳道1是标记物；泳道2是H5N1(-1)A/鸡/越南/8/2004(高致病性禽流感)(HPAI)；泳道3是H5N3(-1)A燕鸥/澳大利亚/75/(低致病性禽流感)(LPAI)；泳道4是H7N3(-1)A/鸡/昆士兰州/1994(HPAI)；泳道5是H7N7(-1)A/鸭子/维多利亚/1976(LPAI)；用于扩增包括神经氨酸苷酶(NA)的SEQ ID NO：7的区域的引物可以为约300bp；而用于扩增包括血凝素(HA)的SEQ ID NO：10的区域的引物可以为约168bp；用于扩增包括血凝素(HA)的SEQ ID NO：1的区域的引物可以为约114bp；
图2显示了使用本发明的用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的引物的敏感性，每个加样样品中病毒拷贝数为每个反应500个拷贝到0.5个拷贝；泳道1是标记物；泳道2和3：每5μl含有500个病毒拷贝；泳道4和5：每5μl含有50个病毒拷贝；泳道6和7：每5μl含有5个病毒拷贝；泳道8和9：每5μl含有0.5个病毒拷贝；泳道10为含有不相关病毒的阴性对照；阳性DNA对照是由从相应的扩增子中单独克隆的DNA制备的；
图3为凝胶电泳图，该图证实了，与甲型流感的其它亚型相比，本发明的试剂盒3的引物与H5N1亚型的结合更具有特异性；泳道1是标记物；泳道2是H5N1(-1)A/鸡/越南/8/2004(HPAI)；泳道3是H5N3；用于扩增包括NA的SEQ ID NO：7的区域的引物可以为约300bp；而用于扩增包括HA的SEQ ID NO：1的区域的引物可以为约195bp。
具体实施方式
对本发明的说明书中所采用的一些术语在下文中进行定义是为了使本发明更加清楚。没有具体描述的本领域公知的普通分子生物学方法和技术可以在教科书如《分子克隆：实验手册》第三版的1-3卷中找到，该书由Sambrook等编写，由冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约)在2001年出版(Sambrook et al.(ed.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)。这本书还可以作为网上参考书从http://www.molecularcloning.com/获得。
定义
核苷酸：包括但不限于具有与糖连接的碱基的单体，如嘧啶、嘌呤或它们的合成类似物；或者具有与氨基酸连接的碱基的单体，如位于肽核酸(PNA)中的单体。核苷酸是多聚核苷酸中的一种单体。核苷酸序列是指在多聚核苷酸中碱基的序列。
多聚核苷酸：任何长度的核酸序列(如线性序列)。多聚核苷酸包括寡核苷酸，还包括在染色体中发现的序列。“寡核苷酸”为通过天然的磷酸二酯键结合的多个结合的核苷酸。寡核苷酸类似物是指具有与寡核苷酸相似的功能但含有非天然存在的部分的物质。例如，所述寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，如改变的糖部分或相互连接的糖，如，硫代磷酸寡脱氧核苷酸。天然存在的多聚核苷酸的功能类似物可以与RNA或者DNA结合，并且可以包括肽核酸(PNA)分子。多聚核苷酸也被称为多聚核酸，这两个术语可以相互交换使用。短语“多聚核酸”是指RNA或DNA，以及与RNA或DNA相应的或互补的mRNA和cDNA。根据本发明，术语“多聚核苷酸”还包括肽核酸(PNA)。术语“基因”包括多聚核酸的有义链和反义链，所述多聚核酸能够编码肽、前肽、蛋白质或标记，或者是指含有多聚核酸的载体或质粒，尽管通常只给出有义链。多聚核苷酸的片段是长度缩短了的多聚核苷酸。
核苷酸序列的不确定性(ambiguity)：随着时间的推移，在核苷酸序列中少数核苷酸可以改变或变异。通过这种改变或变异，原始的核苷酸被另一个核苷酸置换或取代，尤其是一种嘌呤被另一种嘌呤取代，一种嘧啶被另一种嘧啶取代。然而，嘌呤也可以是嘧啶的取代基，反之亦然。核苷酸的位置是不确定的，其位置可以由一种或多种核苷酸、标准符号或者字母表示，这是本领域技术人员所公知的，本申请的序列表就采用这种方法。这些符号或字母(上文或下文中的)是国际纯粹和应用化学联合会所提议的(IUPAC；Cornish-Bowden(1985)Nucl.Acids Res.13：3021-3030)，它也是对应于WIPO标准ST.25附录2表1，这些符号或字母表示如下：
IUPAC核苷酸模糊编码(nucleotide ambiguity codes)
符号 含义 核酸
--------------------------------------------------
A A 腺嘌呤
C C 胞嘧啶
G G 鸟嘌呤
T T 胸腺嘧啶
U U 尿嘧啶
M A或C
R A或G
W A或T
S C或G
Y C或T
K G或T
V A或C或G
H A或C或T
D A或G或T
B C或G或T
X G或A或T或C
N G或A或T或C
引物：短核酸，如，两种或两种以上的核苷酸的DNA寡核苷酸或者具有更长的长度的DNA寡核苷酸，如具有6，98或者10个核苷酸的长度，所述短核酸与互补的靶DNA链一起退火通过核酸杂交形成引物与靶DNA链的杂交体，然后通过DNA聚合酶沿着靶DNA链进行延伸。可以使用引物对使核酸序列进行扩增，例如，使用聚合酶链式反应(PCR)或者本领域公知的其它的核酸扩增方法。
本文中使用的探针和/或引物可以包括，例如至少具有10个核苷酸的用于编码特定蛋白的核酸序列。然而，探针和/或引物也可以小于10个核苷酸。
多聚核苷酸、多聚核酸、探针和/或引物具有一定的序列。已经列出了本发明感兴趣的序列。当多聚核苷酸、多聚核酸、探针或引物具有相同的序列时，两种长度的多聚核苷酸、多聚核酸、探针或引物可以认为拥有相同的序列。然而，根据本发明，如果探针或引物能结合到两种序列上，则这两种序列也被称为是相同的。
当提及探针和/或引物时，术语“特异性的”(对靶序列)是指在严格的条件下，探针和/或引物实质上只能够与给定的含有靶序列的样品中的靶序列进行杂交。
杂交：在该过程中，寡核苷酸和/或它们的类似物通过氢键在互补的碱基之间结合，所述氢键包括沃森-克里克(Watson-Crick)氢键、霍氏(Hoogsteen)氢键或者反Hoogsteen氢键。通常核酸由含氮的碱基组成，所述碱基为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或者嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮的碱基形成由嘧啶与嘌呤组成的氢键，并且密啶与嘌呤形成的键被称为“碱基对”。更尤其是，A与T或U结合，G与C结合。“互补”是指两种不同的核酸序列之间或者同一核酸序列两个不同区域之间的存在的配对的碱基。
“特异性杂交”和“特异性互补”为表示充分互补的术语，所述充分是指在寡核苷酸(或它的类似物)与靶DNA或者RNA之间能够形成稳定的特异性的结合的程度。寡核苷酸或者寡核苷酸的类似物与其特异性杂交的靶序列不需要100％地互补。当寡核苷酸或其类似物与靶DNA或者RNA分子的结合干扰了靶DNA或者RNA的正常功能，则寡核苷酸或其类似物就是特异性杂交，并且互补的程度足以避免寡核苷酸或其类似物与非靶序列在需要特异性结合的情况下进行非特异性结合，例如，所述需要特异性结合的情况为在生理情况下进行体内分析的情况。这种结合被称为“特异性杂交”。杂交条件所导致的特异性的严格程度，取决于所选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是钠离子浓度)决定了杂交的严格性。
本领域的技术人员将能理解，根据上下文，术语“结合”、“使杂交”、“杂交”或者可以相互替换而不会导致歧义。
因此，至少一种本发明的引物和/或探针可以用于特异性地与甲型流感病毒的核酸进行杂交。尤其是，至少一种本发明的引物和/或探针可以用于与甲型流感病毒的H5N1亚型的核酸、RNA或者DNA进行特异性地杂交，而不与甲型流感病毒的其它亚型的核酸或者其它病毒的核酸进行交叉杂交。因此，引物或探针主要是由核苷酸序列组成，如果还有其它的序列和附加的核苷酸，则，所述其它的序列和附加的核苷酸在根据本发明的诊断分析所选择的条件下不能减弱引物和/或探针与H5N1病毒核酸的特异性结合能力。
体外扩增：能够增加样品中或标本中的核酸分子的拷贝数的技术。扩增的实例是聚合酶链式反应，在该技术中，将从研究对象中收集的生物样品与一对寡核苷酸引物(引物对)进行接触，所述接触的条件是使引物与样品中的核酸模板进行杂交。引物对可以定义为包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物。引物对中的每一种引物分别与待扩增的DNA模板序列的(有义或反义)链进行杂交。引物在合适的条件延长，并从模板解离，然后再一次进行退火、延长、解离以扩增核酸的拷贝数。体外扩增的产物的特性可以通过电泳、限制性内切酶的剪切方式、寡核苷酸杂交或寡核苷酸的连接和/或核酸测序等标准的技术进行测定。
扩增子：体外核酸扩增过程的产物被称为扩增子。扩增子的长度由上游引物和下游引物的起始位置决定，相对于核苷酸位置的固定的位置参数，通常是相对于待扩增序列的上游(有义链或者编码链)链。例如，相对于有义链或者编码链，理论的20-bp的正向引物起始于位置100，结束于位置120，20-bp的反向引物起始于位置10000，结束于位置980(相对于有义链或者编码链)。所述引物对将扩增从位置100到位置1000的900-bp的扩增子。所述扩增子包括上游引物和下游引物。扩增子的长度还可以证实本发明的引物序列的成功的杂交。
限制性位点：限制性位点是限制性内切酶特异性地识别和切割特定的核酸序列的位点。内部限制性位点是位于感兴趣的特异性的核酸序列中的限制性位点。
标记：使被施用了、粘附了、偶合了、杂交了或键合了所述标记的任何分子、表面或材料通过该标记而能够被检测出的化学物质、成分或者分子。标记的实例包括染料、辐射性标记、荧光标记、磁性标记和酶标记。标记可以用于指示被施用了、粘附了、偶合了、杂交了或键合了标记的分子、表面或材料的存在。这种标记还可以被称为报告标记或报告分子。生物样品：来自于人、动物或者植物的任何组织或组织液的样品。
描述
本发明提供了用于确定在生物样品中或者从生物样品中分离的和/或纯化的生物材料中存在有甲型流感类型的病毒或亚型的病毒的寡核苷酸、方法和试剂盒。
本发明提供了用于确定在生物样品中是否存在甲型流感病毒和/或亚型病毒的方法。该方法首先可以确定通常存在于甲型流感亚型中的基因序列的存在和/或一种或多种存在于具体的亚型中的基因序列的存在。
本发明的方法通过使用甲型流感病毒中作为识别序列的核酸序列或寡核苷酸提供了一种灵敏的检测方法。所述检测可以通过如聚合酶链式反应(PCR)和/或悬浮阵列技术来实现。然而，也可以使用任何其它合适的检测技术。
寡核苷酸
本发明提供了用于检测流感病毒的用作探针和/或引物的寡核苷酸。本发明设计的探针/或引物能够识别甲型流感病毒及其H5N1亚型中的序列，并且在所述甲型流感病毒及其H5N1亚型中的序列可以包括在特定位点的单个碱基的突变。
本发明的探针或引物的长度可以为9-50个核苷酸。尤其是，长度为12-30个核苷酸。更尤其是，长度为15-25个核苷酸。本发明所使用的探针和引物如下文所述。
例如，本发明的方法和试剂盒可以利用设计的位于H5N1的HA片段4附近的高致病性区域的特定的寡核苷酸。
根据本发明，至少一种引物对能够检测存在于所有甲型流感病毒株中的保守M基因(编码基质蛋白)，该基因可以用于确定甲型流感病毒。并且，至少一个引物对能够检测血凝素(HA)片段或者H5N1株的区域。使用这种特异的组合，这些引物对产生信号琼脂凝胶模式，该琼脂凝胶模式用作用于确定正确的甲型流感病毒的H5N1亚型的内部确定和外部确定的结合。
甲型流感病毒编码8个开放阅读框(ORFs)，包括PB1(片段1)、PB2(片段2)、PA(片段3)、HA(片段4)、NP(片段5)、NA(片段6)、M(片段7)和NS(片段8)。
在本发明中，SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和/或SEQID NO：19针对所述病毒的HA区域。
本领域的技术人员应当理解的是：所述探针或引物还可以包括至少一种标记。
本发明提供的寡核苷酸(例如，探针和/或引物)和核酸是被适当的标记和/或报告分子所标记的。象这样，对于所选择的检测方法，所述探针还可以包括其它分子以检测杂交的探针和靶序列。例如，这些分子可以为生物素、抗生物素蛋白(avidin)和/或链霉素抗生物素蛋白(strepta-avidin)。这些分子可以使标记或报告分子能够识别感兴趣的核苷酸序列，或者使标记或报告分子能够与感兴趣的核苷酸序列进行结合。
因此，本发明提供了一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。尤其是，本发明提供了一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸主要包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。更尤其是，本发明提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸由选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列所组成：SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列。所述分离的寡核苷酸可以包括选自由SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：60所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
根据具体的实施方式，提供了通过PCR分析能够对甲型流感病毒的H5N1亚型进行特异地检测的一个或多个引物对。尤其是，通过一步RT-PCR分析。尤其是，提供了通过一步RT-PCR分析能够对甲型流感病毒的H5N1亚型进行特异地检测的一个或多个引物对。例如，本发明的方法和试剂盒可以利用设计位于H5N1的HA片段4附近的高致病性区域的特定引物对。尤其是，探针、引物或引物对可以包括至少一种能够与SEQ ID NO：1或它的片段杂交或互补的核苷酸序列。
SEQ ID NO：1或它的片段可以包括能够被限制性内切酶消化的内部确认位点。可以使用任何合适的限制性内切酶。例如，限制性内切酶为Mob II。然而，对于本领域的技术人员来说，使用其它限制性内切酶也是显而易见的。位于检测区域中的限制性内切酶的酶切位点可以提高确定的水平，这将确保生物样品中的或者从生物样品中提取、纯化和/或扩增的能够与SEQ ID NO：1杂交的任何核酸序列确实来自于甲型流感病毒的H5N1亚型的高致病性区域。这降低了由与相似的甲型流感亚型而引起的假阳性结果的几率。位于检测区域的任何合适的限制性内切酶的酶切位点都能够提供用于确认H5N1亚型的内部确认信息。
本发明的方法能够灵敏地并特异性地对甲型流感病毒的H5N1亚型的HA片段4的高致病性区域进行检测。如果检测针对于高致病性区域并且高致病性区域的序列发生突变，那么，很可能病原体的毒性也发生了改变。甲型流感病毒的H5N1亚型的HA片段4(SEQ ID NO：1)的高致病性区域似乎对H5N1亚型是独特的。HA片段可以使N5N1亚型区别于含有H5N3或H5N2亚型的甲型流感的其它亚型。因此，HA片段或者区域可以用作亚型的检测区域。
位于检测区域中的限制性内切酶的酶切位点能够提高确定的水平，这将确保生物样品中的或者从生物样品中提取、纯化和/或扩增的与SEQ ID NO：1杂交的任何核酸序列确实来自于甲型流感病毒的H5N1亚型的HA片段4的高致病性区域。这降低了由相似的甲型流感亚型引起的假阳性结果的几率。位于检测区域的任何合适的限制性内切酶的酶切位点都能够提供用于确认H5N1亚型的内部确认信息。
根据本发明，还提供了包括如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的引物。
还提供了包括如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的引物。
本发明的引物对可以包括如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。尤其是，如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对能够扩增SEQ ID NO：6。
本发明的探针可以是包括能够与如SEQ ID NO：1所示的序列或它的片段杂交或者互补的核苷酸序列的探针。
所述引物对可以包括如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。尤其是，如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对、或如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的引物对能够扩增与包括如SEQ ID NO：1所示的序列或其片段杂交或者互补的序列。
所述方法进一步包括通过以下方法检测H5N1的NA片段6：使另一种能够与SEQ ID NO：7(例如，与SEQ ID NO：7的至少15个核苷酸的部分)的部分特异性杂交的核酸探针或引物与生物样品中的核酸序列接触，或者使另一种核酸探针或引物与从生物样品中提取、纯化或扩增的核酸接触，接触的时间和条件使接触足以发生特异性杂交。尤其是，杂交一段时间使探针或引物与核酸或生物样品之间足以出现特异性杂交，或者其中另一种探针或引物是由与SEQ ID NO：7的一部分互补的核苷酸序列所组成的。尤其是，本发明的另一种引物可以包括如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。所述另一种的引物对可以包括如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。尤其是，如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所述的另一种引物对能够扩增SEQ ID NO：7。在一个优选的实施方式中，所述另一种探针包括如SEQ ID NO：7所述的至少15个核苷酸的部分。更尤其是，如SEQ ID NO：8所示的正向引物，如SEQ ID NO51或者SEQ ID NO：52所示的反向引物，能够扩增SEQ ID NO：7，并且包括如SEQ ID NO：60所示的序列的探针能够与所述扩增子结合。
检测到甲型流感病毒的H5N1亚型的神经氨酸苷酶(NA)片段6能够提供进一步的确认，以确认存在于生物样品中的或者从生物样品中提取、纯化或扩增的核酸中的与甲型流感病毒的H5N1亚型的血凝素(HA)片段4的高致病性区域的SEQ ID NO 1杂交的确实为甲型流感病毒的H5N1亚型。这进一步降低了假阳性的几率。在样品中检测到存在有SEQ ID NO：7，则提供了外在的确认信息。
根据另一方面，还提供了一种用于确定在生物样品中是否存在有甲型流感病毒或者它的亚型的方法，该方法包括以下步骤：提供生物样品；使至少一种核酸探针、引物或引物对与生物样品接触，或者使探针、引物或引物对与从生物样品中提取的、纯化的和/或扩增的核酸接触，其中，所述探针、引物或引物对与SEQ ID NO：10的部分(例如，SEQ ID NO：10的至少15个核苷酸的部分)或它片段杂交；对接触步骤的杂交结果进行检测，其中，当检测到所述探针、引物或引物对与样品或者从所述生物样品提取的、纯化的或扩增的核酸之间的杂交时，则确定在生物样品中存在有甲型流感病毒或者它的亚型的基质片段。在一个优选的实施方式中，所述方法进一步包括对所有甲型流感病毒的亚型的基质片段进行检测，这是通过使另一种能够与SEQID NO：10的部分(SEQ ID NO：10的至少15个核苷酸的部分)特异性杂交的核酸探针、引物或引物对与生物样品接触一段时间，或者与从生物样品提取的、纯化的或扩增的核酸接触，接触的时间和条件足以使另一种探针或引物与核酸或生物样品之间出现特异性地杂交，或者其中另一种探针、引物或引物对由与SEQ ID NO：10的一部分互补的核苷酸序列所组成。
检测到在甲型流感病毒的所有亚型中均是保守的并且是特异性的基质片段7，则进一步确认了阳性结果真正来自甲型流感病毒，所述阳性结果是从与血凝素(HA)片段4的高致病性区域的SEQ ID NO 1或者神经氨酸苷酶(NA)片段6的SEQ ID NO：7杂交的生物样品中或者从生物样品中提取的、纯化的和/或扩增的核酸中检测到的。这进一步降低了假阳性的几率。在样品中检测到存在有SEQ ID NO：10，则提供了外在的确认信息。
所述引物包括如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。其它的引物对包括如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。尤其是，如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的其它的引物对能够扩增SEQ ID NO：10。根据另一方面，所述探针包括如SEQ ID NO：10所示的15个核苷酸的部分。
根据另一方面，所述方法进一步包括：检测H5N2的NA片段6，这是通过使另一种能与SEQ ID NO：13(例如，SEQ ID NO：13的至少15个核苷酸的一部分)的一部分特异性地杂交的核苷酸探针、引物或引物对与核酸样品接触，或者与从生物样品中提取的、纯化的和/或扩增的核酸接触，接触的时间和条件足以使另一种探针或引物和核酸或样品之间出现特异性的杂交，或者另一种探针、引物或引物对包括与SEQ ID NO：13的一部分互补的核苷酸序列。
检测到甲型流感病毒的H5N2亚型的神经氨酸苷酶(NA)片段6，则提供了阴性确认，即，在生物样品中或者从生物样品中提取、纯化或扩增的核酸中不存在H5N1亚型。所述样品与甲型流感病毒的H5N2亚型的神经氨酸苷酶(NA)片段6的SEQ ID NO 13杂交，而不与N5H1的SEQ ID No 1或7杂交。这进一步降低了假阳性的几率。在样品中检测到存在有SEQ ID NO：13，则提供了阴性的外在确认信息。
所述的另一种引物可以包括如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。尤其是，所述另一种引物对包括如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。所述另一种如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的引物对能够扩增SEQ ID NO：13。根据另一方面，所述另一种探针包括如SEQ ID NO：13所述的15个核苷酸的部分。
根据另一方面，所述使用一种或者多种探针、引物或引物对是否存在甲型流感病毒的H5N1亚型进行的检测，是通过色谱法分析实现的，所述一种或者多种探针、引物或引物对选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8和9或者它们的互补序列所组成的组中。
本发明提供一种简单的、灵敏的和/或特异的诊断测试。通过使用本文描述的探针和/或引物，使所述方法和/或试剂盒比现有技术的检测方法更加灵敏且特异性更高。这种测试可以通过悬浮阵列技术来实现。或者，这种测试可以通过一步PCR方法或者两步PCR来实现。也可以使用任何其它适合的技术。
因此，在一个实施方式中，本发明的H5N1的检测方法和试剂盒通常是使用对M基因和甲型流感病毒基因组的H5N1亚型的HA基因和NA基因的高致病性区域具有特异性的一组探针，来检测所述病毒的存在。
所述方法可以通过使用一种或者多种能够识别甲型流感病毒的M基因并能够与甲型流感病毒的M基因杂交的探针，来检测病毒核酸序列的存在。可以使用其它的探针来识别位于核苷酸999到核苷酸1091的HA基因并与位于核苷酸999到核苷酸1091的HA基因杂交，或者使用一种或者多种探针来识别位于核苷酸943到核苷酸1114的HA基因的区域以及NA基因并与位于核苷酸943到核苷酸1114的HA基因的区域以及NA基因杂交。
使用悬浮阵列技术的检测
根据本发明，在使用悬浮阵列技术进行检测之前，可以通过例如PCR任意地对样品核酸进行扩增。当使用悬浮阵列技术时，一种或者多种本发明的序列被结合到支持物上(如颗粒或者微珠)。根据一种实施方式，每一种探针被用于标记一种独特的微珠，当用特定波长的光激发时，该微珠可以通过由两种染料的特定比例而产生独特的荧光信号来确认。与来自样品的核酸结合的或杂交的微珠通过分类或者与没有与核酸结合的或杂交的微珠分离开而进行区分。然后，使用第一激光并基于两种染料发出特定强度的荧光来识别与核酸结合的或杂交的微珠。第二激光通过使结合到探针或者核酸上的标记发出荧光，来定量与来自样品的核酸结合的或杂交的探针的量。
悬浮阵列技术的实例在以下专利中有描述：Luminex公司的美国专利US 6,939,720、US 6,916,661、US 6,939,720或者US 6,514,295(其全部内容并入本文作为参考)。
根据该项技术，在包括多达100组的5.6微米的微珠的液体悬浮阵列中，每一个微珠用不同比例的在光谱上可以区分的两种荧光进行染色以使100组的微珠相互区别。每一组微珠可以与不同的捕获分子如本发明的探针相结合。然后，将结合的微珠与样品在微量培养板的孔中混合，并孵育以使样品中的核酸(例如，样品中纯化的RNA，从样品中转化的cDNA或者由PCR扩增的DNA扩增子)与结合到微珠上的探针杂交。未结合的核酸可以通过例如离心进行分离。例如，样品中的核酸还可以使用生物素进行预标记。生物素标记可以结合到另一种荧光报告分子上，如链霉素抗生物素蛋白-藻红蛋白(streptavidin-phycoerythrin)。
在对荧光标记的报告分子进行孵育之后，将微量培养板的每个微孔中的内含物吸出，并用流式细胞仪进行分析，其中，微珠排列成一队经过流动的细胞。用两种激光分别激发微珠。第一种(红色)分类激光激发每一个微珠中的染料以发出荧光信号，通过荧光信号的强度来确定每一个微珠的光谱地址或者身份。第二种(绿色)报告激光激发与微珠或者样品结合的报告分子，从而确定捕获的样品核酸的量。然后，对基于每一个微珠的荧光信号进行同步记录，并将信号转为用于微珠的分析的数据。这种分析还能区分捕获样品核酸的微珠和没有捕获样品核酸的微珠。
因此，本发明通过悬浮这列技术提供了对寡核苷酸与样品和/或核酸的结合进行检测的方法。所述悬浮阵列技术可以包括以下步骤：
(a)提供生物样品；
(b)使至少一种寡核苷酸与所述生物样品中的至少一种核酸接触，或者，使所述寡核苷酸与从生物样品中提取的、纯化的和/或扩增的至少一种核酸接触，其中所述寡核苷酸包括选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体和它们的互补序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列；和
(c)对由步骤(b)的接触所产生的结合进行检测，如果检测到该结合，则存在有甲型流感病毒的H5NA亚型。
因此，本发明的方法可以包括：
(i)提供生物样品；
(ii)使用至少一种报告标记对生物样品中的至少一种核酸或者从生物样品中提取的、纯化的或扩增的至少一种核酸进行标记；
(iii)将至少一种探针固定到含有至少一种荧光染料的至少一种微珠上；
(iv)使所述至少一种探针与所述至少一种核酸进行接触以使所述探针与核酸结合；
(v)根据用第一激光并基于至少一种荧光染料的荧光强度来识别微珠，并且使用第二激光并基于报告基因，对核酸与探针的结合进行检测，所述探针固定在识别出的微珠上；检测到该核酸与探针的结合则表明存在有甲型流感病毒的H5N1亚型。
本发明的方法可以包括通过扩增步骤来检测结合或杂交。例如，所述方法可以包括使用一种或多种探针或引物或引物对，进行聚合酶链式反应(PCR)形式的检测手段。
使用聚合酶链式反应的检测
本领域的技术人员将能理解本发明的探针也可以用作PCR检测的引物，因为它们能够区分一段可以被扩增的核酸。因此，根据上下文或者使用检测方法，术语引物和探针可以相互交换引用。本发明中使用的实时PCR检测可以通过使用PCR平台如Roche公司的LightCyclerTM、Stratagene公司的实时PCR系统、the Applied Biosystems公司的ABI 7000实时PCR分析仪或者其它的合适的检测平台进行实施。
例如，所述方法可以通过PCR并使用对乙型流感病毒基因组(例如，基质基因)的区域具有选择性的正向引物和反向引物的引物对，使存在于样品中的核酸进行扩增以获得扩增产物或扩增子。然后可以对任何的结合、杂交和/或杂交的产物进行检测。例如，扩增产物可以通过用于确定扩增产物的核苷酸的长度的色谱法或凝胶电泳法进行检测，例如，可以通过在2％或3％的琼脂糖中与具有合适分辨率的分子量标记同时进行电泳。具有核苷酸长度的扩增产物的存在表明样品中存在有乙型流感病毒的基质核酸，所述核苷酸长度为正向引物的长度、反向引物的长度和正向引物与反向引物之间的长度的总和。
选择性地，产物可以通过PCR使用杂交探针来进行检测，例如，使用实时荧光检测，如TaqmanTM系统(Applied Biosystems，Foster City，California)，其中，当探针结合到或者杂交到靶序列上并通过聚合酶进行延长时，结合到探针上的荧光标记被释放。因此，释放的标记的量给出了存在于样品中的靶序列的量的信息。
当使用PCR方法检测杂交时，杂交探针可以包括与扩增产物的一部分核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述扩增产物是将通过所选择的扩增引物和以乙型流感病毒基因组核酸作为模板而获得的。
如果在PCR中使用，本发明的一对序列可以用作针对于乙型流感病毒序列的一段的正向(上游)引物和反向(下游)引物。然后，通过PCR方法，这些引物使所述乙型流感病毒序列的一段进行扩增。然后，所获得的扩增子可以通过凝胶电泳根据扩增子的大小(长度或分子量)进行鉴别，和/或者通过结合到扩增子的探针进行鉴别。
根据本发明，所述至少一种寡核苷酸可以是形成引物对的两种寡核苷酸，并且步骤(c)中的检测可以通过聚合酶链式反应来实现。
作为一个实例，为了检测甲型流感病毒的H5N1亚型的存在，可以对HA-114扩增子进行扩增。所述引物对可以与核酸结合并扩增包括如SEQ IDNO：6所示的至少一个序列的扩增子。所述引物对可以包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，所述正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：25，所述反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：26。尤其是，所述正向引物可以至少包括如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列并且所述反向引物可以包括选自由SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
作为另一个实例，可以对HA-195扩增子进行扩增。所述引物对可以与核酸结合并扩增包括如SEQ ID NO：7所示序列的至少一种扩增子。所述引物对可以包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，所述正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：18，所述反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：19。尤其是，所述正向引物可以包括选自由SEQ ID NO：37到SEQ ID NO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列，并且所述反向引物可以包括选自由SEQ IDNO：45和SEQ ID NO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列。包括选自由SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所组成的组中的至少一个核苷酸序列的探针可以与所述扩增子结合。
所述检测步骤可以通过对由聚合酶链式反应所释放的至少一种标记进行检测，并确定由聚合酶链式反应所获得的至少一种扩增子的分子量来实现，和/或者所述检测可以通过对至少一种探针与至少一种扩增子的结合进行检测实现。在聚合酶链式反应结束后，可以进行电泳。
对于通过PCR的检测，步骤(b)中的接触、和/或步骤(c)中的结合、和/或探针与扩增子结合的时间和条件足以使寡核苷酸与样品、核酸和/或与扩增子相对应的探针之间发生特异性的接触或特异性的结合。
所述生物样品可以来自疑为被甲型流感病毒的H5N1亚型所感染的人类或者非人类动物。而且，所述寡核苷酸和/或样品或者核酸可以被标记。
试剂盒
本发明还一般性地涉及一种用于确定在生物样品中或者从生物样品中分离的和/或纯化的生物材料中存在有流感病毒的试剂盒。
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括选自由SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和它们的片段所组成的组中的至少一个核苷酸。
尤其是，所述试剂盒可以用于检测是否存在有甲型流感病毒。更尤其是，所述试剂盒可以用于检测是否存在有甲型流感病毒的H5N1亚型。所述试剂盒可以用于生物样品，所述样品可以来源于被甲型流感病毒的H5N1亚型所感染的人类或动物。
所述试剂盒可以进一步包括关于试剂盒使用的信息。例如，可以是由厂商提供的示例性说明的信息。尤其是，本发明提供了操作简单的RT-PCR检测试剂盒。这种试剂盒包括一种或多种本发明的引物和/或探针，例如，所述试剂盒可以包括由一种或多种多核苷酸所组成的引物，该多核苷酸包括以下核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和/或它们的片段。通过悬浮阵列技术进行检测的试剂盒可以包括至少一种微珠、至少一种荧光染料、至少一种报告标记和/或至少一种探针。
本发明的试剂盒可以任选地包括阳性对照核酸，例如包括甲型流感病毒的H5N1亚型的HA、NA和/或M区域的核酸或至少它们的一部分，以及RNA或DNA。
本领域的技术人员能够理解到：所述探针和/或引物可以进一步包括一种标记。所述标记可以是使被施用了、粘附了、偶合了、杂交了或键合了所述标记的任何分子、表面或材料通过该标记而能够被检测出的化学物质、成分或者分子。标记的实例包括染料、辐射性标记、荧光标记、磁性标记和酶标记。
此外，所述探针还可以包括用于所选的用以检测杂交的探针和靶序列的检测方法的其它分子。这些分子的实例可以是生物素、抗生物素蛋白和/或链霉素抗生物素蛋白。这些分子可以使标记或报告分子能够识别感兴趣的核苷酸序列，或者使标记或报告分子能够与感兴趣的核苷酸序列进行结合。
现在已对本发明做了一般的描述，通过参照下述的实施例将更加容易理解本发明，这些实施例的给出是为了说明的目的，而不是为了限制本发明。
实施例
实施例1：材料和方法
未具体描述的本领域的公知的标准的分子生物学技术在《分子克隆：实验手册》中具有描述，该书由Sambrook和Russel编写，由冷泉港实验室出版社(纽约)在2001年出版(Sambrook and Russel，，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(2001))。
标准
将储存的病毒用健康的志愿者的血清稀释10倍。用QIAGEN公司的病毒RNA试剂盒(QIAGEN GMbH，德国)提取RNA。
患者样品
从禽流感患者的血亲样品中分离病毒。使用Qiagen QIAamp的病毒RNA提取试剂盒(编号：52906)，按照产品用法说明直接提出RNA。
使用Qiagen RLT缓冲液，以本领域的技术人员公知的方式从感染的鸟体内提取RNA，所述Qiagen RLT缓冲液是含有胍和β-巯基乙醇的专利产品。
分离的样品包括：
H5N1(-1)A/鸡/越南/2004(HPAI)，
H5N3(-1)A燕鸥/澳大利亚/75/(LPAI)，
H7N3(-1)A/鸡/昆士兰州/1994(HPAI)和
H7N7(-1)A/鸭子/维多利亚/1976(LPAI)。
其它病毒
使用QIAGEN病毒RNA迷你型试剂盒(QIAGEN GMbH，德国)，按照产品的使用说明书从储存的病毒中直接提取RNA，所述储存的病毒从美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC；VA，美国)中获得。本领域的技术人员能理解到：从任何非流感病毒中分离出的RNA足以用作合适的阴性对照。
MRC-5细胞系
使用Qiagen RNA提取试剂盒(编号：74104)，从正常的二倍体人成纤维细胞系MRC-5(ATCC CCL171)中，直接提出总RNA，并且用分光光度计进行定量分析。
使用引物对的检测
从被认为含有甲型流感病毒的H5N1亚型的样品中提取RNA，使用公知的方法评价RNA。然后使用逆转录酶或者本领域公知的其它任何方法，将RNA转变为DNA。使用用于RT-PCR的第一链cDNA合成试剂盒(Roche公司销售，巴赛尔，瑞士，编号：1 483 188)以典型的方式将样品混合物转变为cDNA。
悬浮阵列
悬浮阵列仪和微珠来自Luminex公司，Alexa488荧光染料来自Invitrogen/Molecular Probes公司(Eugene，Oregon)。所使用的设备为Luminex公司的(Austin，Texas)的Luminex 100测试仪。
实施例2：通过悬浮阵列技术检测乙型流感病毒
探针
尽管本发明的下列探针设计为用于通过悬浮阵列技术检测甲型流感病毒，尤其是用于进一步检测H5N1亚型，但本领域的技术人员应该能理解到：下述序列还可以用于其它合适的用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的其它合适的检测方法，例如，原位杂交、核酸酶分析等。
用于M基因的探针
下述探针被设计为用于检测所有甲型流感病毒的普通探针，所述检测通过识别和/或鉴定M基因(基质基因片段7)的核苷酸28到171的一部分来进行。
MP-168(上游)
`5’-GAGNCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’(SEQ ID NO：23)
N＝A、T、C或G
尤其是，该序列为：
5’-GAGYCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’(SEQ ID NO：21)
Y＝C/T
因此，对于MP-168(上游)特定的变体为：
5’-GAGCCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’(SEQ ID NO：30)
5’-GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’(SEQ ID NO：31)
MP-168(下游)
5’-TTAGTCAGAGGTGACAGNATTGGTC-3’(SEQ ID NO：24)
N＝A、T、C或G
尤其是，该序列为：
5’-TTAGTCAGAGGTGACAGRATTGGTC-3’(SEQ ID NO：22)
R＝A/G
因此，对于MP-168(上游)特定的变体为：
5’-TTAGTCAGAGGTGACAGAATTGGTC-3’(SEQ ID NO：32)
5’-TTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC-3’(SEQ ID NO：33)
MP-168(探针)
5’-GCTTTGAGGGGGCCTGANGGN-3’(SEQ ID NO：53).
N＝A、T、C或G
尤其是，序列为：
5’-GCTTTGAGGGGGCCTGAYGGR-3’(SEQ ID NO：54)
Y＝C/T，
R＝A/G
因此，对于MP-168探针特定的变体为：
5’-GCTTTGAGGGGGCCTGACGGA-3’(SEQ ID NO：56)
5’-GCTTTGAGGGGGCCTGATGGA-3’(SEQ ID NO：57)
5’-GCTTTGAGGGGGCCTGACGGG-3’(SEQ ID NO：58)
5’-GCTTTGAGGGGGCCTGATGGG-3’(SEQ ID NO：59)
用于HA基因的探针
设计下述两种探针以检测甲型流感病毒的H5N1亚型的HA基因和片段4，所述检测通过对HA基因从核苷酸999到核苷酸1091的HA基因片段部分进行识别和/或鉴定：
HA-114(上游)
5′-CAAACANATTANTNCTTGCNACWG-3’(SEQ ID NO：25)
N＝A、T、C或G
尤其是，序列为：
5′-CAAACARATTARTYCTTGCDACWG-3′(SEQ ID NO：16)
R＝A/G
Y＝C/T
D＝A/G/T
W＝A/T
更尤其是，序列为：
5′-CAAACAGATTAGTYCTTGCGACTG-3′(SEQ ID NO：34)
HA-114(下游)
5’-CCTGCCATCCTCCNTCTATAAA-3’(SEQ ID NO：26)
N＝A、T、C或G
尤其是，序列为：
5′-CCTGCCATCCTCCYTCTATAAA-3′(SEQ ID NO：17)
Y＝C/T
因此，对于HA-114(下游)的特定的变体为：
5′-CCTGCCATCCTCCCTCTATAAA-3′(SEQ ID NO：35)
5′-CCTGCCATCCTCCTTCTATAAA-3′(SEQ ID NO：36)
设计下述探针，以通过对HA基因从核苷酸943到核苷酸1114的HA基因片段部分进行识别和/或鉴定，来对甲型流感病毒的H5N1亚型的HA基因和片段4进行检测：
HA-195(上游)
5′-GCCATTCCACAANATNCANCC-3′(SEQ ID NO：27)
N＝A、T、C或G
尤其是，序列为：
5′-GCCATTCCACAAYATMCAYCC-3′(SEQ ID NO：18)
Y＝C/T
M＝A/C
因此，对于HA-195(上游)的特定的变体为：
5′-GCCATTCCACAACATACACCC-3′(SEQ ID NO：37)
5′-GCCATTCCACAATATACACCC-3′(SEQ ID NO：38)
5′-GCCATTCCACAACATCCACCC-3′(SEQ ID NO：39)
5′-GCCATTCCACAATATCCACCC-3′(SEQ ID NO：40)
5′-GCCATTCCACAACATACATCC-3′(SEQ ID NO：41)
5′-GCCATTCCACAATATACATCC-3′(SEQ ID NO：42)
5′-GCCATTCCACAACATCCATCC-3′(SEQ ID NO：43)
5′-GCCATTCCACAATATCCATCC-3′(SEQ ID NO：44)
HA-195(下游)
5′-TANCCATACCAACCATCTANCATTT-3′(SEQ ID NO：28)
N＝A、T、C或G
尤其是，序列为：
5′-TAYCCATACCAACCATCTAYCATT-3′(SEQ ID NO：19)
Y＝C/T
因此，对于HA-195(下游)的特定的变体为：
5′-TACCCATACCAACCATCTACCATT-3′(SEQ ID NO：45)
5′-TACCCATACCAACCATCTATCATT-3′(SEQ ID NO：46)
5′-TATCCATACCAACCATCTACCATT-3′(SEQ ID NO：47)
5′-TATCCATACCAACCATCTATCATT-3′(SEQ ID NO：48)
HA-195(探针)
5’-GNCATTCCCCGATGGTGAGAGG-3’(SEQ ID NO：29)
N＝A、T、C或G
尤其是，序列为：
5’-GRCATTCCCCGATGGTGAGAGG-3’(SEQ ID NO：20)
R＝A/G
因此，对于HA-195(探针)的特定的变体为：
5’-GACATTCCCCGATGGTGAGAGG-3’(SEQ ID NO：49)
5’-GGCATTCCCCGATGGTGAGAGG-3’(SEQ ID NO：50)
用于H5N1的NA基因的探针
设计下述探针，以通过对NA基因从核苷酸528到核苷酸805的NA基因片段的300个碱基对部分进行识别和/或鉴定，来对甲型流感病毒的H5N1亚型的NA基因和片段6进行检测：
NA-300(上游)
5′-TGATGGCACCAGTTGGTTGAC-3′(SEQ ID NO：8).
NA-300(下游)
5′-GCATCAGGATAACAGGAGCAYTC-3′(SEQ ID NO：9)
Y＝C/T.
因此，对于NA-300(下游)引物的特定的变体为：
5′-GCATCAGGATAACAGGAGCACTC-3′(SEQ ID NO：51)
5′-GCATCAGGATAACAGGAGCATTC-3′(SEQ ID NO：52)
NA-300(探针)
5’-ACAGCCACAGCCCCATTGTCTG-3’(SEQ ID NO：60)
用于H5N2的NA基因组的作为阴性确认标志的探针
设计特异性的引物对，通过对NA基因从核苷酸440到核苷酸774的NA基因片段的361个碱基对部分进行扩增，来对甲型流感病毒的H5N2亚型的NA基因和片段6进行检测。本领域的技术人员应该理解为：扩增子的长度包括核苷酸位置的差值(774减440)加上反向引物的长度(27bp)，所得之和为扩增子的长度361。设计这种特异性的引物对，用作检测H5N2亚型-NA基因的特异性的确认。
针对NA基因的上游引物的起始于位点440。
5′-AATGAGTTGGGTGTTCCGTTTC-3′(SEQ ID NO：14)(22-mer)
对于NA基因的下游引物的终止位置为位置774。
5′-AACAGGAACATTCCTCTATATGCTGAG-3′(SEQ ID NO：15)(27-mer)
探针在微珠上的固定
探针通过微珠表面的羧基被固定到Luminex微珠上。固定后，将微珠混合，以形成多元的组。为了全面地筛选样品，在多元组中可以包括本发明的探针序列的所有组合。在多元组中还可以包括具有固定到其上的合适的控制序列的微珠。
样品
通过RT-PCR(方法如下述实施例3所述)对流感H5N1和H7N3亚型以及乙型流感病毒样品中的核酸进行扩增，使用它们的cDNA并且将估计拷贝数的cDNA与微珠混合以进行杂交。
杂交
然后，将样品与一组多元微珠接触，所述多元微珠分别含有大约相同丰度的HA-195探针变体(SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50)、大约相同丰度的MP-168探针变体(SEQ ID NO：56到SEQ ID NO：59)和NA-300探针(SEQ IDNO：60)。将所有的杂交，在37℃下的含有2.25mol/l的四甲基铵、0.75g/l的十二烷基磺酸钠、37.5mmol/l的Tris(pH为8.0)的杂交缓冲液中杂交1小时。杂交后，加入2μL的10g/L的链霉素抗生素-藻红蛋白，并在室温下孵育30分钟。
然后用200μL杂交缓冲液稀释混合物，并用Luminex 100系统设备进行分析，以检测并定量分析在样品中存在的靶核酸序列。
结果
悬浮阵列检测分析的结果列在表1和2中，以所述设备得到的荧光强度(检测结果没有单位)表示。对于两个表来说，选择强度为100作为任意的阀值取舍点。
在扩增步骤中使用的引物变体为：
甲型流感，NA 300，对H5N1亚型具有特异性(SEQ ID NO：8和SEQID NO：9)
甲型流感，HA 195，对H5N1亚型具有特异性(SEQ ID NO：37和SEQID NO：45)
甲型流感，基质168，对任何的甲型流感均具有特异性(SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33)
从两个表中可以看出，尽管存在高拷贝的非特异性核酸，但本发明的探针能够检测到低拷贝的H5N1核酸，这表明本发明的探针具有特异性。
表1
表2
实施例3：通过聚合酶链式反应检测H5N1和H5N2亚型
设计这些引物，以特异性地检测甲型流感病毒，并进一步特异性地检测H5N1和H5N2亚型。设计用于基于凝胶的RT-PCR的这些引物对。这意味着将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，扩增产物可以通过溴化乙啶染色来检测。本文中描述的所有引物都是根据NCBI流感病毒的序列数据库所提供的序列设计的。
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/influenza/list.cgi)
针对于所有的甲型流感亚型的M基因的引物对
设计的引物对为用于检测甲型流感的所有类型的引物对，该引物对可以扩增M基因(基质基因的片段7)从核苷酸28到核苷酸171的168个碱基对的部分。
A、上游引物
在本文中，正向引物也称为上游引物，它具有24-mer，能以M基因的位置28作为杂交起点，它的序列为：
SEQ ID NO：11：5′-GAGTCTTCTAACCGAGGT CGAAAC-3′。
B、下游引物
在本文中，反向引物也称为下游引物，它具有25-mer，能以M基因的位置171作为杂交终点，它的序列为：
SEQ ID NO：12：5′-TTAGTCAGAGGTGA CAGGATTGGTC-3′。
C、该引物对获得的扩增子
用该引物对获得的扩增子的序列为SEQ ID NO：10GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAA(168bp)。
针对于H5N1中的HA基因的引物对
设计另一对用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的HA基因的片段4的特异性引物对，该引物对可以扩增HA基因从核苷酸999到核苷酸1091的114个碱基对的部分。
A、上游引物
在本文中，正向引物也称为上游引物，它具有24-mer，能以HA基因的位置999作为杂交起点，它的序列为：
SEQ ID NO：2 5′-CAAACAGATTAGTCCTTGCGACTG-3′(24bp)。
B、下游引物
在本文中，反向引物也称为下游引物，它具有22-mer，能以HA基因的位置1091作为杂交终点，它的序列为：
SEQ ID NO：3 5′-CYTGCCATCCTCCCTCTATAAA-3′(22bp)。在这种情况下，Y可以是C或T。
C、该引物对获得的扩增子
该引物对获得的扩增子的序列为SEQ ID NO：6CAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCARG(114bp)。
扩增的区域包括SEQ ID NO：15’-AGAAGAAGAAAAAAG-3’的高致病性区域序列。SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：6可以被限制性内切酶Mbo II消化，提供一个用于检测存在的甲型流感病毒的H5N1亚型的HA基因的片段4区域的内部确认标志。
针对于H5N1中的HA基因的另一种引物对
设计另一对用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的HA基因的片段4的特异性引物对，该引物对可以扩增HA基因从核苷酸943到核苷酸1114的195个碱基对的部分。
A、上游引物
在本文中，正向引物也称为上游引物，它具有21-mer，能以HA基因的位置943作为杂交起点，它的序列为SEQ ID NO：45′-GCCATTCCACAAYATACACCC-3′(21bp)。在这种情况下，Y可以是C或T。
B、下游引物
在本文中，反向引物也称为下游引物，它具有24-mer，能以HA基因的位置1114作为杂交终点，它的序列为SEQ ID NO：55′-TACCCATACCAACCATCTACCATT-3′(24bp)。
C、该引物对获得的扩增子
该引物对获得的扩增子的序列为SEQ ID NO：55GCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTA(195bp)。
扩增的区域包括SEQ ID NO：1 5’-AGAAGAAGAAAAAAG-3’的高致病性区域序列。SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：6可以被限制性内切酶Mbo II消化，提供一个用于检测存在的甲型流感病毒的H5N1亚型的HA基因的片段4区域的内部确认标志。
针对于H5N1中的NA基因的引物对
设计另一对用于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的NA基因的片段6的特异性引物对，该引物对可以扩增NA基因从核苷酸528到核苷酸805的300个碱基对的部分。
A、上游引物
在本文中，正向引物也称为上游引物，它具有21-mer，能以NA基因的位置528作为杂交起点，它的序列为SEQ ID NO：85′-TGATGGCACCAGTTGGTTGAC-3′(21)。
B、下游引物
在本文中，反向引物也称为下游引物，它具有22-mer，能以NA基因的位置805作为杂交终点，它的序列为SEQ ID NO：95′-GCATCAGGATAACAGGAGCAYTC-3′。在这种情况下，Y可以是C或者T。因此，下游引物可以包括序列SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。
C、该引物对获得的扩增子
该引物对获得的扩增子的序列为SEQ ID NO：7TGATGGCACCAGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGCTGTGGCTGTATTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGGAATAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGCTCTTGCTTTACTGTAATGACTGACGGACCAAGTAATGGTCAGGCATCACATAAGATCTTCAAAATGGAAAAAGGGAAAGTGGTTAAATCAGTCGAATTGGATGCTCCCAATTATCACTATGAGGARTGCTCCTGTTATCCTGATGC(300bp)。
针对于H5N2中的NA基因的引物对
设计用于检测甲型流感病毒的H5N2亚型的NA基因的片段6的特异性引物对，该引物对可以扩增NA基因从核苷酸440到核苷酸774的361个碱基对的部分。设计这种特异性引物对，以检测H5N2亚型-NA基因作为特异性的确认标志。
A、上游引物
在本文中，正向引物也称为上游引物，它具有22-mer，能以NA基因的位置440作为杂交起点，它的序列为SEQ ID NO：145′-AATGAGTTGGGTGTTCCGTTTC-3′。
B、下游引物
在本文中，反向引物也称为下游引物，它具有27-mer，能以NA基因的位置774作为杂交终点，它的序列为SEQ ID NO：155′-AACAGGAACATTCCTCTATATGCTGAG-3′。
C、该引物对获得的扩增子
该引物对获得的扩增子的序列为SEQ ID NO：13AATGAGTTGGGTGTTCCGTTTCACTTGGGAACCAAACAAGTGTGCATAGCATGGTCCAGTTCAAGTTGCCATGACGGGAAAGCATGGTTGCACGTCTGTGTTACTGGGGATGATAGAAATGC GACTGCTAGTTTCATTTATGATGGGATGCTCGTTGACAGTATAGGTTCATGGTCTCAAAATATCCTCAGAACTCAGGAGCCAGAGTGCGTTTGCATCAATGGGACTTGTACAGTAGTAATGACTGATGGAAGCGCATCAGGGAAAGCCGACACTAGAATATTATTCATTGAAGAGGGGAAAGTTGTTCACATTAGCCCATTGTCGGGAAGTGCTCAGCATATAGAGGAATGTTCCTGTT(361bp)。
实施例4：检测试剂盒
为了实施本发明，使用试剂盒1通过悬浮阵列技术进行检测，使用试剂盒2通过PCR进行检测。
用于悬浮阵列技术的试剂盒1
甲型流感病毒的常规检测
为了对样品中存在的甲型流感病毒进行常规检测并进行确认，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括固定有如SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：22(MP-168上游和下游探针，针对于所有的流感亚型)所示的至少一个核酸序列的微珠。
为了对H5N1亚型进行分型，所述试剂盒可以进一步包括选自由H5N1的特异性序列所组成的组中的至少一个序列。所述组可以由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9(针对于H5N1亚型的NA基因的探针/引物)、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17(针对于H5N1亚型的HA基因的探针/引物)、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19(针对于H5N1亚型的HA-195区域的探针/引物)和SEQID NO：20(针对于由SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19扩增的扩增子的探针)所组成。因此，所述试剂盒可以包括具有SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：60中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
所述试剂盒可以选择性地包括合适的染料或标记，以通过Luminex系统进行定量分析，以及可以包括与所述试剂盒的使用相关的信息。
用于PCR技术的试剂盒2
通过H5N1的确认对甲型流感病毒进行常规检测
分子细胞生物学研究所(Institute of Molecular and Cell Biology(IMCB))，甲型流感检测试剂盒2
RT-PCR诊断试剂盒
储藏在-20℃下
100次反应/试剂盒，第一批，编号#001
不结霜的冰箱(Non-Frost-Free Freezer)
产物描述
使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒检测甲型流感病毒的存在，并用H5N1确认。使用下述的试剂在所示的浓度下进行第一链cDNA反应。
所述试剂盒使用3套引物：1)对H5N1具有特异性的HA引物对，2)针对于所有甲型流感的M引物对和3)对H5N1具有特异性的NA引物对。在琼脂糖凝胶中进行电泳之后，扩增产物通过溴化乙啶染色进行检测。
所有程序都在一步中进行。
使用Qiagen的一步RT-PCR试剂盒[目录号：210210]。
成分
所述试剂盒包括下述的两个管：
| 管号 | 成分 | 储存条件(短期，长期) |
| 管1 | 包括所有三套引物的引物混合物* | -20℃ |
| 管2 | cDNA阳性对照(10-50个拷贝/μl) | 4℃，-20℃ |
包括核糖核酸酶(RNase)抑制剂。引物包括SEQ ID NOS：2、3、8、9、11和12的核酸。
一步RT-PCR的实验方案
1、样品的制备
向不含RNase的微量离心管(0.5ml或者0.2ml)中加入下列试剂，表中的数据为每个反应管中含有的量：
| 管号 | 种类 | 50μl/Rxn | 20μl/Rxn |
| 管1来自 Qiagen 试剂盒管2或测试样品 | 引物混合物(3套引物)Qiagen 5×缓冲液Qiagen dNTP混合物Qiagen酶混合物不含RNase的水RNA样品 | 2.0μl10.0μl2.0μl2.0μl29.0μl5.0μl | 0.8μl4.0μl0.8μl0.8μl11.6μl2.0μl |
| 总体积 | 50.0μl | 20.0μl |
为了使结果有效，还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照为包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10的cDNA，阴性对照为从非流感型病毒中分离的任何RNA。
2、热循环实验方案-A
对于三模块型PCR循环(three-blocks type PCR cycler)，如由Stratagene提供的RoboCycler
热循环条件为：
3、热循环实验方案-B
对于一模块型PCR循环(one-blocks type PCR cycler)，如由ThermoElectron提供的Px2 Thermal Cycler，热循环条件为：
4、PCR反应的终止
(该步为任选的)
(1)加入30μl的氯仿/管，涡动混合5秒。
(2)离心2分钟。(上层＝水相，下层＝有机相)
5、电泳
用DNA凝胶电泳确定上述产物。
(1)用3％琼脂糖凝胶进行DNA电泳；
(2)在电压为例如100V下进行30分钟。
6、结果的确认
如图1所示，对于HA，期望的产物大小为114bp；对于基质蛋白，期望的产物大小为168bp；和对于NA，期望的产物大小为300bp。
用于PCR技术的试剂盒3
检测甲型流感病毒的H5N1亚型
分子细胞生物学研究所(Institute ofMolecular and Cell Biology(IMCB))，甲型流感检测试剂盒3
RT-PCR诊断试剂盒
储藏在-20℃下
100次反应/试剂盒，第一批，编号#001
不结霜的冰箱(Non-Frost-Free Freezer)
产物描述
使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒检测甲型流感病毒的H5N1亚型的RNA的存在。使用下述的试剂在所示的浓度下进行第一链cDNA反应。
所述试剂盒使用2套引物：1)对H5具有特异性的HA引物对和2)针对于N1具有特异性的NA引物对。在琼脂糖凝胶电泳后，扩增产物通过溴化乙啶染色进行检测。
所有程序都在一步中进行。
使用Qiagen的一步RT-PCR试剂盒[目录号：210210]。
成分
所述试剂盒包括下述的两个管：
| 管号 | 成分 | 储存条件(短期，长期) |
| 管1 | 包括所有两套引物的引物混合物* | -20℃ |
| 管2 | cDNA阳性对照(50个拷贝ea/μl) | 4℃，-20℃ |
*包括RNase抑制剂。引物包括SEQ ID NOS：4、5、8和9。
一步RT-PCR的实验方案
7、样品的制备
向不含RNase的微量离心管(0.5ml或者0.2ml)中加入下列试剂，表中的数据为每个反应管中含有的量：
| 管号 | 种类 | 50μl/Rxn | 20μl/Rxn |
| 管1来自 Qiagen 试剂盒管2或测试样品 | 引物混合物(2套引物)Qiagen 5×缓冲液Qiagen dNTP混合物Qiagen酶混合物不含RNase的水RNA样品 | 2.0μl10.0μl2.0μl2.0μl29.0μl5.0μl | 0.8μl4.0μl0.8μl0.8μl11.6μl2.0μl |
| 总体积 | 50.0μl | 20.0μl |
*注意不要污染。
为了使结果有效，还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照为包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10的cDNA，阴性对照为从非流感型病毒中分离的任何RNA。
热循环实验方案-A
对于三模块型PCR循环(three-blocks type PCR cycler)，如由Stratagene提供的RoboCycler
热循环条件为：
热循环实验方案-B
对于一模块型PCR循环(one-blocks type PCR cycler)，如由ThermoElectron提供的Px2 Thermal Cycler，热循环条件为：
PCR反应的终止
(该步为任选的)
(1)加入30ul的氯仿/管，涡动混合5秒。
(2)离心2分钟。(上层＝水相，下层＝有机相)
电泳
用DNA凝胶电泳确定上述产物。
(1)用3％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳；
(2)在电压为例如100V下进行30分钟。
结果的确认
对于H5N1，HA带的期望的产物大小为195bp；对于H5N3，HA带的期望的产物大小为183bp。因此，两种亚型是不同的，对于H5N1，NA带的期望的产物大小为300bp，如图3所示。
该实施例所用的试剂盒通常制成含有50次或100次反应的量。试剂盒保存在不结霜的冰箱的-20℃下的环境中。图1表示使用试剂盒2所获得的结果，图3表示采用试剂盒3所获得的结果。
本文中描述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒可以用于检测在RNA样品中存在的甲型流感(禽流感)的H5N1亚型的RNA，所述RNA样品是通过选择的合适的RNA提取方法提出的。对所述试剂盒进行优化，以检测5μl病毒RNA测试样品中的少量分子，并且，全部过程都在一步中进行。
电泳
反应的产物用DNA凝胶电泳进行检测，每一泳道使用5μl的反应产物的混合物。3％的琼脂糖凝胶能够提供很好的分辨率；在100V下电泳30分钟。
实施例5：使用所述的引物进行的RT-PCR的特异性
为了验证实施例4中所述的试剂盒2和试剂盒3中设计的引物对可以用于特异性检测甲型流感病毒的H5N1亚型。所选择的病毒通过在试剂盒2中使用引物组SEQ ID NO：2、3、8、9、11和12，并在试剂盒3中使用引物组SEQ ID NO：4、5、8和9进行RT-PCR实现扩增。在所示的滴定浓度下测试下述的甲型流感病毒亚型以检测引物对的特异性：
H5N1(-1)A/鸡/越南/8/2004(HPAI)，
H5N3(-1)A燕鸥/澳大利亚/75/(LPAI)，
H7N3(-1)A/鸡/昆兰州市/1994(HPAI)和
H7N7(-1)A/鸭子/维多利亚/1976(LPAI)。
图1和图3的结果表示引物对对甲型流感病毒的H5N1亚型具有特异性。因此，这表明所述引物对能特异性地检测甲型流感病毒的H5N1亚型。
实施例6：对人类患者样品的分析
临床样品来自大量的人类患者，并用试剂盒2或者试剂盒3的引物组，通过本发明的分析方法进行分析。
PCR诊断试剂盒(RT-PCR)
该实施例所用的试剂盒通常制成含有50或100次反应的量。将实时逆转录聚合酶链式反应进行优化，以检测在生物样品中存在的甲型流感病毒的H5N1亚型的RNA。对该试剂盒进行优化，并在Applied Biosystems公司的实时PCR，ABI Prism 7500中但不局限于该系统中使用。所述试剂盒也可以使用本文其它地方描述的合适的检测平台进行检测。
所述试剂盒的灵敏度足以检测出在每一个RT-PCR反应中的几个RNA。
成分
该实施例中的试剂盒由以下4个管组成：
管1：反应混合物(例如，ABI的目录号为4309169)
管2：酶混合物(例如，ABI的目录号为4309169)
管3：探针混合物(3μM的上游引物(SEQ ID NOS：2、4、8、11和/或14)，3μM的下游引物(SEQ ID NOS：3、5、9、12和/或15)和2μM的探针(SEQ ID NO：1)溶于20mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.2)中。
管4：阳性对照(由引物引起的靶基因的RNA转录产物)
实验方案
1、RT-PCR
将下述的反应混合物制备在96孔光学板(optical plate)中：
管号 种类 体积/Rxn
管1 反应混合物 25.0μl
管2 酶混合物 1.25μl
管3 探针混合物 5.0μl
管4 蒸馏水 13.75μl
- RNA样品 5.0μl
总体积 50.0μl
必须注意防止污染。
2、温度循环条件
使用Stratagene公司的实时PCR系统Mx3000P对引物对和探针检测甲型流感病毒的H5N1亚型的能力进行检测。按照制造商的用法说明，使用该体系对感染患者的样品进行检测。将所述样品稀释几倍，使每5μl中的病毒拷贝数为7.5到6。
结果表明所述引物组和探针能灵敏并特异地分析甲型流感病毒的H5N1亚型，这在临床上是有用的。
实施例6的结果
图2表示使用针对于检测甲型流感病毒的H5N1亚型的引物，在不同浓度下获得的灵敏度，其中每一个点样孔的病毒拷贝数为每个反应500个拷贝数到0.5个拷贝数。泳道1为标记；泳道2和3：每5μl含有500个拷贝的病毒；泳道4和5：每5μl含有50个拷贝的病毒；泳道6和7：每5μl含有5个拷贝的病毒；泳道8和9：每5μl含有0.5个拷贝的病毒；泳道10含有不相关的病毒的阴性对照。阳性DNA由来源于相应的扩增子的单独克隆的DNA制备的。
尽管参照上述实施例详细地说明了本发明，应当理解的是在不违背本发明的宗旨的情况下，可以进行各种改变。引用的所有的专利、专利申请和本申请涉及的出版物的全部内容并入本文作为参考。
序列表
<110>新加坡科技研究局
<120>甲型流感病毒的检测方法和用于检测甲型流感病毒的试剂盒
<130>SP7707
<160>60
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>114
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>HA片段4；r为a或g
<400>1
caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag agaagaagaa 60
aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg carg 114
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>2
caaacagatt agtccttgcg actg 24
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>3
cytgccatcc tccctctata aa 22
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>4
gccattccac aayatacacc c 21
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>5
tacccatacc aaccatctac catt 24
<210>6
<211>114
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>6
caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag agaagaagaa 60
aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg carg 114
<210>7
<211>300
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>7
tgatggcacc agttggttga caattggaat ttctggccca gacaatgggg ctgtggctgt 60
attgaaatac aatggcataa taacagacac tatcaagagt tggaggaata acatactgag 120
aactcaagag tctgaatgtg catgtgtaaa tggctcttgc tttactgtaa tgactgacgg 180
accaagtaat ggtcaggcat cacataagat cttcaaaatg gaaaaaggga aagtggttaa 240
atcagtcgaa ttggatgctc ccaattatca ctatgaggar tgctcctgtt atcctgatgc 300
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>8
tgatggcacc agttggttgac 21
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<220>
<221>misc_feature
<223>y为c或t
<400>9
gcatcaggat aacaggagca ytc 23
<210>10
<211>168
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>10
gagtcttcta accgaggtcg aaacgtacgt tctctctatc atcccgtcag gccccctcaa 60
agccgagatc gcgcagaaac ttgaagatgt ctttgcagga aagaacaccg atctcgaggc 120
tctcatggag tggctaaaga caagaccaat cctgtcacct ctgactaa 168
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>11
gagtcttcta accgaggtcg aaac 24
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>12
ttagtcagag gtgacaggat tggtc 25
<210>13
<211>361
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>13
aatgagttgg gtgttccgtt tcacttggga accaaacaag tgtgcatagc atggtccagt 60
tcaagttgcc atgacgggaa agcatggttg cacgtctgtg ttactgggga tgatagaaat 120
gcgactgcta gtttcattta tgatgggatg ctcgttgaca gtataggttc atggtctcaa 180
aatatcctca gaactcagga gccagagtgc gtttgcatca atgggacttg tacagtagta 240
atgactgatg gaagcgcatc agggaaagcc gacactagaa tattattcat tgaagagggg 300
aaagttgttc acattagccc attgtcggga agtgctcagc atatagagga atgttcctgt 360
t 361
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>14
aatgagttgg gtgttccgtt tc 22
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>15
aacaggaaca ttcctctata tgctgag 27
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-114上游探针/引物
<220>
<221>misc_feature
<223>r为a或g；y为c或t；d为a，g或t；w为a或t
<220>
<221>misc_feature
<223>r为a或g；y为c或t；d为a，g或t；w为a或t
<400>16
caaacaratt artycttgcd acwg 24
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-114下游探针/引物
<220>
<221>misc_feature
<223>y为c或t
<400>17
cctgccatcc tccytctata aa 22
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物
<220>
<221>misc_feature
<223>y为c或t；m为a或c
<400>18
gccattccac aayatmcayc c 21
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195下游探针/引物
<220>
<221>misc_feature
<223>y为c或t
<400>19
tayccatacc aaccatctay catt 24
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195探针
<220>
<221>misc_feature
<223>h为a，c或t；r为a或g
<400>20
grcattcccc gatggtgaga gg 22
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168上游探针/引物
<220>
<221>misc_feature
<223>y＝c或t
<220>
<221>misc_feature
<223>y为ac或t
<400>21
gagycttct aaccgaggtcg aaac 24
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168下游探针/引物
<220>
<221>misc_feature
<223>r为a或g
<400>22
ttagtcagag gtgacagrat tggtc 25
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168上游变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n为a，c，g或t
<400>23
gagncttcta accgaggtcg aaac 24
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168下游变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>n为a，c，g或t
<400>24
ttagtcagag gtgacagnat tggtc 25
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-114上游变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n为a，c，g或t
<400>25
caaacanatt antncttgcn acwg 24
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-114下游变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n为a，c，g或t
<400>26
cctgccatcc tccntctata aa 22
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>n为a，c，g或t
<400>27
gccattccac aanatncanc c 21
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195下游变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n为a，c，g或t
<400>28
tanccatacc aaccatctan catt 24
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195探针变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n为a，c，g或t
<400>29
gncattcccc gatggtgaga gg 22
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-165上游探针/引物 变体1
<400>30
gagccttcta accgaggtcg aaac 24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-165上游探针/引物 变体2
<400>31
gagtcttcta accgaggtcg aaac 24
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168下游探针/引物 变体1
<400>32
ttagtcagag gtgacagaat tggtc 25
<210>33
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168下游探针/引物 变体2
<400>33
ttagtcagag gtgacaggat tggtc 25
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-114上游探针/引物
<400>34
caaacagatt agtycttgcg actg 24
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-114下游探针/引物 变体1
<400>35
cctgccatcc tccctctata aa 22
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-114下游探针/引物 变体2
<400>36
cctgccatcc tccttctata aa 22
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体1
<400>37
gccattccac aacatacacc c 21
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体2
<400>38
gccattccac aatatacacc c 21
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体3
<400>39
gccattccac aacatccacc c 21
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体4
<400>40
gccattccac aatatccacc c 21
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体5
<400>41
gccattccac aacatacatc c 21
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体6
<400>42
gccattccac aatatacatc c 21
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体7
<400>43
gccattccac aacatccatc c 21
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195上游探针/引物 变体8
<400>44
gccattccac aatatccatc c 21
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195下游探针/引物 变体1
<400>45
tacccatacc aaccatctac catt 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195下游探针/引物 变体2
<400>46
tacccatacc aaccatctat catt 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195下游探针/引物 变体3
<400>47
tatccatacc aaccatctac catt 24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195下游探针/引物 变体4
<400>48
tatccatacc aaccatctat catt 24
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195探针 变体1
<400>49
gacattcccc gatggtgaga gg 22
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HA-195探针 变体2
<400>50
ggcattcccc gatggtgaga gg 22
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NA-300下游探针/引物 变体1
<400>51
gcatcaggat aacaggagca ctc 23
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NA-300下游探针/引物 变体2
<400>52
gcatcaggat aacaggagca ttc 23
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168探针
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(21)
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>n为a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>n为a，c，g或t
<400>53
gctttgaggg ggcctgangg n 21
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168探针 变体
<220>
<221>misc_feature
<223>y为c或t，r为a或g
<400>54
gctttgaggg ggcctgaygg r 21
<210>55
<211>195
<212>DNA
<213>甲型流感病毒的H5N1亚型
<220>
<221>misc_feature
<223>HA扩增子
<400>55
gccattccac aacatacacc ctctcaccat cggggaatgc cccaaatatg tgaaatcaaa 60
cagattagtc cttgcgactg ggctcagaaa tagccctcaa agagagagaa gaagaaaaaa 120
gagaggacta tttggagcta tagcaggttt tatagaggga ggatggcagg gaatggtaga 180
tggttggtat gggta 195
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168探针 变体1
<400>56
gctttgaggg ggcctgacgg a 21
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168探针 变体2
<400>57
gctttgaggg ggcctgatgg a 21
<210>58
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168探针 变体3
<400>58
gctttgaggg ggcctgacgg g 21
<210>59
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MP-168探针 变体4
<400>59
gctttgaggg ggcctgatgg g 21
<210>60
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NA-300探针
<400>60
acagccacag ccccattgtc tg 22
Claims (71)
1、一种分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体、和它们的互补序列。
2、根据权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其中，该寡核苷酸主要包括选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体、和它们的互补序列。
3、根据权利要求1或2所述的分离的寡核苷酸，其中，该寡核苷酸由选自由以下序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列所组成：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体、和它们的互补序列。
4、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：23的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
5、根据权利要求1-4中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：23的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
6、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：24的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
7、根据权利要求1-3和6中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：24的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：33所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
8、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：25的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
9、根据权利要求1-3和8中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：25的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
10、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：26的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
11、根据权利要求1-3和10中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：26的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
12、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：27的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
13、根据权利要求1-3和12中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：27的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：37到SEQ IDNO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
14、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：28的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
15、根据权利要求1-3和14中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：28的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：45到SEQ IDNO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
16、根据权利要求1-3中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：29的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
17、根据权利要求1-3和16中任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括SEQ ID NO：29的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：49到SEQ IDNO：50所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
18、根据上述权利要求中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29所组成的组中的至少一个核苷酸序列的至少一种寡核苷酸能够与包括核苷酸序列SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7的至少一种寡核苷酸或其部分进行结合和/或杂交。
19、根据上述权利要求中的任意一项所述的分离的寡核苷酸，其中，包括选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29所组成的组中的至少一个核苷酸序列的至少一种寡核苷酸能够与包括选自由SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；和/或从甲型流感病毒的H5N1亚型中提取的、纯化的和/或扩增的核酸的一部分所组成的组中的至少一个核苷酸序列的至少一种寡核苷酸进行结合和/或杂交。
20、一种用于确定甲型流感病毒的H5N1亚型在生物样品中的存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供生物样品；
(b)使至少一种寡核苷酸与所述生物样品中的至少一种核酸接触，或者使所述寡核苷酸与从所述生物样品中提取的、纯化的和/或扩增的至少一种核酸接触，其中，所述寡核苷酸包括选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体、和它们的互补序列所组成的组中的至少一个核苷酸序列：和
(c)对由步骤(b)的接触所获得的任何结合进行检测，检测到该结合则表示存在有甲型流感病毒的H5N1亚型。
21、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：23的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
22、根据权利要求20或21所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：23的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
23、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：24的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
24、根据权利要求20或23所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：24的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
25、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：25的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
26、根据权利要求20或25所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：25的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
27、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：26的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
28、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：27的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
29、根据权利要求20或28所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：27的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：37到SEQ ID NO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
30、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：28的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
31、根据权利要求20或30所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：28的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：45到SEQ ID NO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
32、根据权利要求20所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：29的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
33、根据权利要求20或32所述的方法，其中，包括SEQ ID NO：29的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：49到SEQ ID NO：50所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
34、根据权利要求20-33中的任意一项所述的方法，其中，步骤(c)中的所述检测包括对未结合的寡核苷酸与结合到所述核酸上的寡核苷酸进行区分。
35、根据权利要求20-34中的任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸被固定在微珠上。
36、根据权利要求20-35中的任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸为探针，该方法包括：
(i)提供生物样品；
(ii)使用至少一种报告标记对所述生物样品中的至少一种核酸或者从所述生物样品中提取的、纯化的或扩增的至少一种核酸进行标记；
(iii)将至少一种探针固定到含有至少一种荧光染料的至少一种微珠上；
(iv)使所述至少一种探针与所述至少一种核酸进行接触以使该探针与核酸结合；
(v)使用第一激光并基于所述至少一种荧光染料的荧光强度来识别微珠；并且使用第二激光并基于报告标记，对核酸与探针的结合进行检测，该探针固定在识别出的微珠上；检测到该核酸与探针的结合则表明存在有甲型流感病毒的H5N1亚型。
37、根据权利要求36所述的方法，其中，所述至少一种微珠含有至少两种荧光染料。
38、根据权利要求37所述的方法，其中，所述至少两种荧光染料能够基于所述至少两种荧光染料的荧光强度使一种微珠与另一种微珠区分开。
39、根据权利要求36-38中的任意一项所述的方法，其中，步骤(ii)中对所述至少一种核酸进行标记是在步骤(iv)中的接触之后进行的。
40、根据权利要求36-39中的任意一项所述的方法，其中，步骤(c)中的检测是通过使用悬浮阵列技术而进行的。
41、根据权利要求20-34中的任意一项所述的方法，其中，步骤(b)中的接触包括使形成引物对的至少两种寡核苷酸与所述核酸进行接触，并且步骤(c)中的检测是通过聚合酶链式反应进行的。
42、根据权利要求41所述的方法，其中，所述检测是通过确定由聚合酶链式反应所获得的至少一种扩增子的分子量来实现的。
43、根据权利要求42所述的方法，其中，所述检测是通过使至少一种探针与由聚合酶链式反应所获得的至少一种扩增子进行结合来实现的。
44、根据权利要求41-42中的任意一项所述的方法，其中，所述引物对能够与所述核酸进行结合，并且能够扩增包括如SEQ ID NO：6所示的序列的至少一种扩增子，所述引物对包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，该正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：25，该反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：26。
45、根据权利要求41-44中的任意一项所述的方法，其中，所述正向引物包括如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列。
46、根据权利要求41-45中的任意一项所述的方法，其中，所述反向引物包括选自由SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
47、根据权利要求41-43中的任意一项所述的方法，其中，所述引物对能够与所述核酸进行结合，并且能够扩增包括如SEQ ID NO：7所示的序列的至少一种扩增子，所述引物对包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，所述正向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：18，所述反向引物包括核苷酸序列SEQ ID NO：19。
48、根据权利要求47所述的方法，其中，所述正向引物包括选自由SEQID NO：37到SEQ ID NO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
49、根据权利要求47或48所述的方法，其中，所述反向引物包括选自由SEQ ID NO：45到SEQ ID NO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列。
50、根据权利要求47-49中的任意一项所述的方法，其中，包括选自由SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所组成的组中的至少一个核苷酸序列的探针能够与所述扩增子进行结合。
51、根据权利要求41-50中的任意一项所述的方法，其中，在所述聚合酶链式反应之后进行电泳，以对所述扩增子进行检测和/或纯化。
52、根据权利要求41-51中的任意一项所述的方法，其中，步骤(b)中的接触和/或步骤(c)中的结合的时间和条件足以使所述寡核苷酸或探针与核酸之间发生特异性的接触或特异性的结合。
53、根据权利要求20-52中的任意一项所述的方法，其中，所述生物样品源自疑为被乙型流感病毒所感染的人类或者非人类动物。
54、根据权利要求20-53中的任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸是被标记的。
55、根据权利要求20-40和50-54中的任意一项所述的方法，其中，所述核酸是被标记的。
56、一种用于检测乙型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自由以下序列所组成的组中的核苷酸序列：SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、它们的片段、它们的衍生物、它们的变体、和它们的互补序列。
57、根据权利要求55所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：23的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
58、根据权利要求56或57所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：23的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
59、根据权利要求56所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：24的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
60、根据权利要求56或59所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：24的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
61、根据权利要求56所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：25的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
62、根据权利要求56或61所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：25的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
63、根据权利要求56所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：26的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
64、根据权利要求56所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：27的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
65、根据权利要求56或64所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：27的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：37到SEQ ID NO：44所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
66、根据权利要求56所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：28的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
67、根据权利要求57或68所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：28的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：45到SEQ ID NO：48所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
68、根据权利要求55所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：29的寡核苷酸为包括至少一个如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
69、根据权利要求56或68所述的试剂盒，其中，包括SEQ ID NO：29的寡核苷酸为包括选自由SEQ ID NO：49到SEQ ID NO：50所组成的组中的至少一个核苷酸序列的寡核苷酸。
70、根据权利要求56-69中的任意一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种寡核苷酸是被标记的
71、根据权利要求56-70中的任意一项所述的试剂盒，该试剂盒还包括至少一种微珠、至少一种荧光染料、和/或至少一种报告标记。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559925A (zh) * | 2009-06-10 | 2012-07-11 | 上海人类基因组研究中心 | 检测人甲型流感病毒h3亚型的引物及方法 |
| CN101899531B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-09-26 | 上海人类基因组研究中心 | 检测人甲型流感病毒h1和/或h3亚型的引物 |
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Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2605015C (en) * | 2005-05-06 | 2013-09-10 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and assays to detect influenza virus a and b nucleic acids |
| WO2008054830A2 (en) * | 2006-01-18 | 2008-05-08 | Regents Of The University Of Colorado | Dna array analysis as a diagnostic for current and emerging strains of influenza |
| WO2008000023A1 (en) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Biochip Innovations Pty Ltd | Detection of influenza virus |
| US9086408B2 (en) * | 2007-04-30 | 2015-07-21 | Nexus Dx, Inc. | Multianalyte assay |
| JP2010528619A (ja) * | 2007-05-31 | 2010-08-26 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | インフルエンザａおよびインフルエンザｂウイルスを検出するための配列および方法 |
| ES2424332T3 (es) * | 2008-06-14 | 2013-10-01 | Veredus Laboratories Pte Ltd | Secuencias de la gripe |
| SG168423A1 (en) * | 2009-07-13 | 2011-02-28 | Agency Science Tech & Res | Influenza detection method and kit therefor |
| WO2018180987A1 (ja) * | 2017-03-29 | 2018-10-04 | 東洋紡株式会社 | 核酸の検出方法 |
| CN113106089A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-13 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种用于检测甲型流感的引物探针组合的恒温扩增试剂盒 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2077277A1 (en) * | 1991-09-09 | 1993-03-10 | John J. Donnelly | Cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates |
| US5833991A (en) * | 1995-04-10 | 1998-11-10 | Cobra Therapeutics, Ltd. | Glycine-containing sequences conferring invisibility to the immune system |
| WO1997014028A2 (en) | 1995-10-11 | 1997-04-17 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method |
| AU1080999A (en) | 1997-10-14 | 1999-05-03 | Luminex Corporation | Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same |
| EP1204869B1 (en) | 1999-08-17 | 2008-10-22 | Luminex Corporation | Method for analyzing a number of samples from a variety of sources for a single analyte |
| US20020165176A1 (en) * | 2000-05-01 | 2002-11-07 | Haynes Joel R. | Nucleic acid immunization |
| CN1258604C (zh) * | 2000-10-05 | 2006-06-07 | 香港基因晶片开发有限公司 | 一种用于检测非致病性或致病性a型流感病毒h5亚型病毒的试剂盒 |
| WO2004057021A2 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | UNIVERSITé LAVAL | Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses |
| US8592197B2 (en) * | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
| EP1747296A2 (en) * | 2004-04-19 | 2007-01-31 | Academisch Medisch Centrum | Detection of viral nucleic acid and method for reverse transcribing rna |
| EP1761645A4 (en) * | 2004-06-10 | 2008-12-31 | Agency Science Tech & Res | DIAGNOSTIC PRIMERS AND METHOD FOR DETECTING H5 AND H5N1 SUBTYPES OF AVIAN INFLUENZA VIRUS |
| WO2006132601A1 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-14 | Agency For Science, Technology And Research | Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1 |
| EP2388340B1 (en) * | 2004-11-01 | 2013-04-03 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method of detecting H7 avian influenza virus |
| US8691781B2 (en) * | 2004-11-05 | 2014-04-08 | Sirnaomics, Inc. | Compositions for treating respiratory viral infections and their use |
| KR20070122506A (ko) * | 2005-03-31 | 2007-12-31 | 로넨 카하나 | 바이러스성 질병에 내성인 가금류 및 기타 동물의 생산방법 |
-
2005
- 2005-11-16 GB GB0523347A patent/GB2432419A/en not_active Withdrawn
-
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899531B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-09-26 | 上海人类基因组研究中心 | 检测人甲型流感病毒h1和/或h3亚型的引物 |
| CN102559925A (zh) * | 2009-06-10 | 2012-07-11 | 上海人类基因组研究中心 | 检测人甲型流感病毒h3亚型的引物及方法 |
| WO2022052781A1 (zh) * | 2020-09-14 | 2022-03-17 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 抗甲型流感病毒的抗体和试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090204 |