CN113106089A - 一种用于检测甲型流感的引物探针组合的恒温扩增试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测甲型流感病毒的引物探针组合试剂盒。所述引物探针组合试剂盒包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针。本发明提供的试剂盒用于甲型流感病毒病毒RNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为甲型流感病毒病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

Description

一种用于检测甲型流感的引物探针组合的恒温扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测甲型流感病毒的引物探针组合试剂盒。

背景技术

甲型流感病毒（Influenza A，IFV A）目前可分为16个H亚型（H1-H16）和9个N亚型（N1-N9），目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有人感染的报道。由于编码HA和（或）NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和（或）NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移（antigenic drift）。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人（>65岁）和婴幼儿（<6岁）。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亚型。近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（H5亚型）病毒的病例时有报道，禽类甲型H5N1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变（antigenicshift）。新型甲型H1N1流感病毒（2009）即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。

甲型流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。常规检测甲型流感主要通过抗原抗体等血清学方法检测或通过qPCR进行核酸实检测；抗原抗体检测对窗口期病人有着检测灵敏度不足等问题，而qPCR有着相对较短的检测周期，且每轮测试可以同时检测多个样本，可以在相对短时间内实现较高通量的样本检查；所以流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断。但是该法需要依赖于较为复杂的检测流程和相对复杂高价的仪器，同时对于检测环境的要求很高，目前需要在疾控中心、三甲医院等地集中检测，容易面临检测试剂有限、检测仪器和实验人员均超负荷运转等问题，无法广泛普及至广大基层医院、防控现场和家庭。另外用于核酸检测的Sanger测序、NGS方法不单可以准确地确认甲型流感病毒的有无，还可以识别基因组中的突变，对于病毒溯源、分型、流行病学追踪均有重要意义，但检测周期至少需要24小时以上，操作复杂，需要专业技术人员实施，难以满足快速检测及对阳性人员进行快速隔离的要求。由于能在单一温度进行反应，不需要仪器进行复杂得温度变化控制，恒温扩增技术对硬件的要求相比qPCR大大降低。但现有的恒温扩增技术在灵敏度、特异性等方面与qPCR相比仍有一定差距，因此没有得到广泛的推广和应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一方面涉及引物探针组合试剂盒，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1~4所示；

环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中，探针5’端第9位核苷酸为核糖核苷酸。

本发明的第二方面涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合试剂盒。

本发明的第三方面涉及如上所述的引物探针组合试剂盒在制备用于检测甲型流感病毒的诊断试剂或试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明提供的试剂盒用于甲型流感病毒RNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为甲型流感病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

2）本发明提供的试剂盒采用核糖核酸酶HII报告系统，与恒温扩增同步反应，在55~65℃条件下均可实现靶基因的有效扩增及检测，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，10-40min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为500 copies/mL。

3）本发明方法中核糖核酸酶HII对探针和靶标序列具有高度特异性，只有扩增产物和探针序列完全互补才发出荧光信号，使扩增的特异性大大提高，从而实现无本底背景的高效恒温核酸扩增。

4）检测所需反应条件简单，对硬件要求低，成本较低，利于技术的广泛推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中对两组引物探针的验证结果；

图2为本发明一个实施例中不同拷贝数的甲型流感病毒的检测结果；

图3为本发明一个实施例中对本发明所提供的引物探针的特异性验证结果；

图4为本发明一个实施例中试剂盒稳定性检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及引物探针组合试剂盒，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1~4所示；

环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中，探针5’端第9位核苷酸为核糖核苷酸。

FIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3端有与靶序列的F2c区互补的F2区并且在5端有与靶基因的F1c区相同的序列。

F3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因F3c区互补的F3区。

BIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3'端有与靶序列B2c区互补的B2区并且在5端有与靶基因Blc区相同的序列。

B3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因B3c区互的B3区。

使用本发明引物组时，可加入一或两类环状引物（LF引物或LB引物）以便加速核酸扩增反应。设计这样的环状引物以使其退火至F1和F2之间的区域或B1和B2之间的区域，然后加入到LAMP反应系统。这样，这些引物与在核酸扩增过程中未使用的环状部分结合，以致利用所有的环状部分作为起点促进核酸反应，从而加速核酸扩增反应。

上述引物探针组合试剂盒能够配合核糖核酸酶 HII实现对甲型流感更加灵敏和特异性的诊断。

核糖核酸酶 HII（RNase HII）为核糖核酸内切酶，适用于在双链 DNA 内部切刻核糖核酸的 5´ 末端，产生 5´ 磷酸和 3´ 羟基末端。RNase HII可以特异性地识别DNA双链中的RNA碱基，并使RNA碱基5’方向连接DNA碱基的磷酸二酯键断裂，导致DNA双链在RNA碱基的5’方向产生了一个切口。在生物体内，通过该切割引发DNA修复，可去除双链DNA中的RNA碱基，确保遗传信息的准确性。本发明基于RNase HII对底物严格配对要求的特性，设计了一种单链探针，该探针内部嵌入了RNA碱基，并将RNase HII应用于扩增系统的报告体系中。由于RNase HII只能识别和切割双链，因此不会作用于单链的探针。在合适的温度下，当环境中存在与探针互补配对的单链DNA，探针会与之杂交，并被RNase HII在特定位置切断，被切断的探针熔解温度下降，无法保持与互补单链DNA稳定结合并解离出来，互补的单链可以结合新的探针开始新一轮循环，实现信号的扩大。整个过程中，通过RNase HII的切割，把与探针互补单链DNA的输入转化成探针断裂的输出，通过碱基的互补配对原则确保生成的产物的特异性，同时实现信号的放大，通过检测探针断裂的情况获得检测结果。

需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1~12所示的引物或探针具有大于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰，以及引入碱基替代物，并且可根据标准技术制备。

术语“碱基替代物” 为不含有碱基，又连接核酸链上下游保持探针整体的完整性，也不妨碍核酸链杂交的结构。例如，当靶序列中出现不需要被检测的多态性位点，可以通过将探针对应位置的碱基以碱基替代物替换来实现简并分析。碱基替代物常用脱氧核苷酸间隔物（dSpacer）或C3间臂（Spacer）。碱基替代物的数量可以为1、2、3、4、5、6个。

术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。

对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST (Altschuletal., 1990、J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic AcidsRes25:17, 3389-402)确定百分比同一性。

引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。

碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。

此外，除特别强调的位点以外，如本领域技术人员所通常理解的，探针总体上由DNA碱基所组成。同理，引物也由DNA碱基所组成。

在一些实施方式中，还可以通过在探针的3’末端加入与靶标序列无关的核酸序列，实现3’末端的封闭。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自乙二醇、C9间臂（Spacer 9）、C18间臂（Spacer 18）、双脱氧间臂[1’,2’-Dideoxyribose (dSpacer)]、C3间臂（C3 Spacer）中的任一种。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自C3间臂。

在一些实施方式中，所述探针在核糖核苷酸两侧的DNA碱基分别标记有荧光基团和淬灭基团。

在一些实施方式中，所述探针的荧光基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。

在一些实施方式中，所述探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。

本发明还涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合试剂盒。

术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。

在一些实施方式中，所述试剂盒还含有如下成分中的至少一种：

核糖核酸酶 H II、样本裂解液、阳性对照、水以及恒温扩增反应所需试剂。

根据反应温度不同，可以使用不同的RNase HII。在一些实施方式中，反应温度为50℃~70℃，优选55℃~65℃，使用嗜热的，如Thermus thermophilus、Pyrococcus abyssi来源的RNase HII。

在一些实施方式中，所述恒温扩增反应所需试剂含有如下成分中的至少一种：

具有链置换能力的DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、缓冲成分、二硫苏糖醇。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

在一些实施方式中，所述逆转录酶选自AMV、HIV RT、RTX中的至少一种。

本发明中所采用的酶可以是野生型酶，也可以是经过序列优化的突变型酶（通常是酶活性增强，或者具有其他优选的性能，例如更好的热稳定性）。

各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供LAMP反应所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始LAMP及HII报告系统报告过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。在一些实施方式中，所述恒温扩增反应所需试剂为冻干试剂。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的引物探针组合试剂盒在制备用于检测甲型流感病毒的诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还涉及如上所述的引物探针组合试剂盒、或如上所述的试剂盒在检测甲型流感病毒中的用途。

在一些实施方式中，检测的温度为50℃~70℃，优选55℃~65℃，也可以选择60℃。

检测的温度可通过水浴提供。

在一些实施方式中，检测的时间为10~60分钟；例如15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、50分钟；优选30分钟。

这样的用途可以是诊断或非诊断目的。

这样的用途可以用于辅助诊断甲型流感病毒（Influenza A）。

上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有甲型流感病毒的动物，特别是家畜及禽类，例如猪、鸡、鹅、鸭；优选为灵长类动物，更优选为人。

检测甲型流感病毒所用的样本优选采集流感样病例的呼吸道标本，如咽拭子、鼻拭子、鼻 咽拭子等，必要时，可同时采集急性期和恢复期双份血清样本。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本和发病7天内急性期血清以及发病后第2~4周的恢复期血清。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1 一种甲型流感病毒病毒荧光法检测试剂盒检测方法的建立

结合指导原则中的建议及对甲型流感病毒基因组保守性的分析，选择M基因进行引物及探针设计。设计的引物及探针如下：

A组：

引物F3：5’-CCGAGGTCGAAACGTATGTTCT-3’ （SEQ ID NO：1）

引物B3：5’-CATTTTGGACAAAGCGTCTACG-3’ （SEQ ID NO：2）

引物FIP：5’-TGAGAGCCTCAAGATCTGTGTTCCATCAGGCCCCCTCAAAGC -3’ （SEQ ID NO：3）

引物BIP：5’-GACAAGACCAATTCTGTCACCTCTTTTTGCAGTCCTCGCTCACTGGG -3’ （SEQID NO：4）

引物LF：5’-ACATCTTCAAGTCTCTGCGC-3’ （SEQ ID NO：5）

引物LB：5’-GGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACG-3’ （SEQ ID NO：6）

引物探针：5’-FAM-ATCTTCAA[rG]TCTCTGCG-BHQ1-3’ （SEQ ID NO：7）

B组：

引物F3：5’-CAGGCCCCCTCAAAGC -3’

引物B3：5’-TCTACGCTGCAGTCCTC -3’

引物FIP：5’-GCCATTCCATGAGAGCCTCAAGCGAGATCGCGCAGAGAC -3’

引物BIP：5’-TCTGTCACCTCTGACTAAGGGGGCTCACTGGGCACGGT-3’

引物LF：5’-TCCCAGCAAAGACATCTTCAA-3’

引物LB：5’-ATTTTGGGGTTTGTGTTCACG -3’

引物探针：5’ -CCCAGCAAA[rG]ACATCTTC-BHQ1-3’

两组引物探针分别对质粒和空白（无核酸酶水）进行检测。

结果如图1所示。两组引物对空白的检测均正常，对质粒检测，A组引物起峰的时间更早。本发明后续的实施例，以以A组引物及探针配制反应体系。

检测方法的建立

本发明构建一种基于恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统的检测甲型流感病毒病毒的试剂盒，包括样本裂解液，恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块，阳性对照和阴性对照，其中样本裂解液含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块中反应体系最优配比如表1所示，包含了本实施例所述的荧光标记探针及所述的引物；阳性对照为含有甲型流感病毒的靶标基因质粒，阴性对照为无核酸酶水。

表1 反应模块反应体系配比

序号	组分	浓度
			1	Tris-HCl（pH 8.8）	10 mM
2	硫酸铵	10 mM
			3	氯化钾	60 mM
4	硫酸镁	3 mM
			5	吐温20	0.10%
6	A组引物F3	0.25 μM
			7	A组引物B3	0.25 μM
8	A组引物FIP	1.6 μM
			9	A组引物BIP	1.6 μM
10	A组引物LF	0.3 μM
			11	A组引物LB	0.3 μM
12	A组引物探针	0.2 μM
			13	Bst聚合酶	12 U
14	反转录酶	200 U

所述反应体系的反应条件为：50-65℃下反应10-60min。

最佳反应条件为：63℃反应40min。

本实施例中对收集的2例经荧光定量PCR验证均为甲型流感病毒RNA阳性的鼻咽拭子/鼻腔冲洗液或吸取物样本，使用本发明的荧光法检测试剂盒测试。

具体操作如下：

步骤一、样本处理。将15 μL样本裂解液和10 μL 阳性对照/阴性对照/待检样本震荡混匀，室温静置5 min；

步骤二、将步骤一产物全部加入恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：63℃ 1分钟，40个循环，此处采集荧光信号，40min可完成检测；

步骤三、结果判定。

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，为有效结果；

②阴性对照：无扩增曲线出现，或终点荧光值低于起点荧光值的3倍，为有效结果；

③被检样本：

a.若终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，判断为阳性；

b.若终点荧光值低于起点荧光值的3倍，判断为阴性。

阳性对照、阴性对照符合“①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，为有效结果；②阴性对照：无扩增曲线出现，或终点荧光值低于起点荧光值的3倍，为有效结果；”的内容，各样本终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，判断为阳性。

结果表明，本实施例建立的甲型流感病毒荧光法检测试剂盒的检测方法能够对鼻咽拭子/鼻腔冲洗液或吸取物中的甲型流感病毒RNA进行检测。

实施例2 甲型流感病毒病毒荧光法检测试剂盒灵敏度测试

将甲型流感病毒标准物质，分别稀释成5000 copies/mL、500 copies/mL、50copies/mL，检验试剂盒的灵敏度。

具体操作如下：

分别取不同浓度的标准物质，以及阴、阳性对照进行检测，其中标准物质每个浓度梯度分别检测5次，记录结果。

结果如图2所示。阴阳性对照检测结果正常。5000 copies/mL、500 copies/mL浓度全部检出，50 copies/mL概率检出，根据10 μL加样体积换算，5 copies/反应以上浓度可稳定检出，0.5 copies/反应时受到取样影响概率检出。

实施例3 甲型流感病毒病毒荧光法检测试剂盒特异性测试

将临床上收集4例甲型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H7N9)、1例乙型流感病毒（Influenza B virus，FluB）、1例呼吸道合胞病毒(Respiratory Sycytial Virus，RSV)、腺病毒(adenovirus，ADV)4种共7例经荧光定量PCR验证为对应病毒阳性的样本进行检测，检验试剂盒的特异性。

具体操作如下：

分别取7例样本以及阴、阳性对照进行检测，记录结果。

结果如图3所示。4例甲型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H7N9)检测结果为阳性，1例FluB、1例RSV、1例腺病毒检测结果为阴性，阴阳性对照检测结果正常。表明本发明的试剂盒检测结果的特异性。

实施例4 甲型流感病毒病毒荧光法检测试剂盒稳定性测试

液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。本试剂盒将包含恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统的荧光法反应液滴在真空干燥成冻干珠试剂，冻干后的冻干珠试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易。本实施例对甲型流感病毒荧光检测试剂盒的稳定性进行验证。

具体操作如下：

将含有冻干试剂的冻干珠密封于西林瓶中，抽真空至0.1Mpa，密封瓶盖保存于2℃及28℃恒温环境。分别于0天、30天、90天、180天、240天，取冻干试剂进行测试。

分别取阴、阳性对照进行检测，记录结果。

结果如图4所示。分别对保存了0天、30天、90天、180、240天的反应模块试剂冻干粉进行测试，本发明的试剂盒中试剂冻干后，在0天、30天、90天、180、240天的检测结果均为符合。表明本发明的试剂盒中试剂冻干成干粉微球后，在2~28℃中能稳定保存至少6个月。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.引物探针组合试剂盒，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1~4所示；

环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中，探针5’端第9位核苷酸为核糖核苷酸。

2.根据权利要求1所述的组合产品，所述探针在核糖核苷酸两侧的DNA碱基分别标记有荧光基团和淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的组合产品，所述探针的荧光基团选自AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。

4.根据权利要求2所述的组合产品，所述探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。

5.试剂盒，其含有权利要求1~4任一项所述的引物探针组合试剂盒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其还含有如下成分中的至少一种：

样本裂解液、阳性对照、阴性对照以及恒温扩增反应所需试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述恒温扩增反应所需试剂含有如下成分中的至少一种：

核糖核酸酶 HII、具有链置换能力的DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、缓冲成分、二硫苏糖醇。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

9.根据权利要求6~8任一项所述的试剂盒，所述恒温扩增反应所需试剂为冻干试剂。

10.权利要求1~4任一项所述的引物探针组合试剂盒在制备用于检测甲型流感病毒的诊断试剂或试剂盒中的应用。

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