CN110964853A

CN110964853A - 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用

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Publication number: CN110964853A
Application number: CN201911315346.XA
Authority: CN
Inventors: 李先强; 姜昕; 厉洁; 黄永伟; 陈巨; 龚丽君
Original assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Current assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110964853B

Abstract

本发明公开了一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用。将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中，同时加入特异探针及放大探针，其中包被探针可与特异探针CES的一端结合固定扩增产物RNA；特异探针LES的一端结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大。本发明无需RNA提取，在检测中不易污染，灵敏度高、特异性强，可广泛用于呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸检测。

Description

一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于双扩增(RNA恒温扩增+多生物素信号放大)技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒及其应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是单链RNA包膜病毒，含有两个亚型——A型和B型。广泛分布于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染主要的和常见的病原体，在绝大部分地区RSV所致的1岁以内婴幼儿的肺炎和支气管炎远远高于其他病原微生物。 RSV的流行具有季节性，易于在冬天和早春感染并引起多达5个月的流行期。我国每年数千万住院的婴幼儿因RSV感染的占50％，且RSV的再感染率很高，成人RSV的再感染同样很常见。该病毒具有传染性强，症状与副流感病毒肺炎、轻流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎在临床上几乎无法区别，因此，实验室诊断就显得非常重要。

副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)是单链RNA包膜病毒，四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，1型是儿童喉气管支气管炎的主要原因，而2型次之。1型2型均能造成其他的上呼吸道和下呼吸道疾病。3型经常导致肺炎和细支气管炎。4型通常被认为散发存在，引起的呼吸道症状轻微。副流感病毒是常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。人类副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右。

腺病毒(Adenovirus，AdV)是一种无包膜的双链DNA病毒，共有56种血清型，分A-G七个亚属，其中引起呼吸道感染的主要是B、C、E亚属，B属感染目前已经成为急性呼吸道感染的重要因素。腺病毒感染呼吸道的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等，多感染6个月到5岁的儿童，占儿童呼吸道感染的5％到20％，潜伏期一般一周左右。一般秋春以呼吸道感染为多，春、初夏以合并结膜炎为多。大多以飞沫传染，少部分因粪便接触感染。病程一般约一周左右，也有超过一周的。腺病毒还可引起除呼吸道感染以外的泌尿道和胃肠道的感染，症状与其他病原微生物的感染很相似，根据临床表现很难进行诊断，非常有必要进行实验室诊断加以证实。

RSV、PIV和AdV感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为实验室分离培养，免疫学技术检测和分子生物学诊断。分离培养是最传统的检测，该方法虽然可靠，但耗时长，因此使该方法无法在临床上得到有效应用。免疫学检测主要包括免疫荧光法、酶联免疫法和胶体金法等。免疫学检测方法特异性和灵敏度适中，简便快捷，也是现在临床上常用的检测方法，但存在难以解决的假阴性假阳性问题。分子生物学方法主要为荧光PCR法，可直接检测核酸，灵敏度高、特异性强，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势。但是PCR的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的RSV、PIV和AdV的诊断方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA 聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中进行杂交，同时加入的还有该包被探针对应的特异探针及放大探针。其中包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，CES系列探针的另一端可结合到RNA产物上，使RNA产物锚定到微孔中；每个指标的LES系列探针的一端可结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大过程。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素-HRP酶联物结合，最终形成包被探针-特异探针-RNA扩增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-HRP酶联物复合体，最后加入HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒，包括：

1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl₂，70mMKCl，15％DM SO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM，其中扩增引物包括四组：呼吸道合胞病毒(包括A型和B型)、副流感病毒(包括1、2、3型)、腺病毒(包括B属、C属和E属)和人内参基因，具体的：

(1)呼吸道合胞病毒(P基因的一段保守区序列)的扩增引物：

RSV-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCAAA3’；

RSVA-F引物：5’TGTTATAGGACTTTCTTT3’；

RSVB-F引物：5’AGTGACTTCTATGTCTAT3’；

(2)副流感病毒(L基因一段保守区序列)的扩增引物：

PIV1-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGATTGTAAAAAGCAAGATT3’；

PIV1-F引物：5’GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3’；

PIV2-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTACTTATT3’；

PIV2-F引物：5’CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3’；

PIV3-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATCCTG3’；

PIV3-F引物：5’TCACTTTCTCAGTTAATAT3’；

(3)腺病毒(5’-3’)(AdV-B属是L3基因的一段保守区序列、AdV-C属是hexon的一段保守区序列、AdV-E属是hexon protein的一段保守区序列)的扩增引物：

ADV-B属-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCCGGTCAACGGGTACGA；

ADV-B属-F引物：ACCTGAGTCCGGGTCTGGTG；

ADV-C属-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATCYTCAGTTCCATGRTT；

注：本发明中的简并碱基Y代表T/C；

注：本发明中的简并碱基R代表A/G；

ADV-C属-F引物：TTGCARGACAGAAACACAGAGCT；

ADV-E属-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATATCAGCATAAATTACTGTG；

ADV-E属-F引物：AGCTTTAAACCCTACTCCGG；

(4)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：

内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCAGCTAAGAG CA3’；

内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’；

由于副流感病毒基因序列变异较大，在设计引物时分别针对副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型进行单独设计；呼吸道合胞病毒在设计时F引物设计两条，R引物共用一条；腺病毒核酸基因序列同样存在变异较大的情况，AdV属不同血清型基因序列差异性也较大，本发明在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，在设计引物时分别针对腺病毒的B、C、E属进行设计。所以AdV-C属的引物和探针设计成简并碱基，可以对这些流行株进行全覆盖。本发明所设计的引物能够扩增出所有常见血清型，又能够最小化的影响彼此之间的扩增效率。本发明设计的各对引物R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；

3)细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001，可以裂解细胞，释放核酸；

4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列(5’-3’)为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCA CATG；

5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

(1)RSVA特异探针序列：

RSVA-LES1:5’TTGACAGATATGATACTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

RSVA-LES2:5’TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

RSVA-LES3:5’TTGGGTGATGTGAATTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

RSVA-LES4:5’CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

RSVA-LES5:5’AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

RSVA-CES:5’ACTTCTATATCTATTGAGTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(2)RSVB特异探针序列：

RSVB-LES1：5’TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACG TGGT3’；

RSVB-LES2：5’GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACG TGGT3’；

RSVB-LES3：5’GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

RSVB-CES：5’TTGACAGATATTATGCTATCTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(3)PIV1特异探针序列：

PIV1-LES1：5’TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

PIV1-LES2：5’TAGCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT 3’；

PIV1-CES：5’TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(4)PIV2特异探针序列：

PIV2-LES1：5’TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

PIV2-LES2：5’CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

PIV2-CES：5’TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(5)PIV3特异探针序列：

PIV3-LES1：5’GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

PIV3-LES2：5’AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT 3’；

PIV3-CES：5’TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(6)AdV-B属的特异探针序列：

ADV-B-LES1：AAATTTAGAAACCCCACATTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

ADV-B-LES2：GTGGCGCCCACCCACGATTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

ADV-B-LES3：GTGACCACCGACCGTAGCTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

ADV-B-CES1：GCCCGTGCAACAGACACCTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

ADV-B-CES2：TACTTCAGTATGGGGAACTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(7)AdV-C属的特异探针序列：

ADV-C-LES1：5’TTTTCYATGTGGAATCAGGCTGTWGTTTT CATGTGAGAACGCGAA CGTGGT3’；

注：本发明中的简并碱基W代表A/T。

ADV-C-LES2：5’ACAGCTATGATCCAGATGTYAGAATTTTTCATGTGAGAACGCGAAC GTGGT3’；

ADV-C-CES：5’GGTGATAGAACCAGRTAYTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(8)AdV-E属的特异探针序列：

ADV-E-LES1：GCCAGTGGAAGGATGCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

ADV-E-LES2：ACAGCAAAATGCATACCTTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

ADV-E-LES3：TTGGGGTAGCTGCCATGCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

ADV-E-CES1：ACAACAGTCTGGCTCCCATTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

ADV-E-CES2：AGGGAGCGCCCAATACCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

(9)人内参基因特异探针序列：

内参LES1：5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’；

内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTT CTGTACGTATGTATGT3’；

内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTCTGTACGTATGTATGT3’；

6)微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列(5’-3’)为：5’ACATACATACGTACAG3’；

7)HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；

8)配制杂交液、洗液A(5×)、洗液B(5×)、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1％SDS的5×SSC；洗液A(5×)：含0.5％SDS的5×SSC；洗液B(5×)：含0.5％SDS的5×P BS；封闭液：含0.5％BSA、1×PBS；底物稀释液：50mM pH8.5 Tris-HCl；

9)底物：鲁米诺化学发光底物(购至Thermo Fisher，货号37075)，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。

本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸的方法，包括如下步骤：

(1)RNA恒温扩增

本发明检测指标有9个：呼吸道合胞病毒(包括A和B型)、副流感病毒(包括1、2、3型)、腺病毒(包括AdV B属、C属和E属)和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R 引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7 启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA 分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH 消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链 DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA分子产物(如图1)。

本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。

(2)多生物素信号放大

a，设计特异探针、放大探针和包被探针

特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在微孔板中的包被探针集合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T 链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和放大探针结合，起到链接放大探针的作用，这两个部分用4～5个T链接。

放大探针：放大探针为含有多个生物素的探针，该探针可以和特异探针LES的一端结合，探针上的生物素可以和HRP-链霉亲和素酶联物结合。

包被探针：包被探针被固定在微孔板中，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。

所诉特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。

所诉特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步骤的灵敏度，从而增加检测体系的灵敏度。

b，检测结果判断

扩增检测时同时设置阴性对照，即在检测样本的同时也扩增阴性质控物(细胞裂解液，购至美国Signosis公司，货号CL-0001)。每管扩增产物会被均分到四个微孔板微孔中，其中 RSV微孔在杂交时会加入呼吸道合胞病毒特异探针；PIV微孔在杂交时会加入副流感病毒特异探针；AdV微孔在杂交时会加入腺病毒特异探针；内质控微孔在杂交时会加入内参特异探针。杂交洗涤后加入化学发光底物，并进行化学发光值测定，对样本检测指标的比值R进行计算，其中R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位 (RLU)值)；根据比值R对样本进行定性判断，比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。

结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：

(1)核酸提取

采集疑似呼吸道合胞病毒、副流感病毒或腺病毒患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒RNA分子。

(2)RNA恒温扩增

向17μL的含有呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒和内参引物的扩增反应液中加入 2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有呼吸道合胞病毒、副流感病毒或腺病病毒核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。

(3)多生物素信号放大

a，将RNA恒温扩增产物与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)、放大探针及杂交液同时加入到微孔板中，50℃恒温孵育1小时。

扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同微孔板中的包被探针结合，可以将RNA分子固定在微孔板中；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与放大探针互补配对，形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针复合物，该复合物被固定在微孔板上(如图2)。

b，用洗液A洗去未结合于微孔板上的RNA分子、特异探针和放大探针。

c，加入封闭液，室温封闭1～2分钟，封闭非特异性位点。

d，将HRP-链霉亲和素酶联物加入微孔板孵育，该酶联物可以和放大探针上的生物素结合，最终形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针-HRP-链霉亲和素酶联物，并被固定在微孔板上。

e，用洗液B洗去游离的HRP-链霉亲和素酶联物。

f，按照底物A:底物B:底物稀释液＝1:1:8的比例配置底物，向每个微孔加入底物，并进行化学发光值测定。

g，计算待测样本各个标的比值R。

R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU) 值)。

比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。

第二方面，提供上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒核酸的试剂盒在制备呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒检测试剂中的应用。

本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：

1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒和内参基因四种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在 42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。

2、由于腺病毒共有56种血清型，分A-G七个亚属，序列变异较大，本发明在设计引物时必须保证能够特异地扩增出引起呼吸道感染的B、C、E亚属，因此，将ADV-C的引物和特异探针都设计成简并碱基。同时本发明在设计引物时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。由表20可知本发明试剂盒对14株不同来源的常见呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒具有很好的检出能力。

3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在微孔板上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表18所列的20种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高检测的灵敏度。本发明试剂盒对RSVA(ATCC VR-26)的最低检测限为1.58×10TCID₅₀/mL、 RSVB(ATCC VR-1580)的最低检测限为4.45×10TCID₅₀/mL、PIV1(ATCC VR-94)的最低检测限为1.58×10TCID₅₀/mL、PIV2(ATCC VR-92)的最低检测限为2.8×10TCID₅₀/mL、PIV3 (ATCC VR-93)的最低检测限为1.58×10TCID₅₀/mL、AdV3(ATCC VR-3)的最低检测限为 1.58×10TCID₅₀/mL、AdV5(ATCC VR-846)的最低检测限为2.8TCID₅₀/mL、AdV4(ATCC VR-1572)的最低检测限为1.58×10TCID₅₀/mL。对于448份诊断结果均与呼吸道感染相关临床样本的呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒检测灵敏度、特异性高于三种分别检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒的某商品化荧光定量PCR试剂盒。

附图说明

图1RNA恒温扩增原理图；

图2多生物素信号放大原理图；

图3 96孔微孔板布板示意图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中所用的化学发光检测仪器为厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号TZD-CL-200G。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005)中所述的条件进行。

【实施例1】灵敏度测试

将ATCC来源的病毒原液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，

病原体信息如下：

表1病原体信息

病原体名称	ATCC编号	浓度
			RSVA	VR-26	1.58×10<sup>7</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
RSVB	VR-1580	8.89×10<sup>5</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
			PIV1	VR-94	1.58×10<sup>4</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
PIV2	VR-92	2.8×10<sup>6</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
			PIV3	VR93	1.58×10<sup>7</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
AdV3(B属)	VR-3	1.58×10<sup>8</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
			AdV5(C属)	VR-846	2.8×10<sup>5</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
AdV4(E属)	VR-1572	2.8×10<sup>6</sup>TCID<sub>50</sub>/mL

检测结果：

(1)RSV-A最低检测限检测结果

表2不同滴度RSV-A的检测实验数据

表3 RSV-A最低检测限实验数据

(2)RSV-B最低检测限检测结果

表4不同滴度RSV-B的检测实验数据

表5 RSV-B最低检测限实验数据

(3)AdV-3最低检测限检测结果

表6不同滴度AdV-3的检测实验数据

表7 AdV-3最低检测限实验数据

(4)AdV-4最低检测限检测结果

表8不同滴度AdV-4的检测实验数据

表9 AdV-4最低检测限实验数据

(5)AdV-5最低检测限检测结果

表10不同滴度AdV-5的检测实验数据

表11 AdV-5最低检测限实验数据

(6)PIV-1最低检测限检测结果

表12不同滴度PIV-1的检测实验数据

表13 PIV-1最低检测限实验数据

(7)PIV-2最低检测限检测结果

表14不同滴度PIV-2的检测实验数据

表15 PIV-2最低检测限实验数据

(8)PIV-3最低检测限检测结果

表16不同滴度PIV-3的检测实验数据

表17 PIV-3最低检测限实验数据

最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：

病原体名称	ATCC编号	灵敏度
			RSVA	VR-26	1.58×10TCID<sub>50</sub>/mL
RSVB	VR-1580	4.45×10TCID<sub>50</sub>/mL
			PIV1	VR-94	1.58×10TCID<sub>50</sub>/mL
PIV2	VR-92	2.8×10TCID<sub>50</sub>/mL
			PIV3	VR93	1.58×10TCID<sub>50</sub>/mL
AdV3(B属)	VR-3	1.58×10TCID<sub>50</sub>/mL
			AdV5(C属)	VR-846	2.8TCID<sub>50</sub>/mL
AdV4(E属)	VR-1572	1.58×10TCID<sub>50</sub>/mL

【实施例2】特异性验证

1，测试菌株

将表18中的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体、滴度及特异性验证结果如下：

表18特异性验证测试菌株信息及特异性验证测测试结果

2，测试结果

测试结果如下：

表19特异性验证测测试结果

3，结论

从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。

【实施例3】病原体检出力验证

使用本发明试剂盒对14株病原体株进行检测，验证本试剂盒对不同病原体株的检出能力。检测结果如下：

表20不同病原体株检测结果

从以上结果可以看出，本试剂盒对不同的病原体株具有很好的检出能力。

【实施例4】临床样本的验证

1，临床样本信息

在湖北省人民医院共检测样本448份，其中男性标本和女性标本分别为236例和212例，分别占比为52.38％和47.62％。448例标本中，患者年龄最大为68岁，最小为1个月，平均年龄为11.13岁，标准差为13.5岁，中位数为6岁。入组患者的诊断结果均与呼吸道感染相关，具体分布情况如下：疑似流感182例，(急性)上呼吸道感染107例，(感染性)发热 73例，(急性、喘息性)支气管炎44例，流行性感冒27例，其他15例。

2，检测结果

(1)呼吸道合胞病毒检测结果

检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：

对于不一致的3例样本采用“基因测序法”进行检测，测序结果与本试剂盒检测结果一致，因此可见某商品化检测呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒漏检1例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本呼吸道合胞病毒检测灵敏度更高，特异性更强。

(2)副流感病毒检测结果

检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测副流感病毒荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：

对于不一致的8例样本采用“基因测序法”进行复测，结果阳性6例，5例为本发明试剂盒检测阳性某商品化荧光定量PCR试剂盒检测阴性样本，另一例为本发明试剂盒检测阴性某商品化荧光定量PCR试剂盒检测阳性样本。显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时副流感病毒检测灵敏度更高，特异性更强。

(3)腺病毒检测结果

检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测腺病毒荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：

对于不一致的5例样本采用“基因测序法”进行检测，测序结果与本试剂盒检测结果一致，因此可见某商品化检测腺病毒荧光定量PCR试剂盒漏检3例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时腺病毒检测灵敏度更高，特异性更强。

序列表

<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司

<120> 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用

<160> 57

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactataggg agacatggag aagatgcaaa 40

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgttatagga ctttcttt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtgacttct atgtctat 18

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg agatccgatt gtaaaaagca agatt 45

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gattttgatc tgccggggcg at 22

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg agacaaactc atatactact tatt 44

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cattgttcta ttggttgaag c 21

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggg agatctgaca tactctatcc tg 42

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcactttctc agttaatat 19

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg agattcccgg tcaacgggta cga 43

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acctgagtcc gggtctggtg 20

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)

<223> y=t或c

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)

<223> r=a或g

<400> 12

taatacgact cactataggg agatcatcyt cagttccatg rtt 43

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> r=a或g

<400> 13

ttgcargaca gaaacacaga gct 23

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg agatatcagc ataaattact gtg 43

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agctttaaac cctactccgg 20

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg agacaccaga gacactcagc taagagca 48

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagcagccgc ggtaattc 18

<210> 18

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> 两个碱基之间用biotin连接

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(46)

<223> 两个碱基之间用biotin连接

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(68)

<223> 两个碱基之间用biotin连接

<400> 18

agaaggcgtc cgtctttgag gcacccgatg gataggtcgg tgaataagca tcgtgccctt 60

tcgcagacca cgttcgcgtt ctcacatg 88

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttgacagata tgatactatt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcttttttct tgggatcttt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgggtgatg tgaatttgtt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccctttattg attctaggtt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aatttggtgg ctctgttgtt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acttctatat ctattgagtt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tttcttctta ggatctttgg atgatttttc atgtgagaac gcgaacgtgg t 51

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcaaacttgc cttttattga ttctattttc atgtgagaac gcgaacgtgg t 51

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggaattttgt agctttgtta ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttgacagata ttatgctatc ttttctgtac gtatgtatgt 40

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tcatagggtt gattgatatc ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 30

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tagcaaaacg tgaagttgag ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttatactgtt atcttttaaa ttttctgtac gtatgtatgt 40

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tatttcagaa atgtcaagat ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 33

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

catgcgggaa gtgccctagt ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcattattgt gaagagggct ttttctgtac gtatgtatgt 40

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gctattttac ctttaacgat ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 36

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aggagagtta aggtgacact ttttcatgtg agaacgcgaa cgtggt 46

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tcataattgt gtgtaattgt ttttctgtac gtatgtatgt 40

<210> 38

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaatttagaa accccacatt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 39

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtggcgccca cccacgattt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 40

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gtgaccaccg accgtagctt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 41

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcccgtgcaa cagacacctt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 42

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tacttcagta tggggaactt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 43

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> y=t或c

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)

<223> w=a或t

<400> 43

ttttcyatgt ggaatcaggc tgtwgttttc atgtgagaac gcgaacgtgg t 51

<210> 44

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)

<223> y=t或c

<400> 44

acagctatga tccagatgty agaatttttc atgtgagaac gcgaacgtgg t 51

<210> 45

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)

<223> y=t或c

<400> 45

ggtgatagaa ccagrtaytt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gccagtggaa ggatgctatt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 47

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acagcaaaat gcataccttt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 48

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ttggggtagc tgccatgctt ttcatgtgag aacgcgaacg tggt 44

<210> 49

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acaacagtct ggctcccatt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 50

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agggagcgcc caataccttt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 51

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

aaagctcgta gttggatctt tttcatgtga gaacgcgaac gtggt 45

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ttgggagcgg gcgggcggtt tttcatgtga gaacgcgaac gtggt 45

<210> 53

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tccgccgcga ggcgagcctt tttcatgtga gaacgcgaac gtggt 45

<210> 54

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

accgcccgtc cccgcccctt tttcatgtga gaacgcgaac gtggt 45

<210> 55

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

agctccaata gcgtatattt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 56

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

taaagttgct gcagttaatt ttctgtacgt atgtatgt 38

<210> 57

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

acatacatac gtacag 16

Claims

1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl₂，70 mMKCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM，其中扩增引物包括四组：呼吸道合胞病毒，包括A型和B型、副流感病毒，包括1、2、3型、腺病毒，包括B属、C属和E属、和人内参基因，具体的：

（1）呼吸道合胞病毒的扩增引物：

RSV-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACATGGAGAAGATGCAAA3’；

RSVA-F引物：5’ TGTTATAGGACTTTCTTT3’ ；

RSVB-F引物：5’ AGTGACTTCTATGTCTAT3’ ；

（2）副流感病毒的扩增引物：

PIV1-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCCGATTGTAAAAAGCAAGATT3’ ；

PIV1-F引物：5’ GATTTTGATCTGCCGGGGCGAT3’ ；

PIV2-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAACTCATATACTACTTATT3’ ；

PIV2-F引物：5’ CATTGTTCTATTGGTTGAAGC3’ ；

PIV3-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGATCTGACATACTCTATCCTG3’ ；

PIV3-F引物：5’ TCACTTTCTCAGTTAATAT3’ ；

（3）腺病毒（5’-3’）的扩增引物：

ADV-B属-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCCGGTCAACGGGTACGA;

ADV-B属-F引物：ACCTGAGTCCGGGTCTGGTG;

ADV-C属-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCATCYTCAGTTCCATGRTT;

其中，Y=T/C；

ADV-C属-F引物：TTGCARGACAGAAACACAGAGCT;

ADV-E属-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGATATCAGCATAAATTACTGTG;

ADV-E属-F引物：AGCTTTAAACCCTACTCCGG;

（4）内参基因的扩增引物：

内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCAGCTAAGAGCA3’;

内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’;

2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地，所述逆转录酶为AMV或M-MLV；

3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；

4）放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列（5’-3’）为: AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；

5）特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

（1）RSVA特异探针序列：

RSVA-LES1: 5’TTGACAGATATGATACTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVA-LES2: 5’TCTTTTTTCTTGGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVA-LES3:5’ TTGGGTGATGTGAATTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVA-LES4: 5’CCCTTTATTGATTCTAGGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVA-LES5: 5’AATTTGGTGGCTCTGTTGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVA-CES: 5’ACTTCTATATCTATTGAGTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（2）RSVB特异探针序列：

RSVB-LES1：5’TTTCTTCTTAGGATCTTTGGATGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVB-LES2：5’GCAAACTTGCCTTTTATTGATTCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVB-LES3：5’GGAATTTTGTAGCTTTGTTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

RSVB-CES：5’TTGACAGATATTATGCTATCTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（3）PIV1特异探针序列：

PIV1-LES1：5’TCATAGGGTTGATTGATATCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

PIV1-LES2：5’TAGCAAAACGTGAAGTTGAGTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

PIV1-CES：5’TTATACTGTTATCTTTTAAATTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（4）PIV2特异探针序列：

PIV2-LES1：5’TATTTCAGAAATGTCAAGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

PIV2-LES2：5’CATGCGGGAAGTGCCCTAGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

PIV2-CES：5’TCATTATTGTGAAGAGGGCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（5）PIV3特异探针序列：

PIV3-LES1：5’GCTATTTTACCTTTAACGATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

PIV3-LES2：5’AGGAGAGTTAAGGTGACACTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

PIV3-CES：5’TCATAATTGTGTGTAATTGTTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（6）AdV-B属的特异探针序列：

ADV-B -LES1：AAATTTAGAAACCCCACATTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-B-LES2：GTGGCGCCCACCCACGATTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-B-LES3：GTGACCACCGACCGTAGCTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-B-CES1：GCCCGTGCAACAGACACCTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

ADV-B-CES2：TACTTCAGTATGGGGAACTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（7）AdV-C属的特异探针序列：

ADV-C-LES1：5’TTTTCYATGTGGAATCAGGCTGTWGTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

其中，W=A/T；

ADV-C-LES2：5’ACAGCTATGATCCAGATGTYAGAATTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-C-CES：5’GGTGATAGAACCAGRTAYTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

其中，R=A/G；

（8）AdV-E属的特异探针序列：

ADV-E-LES1：5’GCCAGTGGAAGGATGCTATTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-E-LES2：5’ACAGCAAAATGCATACCTTTTT CATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-E-LES3：5’TTGGGGTAGCTGCCATGCTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

ADV-E-CES1：5’ACAACAGTCTGGCTCCCATTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

ADV-E-CES2：5’AGGGAGCGCCCAATACCTTTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

（9）人内参基因特异探针序列：

内参LES1：5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCATGTGAGAACGCGAACGTGGT3’ ；

内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTT CTGTACGTATGTATGT3’ ；

内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTCTGTACGTATGTATGT3’ ；

6）微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列（5’-3’）为：5’ACATACATACGTACAG3’ ；

7）HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；

8）配制杂交液、洗液A（5×）、洗液B（5×）、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1% SDS的5×SSC；洗液A（5×）：含0.5% SDS的5×SSC；洗液B（5×）：含0.5% SDS的5×PBS；封闭液：含0.5% BSA、1 × PBS；底物稀释液：50mM pH8.5 Tris-HCl；

9）底物：购至Thermo Fisher，货号37075的鲁米诺化学发光底物，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。

2.权利要求1所述的试剂盒在制备呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒检测试剂中的应用。