CN113073151A - 一种使用酶切探针报告系统的检测腺病毒HAdV的引物探针组合物及其试剂盒 - Google Patents
一种使用酶切探针报告系统的检测腺病毒HAdV的引物探针组合物及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测腺病毒的引物探针组合产品。所述引物探针组合产品包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针。本发明提供的试剂盒用于腺病毒DNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为腺病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测腺病毒HAdV的引物探针组合物及其试剂盒。
背景技术
人腺病毒（Human adenovirus, HAdV）肺炎（以下简称腺病毒肺炎）是儿童社区获得性肺炎中较为严重的类型之一，多发于6个月至5岁儿童，是目前造成婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一。
HAdV属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链DNA病毒，1953年由Rowe等首次发现。目前已发现至少90个基因型，分为A-G共7个亚属，不同型别 HAdV的组织嗜性、致病力、流行地区等特性不同。HAdV感染可引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等。与呼吸道感染相关的HAdV主要有B亚属（HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55 型），C 亚属（HAdV-1、2、5、6、57型）和E亚属（HAdV-4型）。
在儿童腺病毒肺炎诊疗规范中，对腺病毒的病原学检查包括以下几种：（1）病毒分离和血清学鉴定。传统的病毒分离和血清分型方法虽是诊断腺病毒的金标准，但不适于临床早期诊断。（2）抗原检测。针对腺病毒衣壳六邻体抗原进行检测，多采用免疫荧光方法，标本为鼻咽抽吸物、鼻咽拭子、痰液及肺泡灌洗液，发病 3-5 天内检出率最高，重症病例 2-3周仍可阳性。但是该方法存在特异性不高的情况。（3）PCR检测。比传统的病毒培养和病毒抗原检测敏感性更高，标本为鼻咽拭子或痰液、支气管肺泡灌洗液等。实时定量 PCR 可对病毒进行定量分析，帮助预测病情严重程度。但是但是该法需要依赖于较为复杂的检测流程和相对复杂高价的仪器，同时对于检测环境的要求很高，目前需要在疾控中心等地集中检测，容易面临检测试剂有限、检测仪器和实验人员均超负荷运转等问题，无法广泛普及至广大基层医院、防控现场和家庭。（4）其他方法。宏基因测序在诊断腺病毒感染以及分型方具有优势，但价格昂贵，结果需要专业人员判定，不推荐常规开展。该方法主要用于特殊人群如合并基础疾病、免疫缺陷病、其他方法检测阴性或病情危重以及混合感染需尽早明确病原的患儿，结果判断必须结合临床。
随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）、RPA（重组酶依赖的扩增技术）等均可在等温条件下扩增病毒核酸。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在无需反复变温的反应条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。及时准确地病毒检测对于疾病的防治具有重要意义，因此研究和开发一种能在基层诊疗机构使用，在常温下快速检测核酸的试剂盒非常有必要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一方面涉及引物探针组合物，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；
F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1~4所示；
HAdV-F3（SEQ ID NO .1）：5’-TTGCGATCGCACCCTTTG-3′
HAdV-B3（SEQ ID NO .2）：5’-ACACGGACCACGTCAAAG-3′
HAdV-FIP（SEQ ID NO .3）：5’-AGGTTTTGGCCCAGGTCTGTGGCGCATCCCATTCTCCAG-3′
HAdV-BIP（SEQ ID NO .4）：5’-TCTCTACGCCAACTCCGCCCAAGAAGGGTGGGCTCGTC-3′
环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~6所示；
HAdV-LF（SEQ ID NO .5）：5’-TGCGCCCATGGACATAAAG -3′
HAdV-LB（SEQ ID NO .6）：5’-ACGCGCTAGACATGACTTT-3′
探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中，探针5’端第10位核苷酸为核糖核苷酸。
HAdV-P（SEQ ID NO .7）：5’-FAM-TGCGCCCAT[rG]GACATAAAG-BHQ1-3’
本发明的第二方面涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合物。
本发明的第三方面涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于检测HAdV的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1）本发明提供的试剂盒用于HAdV病毒DNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为HAdV病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。
2）本发明提供的试剂盒采用核糖核酸酶HII报告系统，与恒温扩增同步反应，在55~65℃条件下均可实现靶基因的有效扩增及检测，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，10-40min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为500 copies/mL。
3）本发明方法中核糖核酸酶HII对探针和靶标序列具有高度特异性，只有扩增产物和探针序列完全互补才发出荧光信号，使扩增的特异性大大提高，从而实现无本底背景的高效恒温核酸扩增。
4）检测所需反应条件简单，对硬件要求低，成本较低，利于技术的广泛推广。
5）可冻干，便于运输，符合POCT场景需求，对应实施例结果；
附图说明
图1为实施例1中对两组引物探针的验证结果；
图2为实施例2中HAdV的灵敏度测试结果；
图3为实施例3中对本发明所提供的引物探针的特异性验证结果；
图4为实施例4中试剂盒稳定性检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；
F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1~4所示；
环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~6所示；
探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中，探针5’端第10位核苷酸为核糖核苷酸。
FIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3端有与靶序列的F2c区互补的F2区并且在5端有与靶基因的F1c区相同的序列。
F3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因F3c区互补的F3区。
BIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3'端有与靶序列B2c区互补的B2区并且在5端有与靶基因Blc区相同的序列。
B3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因B3c区互的B3区。
使用本发明引物组时，可加入一或两类环状引物（LF引物或LB引物）以便加速核酸扩增反应。设计这样的环状引物以使其退火至F1和F2之间的区域或B1和B2之间的区域，然后加入到恒温扩增反应系统。这样，这些引物与在核酸扩增过程中未使用的环状部分结合，以致利用所有的环状部分作为起点促进核酸反应，从而加速核酸扩增反应。
上述引物探针组合物能够配合核糖核酸酶 HII实现对HAdV更加灵敏和特异性的诊断。
核糖核酸酶 HII（RNase HII）为核糖核酸内切酶，适用于在双链 DNA 内部切刻核糖核酸的 5´ 末端，产生 5´ 磷酸和 3´ 羟基末端。RNase HII可以特异性地识别DNA双链中的RNA碱基，并使RNA碱基5’方向连接DNA碱基的磷酸二酯键断裂，导致DNA双链在RNA碱基的5’方向产生了一个切口。在生物体内，通过该切割引发DNA修复，可去除双链DNA中的RNA碱基，确保遗传信息的准确性。本发明基于RNase HII对底物严格配对要求的特性，设计了一种单链探针，该探针内部嵌入了RNA碱基，并将RNase HII应用于扩增系统的报告体系中。由于RNase HII只能识别和切割双链，因此不会作用于单链的探针。在合适的温度下，当环境中存在与探针互补配对的单链DNA，探针会与之杂交，并被RNase HII在特定位置切断，被切断的探针熔解温度下降，无法保持与互补单链DNA稳定结合并解离出来，互补的单链可以结合新的探针开始新一轮循环，实现信号的扩大。整个过程中，通过RNase HII的切割，把与探针互补单链DNA的输入转化成探针断裂的输出，通过碱基的互补配对原则确保生成的产物的特异性，同时实现信号的放大，通过检测探针断裂的情况获得检测结果。
需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO.1~7所示的引物或探针具有大于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰，以及引入碱基替代物，并且可根据标准技术制备。
术语“碱基替代物” 为不含有碱基，又连接核酸链上下游保持探针整体的完整性，也不妨碍核酸链杂交的结构。例如，当靶序列中出现不需要被检测的多态性位点，可以通过将探针对应位置的碱基以碱基替代物替换来实现简并分析。碱基替代物常用脱氧核苷酸间隔物（dSpacer）或C3间臂（Spacer）。碱基替代物的数量可以为1、2、3、4、5、6个。
术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST (Altschuletal., 1990、J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic AcidsRes25:17, 3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
此外，除特别强调的位点以外，如本领域技术人员所通常理解的，探针总体上由DNA碱基所组成。同理，引物也由DNA碱基所组成。
在一些实施方式中，还可以通过在探针的3’末端加入与靶标序列无关的核酸序列，实现3’末端的封闭。
在一些实施方式中，所述间臂修饰选自乙二醇、C9间臂（Spacer 9）、C18间臂（Spacer 18）、双脱氧间臂[1’,2’-Dideoxyribose (dSpacer)]、C3间臂（C3 Spacer）中的任一种。
在一些实施方式中，所述间臂修饰选自C3间臂。
在一些实施方式中，所述探针在核糖核苷酸两侧的DNA碱基分别标记有荧光基团和淬灭基团。
在一些实施方式中，所述探针的荧光基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中，所述探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
本发明还涉及一种试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合物。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有如下成分中的至少一种：
核糖核酸酶HII、样本裂解液、阳性对照、阴性对照以及恒温扩增反应所需试剂。
根据反应温度不同，可以使用不同的RNase HII。在一些实施方式中，反应温度为50℃~70℃，优选55℃~65℃，使用嗜热的酶，如Thermus thermophilus、Pyrococcus abyssi来源的RNase HII。
在一些实施方式中，所述恒温扩增反应所需试剂含有如下成分中的至少一种：
具有链置换功能的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、Na+、K+、缓冲成分、二硫苏糖醇。
在一些实施方式中，所述的具有链置换功能的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
各组分优选以冻干形式，例如以冻干粉或冻干珠的形式实现。冻干后的试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易并降低了操作误差。在一些实施方式中，所述恒温扩增反应所需试剂为冻干试剂。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的引物探针组合物在制备用于检测HAdV的试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，检测的温度为50℃~70℃，优选55℃~65℃。
检测的温度可通过水浴、金属浴等方式提供。
在一些实施方式中，检测的时间为10-60分钟；例如15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、50分钟；优选30-40分钟。
这样的用途可以是诊断或非诊断目的。
这样的用途可以用于检测HAdV。
检测HAdV用的样本优选为受试者的上呼吸道标本（如咽拭子、鼻拭子等）、下呼吸道标本（如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等）。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 一种用于HAdV病毒荧光法检测试剂盒检测方法的建立
结合指导原则中的建议及对HAdV基因组保守性的分析，选择保守区域进行引物及探针设计。设计的引物及探针如下：
A组：
HAdV-F3（SEQ ID NO .1）：5’-TTGCGATCGCACCCTTTG-3′
HAdV-B3（SEQ ID NO .2）：5’-ACACGGACCACGTCAAAG-3′
HAdV-FIP（SEQ ID NO .3）：5’-AGGTTTTGGCCCAGGTCTGTGGCGCATCCCATTCTCCAG-3′
HAdV-BIP（SEQ ID NO .4）：5’-TCTCTACGCCAACTCCGCCCAAGAAGGGTGGGCTCGTC-3′
HAdV-LF（SEQ ID NO .5）：5’-TGCGCCCATGGACATAAAG -3′
HAdV-LB（SEQ ID NO .6）：5’-ACGCGCTAGACATGACTTT-3′
探针：HAdV-P（SEQ ID NO .7）：5’-FAM-TGCGCCCAT[rG]GACATAAAG-BHQ1-3
B组：
HAdV-F3_1：5’-TGCCCTACCCACTAATAGGC -3′
HAdV-B3_1：5’-CATAAAGAAGGGTGGGCTCG -3′
HAdV-FIP_1：5’-GATGCGCCAAAGGGTGCGATAAAACCGCGGTTGACAGT -3′
HAdV-BIP_1：5’-CACTCACAGACCTGGGCCAAAATCCATGGGATCCACCTCAA -3′
HAdV-LF_1：5’-CGCAAAGAAACTTTTTCTGGG -3′
HAdV-LB_1：5’-CCTTCTCTACGCCAACTCC -3′
探针：HAdV-P_：5’-FAM-CGCAAAGAAA[rC]TTTTTCTGG-BHQ1-3
两组引物探针分别对质粒和空白（NTC）进行检测。
结果如图1所示。两组引物对空白的检测均正常，对质粒检测，A组引物起峰的时间更早。本发明后续的实施例，以A组引物及探针配制反应体系。
检测方法的建立：
本发明构建一种基于恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统的检测腺病毒HAdV病毒的试剂盒，包括样本裂解液，恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块，阳性对照和阴性对照，其中样本裂解液含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块中反应体系最优配比如表1所示，包含了本实施例所述的荧光标记探针及所述的引物；阳性对照为含有HAdV病毒的靶标基因质粒，阴性对照为无核酸酶水。
表1 反应模块反应体系配比
所述反应体系的反应条件为：50-65℃下反应10-60min。
最佳反应条件为：65℃反应40min。
本实施例中对收集的2例经荧光定量PCR验证均为HAdV病毒阳性的鼻咽拭子/鼻腔冲洗液或吸取物样本，使用本发明的荧光法检测试剂盒测试。
具体操作如下：
步骤一、样本处理。将15 μL样本裂解液和10 μL 阳性对照/阴性对照/待检样本震荡混匀，室温静置5 min；
步骤二、将步骤一产物全部加入恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：65℃ 1分钟，40个循环，每分钟采集荧光信号，40min完成检测；
步骤三、结果判定。
①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，为有效结果；
②阴性对照：无扩增曲线出现，或终点荧光值低于起点荧光值的3倍，为有效结果；
③被检样本：
a.若终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，判断为阳性；
b.若终点荧光值低于起点荧光值的3倍，判断为阴性。
阳性对照、阴性对照符合“①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，为有效结果；②阴性对照：无扩增曲线出现，或终点荧光值低于起点荧光值的3倍，为有效结果；”的内容，各样本终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，判断为阳性。
结果表明，本实施例建立的HAdV病毒荧光法检测试剂盒的检测方法能够对鼻咽拭子/鼻腔冲洗液或吸取物中的HAdV病毒DNA进行检测。
实施例2 HAdV病毒荧光法检测试剂盒灵敏度测试
将HAdV标准物质，分别稀释成5000 copies/mL、500 copies/mL、50 copies/mL，检验试剂盒的灵敏度。
具体操作如下：
分别取不同浓度的标准物质，以及阴、阳性对照进行检测，其中标准物质每个浓度梯度分别检测5次，记录结果。
结果如图2所示。阴阳性对照检测结果正常。5000 copies/mL、500 copies/mL浓度全部检出，50 copies/mL概率检出，根据10 μL加样体积换算，5 copies/反应以上浓度可稳定检出，0.5 copies/反应时受到取样影响概率检出。
实施例3HAdV病毒荧光法检测试剂盒特异性测试
将临床上收集3例腺病毒HAdV、1例诺如病毒（Norovirus，NV）、1例轮状病毒（Rotavirus，RV）3种共5例经荧光定量PCR验证为对应病毒阳性的样本进行检测，检验试剂盒的特异性。
具体操作如下：
分别取5例样本以及阴、阳性对照进行检测，记录结果。
结果如图3所示。3例HAdV检测结果为阳性，1例NV、1例RV检测结果为阴性，阴阳性对照检测结果正常。表明本发明的试剂盒检测结果的特异性。
实施例4 HAdV病毒荧光法检测试剂盒稳定性测试
液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。本试剂盒将包含恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统的荧光法反应模块在真空干燥成粉状试剂，冻干后的粉状试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易，并减少操作误差。本实施例对HAdV病毒荧光检测试剂盒的稳定性进行验证。
具体操作如下：
将含有冻干试剂的八连管密封于含有干燥剂的铝箔袋中，保存于37℃恒温箱。分别于0天、30天、90天、180天，取冻干试剂进行测试。
分别取阴、阳性对照进行检测，记录结果。
结果如图4所示。分别对保存了0天、30天、90天、180天的反应模块试剂冻干粉进行测试，本发明的试剂盒中试剂冻干后，在0天、30天、90天、180天的检测结果均为符合。表明本发明的试剂盒中试剂冻干后，在37℃中能稳定保存至少3个月。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测腺病毒HAdV的引物探针组合物，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；
F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1~4所示；
环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~6所示；
探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中，探针5’端第10位核苷酸为核糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述探针在核糖核苷酸序列两端的DNA碱基分别标记有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的组合物，所述探针的荧光基团选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、以及Cy5.5中的任一种。
4.根据权利要求2所述的组合物，所述探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
5.一种检测腺病毒HAdV的试剂盒，其含有权利要求1~4任一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其还含有如下成分中的至少一种：
样本裂解液、阳性对照、阴性对照以及恒温扩增反应所需试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述恒温扩增反应所需试剂含有如下成分中的至少一种：
核糖核酸酶 HII、具有链置换功能的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、Na+、K+、缓冲成分、二硫苏糖醇。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
9.根据权利要求6~8任一项所述的试剂盒，所述恒温扩增反应所需试剂为冻干试剂。
10.权利要求1~4任一项所述的引物探针组合产品在制备用于检测HAdV的诊断试剂或试剂盒中的应用。
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| CN (1) | CN113073151B (zh) |
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2021
- 2021-05-12 CN CN202110515329.1A patent/CN113073151B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113073151B (zh) | 2024-09-13 |
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