CN105400907A

CN105400907A - 一种甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒

Info

Publication number: CN105400907A
Application number: CN201511015612.9A
Authority: CN
Inventors: 迟大利; 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-03-16

Abstract

本发明提供了一种用于甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、呼吸道病毒引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照。本发明可对提取好的呼吸道病毒核酸直接进行一步法RT-PCR反应，对样本中的甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的分类定性检测，并依靠内参基因作为内对照、利用UNG酶预防污染。本发明的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于人鼻咽拭子样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。

Description

一种甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒。

背景技术

呼吸道病毒（Virusesassociatedwithrespiratoryinfections）是指主要以呼吸道为侵入门户，首先在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道及其他器官损害的病毒的总称。临床上的急性呼吸感染中有90～95%是由这群毒引起的。呼吸道病毒多为单链RNA（ssRNA）病毒，一般具有包膜及刺突，主要经呼吸道传播，定位于呼吸道，可反复感染，人群流行率高。其中，流行性感冒病毒（influenzavirus）和呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV）为临床常见的、重要的呼吸道病毒。

呼吸道合胞病毒形态为球形，基因组为线性、不分节段的单链RNA（ssRNA），病毒体有包膜，膜上有刺突，由糖蛋白组成，无血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）。根据病毒表面蛋白抗原的变异，可将RSV分为两种类型：RSVA型和RSVB型。

呼吸道合胞病毒肺炎（respiratorysyncytialviruspneumonia）简称合胞病毒肺炎，由呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV）引起的一种小儿常见的间质性肺炎，多发生于婴幼儿。由于母传抗体不能预防感染的发生，出生不久的小婴儿即可发病，但新生儿较少见。国外偶有院内感染导致产科医院新生儿病房爆发流行的报道。该病的诊断主要根据病毒学及血清学检查结果。近年来利用鼻咽分泌物脱落细胞及血清中IgM抗体的间接法免疫荧光技术、ELISA、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法（APAAP）、生物素抗生物素ELISA法、辣根过氧化物酶—抗辣根过氧化物酶法（PAP）、单克隆抗体荧光法等都能进行合胞病毒感染的快速诊断。

流行性感冒是由流行性感冒病毒引起的一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道疾病，其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播，典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是流行性感冒的高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒可分为甲型流感病毒（InfluenzaAvirus）、乙型流感病毒（InfluenzaBvirus）和丙型流感病毒（InfluenzaCvirus）三种类型。其中，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行；乙型流感病毒的抗原变异较小，仅在人类之间传播，通常只引起流感的局部爆发，乙型流感通常伴有肌炎及胃肠道症状，在某些年份可成为强势株。相较于甲型流感病毒，乙型流感病毒更容易引起较为严重的合并症；丙型流感病毒的抗原稳定，且致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。

在流感病毒流行期结合临床症状诊断流感并不困难，但要确诊或流行监测时必须进行实验室检查，主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。近年来，分子生物学方法不断被应用到流感病毒的快速检测中，流感病毒的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了流感病毒实验室诊断的发展方向。

当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了PCR高敏感性、DNA杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，具有简便、微量、快速、高特异、高敏感等优点。因此，荧光定量PCR法是临床早期诊断病毒感染的最有价值的方法之一。

TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整或与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，TaqDNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。

目前，国际上呼吸道病毒检测试剂主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等联检试剂盒，或甲型流感病毒分型检测试剂盒等。国内有4家公司研制出了甲型流感病毒和乙型流感病毒联合检测试剂，均已获国家生产许可，但尚无与呼吸道合胞病毒联合检测的荧光PCR检测试剂盒。

同时为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP；而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶在50℃以上即失去活性，这样经过热循环不会破坏病人呼吸道病毒核酸。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从呼吸道病毒阳性病人样本血清中提取的核酸因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。

而且，将人造的竞争性内参RNA（慢病毒）引入反应体系，以指示每个PCR反应管的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。

该技术通过对呼吸道病毒中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒基因组全序列比对分析，分别获得针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的序列特异性引物和荧光探针，通过检测人鼻咽拭子样本，确定该试剂盒的各种检测指标，确定该试剂盒检测的特异性、灵敏度，为呼吸道病毒感染的确诊、病情程度判断、疗效评价、新药开发等提供一个方便、廉价的检测手段。其关键技术为获得针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒各自序列特异性的引物和荧光探针，制备高特异性、搞敏感性、重复性好的呼吸道病毒荧光检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用于甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

本发明的技术方案为：提供一种用于甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，采用一步法RT-PCR技术对三种呼吸道病毒RNA进行定性检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂对人鼻咽拭子样本进行核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需多次重复循环、防止产物污染。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰、可靠性高。

本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、呼吸道病毒引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照。其中，所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl100mM、明胶0.2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4mM、MgCl₂6mM的混合液；所述的RT-PCR酶混合物为逆转录酶、TaqDNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3U/μl，TaqDNA聚合酶2U/μl，UNG酶1U/μl）；所述的呼吸道病毒引物探针为一对甲型流感病毒核酸序列特异性引物、一对乙型流感病毒核酸序列特异性引物、一对呼吸道合胞病毒核酸序列特异性引物、一对外源性内参系列特异性引物、一条甲型流感病毒型特异性探针、一条乙型流感病毒特异性探针、一条呼吸道合胞病毒特异性探针和一条外源性内参特异性探针的混合液（引物各6.25uM，甲型流感病毒特异性探针2.5uM，乙型流感病毒特异性探针2.5uM，呼吸道合胞病毒特异性探针2.5uM和外源性内参特异性探针2.5uM）；所述的外源性内参为含有与该外源性内参基因序列相同的特定基因片段的慢病毒；所述的阴性对照为无呼吸道病毒的正常人血清；所述的临界阳性对照为含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒各自核酸序列片段的慢病毒；所述强阳性对照为含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒各自核酸序列片段的慢病毒。检测用的甲型流感病毒核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQIDNo.5〉为：5’-CCATTCTGTTGTATATGAGAC-3’

下游引物序列〈SEQIDNo.6〉为：5’-CCAAACAACATGGACAAGGCG-3’

检测用的乙型流感病毒核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQIDNo.7〉为：5’-CAACATGACCACAACACAAAT-3’

下游引物序列〈SEQIDNo.8〉为：5’-GTCTTGACCAGGATAGTCAAG-3’

检测用的呼吸道合胞病毒核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQIDNo.9〉为：5’-TCCTGATTTCCTCACAGAGGCT-3’

下游引物序列〈SEQIDNo.10〉为：5’-TGTCAAATGTGATTATGCATGT-3’

检测用的外源性内参核酸序列特异性扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQIDNo.11〉为：5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTA-3’

下游引物序列〈SEQIDNo.12〉为：5’-TTTGATCTTCRGCAGCGCACG-3’

甲型流感病毒特异性探针序列〈SEQIDNo.13〉为：5’-FAM-CAACTGGTGCGCTTGCCAGCTGCATG-BHQ-3’

乙型流感病毒特异性探针序列〈SEQIDNo.14〉为：5’-HEX-TGGGTCCGGGAGCAACCAATGCCAC-BHQ-3’

呼吸道合胞病毒特异性探针序列〈SEQIDNo.15〉为：5’-CY3-TAGTTCACTCTGTGTTCATACTTAG-BHQ-3’

外源性内参特异性探针序列〈SEQIDNo.16〉为：5’-CY5-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCAC-BHQ-3’

本发明提供的试剂保存于-20℃，冻融次数应小于3次。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照。扩增检测方法如下：

a、按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品5个＋1）n配制反应液：取RT-PCR反应液n×25μl、呼吸道病毒引物探针n×4μl、RT-PCR酶混合物n×1μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按30μl/管分装到反应管中；

b、取样本提取物、对照品提取物各20μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上；

c、反应程序为：50℃反应25min，然后95℃保温5min，再按95℃15s→60℃50s，循环45次，并于60℃分别采集FAM、HEX、CY3和CY5荧光通道的信号；

d、仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。在四通道（FAM、HEX、CY3和CY5）下检测反应扩增产物的荧光强度：

当CY5通道检测Ct值小于等于40时，其余三个通道检测Ct值均为0或空白：三种呼吸道病毒呈阴性；FAM通道检测Ct值小于等于40：甲型流感病毒呈阳性；HEX通道检测Ct值小于等于40：乙型流感病毒呈阳性；CY3通道检测Ct值小于等于40：呼吸道合胞病毒呈阳性。

当CY5通道检测Ct值大于40时，不论其余三个通道检测Ct值如何，实验无效，应当检查仪器、试剂、操作等方面的原因，重复检测，如所示。

本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以呼吸道病毒核酸为模板，采用病毒基因组特异性引物探针，辅以逆转录酶、TaqDNA聚合酶和UNG酶，并加入竞争性内参，经一步法荧光RT-PCR实验，可快速、准确对三种呼吸道病毒的鉴定、检测；从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰、可靠性高，可用于人鼻咽拭子样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。

具体实施方式

实施例1一种甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒

1.呼吸道病毒核酸的提取

使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂对人鼻咽拭子样本进行核酸提取。

2.逆转录及荧光RT-PCR扩增（每人份50μl体系）

a、一步法RT-PCR反应液的配制：

[0046] RT-PCR反应液	[0047] 25 μl
		[0048] RT-PCR酶混合物	[0049] 1 μl
[0050] 呼吸道病毒引物探针	[0051] 4 μl
		[0052] 模板	[0053] 20 μl
[0054] 反应液体积：	[0055] 50 μl

b、一步法RT-PCR反应程序：

[1]50℃25min

[2]95℃5min

[3]95℃15s

[4]60℃50s

[5]Goto[4]，45cycles

在第五步采集FAM、HEX、CY3和CY5通道荧光信号。

[6]End

3.检测：

本发明适用于ABI7500荧光定量PCR仪进行基因分型检测。

4.结果判断：

仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。在四通道（FAM、HEX、CY3和CY5）下检测反应扩增产物的荧光强度：

实施例2临床检测

用上述方法对50例临床样品进行荧光PCR定性检测，其中甲型流感病毒患者15例，检出阳性率30%；乙型流感病毒患者4例，检出阳性率为8%；呼吸道合胞病毒患者12例，检出阳性率为24%。本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、可重复度高，可对人鼻咽拭子样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。本发明使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂对人鼻咽拭子样本进行核酸提取，保证了模板的纯度。同时，利用一步法荧光RT-PCR技术，在核酸提取结束后直接将核酸加入到反应体系中，cDNA的合成和PCR反应在一管，无需增加额外步骤；并使用UNG酶避免扩增产物污染。该操作既确保了扩增结果的准确性，灵敏度，又缩短了时间、减少了污染，提高了荧光PCR检测方法的简便性，不仅可用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的分类定性检测，也可作为临床实验室对呼吸道病毒感染的辅助诊断方法、临床治疗效果的监测手段及个体化治疗用药提供参考依据。

核苷酸序列表

SEQUENCELISTING

<110>上海星耀医学科技发展有限公司

上海复星医药（集团）股份有限公司

迟,大利

吴,大治

夏,懿

<120>一种甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒

<130>呼吸道病毒检测

<140>cn

<141>2015-11-18

<160>16

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>139

<212>DNA

<213>InfluenzaAvirus

<400>1

ccaaacaacatggacaaggcggttaaattatacaagaaactgaagagggaaatgacattt60

catggagcaaaggaagttgcactcagttactcaactggtgcgcttgccagctgcatgggt120

ctcatatacaacagaatgg139

<210>2

<211>130

<212>DNA

<213>InfluenzaBvirus

<400>2

caacatgaccacaacacaaattgaggtgggtccgggagcaaccaatgccactataaactt60

tgaagcaggaattctggagtgctatgaaaggttttcatggcaaagagcccttgactatcc120

tggtcaagac130

<210>3

<211>140

<212>DNA

<213>respiratorysyncytialvirus

<400>3

tcctgatttcctcacagaggctatagttcactctgtgttcatacttagttattatacaaa60

ccatgatttaaaagataaacttcaagatctgtcagatgatagattgaataagttcttaac120

atgcataatcacatttgaca140

<210>4

<211>140

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>4

tcctgatttcctcacagaggctatagttcactctgtgttcatacttagttattatacaaa60

ccatgatttaaaagataaacttcaagatctgtcagatgatagattgaataagttcttaac120

atgcataatcacatttgaca140

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>5

ccattctgttgtatatgagac21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>6

ccaaacaacatggacaaggcg21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>7

caacatgaccacaacacaaat21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>8

gtcttgaccaggatagtcaag21

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>9

tcctgatttcctcacagaggct22

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>10

tgtcaaatgtgattatgcatgt22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>11

cattgcttccattgatggctta22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<400>12

tttgatcttcrgcagcgcacg21

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<220>

<221>SEQIDNo.13

<222>(2)..(27)

<223>b=FAM;k=BHQ

<400>13

bcaactggtgcgcttgccagctgcatgk28

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<220>

<221>SEQIDNo.14

<222>(2)..(26)

<223>d=HEX;k=BHQ

<400>14

dtgggtccgggagcaaccaatgccack27

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<220>

<221>SEQIDNo.15

<222>(2)..(26)

<223>h=CY3;k=BHQ

<400>15

htagttcactctgtgttcatacttagk27

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>artificialsequence

<220>

<221>SEQIDNo.16

<222>(2)..(27)

<223>m=CY5;k=BHQ

<400>16

mccaccaattggttcctctctgtgcack28

Claims

1.一种甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察呼吸道病毒中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒基因组全序列，分别检索所得甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的保守序列；并根据该保守序列分别设计出一对甲型流感病毒核酸序列特异性引物、一条甲型流感病毒特异性荧光探针，一对乙型流感病毒核酸序列特异性引物、一条乙型流感病毒特异性荧光探针，一对呼吸道合胞病毒核酸序列特异性引物、一条呼吸道合胞病毒特异性荧光探针，并设计一对外源性内参系列特异性引物和一条内参探针，采用实时荧光PCR方法实现对三种呼吸道病毒的定性鉴定、检测。

2.权利要求1所述的甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于：呼吸道病毒中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒特异性PCR扩增的基因序列和外源性内参基因序列分别为：

〈SEQIDNo.1〉

5’-CCAAACAACATGGACAAGGCGGTTAAATTATACAAGAAACTGAAGAGGGAAATGACATTTCATGGAGCAAAGGAAGTTGCACTCAGTTACTCAACTGGTGCGCTTGCCAGCTGCATGGGTCTCATATACAACAGAATGG-3’，

〈SEQIDNo.2〉

5’-CAACATGACCACAACACAAATTGAGGTGGGTCCGGGAGCAACCAATGCCACTATAAACTTTGAAGCAGGAATTCTGGAGTGCTATGAAAGGTTTTCATGGCAAAGAGCCCTTGACTATCCTGGTCAAGAC-3’，

〈SEQIDNo.3〉

5’-TCCTGATTTCCTCACAGAGGCTATAGTTCACTCTGTGTTCATACTTAGTTATTATACAAACCATGATTTAAAAGATAAACTTCAAGATCTGTCAGATGATAGATTGAATAAGTTCTTAACATGCATAATCACATTTGACA-3’，

〈SEQIDNo.4〉

5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTAAAGGACACCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTTCACGTGCGCTGCYGAAGATCAAA-3’，

甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒中扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的基因序列全长分别为139bp、130bp和140bp，内参基因序列全长137bp，均不同于三条呼吸道病毒扩增基因序列。

3.如权利要求1所述的甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，一对甲型流感病毒特异性引物序列中的一条序列与SEQIDNo.1中所示的序列部分相同，另一条序列与SEQIDNo.1中所示的序列部分互补；一对乙型流感病毒特异性引物序列中的一条序列与SEQIDNo.2中所示的序列部分相同，另一条序列与SEQIDNo.2中所示的序列部分互补；一对呼吸道合胞病毒特异性引物序列中的一条序列与SEQIDNo.3中所示的序列部分相同，另一条序列与SEQIDNo.3中所示的序列部分互补；一对外源性内参特异性引物序列中的一条序列与SEQIDNo.4中所示的序列部分相同，另一条序列与SEQIDNo.4中所示的序列部分互补；甲型流感病毒特异性探针与SEQIDNo.1中所示的序列部分互补，乙型流感病毒特异性探针与SEQIDNo.2中所示的序列部分相同，呼吸道合胞病毒特异性探针与SEQIDNo.1中所示的序列部分相同，外源性内参特异性探针与SEQIDNo.4中所示的序列部分相同,其中，所述的一对甲型流感病毒核酸序列特异性引物，其序列可以选自SEQIDNo.5和SEQIDNo.6，

〈SEQIDNo.5〉为：5’-CCATTCTGTTGTATATGAGAC-3’，

〈SEQIDNo.6〉为：5’-CCAAACAACATGGACAAGGCG-3’；

一对甲型流感病毒特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的一对乙型流感病毒核酸序列特异性引物，其序列可以选自SEQIDNo.7和SEQIDNo.8，

〈SEQIDNo.7〉为：5’-CAACATGACCACAACACAAAT-3’，

〈SEQIDNo.8〉为：5’-GTCTTGACCAGGATAGTCAAG-3’；

一对乙型流感病毒特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的一对呼吸道合胞病毒核酸序列特异性引物，其序列可以选自SEQIDNo.9和SEQIDNo.10，

〈SEQIDNo.9〉为：5’-TCCTGATTTCCTCACAGAGGCT-3’，

〈SEQIDNo.10〉为：5’-TGTCAAATGTGATTATGCATGT-3’；

一对呼吸道合胞病毒特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的一对外源性内参核酸序列特异性引物，其序列可以选自SEQIDNo.11和SEQIDNo.12，

〈SEQIDNo.11〉为：5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTA-3’，

〈SEQIDNo.12〉为：5’-TTTGATCTTCRGCAGCGCACG-3’；

一对外源性内参特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的甲型流感病毒特异性探针，可以选自SEQIDNo.13的序列，

〈SEQIDNo.13〉为：5’-FAM-CAACTGGTGCGCTTGCCAGCTGCATG-BHQ-3’，

其中探针5’-端标记FAM荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团,甲型流感病毒基因片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的乙型流感病毒特异性探针，可以选自SEQIDNo.14的序列，

〈SEQIDNo.14〉为：5’-HEX-TGGGTCCGGGAGCAACCAATGCCAC-BHQ-3’，

其中探针5’-端标记HEX荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团,乙型流感病毒基因片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的呼吸道合胞病毒特异性探针，可以选自SEQIDNo.15的序列，

〈SEQIDNo.15〉为：5’-CY3-TAGTTCACTCTGTGTTCATACTTAG-BHQ-3’，

其中探针5’-端标记CY3荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团,呼吸道合胞病毒基因片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的外源性内参特异性探针，可以选自SEQIDNo.10的序列，

〈SEQIDNo.16〉为：5’-CY5-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCAC-BHQ-3’，

其中探针5’-端标记CY5荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团,外源性内参基因序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。

4.如权利要求1所述的甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、呼吸道病毒引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照,其中，所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl100mM、明胶0.2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4mM、MgCl₂6mM的混合液；所述的RT-PCR酶混合物为逆转录酶、TaqDNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3U/μl，TaqDNA聚合酶2U/μl，UNG酶1U/μl）；所述的呼吸道病毒引物探针为一对甲型流感病毒核酸序列特异性引物、一对乙型流感病毒核酸序列特异性引物、一对呼吸道合胞病毒核酸序列特异性引物、一对外源性内参系列特异性引物、一条甲型流感病毒型特异性探针、一条乙型流感病毒特异性探针、一条呼吸道合胞病毒特异性探针和一条外源性内参特异性探针的混合液（引物各6.25uM，甲型流感病毒特异性探针2.5uM，乙型流感病毒特异性探针2.5uM，呼吸道合胞病毒特异性探针2.5uM和外源性内参特异性探针2.5uM）；所述的外源性内参为含有与该外源性内参基因序列相同的特定基因片段的慢病毒；所述的阴性对照为无呼吸道病毒的正常人血清；所述的临界阳性对照为含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒各自核酸序列片段的慢病毒；所述强阳性对照为含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒各自核酸序列片段的慢病毒。

5.如权利要求1中所述的甲、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步法RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、呼吸道病毒引物探针按照25:1:4的比例混合，反应液体积为50ul；

b、一步法荧光定量PCR反应程序：

50℃25min

95℃5min

95℃15s

60℃50s

Goto[4]，45cycles

在第五步采集FAM、HEX、CY3和CY5通道荧光信号。