CN108239677A

CN108239677A - 一种甲型流感病毒基因分型检测试剂盒

Info

Publication number: CN108239677A
Application number: CN201611207953.0A
Authority: CN
Inventors: 迟大利; 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2018-07-03

Abstract

本发明提供了一种甲型流感病毒基因分型检测检测试剂盒，试剂盒包括RT‑PCR反应液、RT‑PCR酶混合物、甲型流感病毒分型引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照。本发明可对提取好的甲型流感病毒RNA直接进行一步法RT‑PCR反应，对样本中的甲型流感病毒进行荧光分型检测，并依靠内参基因序列作为内对照、利用UNG酶预防污染。本发明的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于人鼻咽拭子样本中季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）荧光分型鉴定、检测。

Description

一种甲型流感病毒基因分型检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于甲型流感病毒基因分型（季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009））检测试剂盒。

背景技术

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒可分为甲型流感病毒（Influenza A virus）、乙型流感病毒（Influenza B virus）和丙型流感病毒（Influenza C virus）三种类型。其中，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。依据病毒颗粒外膜血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为16个H亚型（H1-H16）和9个N亚型（N1-N9），目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有人感染的报道。由于编码HA和（或）NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和（或）NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移（antigenic drift）。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人（>65岁）和婴幼儿（<6岁）。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亚型，甲型H3流感与甲型H1N1同属甲型流感病毒，但其实它并不是一种新的流感病毒，早在1988年，美国就发现了甲型H3流感病毒，一些针对它的疫苗早已被研制成功。该病毒非常活跃，多次在流感季节“袭击”全球，逐渐成为全球流感防控的重点病毒之一，目前（截止2009年8月）它也是中国较为活跃的毒株。

近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（H5亚型）病毒的病例时有报道，禽类甲型H5N1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变（antigenic shift）。新型甲型H1N1流感病毒（2009）即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。

流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断，甲型流感病毒各亚型检测试剂还可用于区分季节性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可获得关于流感暴发的流行病学信息。

在流感病毒流行期结合临床症状诊断流感并不困难，但要确诊或流行监测时必须进行实验室检查，主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。近年来，分子生物学方法不断被应用到流感病毒的快速检测中，流感病毒的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了流感病毒实验室诊断的发展方向。

因此，研发一种区分甲型流感病毒基因分型（季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009））检测试剂盒用于临床诊断、指导临床用药、监控流感发病规律，成为当务之急。

当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了PCR高敏感性、DNA杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，具有简便、微量、快速、高特异、高敏感等优点。因此，荧光定量PCR法是临床早期诊断病毒感染的最有价值的方法之一。

TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整或与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。

同时为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP；而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶在50℃以上即失去活性，这样经过热循环不会破坏病人呼吸道病毒核酸。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从呼吸道病毒阳性病人样本血清中提取的核酸因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。

而且，将人造的竞争性内参RNA（慢病毒）引入反应体系，以指示每个PCR反应管的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。

目前，国际上甲型流感病毒检测试剂主要有甲型流感病毒定性检试剂盒，或甲型流感病毒分型检测试剂盒等。国内有甲型流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)已获得国家生产许可，但尚无甲型流感病毒分亚型联合检测的荧光PCR检测试剂盒上市。

该试剂盒通过对甲型流感病毒中的季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）基因组全序列比对分析，分别获得针对季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）的序列特异性引物和荧光探针，通过检测人鼻咽拭子样本，确定该试剂盒的各种检测指标，确定该试剂盒检测的特异性、灵敏度，为不同亚型甲型流感病毒感染的确诊、病情程度判断、疗效评价、新药开发等提供一个方便、廉价的检测手段。其关键技术为获得针对季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）各自序列特异性的引物和荧光探针，制备高特异性、搞敏感性、重复性好的甲型流感病毒荧光分型检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用于甲型流感病毒基因分型（季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009））检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

本发明的技术方案为：提供一种用于甲型流感病毒基因分型（季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009））检测试剂盒，采用一步法RT-PCR技术对三种亚型甲型流感病毒RNA进行定性分型检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（体液RNA））对人鼻咽拭子样本进行核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需多次重复循环、防止产物污染。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰、可靠性高。

本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、甲型流感病毒分型引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照。其中，所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl (pH8.3) 20 mM、KCl 100 mM、明胶0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl₂6 mM的混合液；所述的RT-PCR酶混合物为逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3 U/μl，Taq DNA聚合酶2 U/μl，UNG酶1 U/μl）；所述的甲型流感病毒分型引物探针为一对季节性流感病毒H1亚型核酸序列特异性引物、一对季节性流感病毒H3亚型核酸序列特异性引物、一对甲型H1N1流感病毒（2009）核酸序列特异性引物、一对外源性内参系列特异性引物、一条季节性流感病毒H1亚型特异性探针、一条季节性流感病毒H3亚型特异性探针、一条甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针和一条外源性内参特异性探针的混合液（引物各6.25 uM，季节性流感病毒H1亚型特异性探针2.5 uM，季节性流感病毒H3亚型特异性探针2.5 uM，甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针2.5 uM和外源性内参特异性探针2.5 uM）；所述的外源性内参为含有与该外源性内参基因序列相同的特定基因片段的慢病毒；所述的阴性对照为无流感病毒的生理盐水；所述的临界阳性对照为含有季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）各自核酸序列片段的慢病毒；所述强阳性对照为含有季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）各自核酸序列片段的慢病毒。检测用的季节性流感病毒H1亚型核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQ ID No.5〉为：5’-ATGAGCAGGGATCTGGTT-3’；

下游引物序列〈SEQ ID No.6〉为：5’-CCACTGAAGTAAATTGAATGTT-3’。

检测用的季节性流感病毒H3亚型核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQ ID No.7〉为：5’-GCGACAATCCTCATCGA-3’；

下游引物序列〈SEQ ID No.8〉为：5’-AGCTTTGCTGCGTTCAACGAA-3’。

检测用的甲型H1N1流感病毒（2009）核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQ ID No.9〉为：5’-TACATTTGCAACCGCAAATGCAG-3’；

下游引物序列〈SEQ ID No.10〉为：5’-CAGAGTGTGTTACTGTTACA-3’。

检测用的外源性内参核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQ ID No.11〉为：5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTA-3’；

下游引物序列〈SEQ ID No.12〉为：5’-TTTGATCTTCRGCAGCGCACG-3’。

季节性流感病毒H1亚型特异性探针序列〈SEQ ID No.13〉为：5’-FAM-CGCAGCAGATCAGAAAAGCACAC-BHQ-3’。

季节性流感病毒H3亚型特异性探针序列〈SEQ ID No.14〉为：5’-HEX-CCTTGATGGAATAAACTGCACACTG-BHQ-3’。

甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针序列〈SEQ ID No.15〉为：5’-ROX-CACATTATGTATAGGTTATCATGCGAAC-BHQ-3’。

外源性内参特异性探针序列〈SEQ ID No.16〉为：5’-CY5-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCAC-BHQ-3’。

本发明提供的试剂保存于-20℃，冻融次数应小于3次。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照。扩增检测方法如下：

a、按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品3个＋1）n 配制反应液：取RT-PCR反应液n×25 μl甲型流感病毒分型引物探针n×4 μl、RT-PCR酶混合物n×1 μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按30 μl/管分装到反应管中；

b、取样本提取物、对照品提取物各20 μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上；

c、反应程序为：50℃反应25 min，然后95℃保温5 min，再按 95℃ 15 s、60℃ 50 s，循环45次，并于60℃分别采集FAM、HEX、ROX和CY5荧光通道的信号；

d、仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。在四通道（FAM、HEX、ROX和CY5）下检测反应扩增产物的荧光强度：

（1）当CY5通道检测Ct值小于等于40时，其余三个通道检测Ct值均为0或空白：三种甲型流感病毒呈阴性；FAM通道检测Ct值小于等于40：季节性流感病毒H1亚型呈阳性；HEX通道检测Ct值小于等于40：季节性流感病毒H1亚型呈阳性；ROX通道检测Ct值小于等于40：甲型H1N1流感病毒（2009）呈阳性。

（2）当CY5通道检测Ct值大于40时，不论其余三个通道检测Ct值如何，实验无效，应当检查仪器、试剂、操作等方面的原因，重复检测，如（1）所示。

本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以甲型流感病毒核酸为模板，采用病毒基因组特异性引物探针，辅以逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶，并加入竞争性内参，经一步法荧光RT-PCR实验，可快速、准确对三种甲型流感病毒进行鉴定、检测；从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰、可靠性高，可用于人鼻咽拭子样本中季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）的定性鉴定、检测。

具体实施方式

实施例1 一种甲型流感病毒基因分型检测试剂盒

1.流感病毒核酸的提取

使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（体液RNA））对人鼻咽拭子样本进行核酸提取。

2.逆转录及荧光RT-PCR扩增（每人份50 μl体系）

a、一步法RT-PCR反应液的配制：

b、一步法RT-PCR反应程序：

[1] 50℃ 25 min

[2] 95℃ 5 min

[3] 95℃ 15 s

[4] 60℃ 50 s

[5] Go to [3] ，45 cycles

在第四步采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光信号

[6] End

3.检测：

本发明适用于ABI 7500荧光定量PCR仪进行基因分型检测。

4.结果判断：

仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。在四通道（FAM、HEX、ROX和CY5）下检测反应扩增产物的荧光强度：

实施例2 临床检测

用上述方法对50例临床样品进行荧光PCR定性检测，其中季节性流感病毒H1亚型患者6例，检出阳性率12%；季节性流感病毒H3亚型患者7例，检出阳性率为14%；甲型H1N1流感病毒（2009）患者3例，检出阳性率为6%。本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、可重复度高，可对人鼻咽拭子样本中季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）的定性鉴定、检测。本发明使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（体液RNA））对人鼻咽拭子样本进行核酸提取，保证了模板的纯度。同时，利用一步法荧光RT-PCR技术，在核酸提取结束后直接将核酸加入到反应体系中，cDNA的合成和PCR反应在一管，无需增加额外步骤；并使用UNG酶避免扩增产物污染。该操作既确保了扩增结果的准确性，灵敏度，又缩短了时间、减少了污染，提高了荧光PCR检测方法的简便性，不仅可用于季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）的分类定性检测，也可作为临床实验室对流感病毒感染的辅助诊断方法、临床治疗效果的监测手段及个体化治疗用药提供参考依据。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

上海复星医药（集团）股份有限公司

迟大利吴大治夏懿

<120> 一种甲型流感病毒基因分型检测试剂盒

<130> Inf.A RNA分型

<140> cn

<141> 2016-11-30

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 1

atgagcaggg atctggttac gcagcagatc agaaaagcac acaaattgca attgatggga 60

ttagcaacaa agtgaactca gtaattgaaa aaatgaacat tcaatttact tcagtgg 117

<210> 2

<211> 125

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 2

gcgacaatcc tcatcgaatc cttgatggaa taaactgcac actgatagat gctctattgg 60

gggaccctca ttgtgatggc tttcaaaatg agaaatggga ccttttcgtt gaacgcagca 120

aagct 125

<210> 3

<211> 110

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 3

tacatttgca accgcaaatg cagacacatt atgtataggt tatcatgcga acaattcaac 60

agacactgta gacacagtac tagaaaagaa tgtaacagta acacactctg 110

<210> 4

<211> 137

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 4

cattgcttcc attgatggct taaaggacac caccaattgg ttcctctctg tgcacaggct 60

aattttttag ggaaaatctg gccttcccac aaggggaggc cagggaattt tcttcacgtg 120

cgctgcygaa gatcaaa 137

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 5

atgagcaggg atctggtt 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 6

ccactgaagt aaattgaatg tt 22

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 7

gcgacaatcc tcatcga 17

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 8

agctttgctg cgttcaacga a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 9

tacatttgca accgcaaatg cag 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 10

cagagtgtgt tactgttaca 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 11

cattgcttcc attgatggct ta 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<400> 12

tttgatcttc rgcagcgcac g 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<220>

<221> SEQ_ ID_No.13

<222> (2)..(24)

<223> b=FAM; d=BHQ

<400> 13

bcgcagcaga tcagaaaagc acacd 25

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<220>

<221> SEQ_ ID_No.14

<222> (2)..(26)

<223> b=HEX; d=BHQ

<400> 14

bccttgatgg aataaactgc acactgd 27

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<220>

<221> SEQ_ ID_No.15

<222> (2)..(29)

<223> b=ROX; d=BHQ

<400> 15

bcacattatg tataggttat catgcgaacd 30

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial

<220>

<221> SEQ_ ID_No.16

<222> (2)..(27)

<223> b=CY5; d=BHQ

<400> 16

bccaccaatt ggttcctctc tgtgcacd 28

Claims

1.一种甲型流感病毒基因分型检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察、检索已知季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）各自基因组内一致性保守序列设计出一对季节性流感病毒H1亚型核酸序列特异性引物、一对季节性流感病毒H3亚型核酸序列特异性引物、一对甲型H1N1流感病毒（2009）核酸序列特异性引物、一对外源性内参系列特异性引物、一条季节性流感病毒H1亚型特异性探针、一条季节性流感病毒H3亚型特异性探针、一条甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针和一条外源性内参特异性探针，采用实时荧光RT-PCR方法扩增目的基因。

2.权利要求1所述的甲型流感病毒基因分型检测试剂盒，其特征在于：季节性流感病毒H1亚型、季节性流感病毒H3亚型、甲型H1N1流感病毒（2009）RNA特异性PCR扩增的基因序列和内参基因序列分别为：

〈SEQ ID No.1〉

5’-ATGAGCAGGGATCTGGTTACGCAGCAGATCAGAAAAGCACACAAATTGCAATTGATGGGATTAGCAACAAAGTGAACTCAGTAATTGAAAAAATGAACATTCAATTTACTTCAGTGG-3’，

〈SEQ ID No.2〉

5’-GCGACAATCCTCATCGAATCCTTGATGGAATAAACTGCACACTGATAGATGCTCTATTGGGGGACCCTCATTGTGATGGCTTTCAAAATGAGAAATGGGACCTTTTCGTTGAACGCAGCAAAGCT-3’，

〈SEQ ID No.3〉

5’-TACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTG-3’，

〈SEQ ID No.4〉

5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTAAAGGACACCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTTCACGTGCGCTGCYGAAGATCAAA-3’，

甲型流感病毒基因分型检测试剂盒中季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）扩增基因序列全长分别为117 bp、125bp和110 bp，均属血细胞凝集素神经氨酸酶基因，且均为单拷贝序列；内参基因序列全长137 bp，均与三种甲型流感病毒扩增基因中的探针序列有所不同。

3.如权利要求1所述的甲型流感病毒基因分型检测试剂盒，一对季节性流感病毒H1亚型特异性引物序列中的一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列相同，另一条序列与SEQ IDNo.1中所示的序列互补；一对季节性流感病毒H3亚型特异性引物序列中的一条序列与SEQID No.2中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.2中所示的序列互补；一对甲型H1N1流感病毒（2009）特异性引物序列中的一条序列与SEQ ID No.3中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.3中所示的序列互补；内参特异性引物序列中的一条序列与SEQ ID No.4中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.4中所示的序列互补；其中，所述的一对季节性流感病毒H1亚型特异性引物，其序列可以选自SEQ ID No. 5和SEQ ID No.6，

〈SEQ ID No.5〉为：5’-ATGAGCAGGGATCTGGTT-3’，

〈SEQ ID No.6〉为：5’-CCACTGAAGTAAATTGAATGTT-3’；

一对季节性流感病毒H1亚型特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的一对季节性流感病毒H3亚型特异性引物，其序列可选自SEQ ID No. 7和SEQ ID No.8，

〈SEQ ID No.7〉为：5’-GCGACAATCCTCATCGA-3’，

〈SEQ ID No.8〉为：5’-AGCTTTGCTGCGTTCAACGAA-3’；

一对季节性流感病毒H3亚型特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的一对甲型H1N1流感病毒（2009）特异性引物，其序列可选自SEQ ID No. 9和SEQ ID No.10，

〈SEQ ID No.9〉为：5’-TACATTTGCAACCGCAAATGCAG-3’，

〈SEQ ID No.10〉为：5’-CAGAGTGTGTTACTGTTACA-3’；

一对甲型H1N1流感病毒（2009）特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的一对内参特异性引物，其序列可选自SEQ ID No. 11和SEQ ID No.12，

〈SEQ ID No.11〉为：5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTA-3’，

〈SEQ ID No.12〉为：5’-TTTGATCTTCRGCAGCGCACG-3’；

一对内参特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的季节性流感病毒H1亚型特异性探针，可以选自SEQ ID No.13的序列，

〈SEQ ID No.13〉为：5’-FAM-CGCAGCAGATCAGAAAAGCACAC-BHQ -3’，

其中，探针5’-端标记FAM荧光基团，探针3’-端标记淬灭基团；季节性流感病毒H1亚型特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的季节性流感病毒H3亚型特异性探针，可以选自SEQ ID No.14的序列，

〈SEQ ID No.14〉为：5’-HEX-CCTTGATGGAATAAACTGCACACTG-BHQ -3’，

其中，探针5’-端标记HEX荧光基团，探针3’-端标记淬灭基团；季节性流感病毒H3亚型特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针，可以选自SEQ IDNo.15的序列，

〈SEQ ID No.15〉为：5’-ROX-CACATTATGTATAGGTTATCATGCGAAC -BHQ-3’，

其中探针5’-端标记ROX荧光基团，探针3’-端标记淬灭基团；甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的内参特异性探针，可以选自SEQ ID No.16的序列，

〈SEQ ID No.16〉为：5’-CY5-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCAC-BHQ -3’，

其中探针5’-端标记CY5荧光基团，探针3’-端标记淬灭基团；内参基因序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。

4.如权利要求1所述的甲型流感病毒基因分型检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、甲型流感病毒分型引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照；其中，所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl (pH8.3) 20 mM、KCl 100mM、明胶0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl₂ 6 mM的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶、TaqDNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3 U/μl，Taq DNA聚合酶2 U/μl，UNG酶1 U/μl）；所述的甲型流感病毒分型引物探针为一对季节性流感病毒H1亚型特异性引物、一对季节性流感病毒H3亚型特异性引物、一对甲型H1N1流感病毒（2009）特异性引物、一条季节性流感病毒H1亚型特异性探针、一条季节性流感病毒H3亚型特异性探针、一条甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针和一条内参特异性探针的混合液（引物各6.25 uM，季节性流感病毒H1亚型特异性探针2.5 uM，季节性流感病毒H3亚型特异性探针2.5 uM，甲型H1N1流感病毒（2009）特异性探针2.5 uM和内参特异性探针2.5 uM）；所述的内参为含有与内参基因序列相同的特定基因片段的慢病毒的生理盐水；所述的阴性对照为甲型流感病毒的生理盐水；所述的临界阳性对照为含有季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）各自核酸序列片段的慢病毒；所述的强阳性对照为含有季节性流感病毒H1亚型、H3亚型和甲型H1N1流感病毒（2009）各自核酸序列片段的慢病毒。

5.如权利要求1中所述的甲型流感病毒基因分型检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步法RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、甲型流感病毒分型引物探针按照25: 1: 4的比例混合，反应液体积为50 ul；

b、一步法荧光PCR反应程序：

[1] 50℃ 25 min

[2] 95℃ 5 min

[3] 95℃ 15 s

[4] 60℃ 50 s

[5] Go to [3] ，45 cycles

在第[4]步采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光信号

[6] End。