CN111793720A - 一种酶切探针恒温检测SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸的试剂盒 - Google Patents

一种酶切探针恒温检测SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种酶切探针恒温检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒ORF1ab基因等温扩增引物和相应可被RNaseH酶切的含RNA碱基探针；其中该碱基探针的RNA碱基左、右两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。利用高效的恒温扩增的引物与探针，可以对SARS‑CoV‑2新型冠状病毒进行恒温的多重检测，具有高灵敏度与高特异性。本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，实现对新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、肺泡灌洗液和痰液样本的检测，具有简便、快速、准确的特点。

Description

一种酶切探针恒温检测SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸的试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种酶切探针恒温检测SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸的试剂盒。
背景技术
冠状病毒为不分阶段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科，根据其血清型和基因组特点，分为α、β、γ、δ四个属。已知感染人的冠状病毒有7种，包括HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、MERSr-CoV、SARSr-CoV和新发现的SARS-CoV-2；SARS-CoV-2是一种β属的新型冠状病毒。
SARS-CoV-2对紫外线和热敏感，56℃30min、乙醚、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸等均可有效灭活冠状病毒。基于目前的流行病学调查和研究成果，潜伏期为1-14天，多为3-7天；感染途径主要为SARS-CoV-2感染患者，目前SARS-CoV-2表现出来的主要症状为发热、咳嗽、乏力、肌肉疼痛或者不适；重症表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍，感染途径还包括无症状感染者，无症状感染者的存在可导致疑似感染者及密切接触者数量大量增加，加速疫情的蔓延。
新型冠状病毒肺炎的诊断基于流行病学史、临床表现及影像学表现，而病毒的核酸检测可为其诊断提供直接证据，促进患者的隔离、治疗和评估，同时还能为疫情防控中心及时切断传播途径、有效控制传染源提供指导，保障疫情的防控。目前我国《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中推荐用实时荧光RT-PCR技术，该技术具有高度灵敏、高特异性，是目前核酸检测广泛运用的方法。但由于PCR方法对实验室，设备等要求较高，不能满足一些室外环境或较落后地区的检测，因此需要开发一种简便、快速的SARS-CoV-2 检测试剂盒。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种酶切探针恒温检测SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：检测SARS-CoV-2新型冠状病毒ORF1ab基因等温扩增引物和相应可被RNaseH酶切的含RNA碱基探针；其中该碱基探针的RNA碱基左、右两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。
在一种实施方式中，所述检测SARS-CoV-2新型冠状病毒ORF1ab基因等温扩增引物是SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6和相应可被RNaseH酶切的探针是SEQ ID NO.7，该探针中包括一个RNA碱基，斜体小写字母表示的碱基为RNA碱基，T修饰报告荧光基团，淬灭基团修饰在3'末端；
Figure BDA0002608885630000021
。
在一种实施方式中，试剂盒还包括检测一段人工合成且与SARS-CoV-2新型冠状病毒及人源核酸均非同源的内参基因等温扩增引物SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.13和相应可被RNaseH酶切探针SEQ ID NO.14，该探针中包括一个RNA碱基，斜体下划线小写所显示的碱基为RNA碱基，T修饰报告荧光基团，淬灭基团修饰在3'末端；
Figure BDA0002608885630000022
Figure BDA0002608885630000031
。
在一种实施中，所述内参基因为植物中一段随机组合序列。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照品，该对照品为SARS-CoV-2ORF1ab 基因的假病毒。
在一种实施方式中，荧光报告基团可分别为FAM、VIC、HEX、ROX、Texas Red、 CY3、CY5中的任一种，所述淬灭基团是BHQ1、BHQ2、BHQ3中任一种。
本发明开发了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，实现对新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、肺泡灌洗液和痰液样本的检测，具有简便、快速、准确的特点，为疫情的防控提供支持。本发明的试剂盒具有以下主要优点：
1.时间快速，检测病原体RNA在1个小时内完成，最快可30min内出检测报告。
2.敏感性和特异性好：多对引物扩增同一靶标，敏感性和特异性极高。
3.实时扩增：含有可酶切的探针，可实时观察扩增情况；
4.引入内参质控，可以全面监测试验过程，保证试验质量；
5.社会成本低，且对设备和场景要求低。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是表示试剂盒重复20次检测样本1 250Copies/mL结果图；
图2是表示试剂盒重复20次检测样本2 250Copies/mL结果图；
图3是表示试剂盒重复20次检测样本3 250Copies/mL结果图；
图4是表示试剂盒检测其他呼吸道病原体和人基因组核酸的交叉扩增图。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，所用的材料，如无特殊说明，均为本领域常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1新型冠状病毒检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)引物探针筛选
1.引物探针序列筛选
a.引物探针序列
选择新型冠状病毒特异性的ORF1ab保守区域作为扩增的靶标基因，设计特异性的引物和含RNA碱基的探针(rProbe)，其中rProbe的RNA碱基左、右两端分别标记FAM 荧光基团和BHQ1淬灭基团；体系中以重组的植物中的一段保守序列作为外源内参，作为对试剂以及操作本身的质控，避免假阴性，设计特异性的引物和含RNA碱基的探针 (rProbe)，其中rProbe的RNA碱基左、右两端分别标记ROX荧光基团和BHQ2淬灭基团。选取的引物探针组合序列见表1和2。
表1新型冠状病毒靶标引物探针序列筛选
Figure BDA0002608885630000041
Figure BDA0002608885630000051
注：探针序列中小写字母表示RNA碱基，T修饰报告荧光基团，淬灭基团修饰在3'末端
表2外源内参引物探针序列筛选
Figure BDA0002608885630000052
注：探针序列中小写字母表示RNA碱基，T修饰报告荧光基团，淬灭基团修饰在3'末端
a.使用模板：SARS-CoV-2和内参假病毒浓度均为1000Copies/mL、500Copies/mL、250Copies/mL及检测16例新型冠状病毒阴性样本(包括HKU1，OC43，NL63、229E、 SARA冠状病毒、MERS冠状病毒的核酸)和人基因组DNA(核酸浓度均>105Copies/mL)。
b.试剂盒组分浓度
各组分浓度为：RNaseH为14-16mU，甜菜碱为0.3-0.4M，dNTP为1.4-1.7mM， MgSO4为5-6mM，FIP和BIP浓度为1.4-1.6μM，F3和B3浓度为0.6-0.8μM，LF和 LB浓度为为0.2-0.3μM，探针浓度为0.2-0.3μM。Bst聚合酶16-18U，AMV逆转录酶为 60-62U。
c.扩增程序为：60cycles:63℃,1min(收集荧光)
d.结果：新型冠状病毒第一套引物探针组合检测假病毒灵敏度最高，可检出250copies/mL，且与人源DNA及其他冠状病毒无交叉。内参的第2套引物探针组合检测内参假病毒的灵敏度最高，可检出250copies/mL。
表3新冠和内参引物探针筛选结果
Figure BDA0002608885630000061
2.新冠和内参二重组合评价
a.经过筛选评价，新冠和内参的最终使用引物和探针如下表4。
表4新冠和内参引物探针筛选序列
Figure BDA0002608885630000062
Figure BDA0002608885630000071
b.对筛选的新冠和内参引物进行组合评价，多重反应液组分浓度如下：
RNaseH为14-16mU，甜菜碱为0.3-0.4M，dNTP为1.4-1.7mM，MgSO4为5-6mM，新冠FIP和BIP浓度为1.4-1.6μM，F3和B3浓度为0.6-0.8μM，LF和LB浓度为0.2-0.3μM，探针浓度为0.2-0.3μM；内参FIP和BIP浓度为0.18-0.23μM.F3和B3浓度为0.13-0.16μM， LF和LB浓度为0.02-0.03μM，探针浓度为0.05-0.07μM。
c.制备模板：将SARS-CoV-2和内参假病毒浓度混合成终浓度为1000Copies/mL、500Copies/mL、250Copies/mL及检测16例新型冠状病毒阴性样本(包括HKU1，OC43， NL63、229E、SARA冠状病毒、MERS冠状病毒的核酸)和人基因组DNA(核酸浓度均 >105Copies/mL)。
d.结果：
表5新冠和内参二重组合检测结果
Figure BDA0002608885630000072
由上表结果可知，多重反应液的灵敏度与基本一致，可检出250Copies/mL的新型冠状病毒假病毒溶液。
实施例2新型冠状病毒检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)制备
1.试剂盒组分：核酸反应液、检测酶液、阳性对照品、阴性对照品和内参对照品，其中核酸反应液包括引物、探针、核糖核酸酶RNaseH、甜菜碱、dNTP、MgSO4、buffer；检测酶液包括Bst聚合酶、AMV逆转录酶；阳性对照品为SARS-CoV-2ORF1ab基因的假病毒，浓度为106Copies/mL；内参对照品为所述外源内参假病毒，浓度为104Copies/mL；阴性对照品为无RNase和DNase水。
2.样本处理
采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(52904)、天根生化科技(北京)有限公司的病毒RNA提取试剂盒(YDP315-R)、常州金麦格生物技术有限公司的“核酸提取试剂”(苏常械备20190082号)或江苏宏微特斯医药科技有限公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)(HWTS-3001)进行样本核酸的提取和纯化，其中痰液样本参考《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第五版)》)进行前处理。提取过程中每管加入内参对照品3μL，阳性对照品和阴性对照品需平行参与提取。
3.扩增检测
按照下表6配制扩增试剂，加入提取的核酸各10μL后进行上机检测，所用仪器为荧光PCR仪或等温扩增仪，仪器通道选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：None) 检测2019新型冠状病毒核酸；选择ROX通道(Reporter：ROX，Quencher：None) 检测内参。反应程序为60℃，1min，60cycles，在FAM和ROX通道收集荧光信号。
表6反应Mix配制表
成分 核酸反应液 检测酶液
扩增试剂比例 19.3μL×N 0.7μL×N
4.结果分析
4.1.如果检测样本FAM通道有明显扩增曲线，且Tt值≤50，则判断为新型冠状病毒阳性。
4.2.如果检测样本FAM通道50＜Tt值＜60，需进行复验，若复验结果一致，则判断为新型冠状病毒阳性。
4.3.如果检测样本FAM通道无扩增信号，ROX通道有扩增曲线且Tt值≤45，则判断为新型冠状病毒阴性；如果检测样本FAM通道无扩增信号，ROX通道有扩增曲线且 Tt值＞45，建议重新提取后进行检测。
4.4.如果检测样本FAM通道和ROX通道均无扩增信号，建议重新提取样本后进行检测。
5.临床样本检测结果
按照上述操作步骤检测21例样本的结果见下表7，结果显示制备的新型冠状病毒检测试剂盒可准确进行样本检测，结果与临床诊断的符合率为100％。
表7 21例样本检测结果
Figure BDA0002608885630000091
实施例3新型冠状病毒检测试剂盒检测灵敏度
选择3例不同来源的SARS-CoV-2阳性样本，使用ddPCR进行浓度标定，将已标定的3例SARS-CoV-2阳性样本，根据其浓度使用SARS-CoV-2阴性样本进行稀释得到 1000Copies/mL、500Copies/mL、250Copies/mL和100Copies/mL浓度的样本，每个梯度的样品重复检测20次，确定试剂盒的检测灵敏度，按照实施例1的操作步骤进行检测，试剂盒检测3例样本不同浓度的结果见下表8，检测3例样本的250Copies/mL重复20 次结果见图1-3。
结果显示试剂盒检测3例不同来源的样本250Copies/mL重复20次均能稳定检出，因此确定试剂盒的检测限为250Copies/mL。
表8不同样本的最低检测限评价结果统计
Figure BDA0002608885630000101
实施例4新型冠状病毒检测试剂盒检测特异性
为了排除本试剂盒与其他呼吸道病原体RNA的交叉反应，选取人冠状病毒 SARSr-CoV、MERSr-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、季节性H1N1流感病毒、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、 B、C，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，人偏肺病毒、肠病毒A、B、C、D，人间质肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘 -带状疱疹病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、耶氏肺孢子虫及人基因组核酸，验证新型冠状病毒检测试剂盒的检测特异性，按照实施例1的操作步骤进行检测，结果见图4，其中A 表示内参，B表示新型冠状病毒。
结果显示试剂盒检测上述呼吸道病原体及人因组均为阴性，说明试剂盒与上述呼吸道病原体及人因组均无交叉反应。
实施例5新型冠状病毒检测试剂盒干扰性能验证
试剂盒检测样本中可能含有的内源性干扰物质主要为粘蛋白、人血液，对于新型冠状病毒SARS-CoV-2感染患者，常见的外源性干扰物质主要为一些抗菌和抗病毒药物，如抗病毒药物α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、抗生素莫匹罗星、阿奇霉素、头孢菌素、美罗培南、左氧氟沙星以及妥布霉素等；外源性干扰物质鼻用喷雾剂或滴鼻剂(苯福林、羟甲唑啉、氯化钠(含防腐剂))鼻用皮肤类固醇(倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松)、过敏性症状缓解药物盐酸组胺。这些内源和外源性干扰物质可能会对样本提取及检测存在影响，按照实施例1的操作步骤进行检测，结果见下表9。
结果显示，当干扰物质浓度分别为：粘蛋白(60mg/mL)、10％(v/v)的人血液、苯福林(2mg/mL)、羟甲唑啉(2mg/mL)、氯化钠(含防腐剂)(20mg/mL)、倍氯美松 (20mg/mL)、地塞米松(20mg/mL)、氟尼缩松(20μg/mL)、曲安奈德(2mg/mL)、布地奈德(2mg/mL)、莫米松(2mg/mL)、氟替卡松(2mg/mL)、盐酸组胺(5mg/mL)、α-干扰素(800IU/mL)、扎那米韦(20mg/mL)、利巴韦林(10mg/mL)、奥司他韦(60ng/mL) 帕拉米韦(1mg/mL)、洛匹那韦(500mg/mL)、利托那韦(60mg/mL)、莫匹罗星(20mg/mL)、阿奇霉素(1mg/mL)、头孢丙烯(40μg/mL)美罗培南(200mg/mL)、左氧氟沙星(10μg/mL)、妥布霉素(0.6mg/mL)对检测体系无干扰。
表9干扰物质检测结果
Figure BDA0002608885630000111
Figure BDA0002608885630000121
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 一种酶切探针恒温检测SARS⁃CoV⁃2新型冠状病毒核酸的试剂盒
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caaaatcatt ctccatgcct ctcct 25

Claims (6)

1.一种酶切探针恒温检测SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测SARS-CoV-2新型冠状病毒ORF1ab基因等温扩增引物和相应可被RNaseH酶切的含RNA碱基探针；其中该碱基探针的RNA碱基左、右两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测SARS-CoV-2新型冠状病毒ORF1ab基因等温扩增引物是SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6和相应可被RNaseH酶切的探针是SEQ ID NO.7，该探针中包括一个RNA碱基，斜体小写字母表示的碱基为RNA碱基，T修饰报告荧光基团，淬灭基团修饰在3'末端；
Figure FDA0002608885620000011
。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：检测一段人工合成且与SARS-CoV-2新型冠状病毒及人源核酸均非同源的内参基因等温扩增引物SEQ IDNO.8-SEQ ID NO.13和相应可被RNaseH酶切探针SEQ ID NO.14，该探针中包括一个RNA碱基，斜体下划线小写所显示的碱基为RNA碱基，T修饰报告荧光基团，淬灭基团修饰在3'末端；
Figure FDA0002608885620000012
。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为植物中一段随机组合序列。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品，该对照品为SARS-CoV-2ORF1ab基因的假病毒。
6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，荧光报告基团可分别为FAM、VIC、HEX、ROX、Texas Red、CY3、CY5中的任一种，所述淬灭基团是BHQ1、BHQ2、BHQ3中任一种。
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