WO2006070034A2 - Sondas de oligonucleótidos y método para la detección e identificación del virus influenza tipo a causante de infección respiratoria en humanos - Google Patents

Sondas de oligonucleótidos y método para la detección e identificación del virus influenza tipo a causante de infección respiratoria en humanos Download PDF

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WO2006070034A2
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Maria Teresa COIRAS LÓPEZ
Inmaculada Casas Flecha
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates, in general, to the detection of nucleic acid sequences, and, in particular, to probes and assays useful for simultaneously detecting a plurality of nucleic acid sequences in a single test sample. More specifically, the invention relates to probes and methods for the detection, by hybridization, of a plurality of nucleic acid sequences of viruses causing respiratory infections in humans, possibly present in a single test sample, selected from influenza viruses type A , influenza virus type B, influenza virus type C, respiratory syncytial virus type A, respiratory syncytial virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus types 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS), human metapneumovirus and combinations thereof.
  • viruses type A , influenza virus type B,
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) new antiviral drugs may be available, there will also be a growing demand for sensitive diagnostic methods that are routinely included in microbiology laboratories that allow rapid identification of the different viruses that cause respiratory infections. Laboratory diagnosis is, therefore, essential for the detection and identification of viruses that cause respiratory tract infections that cause diseases with clinically indistinguishable signs and symptoms. Erroneously, it is believed, for example, that strep throat can be reliably differentiated from viral pharyngitis in an individual patient. You can even make a probabilistic estimate of this (for example, the symptoms of a common cold have an 80% negative predictive value for the diagnosis of a bacterial pharyngitis), but the confirmation must be done through a laboratory analysis.
  • the etiological diagnosis of viral respiratory infections in humans has been, so far, using traditional methods, such as isolation in cell cultures or the indirect immunofluorescence (IF) technique, which, although they have a high sensitivity, they do not allow more than, except for few occasions, to distinguish the presence of more than one virus co-infecting the sample, which may be due to several factors, for example: (i) the destruction of the cell monolayer by the virus that has a greater cytopathic activity, which would mask the growth of other viruses possibly present in the sample to be tested that would grow more slowly or produce a less obvious cytopathic effect, and (ii) the non-availability of specific monoclonal antibodies that would allow the identification of viruses that They are coinfecting the sample. Therefore, the diagnosis of coinfections is undervalued, due to the absence of techniques that are sensitive enough and specific enough to detect them.
  • IF indirect immunofluorescence
  • viral genomes can be detected by the use of probes or oligonucleotides with a sequence homologous to that of the virus eventually present in the sample to be analyzed.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) techniques are usually simple and non-radioactive, for example, by fluorescence or chemiluminescence.
  • the methods based on hybridization techniques have, in addition to the advantages of specificity and sensitivity, the possibility of being able to quantify the amount of viral nucleic acids present in the sample (viral load), which can be used to monitor the patient's response to The antiviral therapy.
  • Genomic amplification methods make it possible to amplify several million times certain sequences of viral genomes, so that they can be easily detected.
  • the polymerase chain reaction (PCR) 1 in both single and multiple formats has proven to be an extremely sensitive and specific genomic amplification method in the diagnosis of respiratory infections caused by viruses.
  • Genomic amplification is relatively common in tests for the diagnosis of respiratory infections in humans because, in general, the amount of virus present in a conventional respiratory sample (nasopharyngeal lavage or aspirate, pharyngeal smear, gargle, etc.) is usually scarce .
  • the first amplification reaction is an RT-PCR (RT: retrotransciption or reverse transcription) since most of the viruses causing respiratory infections in humans have a genome consisting of RNA.
  • RT-PCR retrotransciption or reverse transcription
  • the methods based on amplification reactions allow the detection of one or several viral agents simultaneously, but not all
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) possible viruses causing respiratory infections, since, as is well known, there are technical difficulties to perform multiple PCRs that allow the simultaneous detection of several viruses, such as the loss of sensitivity when increasing the number of initiators in the reaction mixture or The need to adjust the situation of the initiators in the gene to be amplified in order to obtain easily differentiable fragments by their size when analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the invention provides a solution to the existing need consisting of probes and methods that allow to detect and identify simultaneously, quickly, specifically and sensitively, the main viruses causing infections
  • SUBSTITUTE SHEET human respiratory system possibly present in a single test sample.
  • the invention is based on the development of a hybridization system in which different oligonucleotides with specific sequences (probes) are immobilized on a solid support. These probes have been designed to hybridize specifically with target sequences present in the genome of said viruses, which allows not only the detection and identification of the virus that causes respiratory disease but also enables typing simultaneously.
  • This system can be adapted to the development of easy-to-use kits for microbiology laboratories that require establishing an etiological diagnosis of human respiratory infectious diseases.
  • Viruses causing respiratory infections in humans that can be identified by the method provided by this invention include influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C 1 human respiratory syncytial virus type A, human respiratory syncytial virus type B, adenovirus human, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing acute respiratory syndrome severe (SARS), human metapneumovirus, and combinations thereof.
  • influenza virus type A influenza virus type B
  • influenza virus type C 1 human respiratory syncytial virus type A
  • human respiratory syncytial virus type B adenovirus human
  • human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B enterovirus, rhinovirus,
  • the invention relates to a probe useful for identifying viruses that cause respiratory infections in humans selected from influenza type A virus, influenza type B virus, influenza type C virus, human syncytial respiratory virus type A, respiratory virus human syncytial type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and human metapneumovirus.
  • a probe useful for identifying viruses that cause respiratory infections in humans selected from influenza type A virus, influenza type B virus, influenza type C virus, human syncytial respiratory virus type A, respiratory virus human syncytial type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4
  • the invention in another aspect, relates to a hybridization platform comprising a solid support and at least one of said probes immobilized on said solid support.
  • the invention relates to a method for identifying viruses that cause respiratory infections in humans selected from influenza type A virus, influenza type B virus, influenza type C virus, human syncytial respiratory virus type A, human syncytial respiratory virus type B adenovirus
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) human, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing acute respiratory syndrome severe (SARS), human metapneumovirus and combinations thereof, possibly present in a single test sample, based on the hybridization of target sequences present in the genome of said viruses, optionally amplified by an amplification reaction, with said probes.
  • SARS coronavirus causing acute respiratory syndrome severe
  • the invention relates to a kit for identifying viruses that cause respiratory infections in humans selected from influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, human respiratory syncytial virus type A, human respiratory syncytial virus type B , human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing syndrome Severe acute respiratory (SARS), human metapneumovirus and combinations thereof, by said method comprising at least one of said probes, or at least one of said hybridization platforms.
  • SARS coronavirus causing syndrome Severe acute respiratory
  • Figure 1 shows the detection of reference strains of viruses that cause respiratory infections in humans grown in cell cultures by hybridization in nylon membrane and visualization by chemiluminescence.
  • the viruses tested were influenza virus type A (VIA), influenza virus type B (VIB), human respiratory syncytial virus type A (RSVA), human respiratory syncytial virus type B (RSVB), human adenovirus (ADV1), human coronavirus type 229E (HCV229E), human parainfluenza virus type 1 (PIV1), human parainfluenza virus type 2 (PIV2), human parainfluenza virus type 3 (PIV3), human parainfluenza virus type 4 A (PIV4A), human coronavirus type OC43 (HCVOC43), echovirus (Echo30), rhinovirus (Rhino14), human metapneumovirus (metapneumovirus) and influenza virus type C (VIC).
  • VIA influenza virus type A
  • VIB influenza virus type B
  • RSVA human respiratory syncytial
  • Figure 2 shows the detection by hybridization in nylon membrane and visualization by chemiluminescence of viruses that cause respiratory infections in humans, isolated from clinical samples of the tract
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) respiratory inoculated in cell cultures.
  • the viruses detected were influenza virus type A (Influenza A), influenza virus type B (Influenza B), respiratory virus * syncytial type A (RSVA), respiratory syncytial virus type B (RSVB), human adenovirus (ADV1) and human parainfluenza virus type 3 (Parainfluenza type 3).
  • Probes with different concentrations were used in order to observe the sensitivity depending on the concentration of the probes. For more information see Example 2.
  • Figure 3 shows the detection of influenza virus type A present in clinical samples by hybridization in nylon membrane ( Figure 3A) and by nested PCR ( Figure 3B).
  • Figure 3A shows the results of the hybridization of nucleic acids from the clinical samples tested to detect influenza virus type A with the probes (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) immobilized in the membrane (Lanes 1-12). No influenza A virus was detected in samples 2, 7 and 8.
  • Figure 3B shows the results of a nested PCR carried out to verify the sensitivity and specificity of the prior art (hybridization). Lanes 1-12 correspond to lanes 1-12 observed in Figure 3A.
  • Lane M corresponds to the XIV molecular weight marker, supplied by Roche Diagnostics (100 bp marker). In all lanes (except 2, 7 and 8) a band of 721 base pairs (bp) is observed, corresponding to the amplified fragment of the nucleoprotein gene of human influenza virus type A and an 837 bp band corresponding to the control internal used as control of the process of extraction of genetic material from the sample, as well as the PCR reaction (see Example 3). It is observed that the results obtained with both techniques are concordant.
  • Figure 4 shows the detection of coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) present in clinical samples by hybridization in nylon membrane and chemiluminescence visualization. Various concentrations of the probe used were tested (SEQ ID NO: 18). For a description of the test see Example 4.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • Figure 5 shows the detection of human adenovirus in clinical samples (respiratory secretions) from patients with respiratory conditions by hybridization in glass support (slides) and fluorescence visualization. The fluorescence emitted by the Cy3 molecules present in the amplification product obtained by oligonucleotides is observed
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) specific initiators for human adenoviruses. They have been used for amplification and dyeing by PCR, dilutions of adenovirus causing respiratory infection in humans belonging to serotypes 1 (image 1), 2 (image 2), 4 (image 3), 5 (image 4) and 7 (Image 5), these dilutions equivalent to 10 3 copies of a plasmid containing the fragment of the amplified human adenovirus hexon protein gene under the conditions described in Example 5. A negative control is included.
  • the invention provides probes and methods for simultaneously identifying a plurality of nucleic acid sequences of the main viruses causing respiratory infections in humans possibly present in a single test sample.
  • the invention relates to probes, hereinafter probes of the invention, which allow the identification, by specific hybridization, of the main viruses causing respiratory infections in humans, among which are influenza A viruses, viruses influenza type B, influenza virus type C, human respiratory syncytial virus type A, human respiratory syncytial virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and human metapneumovirus.
  • influenza A viruses viruses influenza type B, influenza virus type C, human respiratory syncytial virus type A, human respiratory syncytial virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type
  • probe refers to a defined sequence oligonucleotide capable of hybridizing with a complementary sequence of a nucleic acid, so it can be used to detect and identify complementary, or substantially complementary, sequences in acids. Nucleic by specific hybridization. Likewise, the term “hybridization”, as used herein, refers to the formation of a duplex structure by two nucleic acids due to the pairing of complementary bases. Hybridization can occur between fully complementary nucleic acid chains or between "substantially complementary" nucleic acid chains containing small mismatched regions. The conditions under which chains of hybridize
  • the person skilled in the art can empirically determine the stability of a duplex taking into account various variables, such as the length and concentration of the base pairs of the probes, the ionic strength and the incidence of the missing base pairs, following the guidelines of the state of the art (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989); and Wetmur, Critica! Reviews in Biochem. and Mol. Biol 26 (3/4): 227-259 (1991)).
  • the probes of the invention are complementary or substantially complementary to specific target sequences contained in the genomes of said viruses causing respiratory infections in humans (influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, human respiratory syncytial virus type A, type B human syncytial respiratory virus, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and human metapneumovirus) so as to allow their generic detection.
  • infectious virus type A influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, human respiratory syncytial virus type A, type B human syncytial respiratory virus, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza
  • the length of the probes of the invention can vary within a wide range although, for practical reasons, probes of small length are preferred, typically between 15 bases and 30 bases, preferably, between 19 bases and 23 bases.
  • probes of greater or lesser length would not affect the sensitivity or specificity of the technique, but could require the realization of a series of modifications on the conditions in which the same is performed by varying the melting temperature thereof and its GC content, which would affect the temperature and hybridization time, fundamentally.
  • the invention provides probes for the detection and identification of influenza virus type A by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The nucleoprotein or its complementary chain.
  • said probes include polynucleotides identified as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Said probes can be used separately or together to increase the sensitivity of the detection. . .
  • the invention provides probes for the detection and identification of influenza virus type B by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of Ia nucleoprotein or its complementary chain.
  • Illustrative examples of said probes include the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Said probes can be used separately or together to increase the sensitivity of the detection.
  • the invention provides probes for the detection and identification of influenza virus type C by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of Ia nucleoprotein or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 5.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human type A respiratory syncytial virus by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of the fusion protein (protein F) or its complementary chain.
  • probes include polynucleotides identified as SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. Said probes can be used separately or together to increase the sensitivity of the detection.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human respiratory syncytial virus type B by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of the fusion protein (protein F) or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 8.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human adenovirus by specific hybridization
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the hexon protein gene or its complementary chain.
  • said probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 9..
  • the invention provides probes for the detection and identification of human parainfluenza virus type 1 by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of The hemagglutinin protein or its complementary chain.
  • Illustrative examples of said probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 10.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human parainfluenza virus type 2 by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of The hemagglutinin protein or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 11.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human parainfluenza virus type 3 by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of The hemagglutinin protein or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 12.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human parainfluenza virus types 4A and 4B by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the hemagglutinin protein gene or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 13 which makes it possible to detect the presence of human parainfluenza viruses type 4A or 4B but does not allow their distinction.
  • the invention provides probes for the detection and identification of enteroviruses by specific hybridization that
  • SUBSTITUTE SHEET include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the 5 'non-coding region or its complementary chain.
  • Illustrative examples of said probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 14..
  • the invention provides probes for the detection and identification of rhinoviruses by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the 5 'non-coding region or its complementary chain.
  • Illustrative examples of said probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 15.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human coronavirus type 229E by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of Ia Spicular protein or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 16.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human coronavirus type OC43 by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of Ia Spicular protein or its complementary chain.
  • probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 17.
  • the invention provides probes for the detection and identification of coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions of hybridization with a nucleic acid sequence located in the gene of the spinal protein or its complementary chain.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • Illustrative examples of said probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 18.
  • the invention provides probes for the detection and identification of human metapneumovirus by specific hybridization that include polynucleotides of 15 to 30 bases capable of hybridizing under strict conditions. hybridization with a nucleic acid sequence located in the protein polymerase gene or its complementary chain. Examples
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Illustrative of such probes include the polynucleotide identified as SEQ ID NO: 19.
  • the probes provided by this invention allow simultaneous detection and identification of the main viruses causing respiratory infection in humans and even their simultaneous typing and / or subtyping.
  • the probes of the invention in particular, probes whose nucleotide sequences are shown in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 19, have several advantages since their short length (23 bases maximum) makes their synthesis to be very economical and, in addition, allow the generic detection of the main viruses that cause respiratory infections in humans, including serotypes thereof, such as influenza viruses of all subtypes of type A, all variants of influenza virus type B, virus variants of influenza type C, human respiratory syncytial virus type A, human respiratory syncytial virus type B, all types of human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, variants of human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and cep as variants of the human metapneumovirus.
  • serotypes thereof such as
  • the use of said probes allows to detect and identify hundreds of viruses that cause respiratory infection at a low cost, which is why they constitute an important step to produce a diagnostic tool that combines all the advantages of hybridization techniques for detection and simultaneous identification of the main viruses that cause infection in the human respiratory tract.
  • oligonucleotide probes for the detection and identification of viruses causing respiratory infections in humans, such as the probes of the invention, include:
  • the probes of the invention are advantageously immobilized on a solid support, as will be described later.
  • Said solid supports in which the probes of the invention have been immobilized, which constitute hybridization platforms, represent a further aspect of this invention.
  • the probes can incorporate additional characteristics that allow the immobilization to the support but that do not alter its main characteristic (hybridize with complementary nucleic acid sequences).
  • said probes may contain an amino group at the 5 'end to facilitate the immobilization of the probe and spatially orient the probe on the membrane or in case of glass support, the treatment of the surface with poly-L-lysine allows the immobilization of the probes without spatial orientation.
  • the invention in another aspect, relates to a hybridization platform comprising a solid support and at least one probe of the invention immobilized on said solid support.
  • solid support refers to an insoluble material, or which can become insoluble by a subsequent reaction.
  • Said solid support may be chosen based on its intrinsic ability to immobilize an oligonucleotide probe, or it may incorporate an additional receptor capable of immobilizing the oligonucleotide probe so as to allow indirect binding of the probe to the solid support through said receptor.
  • Said additional receiver may be a substance loaded with a charge opposite to that of the probe or it may be a specific binding member immobilized on (or attached to) the solid support capable of immobilizing the probe through a specific binding reaction , for example, avidin or streptavidin that allows the immobilization of biotinylated oligonucleotide probes.
  • the solid support can be constituted by any appropriate material that allows the immobilization, directly or indirectly, of the probe to said solid support, for example, plastics, derivatized plastics, polymers, latex, optical fiber, glass or silicon surfaces, ceramic surfaces , metal surfaces, etc. These materials can be used
  • SUBSTITUTE SHEET in any appropriate configuration known to those skilled in the art, for example, in the form of membranes, sheets, films, plates, chips, etc., or they may be covering, totally or partially, or attached to, inert carriers such as paper , nylon, glass, plastic films, fabrics, etc.
  • the solid support can be coated to facilitate the immobilization of the probes to its surface.
  • said solid support is a nylon membrane or a glass or glass surface, for example, a slide, optionally coated, for example, with membranes, silicone supports, polymeric supports, etc.
  • the probe of the invention immobilized on said solid support is selected from the group formed by the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ 5 ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and mixtures thereof.
  • the hybridization platform may contain a variable number of probes of the invention immobilized on the solid support
  • the hybridization platform of the invention comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 of said probes (SEQ ID NO: 1 - SEQ 0 ID NO: 19).
  • the hybridization platform of the invention comprises said 19 probes of the invention (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19).
  • the probes of the invention can be arranged on the solid support in an oriented (known) or non-oriented arrangement.
  • the term "oriented arrangement" means that the probe is immobilized on the support in a defined location (known position). Therefore, in a particular embodiment, the hybridization platform of the invention comprises two or more probes of the invention immobilized on said solid support in an unoriented arrangement. Alternatively, in another particular embodiment, the hybridization platform of the invention comprises two or more probes of the invention immobilized on said solid support in an oriented arrangement.
  • the probes of the invention are immobilized on the solid support in an oriented arrangement, constituting a matrix or chip.
  • Biochips or arrays of DNA involve the provision in specific areas of a support of a set of specific probes. Since the deposition of the 5 probes is performed at microscopic points, a single biochip can be applied in a single biochip.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) very high number of different probes, of the order of 10,000-500,000 different probes per biochip, which allows to simultaneously detect various viral pathogens that cause respiratory infections in humans possibly present in a single clinical sample.
  • the biochip would also allow quantifying the viral load and even identifying the antiviral drug against which it is sensitive or resistant, in order to facilitate the treatment of the patient.
  • any method known to those skilled in the art can be used to immobilize the probes of the invention to the solid support.
  • a commonly used method consists in the non-covalent coating of the solid support with a member of a specific binding pair, for example, streptavidin, and the immobilization of biotinylated oligonucleotide probes.
  • oligonucleotide probes can be directly linked to the solid support by epoxy / amine coupling reactions.
  • the solid support is a membrane that has a negative charge surface, such as a nylon membrane.
  • the membrane is treated with 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) to activate the carboxyl groups present on the surface of the membrane.
  • EDAC 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the probes are designed to contain an amino group at the 5 'end in order to spatially orient the probe on the membrane.
  • the solid support is a glass slide (glass), such as a slide, optionally subjected to a treatment with poly-L-lysine in order to arrange on the glass surface amino groups to be joined by electrostatic interactions to the phosphate groups of the probes, which are not spatially oriented on the surface.
  • glass glass
  • poly-L-lysine in order to arrange on the glass surface amino groups to be joined by electrostatic interactions to the phosphate groups of the probes, which are not spatially oriented on the surface.
  • the concentration of the probes in the solid support can vary within a wide range depending on numerous factors, among which are the nature and type of solid support, the nature of the probe, etc .; however, in a particular embodiment, when the solid support is a nylon membrane, the probes can be used at a concentration between about 60 and about 400 pmoles per lane, preferably, between 0.8 and 1 pmoles / ⁇ l. Alternatively, when the solid support is a glass slide, the concentration of the probes can be comprised
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) between about 1 and about 40 pmol / ⁇ l, preferably 20 pmol / ⁇ ! approximately.
  • the invention relates to a method for identifying viruses causing respiratory infections in humans, hereinafter method of the invention, selected from influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, respiratory human syncytial virus type A, human syncytial respiratory virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, coronavirus human type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS), human metapneumovirus and combinations thereof, possibly present in a test sample, comprising: a) contacting nucleic acids from said test sample with a platform of hybridization of the invention comprising a solid support and at least one probe of the immovable invention enlisted on said solid support, wherein each of said probes is substantially complementary to a specific target sequence of each of said viruses causing respiratory infection;
  • test sample refers to any biological sample suspected of containing one or more viruses causing respiratory infection in humans, such as influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, type A human respiratory syncytial virus, type B human syncytial respiratory virus, human adenovirus, type 1 human parainfluenza virus, type 2 human parainfluenza virus, type 3 human parainfluenza virus, type 4 A and 4 B parainfluenza virus, enterovirus, rhinovirus, coronavirus human type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and human metapneumovirus.
  • the genome of said viruses contains target sequences that allow their detection and identification by hybridization of said target sequences with the appropriate probes, also allowing, at times, their simultaneous typing.
  • the test sample can proceed
  • SUBSTITUTE SHEET from any biological source, for example, samples of human origin of biological fluids or tissues, such as blood, sputum, gargle, smears (pharyngeal or nasopharyngeal), aspirates (nasopharyngeal, bronchial, tracheal or pleural), etc., as well as blood products (plasma, serum, leukocytes).
  • samples of human origin of biological fluids or tissues such as blood, sputum, gargle, smears (pharyngeal or nasopharyngeal), aspirates (nasopharyngeal, bronchial, tracheal or pleural), etc.
  • blood products plasma, serum, leukocytes
  • the test sample can come from virus cell cultures.
  • test sample can be used either directly, as obtained from the source, or after being subjected to a pre-use treatment in order to modify its characteristics, for example, diluting viscous fluids, inactivating interfering agents, converting double stranded nucleic acids into single stranded nucleic acids, accumulating, purifying or amplifying target sequences, etc.
  • the hybridization platform may contain a single probe of the invention, in practice it is preferred that said hybridization platform contains two or more probes of the invention, preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 of the probes of the invention whose nucleotide sequences are selected from the sequences identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19
  • the hybridization platform of the invention comprises said 19 probes of the invention (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19).
  • Virtually any probe of the invention, whose nucleotide sequence is complementary or substantially complementary to a specific target sequence of each of said viruses causing respiratory infection can be used in the implementation of the method of the invention since the hybridization of the probes with the target sequences is indicative of the presence of the corresponding virus in the analyzed sample.
  • the method of the invention whose nucleotide sequence is complementary or substantially complementary to a specific target sequence of each of said viruses causing respiratory infection
  • the probes of the invention immobilized on said solid support are selected from the group formed by the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16,
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Ia hybridization of a target sequence with a probe selected from the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and / or mixtures thereof is indicative of the presence of influenza virus type A in the sample;
  • the hybridization of a target sequence with a probe selected from the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and / or mixtures thereof is indicative of the presence of influenza virus type B in the sample;
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 5 is indicative of the presence of influenza virus type C in the sample;
  • Ia hybridization of a target sequence with a probe selected from the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and / or mixtures thereof is indicative of the presence of human respiratory syncytial virus type A;
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 8 is indicative of the presence of human type B respiratory syncytial virus;
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 9 is indicative of the presence of human adenovirus
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 10 is indicative of the presence of human parainfluenza virus type 1;
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 11 is indicative of the presence of human parainfluenza virus type 2;
  • NO: 12 is indicative of the presence of human parainfluenza virus type 3;
  • hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 13 is indicative of the presence of human parainfluenza virus type 4A and 4B;
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 14 is indicative of the presence of enteroviruses;
  • NO: 15 is indicative of the presence of rhinovirus
  • hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 16 is indicative of the presence of human coronavirus type 229E;
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 17 is indicative of the presence of human coronavirus type OC43;
  • SARS coronavirus causing severe acute respiratory syndrome
  • the hybridization of a target sequence with the probe identified as SEQ ID NO: 19 is indicative of the presence of human metapneumovirus.
  • the detection of the hybridization of the target sequences with the probes of the invention can be carried out by any appropriate method known to those skilled in the art.
  • the mapping of the genetic material (nucleic acids) to hybridize will be different depending on the detection method selected.
  • the marker can be incorporated either in the target sequence to hybridize with the probe or in the probe itself.
  • the detection of the hybridization [step b)] is performed by a radioactive method, while, in another particular embodiment, the detection of the hybridization [step b)] is performed by a non-radioactive method, for example , by a fluorescent, colorimetric or luminescent method (bioluminescent or chemiluminescent).
  • a fluorescein or biotin marking can be performed for chemiluminescent detection, or a digoxigenin marking for chemiluminescent or chemofluorescent detection, etc.
  • the method of the invention comprises performing an amplification reaction of viral nucleic acids before carrying out the hybridization step [step a)].
  • step a) the concentration of viruses causing human respiratory infections to be detected in respiratory secretions is low.
  • nucleic acid amplification reaction can be carried out before performing the hybridization step [step a)].
  • the invention provides a method for identifying viruses that cause respiratory infections in humans, wherein said viruses are selected from influenza type A virus, influenza type B virus, influenza type C virus, human syncytial respiratory virus type A, human syncytial respiratory virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, coronavirus human type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS), human metapneumovirus and combinations thereof, possibly present in a test sample, comprising:
  • step (ii) subjecting the mixture resulting from step (i) to an enzymatic amplification reaction to amplify target sequences of said viruses causing respiratory infection possibly present in said test sample;
  • a hybridization platform of the invention comprising a solid support and, at least, a probe of the invention, oriented or not, immobilized on said solid support , wherein each of said probes is substantially complementary to a
  • the amplification of a nucleic acid region containing the target sequence can be carried out by practically any method of amplification of target sequences, such as, for example, the polymerase chain reaction (PCR), the chain reaction of the Ia ligase (CSF), the band shift amplification [see, in general, G. Walker et al., (1992). Proc. Nati Acad. Sci. USA 89: 392-396; G. Walker et al., (1992). Nucleic Acid Res. 20: 1691-1696], the amplification based on transcription [D. Kwoh et al., (1989). Proc. Nati Acad. Sci. USA 86: 1173-1177], the self-sustained sequence replication (3SR) [J.
  • PCR polymerase chain reaction
  • CSF Ia ligase
  • the amplification reaction can be carried out without extracting the nucleic acids contained in the test sample, advantageously, said nucleic acids present in the sample are extracted before carrying out the amplification reaction.
  • Virtually any appropriate method to extract nucleic acids can be used; However, in a preferred embodiment the nucleic acids contained in the test sample are extracted by using a protocol for extracting nucleic acids in a single step. From any of them an extraction of the genetic material of the sample, both RNA and DNA is performed, since although virtually all respiratory viruses have an RNA genome, adenoviruses have a DNA genome.
  • Commercial methods such as RNeasy (Qiagen) can be used although other methods can also be used, for example, methods based on the extraction with a buffer of
  • the amplification of the regions of the viral nucleic acids that contain the target sequences is carried out by multiple RT-PCR.
  • primers useful in the RT reaction and in the multiple PCR to amplify the target sequence of the influenza virus genotype types A, B and C, human respiratory syncytial virus types A and B and respiratory adenoviruses are mentioned in Coiras and cois. , 2003, Journal of Medical Virology 69: 132-144.
  • the invention (general). Virtually any probe of the invention, whose nucleotide sequence is complementary or substantially complementary to a specific target sequence of each of said viruses causing respiratory infection can be used in the implementation of the method of the invention since the hybridization of the probes with the target sequences is indicative of the presence of the corresponding virus in the analyzed sample.
  • the hybridization platform may contain a single probe of the invention, in practice it
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) prefers that said hybridization platform contains two or more probes of the invention, preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 of the probes of the invention whose nucleotide sequences are selected from the sequences identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
  • the hybridization platform of the invention comprises said 19 probes of the invention ( SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19). Said probes allow the identification of the viruses that cause respiratory infections in humans previously mentioned.
  • the detection of the hybridization between the target sequences of the viral genome present in the products resulting from the amplification reaction (amplicons) with the probes of the invention can be carried out by any of the previously mentioned methods in relation to the detection of the hybridization between the target sequences of the viral genome (without amplifying) with the probes of the invention.
  • the detection of the hybridization is performed by a radioactive method, while, in another particular embodiment, it is performed by a non-radioactive method, for example, by a fluorescent, colorimetric or luminescent method (bioluminescent or chemiluminescent).
  • a fluorescein or biotin marking can be performed for chemiluminescent detection, or a digoxigenin marking for chemiluminescent or chemofluorescent detection, etc.
  • the marking can be done during the amplification process or later, for example by using the Klenow polymerase in the presence of aminoalyl-dUTP (Wang et al., 2002, Proc Nati Acad Sci US A. 99 (24): 15687-15692) or using commercial make-up kits such as Cymerscribe kits from Amersham Life Sciences.
  • the solid support on which the probes of the invention are immobilized is a nylon membrane
  • a fluorescent label such as
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Cy3 or Cy5 (Amersham Life Sciences) linked to a dNTP (either dATP, dUTP, dCGP or dCTP), which allows its subsequent detection with a scanner.
  • dNTP either dATP, dUTP, dCGP or dCTP
  • the detection systems can be varied (radioactive or non-radioactive methods) it is preferred to perform a chemiluminescent detection when the support is a nylon membrane or a slide with a membrane adhered to its surface (for example, Vivid TM Gene Array Slides, PaII Life Sciences).
  • a chemiluminescent detection when the support is a nylon membrane or a slide with a membrane adhered to its surface (for example, Vivid TM Gene Array Slides, PaII Life Sciences).
  • dCTP Perkin Elmer Life Sciences
  • dUTP Roche Diagnostics
  • streptavidin-peroxidase is added at a recommended concentration of 1: 4000, which will allow chemiluminescent development by using luminol in the presence of hydrogen peroxide (by example, ECL Detection System, Amersham Biosciences), according to the manufacturer's instructions.
  • the detection limits have been very similar in all the supports used.
  • the quantification of the detection limits was carried out by means of plasmids containing the fragment resulting from the amplification by PCR.
  • the detection limit has been 10-100 copies of plasmid in all cases.
  • the method of the invention has numerous advantages over other methods used for the detection and identification of viruses, among which the following can be mentioned:
  • oligonucleotide probes for the detection and identification of viruses causing respiratory infections in humans presents additional advantages over conventional techniques based on isolation in cell cultures or IF, among which can be cited the following: (i) regarding isolation in cell cultures, hybridization-based techniques are faster and more sensitive (especially in the case of slow-growing virus or with special requirements for it); and (ii) regarding IF-based techniques, they are more specific.
  • the invention relates to a kit, hereinafter kit of the invention, for the identification of a virus causing respiratory infection selected from influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, respiratory human syncytial virus type A, human syncytial respiratory virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enterovirus, rhinovirus, human coronavirus type 229E, human coronavirus type OC43, coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and
  • a virus causing respiratory infection selected from influenza virus type A, influenza virus type B, influenza virus type C, respiratory human syncytial virus type A, human syncytial respiratory virus type B, human adenovirus, human parainfluenza virus type 1, human parainfluenza virus type 2, human parainfluenza virus type 3, human parainfluenza virus type 4 A and 4 B, enter
  • the kit of the invention comprises a hybridization platform of the invention constituted by a solid support in which one or more probes of the invention are immobilized.
  • the kit of the invention comprises a hybridization platform comprising a solid support on which probes of the invention selected from the group formed by the polynucleotides identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 have been immobilized.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19 and its mixtures.
  • Said probes may be arranged in oriented or non-oriented arrangements.
  • the kit of the invention includes the reagents necessary to carry out the method of the invention, as well as instructions for doing so.
  • it may contain, if desired, specific primers for the amplification of target sequences (if an amplification reaction is carried out before hybridization) as well as positive and negative controls.
  • specific primers for the amplification of target sequences if an amplification reaction is carried out before hybridization
  • positive and negative controls if desired, specific primers for the amplification of target sequences (if an amplification reaction is carried out before hybridization) as well as positive and negative controls.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The samples used for the performance of this test were samples from reference strains of respiratory viruses that cause respiratory infections grown in cell cultures. Said reference strains were supplied by renowned laboratories and are accepted as reference strains by the international scientific community, as listed below:
  • Influenza virus type A / Panama / 2007/99 Influenza virus type B B / Yamanash ⁇ / 166/98 Influenza virus type C C / Africa / 1/66
  • RSVA human respiratory syncytial virus
  • RSVB human syncytial respiratory virus
  • Rhinovirus 14 (Rhino14) 1059
  • virus concentrations used were calculated in each case: 100 TCID 50 in influenza viruses types A and B; dilution 10 "3 of a preparation of influenza virus type C with a title 2048 by inhibition of hemagglutination; dilution 10 '3 of RSVA and RSVB, equivalent to detecting an infected cell by indirect immunofluorescence; dilutions 10" 3 ADV1, human parainfluenza virus types 1, 2, 3 and 4B, human coronavirus 229E, human coronavirus OC43, and human metapneumovirus, all equivalent to 10 5 copies of plasmid; as well as 10 "4 dilutions of Echo30 and Rhino14, equivalent to 0.1 TCID 50 .
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • homologous probes to the template chain of each virus have been used, as well as to the complementary chain, independently and / or together, in order to verify the best sensitivity result.
  • concentrations of each probe are those described above.
  • the location of the probes is specified in each case ( Figure 1).
  • the probes used in this test are indicated in Table 1.
  • probes have a hexyllamino group at the 5 'end, as described by Kaufhold and cois. (FEMS Microbiol. Lett. 1994 Jun 1; 119 (1-2): 19-25).
  • the presence of the amino group facilitates the immobilization of the probe and allows spatial orientation of the probe on the membrane.
  • the probes were diluted in a freshly prepared solution of 500 mM NaHCO 3 , pH 8.4, following a previously described protocol [Vinjé Jy Koopmans MPG. J Clin Microbiol 2000, 38: 2595-2601]. In this case, all probes were used at a concentration of 0.8 ⁇ M.
  • the membrane used in this test was a membrane with a negative charge surface (Biodyne C, PaII Life Sciences) of an approximate size of 14.5 cm x 14.5 cm. Said membrane was prepared following a previously described protocol [Vinjé & Koopmans cited supra]. Briefly, before joining the probes to the membrane, it was treated with a freshly prepared solution of 1-ethyl-3-
  • the extracted genetic material was subjected to an enzymatic amplification reaction in order to amplify fragments containing the homologous sequences to the probes used (Table 1) for the detection of the different viral pathogens (influenza viruses types A, B and C, RSVA , RSVB, ADV1, PIV1, PIV2, PIV3, PIV4, coronavirus, echovirus, rhinovirus and metapneumovirus) immobilized on a nylon membrane.
  • the different viral pathogens influenza viruses types A, B and C, RSVA , RSVB, ADV1, PIV1, PIV2, PIV3, PIV4, coronavirus, echovirus, rhinovirus and metapneumovirus
  • Enzymatic amplification reactions of the different fragments were carried out using the primers described by Coiras and cois. (Coiras and cois., Journal of Medical Virology 69: 132-144 (2003); and Coiras and cois., Journal of Medical Virology 72 (3): 484-495 (2004)).
  • the amplification was carried out in the presence of dATP, dGTP and dCTP 200 ⁇ M, dTTP 130 ⁇ M and biotin-16-dUTP 70 ⁇ M, by reaction in order to label the genetic material (amplification products or amplicons) to hybridize.
  • the probes were diluted in a freshly prepared solution of 500 mM NaHCO 3 , pH 8.4, following the protocol previously described.
  • a freshly prepared solution of 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) at 16% in water, for at least 15 minutes, and then rinsed with water.
  • EDAC 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the probes subjected to the previously indicated treatment were immobilized on the nylon membrane previously prepared by conventional methods [Vinjé & Koopmans cited above] based on the fact that the amino group present in the probes covalently binds to the activated carboxyl groups from the treatment of the membrane with EDAC.
  • the nylon membrane was introduced in a 45-channel miniblotter (Biometra). The channels that were not to contain a probe were filled with a freshly prepared solution of 500 mM NaHCO 3 , pH 8.4, while the channels that were to contain the probes were filled with dilutions of the probes prepared at the time as they were has previously indicated.
  • the probes were incubated in contact with the membrane at room temperature (18-22 0 C) for 10 minutes.
  • the liquid was then aspirated from the channels with a vacuum pump.
  • the esters groups that remained activated in the membrane were hydrolyzed by incubation at room temperature with a solution of 100 mM NaOH for a period of time not exceeding 10 minutes.
  • the membrane with the probes was rinsed with ultrapure distilled water several times.
  • the concentration of the probes in the nylon membrane was approximately 0.8-5 pmoles / ⁇ l (or 120-750 pmoles per lane) in a final volume of 150 ⁇ l, which completely filled the miniblotter lane (Biometra) .
  • the probes were placed on the membrane always following the same order in the rails. The analysis of the results was done using a template that allowed to quickly identify the viruses that had been detected in the sample (s).
  • the membrane with the probes was subjected to a prehybridization treatment. To do this, the membrane with the probes was washed with a solution of
  • 2X SSPE 360 mM NaCI, 20 mM NaH 2 PO 4 , 2 mM EDTA, pH 7.2
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the membrane with the probes was placed in a miniblotter rotated 90 ° with respect to the previous position.
  • Ten microliters of the labeled genetic material was diluted in 150 ⁇ l of hybridization buffer (2x SSPE, 0.5% SDS). Since the product to be hybridized is double - stranded DNA, it was subjected for 10 minutes to heating at 99 0 C and then quickly cooled for 1 minute at 4 0 C. After keeping at room temperature for 1 minute proceeded to make Ia hybridization. The hybridization process was conducted for about 2 hours at about 48 0 C, with gentle shaking.
  • chemiluminescent development with luminol was carried out in the presence of hydrogen peroxide using a commercial kit (ECL Detection System, Amersham Biosciences), following the manufacturer's instructions. The results were visualized by printing X-ray films (Kodak) for 5 minutes, 30 minutes and 4 hours.
  • Detection of respiratory viruses isolated from clinical samples of the respiratory tract inoculated in cell cultures The detection of various respiratory viruses that cause respiratory infections in samples from cell cultures was carried out by means of an assay based on the hybridization to probes immobilized on a membrane of Nylon, of the fragments of genetic material amplified and labeled with biotin.
  • influenza virus type A influenza virus type B
  • RSVA human respiratory syncytial virus type A
  • RSVB human respiratory syncytial virus type B
  • ADV human adenovirus
  • PAV3 human parainfluenza virus type 3
  • serial dilutions were used in base ten, of virus isolated in cell cultures from respiratory samples of patients.
  • the dilutions used for each virus were the following: the initial dilutions, marked as -1 ( Figure 2), were 100 TCID 50 in influenza viruses type A (lanes 1-4) and B (lanes 5-8), a 10 "3 dilution of RSVA (lanes 9-12) and RSVB (lanes 13-16), ADV (lanes 17-20), equivalent to detecting a cell infected by indirect immunofluorescence, and a 10 " 3 dilution
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of human parainfluenza virus type 3 (lanes 21-24), equivalent to detecting 10 5 copies of a plasmid containing the fragment amplified by the RT-PCR.
  • the probes designed for the detection of influenza A and B and RSVA influenza viruses were used together or separately, at a final concentration of 0.8 ⁇ M.
  • the other probes were used at concentrations of 5, 1 and 0.8 ⁇ M in order to observe the different sensitivity depending on the variation of the concentration.
  • probes have a hexylamino group at the 5 'end, as described by Kaufhold and cois. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1; 119 (1-2): 19-25).
  • the presence of the amino group facilitates the immobilization of the probe and allows spatial orientation of the probe on the membrane.
  • the probes were diluted in a freshly prepared solution of 500 mM NaHCO 3 , pH 8.4, following a previously described protocol [Vinjé Jy Koopmans MPG .. J Clin Microbiol 2000, 38: 2595-2601] .
  • the membrane used in this test was a membrane with a negative charge surface (Biodyne C, PaII Life Sciences), approximately 14.5 cm x 14.5 cm in size. Said membrane was prepared following a described protocol.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) previously [Vinjé & Koopmans cited supra]. Briefly, before joining the probes to the membrane, it was treated with a freshly prepared EDAC solution at 16% in water, for at least 15 minutes, and then rinsed with water. The membrane thus prepared was used immediately or stored at 4 0 C in filter paper until its use for a maximum of 1 week.
  • the detection and identification of viral pathogens was carried out in substantially the same way as mentioned in Example 1.2.5.
  • Results obtained are shown in Figure 2 and show the specificity and sensitivity of the tested technique that allows to identify different viral pathogens causing respiratory infections, isolated from clinical samples of the respiratory tract inoculated in cell cultures.
  • the variation in the sensitivity of the detection can be seen as a function of the dilution of the virus and the different concentration of the probe used, as well as whether the probes for the detection of influenza A and B viruses and RSV type A are used. together or separately.
  • the specificity is, in all cases, very high.
  • influenza virus type A present in the clinical sample tested was carried out by means of an assay based on the hybridization of fragments of amplified and labeled genetic material with probes immobilized on a nylon membrane.
  • the samples used to carry out this trial were pharyngeal smears taken from patients who had symptoms indicative of influenza, in order to try to identify the virus that produces the clinical picture.
  • the probes used in this test were designed with a hexylamino group at the 5 'end, as described by Kaufhold and cois. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1; 119 (1-2): 19-25). The presence of the group
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) amino facilitates the immobilization of the probe and allows spatial orientation of the probe on the membrane.
  • the probes were diluted in a freshly prepared solution of 500 mM NaHGO 3 , pH 8.4, following a previously described protocol [Vinjé Jy Koopmans MPG .. J Clin Microbiol 2000, 38: 2595-2601] . In this case, all probes were used at a concentration of 0.8 ⁇ M.
  • the membrane used in this test was a membrane with a negative charge surface (Biodyne C, PaII Life Sciences) of an approximate size of 14.5 cm x 14.5 cm. Said membrane was prepared following a previously described protocol [Vinjé & Koopmans cited supra]. Briefly, before joining the probes to the membrane, it was treated with a freshly prepared EDAC solution to the
  • the extracted genetic material was subjected to an enzymatic amplification reaction in order to amplify fragments containing the sequences homologous to the probes used (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) for the detection of the viral pathogen (influenza virus type A) fixed to a nylon membrane.
  • the enzymatic amplification reaction (RT-PCR) of the different fragments was carried out using the primers and the conditions described by Coiras and cois. (Coiras and cois., Journal of Medical Virology 69: 132-144 (2003)). In all cases, the amplification was carried out in the presence of dATP, dGTP, and 200 ⁇ M dCTP, dTTP
  • SUBSTITUTE SHEET 130 ⁇ M and biotin-16-dUTP 70 ⁇ M per reaction, in order to mark the genetic material (amplification products or amplicons) to hybridize.
  • Hybridization of the amplified genetic material with the probes immobilized on the nylon membrane was carried out in a manner substantially identical to that mentioned in Example 1.2.4.
  • the detection and identification of the viral pathogen was carried out in substantially the same way as mentioned in Example 1.2.5.
  • Figure 3A shows the results of the hybridization of the genetic material from the virus in the clinical sample, with the probes immobilized in the membrane (Lanes 1-12). No influenza A virus was detected in samples 2, 7 and 8. These results show the specificity and sensitivity of Ia
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Technique tested to identify influenza virus type A in clinical samples.
  • Lane M of Figure 3B corresponds to the XIV molecular weight marker, provided by Roche Diagnostics (100 bp marker).
  • a band of 721 base pairs (bp) is observed, corresponding to the amplified fragment of the nucleoprotein gene of influenza A virus, and an 837 bp band, corresponding to the control internal used as a control of the process of extraction of the genetic material from the sample, as well as of the PCR reaction (the plasmid of the internal control and the initiators for its amplification are described in Coiras and cois., (2003) cited above, where the initiators and the conditions for performing the nested PCR are also described).
  • SARS coronavirus causing severe acute respiratory syndrome
  • the samples used to carry out this test were genetic material from inactivated virus and a plasmid that includes a fragment of the coronavirus polymerase that causes severe acute respiratory syndrome (SARS) 1 kindly provided by Dr. Christian Drosten (Bernhard Rickt Institute for Tropical Medicine, National Reference Center for Tropical Infectious Diseases, Hamburg, Germany).
  • Serial dilutions of the inactivated virus from 10 ⁇ 3 dilution have been used, equivalent to serial dilutions made from a 10 5 dilution of plasmid that includes the fragment of the amplified polymerase gene from the CoV-SARS genome.
  • the probe used in this assay was designed with a 5'-hexylamino group, as described by Kaufhold et al. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1; 119 (1-2): 19-25). The presence of the amino group facilitates the immobilization of the probe and allows spatial orientation of the probe on the membrane. Two concentrations of said probe (0.8 ⁇ M and 5 ⁇ M) were tested as shown in Figure 4. For immobilization on the membrane, the probes were diluted in a freshly prepared solution of 500 mM NaHCO 3 , pH 8, 4, following a previously described protocol [Vinjé Jy Koopmans MPG. J Clin
  • the membrane used in this test was a membrane with a negative charge surface (Biodyne C, PaII Life Sciences) of an approximate size of 14.5 cm x 14.5 cm. Said membrane was prepared following a previously described protocol [Vinjé & Koopmans cited supra]. Briefly, before joining the probes to the membrane, it was treated with a freshly prepared EDAC solution to the
  • the extracted genetic material was subjected to an enzymatic amplification reaction in order to amplify fragments containing the sequences homologous to the probes used (SEQ ID NO: 18) for the detection of the viral pathogen (coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) )) attached to a nylon membrane.
  • SARS coronavirus causing severe acute respiratory syndrome
  • SUBSTITUTE SHEET Fragments were carried out using the primers and conditions described by Drosten C and cois. (Drosten C et al., 2003, N Engl J Med. May 15; 348 (20): 1967-76). The amplification was carried out in the presence of dATP, dGTP, and 200 ⁇ M dCTP, 130 ⁇ M dTTP and 70 ⁇ M biotin-16-dUTP, by reaction in order to label the genetic material (amplification products or amplicons) to hybridize.
  • Hybridization of the genetic material amplified with the probe immobilized on the nylon membrane was carried out in a manner substantially identical to that mentioned in Example 1.2.4.
  • the detection and identification of the viral pathogen was carried out in substantially the same way as mentioned in Example 1.2.5.
  • EXAMPLE 5 Detection of human adenovirus present in clinical samples
  • Generic detection of human adenovirus present in clinical samples was carried out by means of an assay based on the hybridization of amplified and labeled fragments of genetic material, with immobilized, non-oriented probes, on slides of crystal.
  • the samples used to carry out this test were respiratory secretions from patients with respiratory conditions.
  • the genetic material was extracted directly from the clinical samples and the possible virus present in them was analyzed by two multiple RT-PCR followed by
  • the probe used in this test (SEQ ID NO: 9) was immobilized directly on a glass surface (slides), in a non-space-oriented arrangement, at a concentration of 20 ⁇ M.
  • the probes are prepared at the recommended concentration in an approximate volume of 40 ⁇ l diluted in 3x SSC, arranged in wells of a 96 plate, preferably U or V bottom to facilitate access of the printing needles. Unlike the hybridization method in nylon membrane, these probes have no modifications at the 5 'end.
  • the probes are not spatially oriented on the surface of the slide functionalized with poly-L-lysine, but are adhered to it throughout its length. This treatment was described by (Schena et al., 1995, Science 270 (5235): 467-470.).
  • the extracted genetic material was subjected to an enzymatic amplification reaction in order to amplify fragments of the sequence of the hexon protein gene, homologous to the probe used (SEQ ID NO: 9) for the detection of adenovirus, fixed to a nylon membrane.
  • the enzymatic amplification reaction was carried out using the initiators and the conditions described in Coiras and cois. (Journal of Medical Virology, 2003, 69: 132-144).
  • the amplification was carried out in the presence of dATP, dGTP, and 200 ⁇ M dTTP, 180 ⁇ M dCTP and 20 ⁇ M Cy3-dCTP per reaction, in order to label the genetic material (amplification products or amplicons) to hybridize.
  • the immobilization of the probe used in this test (SEQ ID NO: 9) to the glass surface was performed by arranging said probe in triplicate on the slide by means of a Pin & Ring system with an Arrayer GMS 417 (Affymetrix Inc.).
  • the amino groups that have been free on the surface of the functionalized and printed slide are blocked with succinic anhydride dissolved in a polar solvent (n-methyl-pyrrolidinone), as described by Eisen and Brown, 1999, Methods Enzymol 303: 179-205.
  • the slides are then immersed in water at 9O 0 C for 2 minutes and then in absolute ethanol momentarily in order to facilitate drying, which is completed by centrifugation at room temperature. Once locked, the slides are stored in desiccator, protected from light, at room temperature, at least 24 hours before performing the hybridization with the samples.
  • Hybridization of the amplified and labeled genetic material, with the probe immobilized in the crystal support was carried out by the following protocol.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) placed on the slide region where the probes were printed and covered with a coverslip. Next was introduced in a hybridization chamber where it was maintained in wet conditions and salinization, and the hybridization was performed for 2 hours at 42 0 C under gentle agitation.
  • the detection and identification of the viral pathogen was carried out after washing the slides with 0.2% SSC Ix-SDS, 0.2% SSC O 1 Ix-SDS, and finally with 0.1x SSC, for 10 minutes each, in agitation, at room temperature and protected from light. After drying them in a slide centrifuge, the results were immediately read.

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Abstract

Se describen sondas y ensayos útiles para detectar simultaneamente, en una única muestra de ensayo, una pluralidad de secuencias de acidos nucleicos de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del sindrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos.

Description

SONDAS Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES VIRUS CAUSANTES DE INFECCIONES RESPIRATORIAS EN HUMANOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona, en general, con Ia detección de secuencias de ácidos nucleicos, y, en particular, con sondas y ensayos útiles para detectar simultáneamente una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos en una única muestra de ensayo. Más específicamente, Ia invención se relaciona con sondas y métodos para Ia detección, mediante hibridación, de una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, eventualmente presentes en una única muestra de ensayo, seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos.
ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN
Los signos y síntomas que causa Ia infección del tracto respiratorio por diferentes virus e incluso algunas bacterias, son generalmente indistinguibles desde un punto de vista clínico. Por ello, es preciso disponer de una herramienta diagnóstica que permita no sólo identificar al agente causante de Ia infección, sino que esta identificación se realice en un corto periodo de tiempo para que el resultado obtenido contribuya a instaurar rápidamente las medidas curativas o paliativas adecuadas y, en el caso de que esté producida por un virus, se evite Ia innecesaria administración de antibióticos, con Ia posible aparición de resistencias bacterianas. Además, el hecho de disponer de un método diagnóstico rápido y fiable de Ia infección viral es de importancia vital para aquellas enfermedades virales que pueden ser tratadas mediante Ia administración de fármacos antivirales, como es el caso de los virus de Ia gripe. Ello contribuiría significativamente a disminuir Ia morbi- mortalidad causada por estos virus en colectivos de riesgo, tales como ancianos, lactantes y pacientes inmunodeprimidos. Considerando que en un futuro próximo se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) podrá disponer de nuevos fármacos antivirales, habrá también una creciente demanda de métodos diagnósticos sensibles que se incluyan de forma rutinaria en los laboratorios de microbiología que permitan identificar rápidamente los diferentes virus causantes de las infecciones respiratorias. El diagnóstico de laboratorio es, por tanto, imprescindible para Ia detección e identificación de los virus causantes de infecciones del tracto respiratorio que causan enfermedades con signos y síntomas clínicamente indistinguibles. Erróneamente, se cree, por ejemplo, que una faringitis estreptocócica puede ser diferenciada de manera fiable de una faringitis vírica en un paciente individual. Se puede incluso realizar una estimación probabilística de ello (por ejemplo, los síntomas de un resfriado común tienen un 80% de valor predictivo negativo para el diagnóstico de una faringitis bacteriana), pero Ia confirmación debe realizarse mediante un análisis de laboratorio.
En general, el diagnóstico etiológico de las infecciones respiratorias víricas en humanos ha sido realizado, hasta el momento, utilizando métodos tradicionales, tales como el aislamiento en cultivos celulares o Ia técnica de inmunofluorescencia (IF) indirecta, que, aunque presentan una elevada sensibilidad, no permiten más que, salvo contadas ocasiones, distinguir Ia presencia de más de un virus coinfectando Ia muestra, Io que puede ser debido a varios factores, por ejemplo: (i) Ia destrucción de Ia monocapa de células por el virus que presente una mayor actividad citopática, Io que enmascararía el crecimiento de otros virus eventualmente presentes en Ia muestra a ensayar que crecieran más lentamente o que produjeran un efecto citopático menos evidente, y (ii) Ia no disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos que permitieran Ia identificación de los virus que están coinfectando Ia muestra. Por ello, el diagnóstico de las coinfecciones está infravalorado, debido a Ia ausencia de técnicas Io suficientemente sensibles y específicas como para detectarlas.
Actualmente se están introduciendo cada vez más en el diagnóstico clínico rutinario ensayos basados en Ia detección del genoma viral en una muestra clínica o en un cultivo celular de Ia misma. Los tipos de ensayos que permiten detectar genomas virales se basan, en general, en métodos de hibridación o en métodos de amplificación.
En el primer caso (métodos de hibridación), los genomas virales pueden ser detectados mediante el uso de sondas u oligonucleótidos con una secuencia homologa a Ia del virus eventualmente presente en Ia muestra a analizar. Estas
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) técnicas suelen ser sencillas y de revelado no radiactivo, por ejemplo, mediante fluorescencia o quimioluminiscencia. Los métodos basados en técnicas de hibridación presentan, además de las ventajas de especificidad y sensibilidad, Ia posibilidad de poder cuantificar Ia cantidad de ácidos nucleicos virales presentes en Ia muestra (carga viral), Io que puede emplearse para monitorizar Ia respuesta del paciente frente a Ia terapia antiviral.
Los métodos de amplificación genómica permiten amplificar varios millones de veces determinadas secuencias de genomas virales, de modo que puedan ser detectadas fácilmente. La reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR)1 tanto en formato simple como múltiple, ha demostrado ser un método de amplificación genómica extremadamente sensible y específico en el diagnóstico de las infecciones respiratorias causadas por virus. La amplificación genómica es relativamente habitual en ensayos para el diagnóstico de infecciones respiratorias en humanos debido a que, en general, Ia cantidad de virus presente en una muestra respiratoria convencional (lavado o aspirado nasofaríngeo, frotis faríngeo, gargarismo, etc.) suele ser escasa. Por ello, para obtener el máximo de sensibilidad suele ser necesario realizar, a continuación de Ia primera reacción de amplificación, una segunda amplificación sobre el fragmento obtenido mediante, por ejemplo, una PCR anidada (nested-PCR). Generalmente, Ia primera reacción de amplificación es una RT-PCR (RT: retrotranscipción o transcripción reversa) puesto que Ia mayoría de los virus causantes de infecciones respiratorias en humanos poseen un genoma constituido por RNA. Aunque Ia realización de una PCR anidada es sencilla y fácil de introducir en Ia rutina de un laboratorio de diagnóstico, también supone una posible fuente de falsos positivos debido a que Ia enorme amplificación del fragmento génico viral puede dar lugar a contaminaciones por productos de amplificación de muestras adyacentes. Por ello, para llevar á cabo de manera rutinaria técnicas de PCR anidada es necesario tomar precauciones especiales, entre las que se encuentran, por ejemplo, el hecho de que los pasos necesarios para Ia realización del proceso de amplificación deben realizarse en laboratorios físicamente separados, en cabinas de flujo laminar distintas, cada una de ellas dotada de reactivos, juegos de micropipetas, tubos estériles y puntas con filtro estériles, todo ello completamente independiente. En el caso de laboratorios pequeños o dotados de escaso material y/o equipos de laboratorio, esto suele ser poco factible.
Por otra parte, los métodos basados en reacciones de amplificación permiten Ia detección de uno o varios agentes virales simultáneamente, pero no de todos los
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) posibles virus causantes de infecciones respiratorias, ya que, como es bien conocido, existen dificultades técnicas para realizar PCRs múltiples que permitan Ia detección simultánea de varios virus, tales como Ia pérdida de sensibilidad al aumentar el número de iniciadores en Ia mezcla de Ia reacción o Ia necesidad de ajustar Ia situación de los iniciadores en el gen a amplificar con objeto de obtener fragmentos fácilmente diferenciables por su tamaño al analizarlos mediante electroforesis en gel de agarosa.
A pesar de todo, se ha descrito una RT-PCR múltiple para Ia detección y tipado simultáneo de algunos virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, concretamente, de virus influenza A, B y C, virus respiratorio sincitial A y B y adenovirus (Coiras et al., 2003, J Med Viral 69:132-144).
Una aproximación alternativa interesante al diagnóstico de infecciones respiratorias de origen viral se basa en Ia aplicación combinada de técnicas de amplificación genómica e hibridación con sondas específicas. Esta aproximación es Ia seguida en el ensayo "Hexaplex", el cual se basa en una amplificación mediante RT-PCR múltiple en un sistema de hibridación con sondas y detección enzimática. Mediante esta técnica es posible detectar los siguientes virus: virus respiratorio sincitial tipos A y B, virus influenza tipos A y B y virus parainfluenza tipos 1 , 2 y 3. No obstante, ese método no permite detectar otros virus causantes de infecciones respiratorias en humanos importantes tales como: adenovirus, un grupo importante de patógenos del tracto respiratorio; el virus parainfluenza tipo 4, causante de infecciones generalmente en niños menores de 2 años no tan leves como se había descrito anteriormente; enterovirus, rhinovirus, ni coronavirus, siendo estos dos últimos grupos los patógenos del tracto respiratorio superior más comunes y posibles causantes de serias complicaciones en el paciente. Además, esos tres últimos grupos de virus se encuentran repetidamente en muestras clínicas de pacientes con infección respiratoria, pero su papel como agentes causantes de infecciones respiratorias está poco definido, así como su epidemiología, debido a Ia dificultad de su detección mediante los métodos habituales. Por tanto, los métodos actuales utilizados en el diagnóstico rutinario de laboratorio de los virus causantes de infección respiratoria en humanos presentan varias desventajas:
- escasa sensibilidad y/o especificidad;
- aparición de falsos negativos cuando se utilizan técnicas basadas en IF;
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) - aparición de falsos positivos cuando se utilizan técnicas basadas en Ia PCR anidada;
- pueden pasar días o incluso semanas antes de Ia obtención de resultados, sobre todo en el caso del aislamiento viral en cultivos celulares;
- dependencia de algunas técnicas del estado de Ia muestra clínica, resultado del proceso de toma, conservación y transporte de Ia misma. Esto es especialmente importante en el caso del aislamiento viral en cultivos celulares y de las técnicas de inmunofluorescencia, donde puede dar lugar a falsos negativos;
- Ia contaminación de Ia muestra con bacterias procedentes de Ia flora normal de Ia región donde se ha realizado Ia toma de Ia misma, puede dificultar su análisis mediante métodos como el aislamiento viral en cultivos celulares, Io que puede originar falsos negativos; y. - Ia necesidad, en algunos casos, de personal cualificado o experimentado en Ia técnica en cuestión.
Existe, por tanto, Ia necesidad de desarrollar métodos efectivos que permitan detectar e identificar simultáneamente los principales agentes virales causantes de infecciones respiratorias en humanos, que subsanen Ia totalidad o parte de los problemas existentes con los métodos actualmente utilizados en el diagnóstico rutinario de laboratorio de los virus causantes de infección respiratoria en humanos. Dichos métodos deberían proporcionar, de forma rápida, específica y sensible, resultados que pudieran ser utilizados por el clínico en Ia toma de decisiones terapéuticas, profilácticas o paliativas. A modo ilustrativo, un método diagnóstico adecuado sería aquel que permitiera diferenciar virus causantes de infecciones respiratorias que requirieran Ia inmediata hospitalización o aislamiento del paciente, de otras causas más leves de infección del tracto respiratorio. Ventajosamente, dichos métodos deberían poder ser realizados en laboratorios cercanos a donde se encuentre el paciente, con instalaciones y equipos económicos, y, sin que fuera necesaria Ia participación de personal altamente cualificado.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una solución a Ia necesidad existente consistente en unas sondas y métodos que permiten detectar e identificar simultáneamente, de forma rápida, específica y sensible, los principales virus causantes de infecciones
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) respiratorias humanas eventualmente presentes en una única muestra de ensayo. Para ello, Ia invención se basa en el desarrollo de un sistema de hibridación en el que se inmovilizan sobre un soporte sólido diferentes oligonucleótidos con secuencias específicas (sondas). Estas sondas han sido diseñadas para hibridar específicamente con secuencias diana presentes en el genoma de dichos virus, Io que permite no solo Ia detección e identificación del virus causante de Ia enfermedad respiratoria sino que, además, posibilita su tipado simultáneamente. Este sistema puede ser adaptado al desarrollo de kits de fácil manejo destinados a laboratorios de microbiología que requieran establecer un diagnóstico etiólogico de enfermedades infecciosas respiratorias humanas.
Los virus causantes de infecciones respiratorias en humanos que pueden ser identificados mediante el método proporcionado por esta invención incluyen virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C1 virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano, y combinaciones de los mismos. Por tanto, en un aspecto, Ia invención se relaciona con una sonda útil para identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido y, al menos, una de dichas sondas inmovilizada sobre dicho soporte sólido.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método para identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos, eventualmente presentes en una única muestra de ensayo, basado en Ia hibridación de secuencias diana presentes en el genoma de dichos virus, opcionalmente amplificadas mediante una reacción de amplificación, con dichas sondas.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un kit para identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos, mediante dicho método que comprende, al menos, una de dichas sondas, o, al menos, una de dichas plataformas de hibridación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra Ia detección de cepas de referencia de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos crecidas en cultivos celulares mediante hibridación en membrana de nylon y visualización mediante quimioluminiscencia. Los virus ensayados fueron virus influenza tipo A (VIA), virus influenza tipo B (VIB), virus respiratorio sincitial humano tipo A (RSVA), virus respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB), adenovirus humano (ADV1), coronavirus humano tipo 229E (HCV229E), virus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1 ), virus parainfluenza humano tipo 2 (PIV2), virus parainfluenza humano tipo 3 (PIV3), virus parainfluenza humano tipo 4 A (PIV4A), coronavirus humano tipo OC43 (HCVOC43), echovirus (Echo30), rhinovirus (Rhino14), metapneumovirus humano (metapneumovirus) y virus influenza tipo C (VIC). Para más información véase el Ejemplo 1.
La Figura 2 muestra Ia detección mediante hibridación en membrana de nylon y visualización mediante quimioluminiscencia de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, aislados de muestras clínicas del tracto
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) respiratorio inoculadas en cultivos celulares. Los virus detectados fueron virus influenza tipo A (Influenza A), virus influenza tipo B (Influenza B), virus respiratorio* sincitial tipo A (RSVA), virus respiratorio sincitial tipo B (RSVB), adenovirus humano (ADV1) y virus parainfluenza humano tipo 3 (Parainfluenza tipo 3). Se utilizaron sondas con diferentes concentraciones con el fin de observar Ia sensibilidad en función de Ia concentración de las sondas. Para más información véase el Ejemplo 2.
La Figura 3 muestra Ia detección de virus influenza tipo A presente en muestras clínicas mediante hibridación en membrana de nylon (Figura 3A) y mediante PCR anidada (Figura 3B). Para una descripción del ensayo véase el Ejemplo 3. La Figura 3A muestra los resultados de Ia hibridación de ácidos nucleicos procedentes de las muestras clínicas ensayadas para detectar virus influenza tipo A con las sondas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) inmovilizadas en Ia membrana (Carriles 1-12). No se detectó virus influenza A en las muestras 2, 7 y 8. En Ia Figura 3B se muestran los resultados de una PCR anidada llevada a cabo para comprobar Ia sensibilidad y especificidad de Ia técnica anterior (hibridación). Los carriles 1-12 corresponden a los carriles 1-12 observados en Ia Figura 3A. El carril M corresponde al marcador XIV de pesos moleculares, suministrado por Roche Diagnostics (marcador de 100 pb). En todos los carriles (excepto 2, 7 y 8) se observa una banda de 721 pares de bases (pb), correspondiente al fragmento amplificado del gen de Ia nucleoproteína del virus influenza humano de tipo A y una banda de 837 pb correspondiente al control interno utilizado como control del proceso de extracción del material genético a partir de Ia muestra, así como de Ia reacción de PCR (véase el Ejemplo 3). Se observa que los resultados obtenidos con ambas técnicas son concordantes.
La Figura 4 muestra Ia detección de coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) presente en muestras clínicas mediante hibridación en membrana de nylon y visualización por quimioluminiscencia. Se ensayaron diversas concentraciones de Ia sonda utilizada (SEQ ID NO: 18). Para una descripción del ensayo véase el Ejemplo 4.
La Figura 5 muestra Ia detección de adenovirus humano en muestras clínicas (secreciones respiratorias) procedentes de pacientes con cuadros respiratorios mediante hibridación en soporte de cristal (portaobjetos) y visualización por fluorescencia. Se observa Ia fluorescencia emitida por las moléculas de Cy3 presentes en el producto de amplificación obtenido mediante oligonucleótidos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) iniciadores específicos para adenovirus humanos. Se han utilizado para Ia amplificación y el mareaje mediante PCR, diluciones de adenovirus causantes de infección respiratoria en humanos pertenecientes a los serotipos 1 (imagen 1), 2 (imagen 2), 4 (imagen 3), 5 (imagen 4) y 7 (imagen 5), equivalentes estas diluciones a 103 copias de un plásmido que contiene el fragmento del gen de Ia proteína del hexón de adenovirus humano amplificado en las condiciones descritas en el Ejemplo 5. Se incluye un control negativo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona sondas y métodos para identificar simultáneamente una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos de los principales virus causantes de infecciones respiratorias en humanos eventualmente presentes en una única muestra de ensayo.
Sondas
En un aspecto, Ia invención se relaciona con unas sondas, en adelante sondas de Ia invención, que permiten Ia identificación, mediante hibridación específica, de los principales virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, entre los que se encuentran virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano.
El término "sonda", tal como aquí se utiliza, se refiere a un oligonucleótido de secuencia definida capaz de hibridar con una secuencia complementaria de un ácido nucleico, por Io que puede utilizarse para detectar e identificar secuencias complementarias, o sustancialmente complementarias, en ácidos nucleicos mediante hibridación específica. Asimismo, el término "hibridación", tal como aquí se utiliza, se refiere a Ia formación de una estructura de tipo dúplex por dos ácidos nucleicos debido al apareamiento de bases complementarias. La hibridación puede ocurrir entre cadenas de ácidos nucleicos totalmente complementarias o entre cadenas de ácidos nucleicos "sustancialmente complementarias" que contienen pequeñas regiones desapareadas. Las condiciones en las que hibridan cadenas de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ácidos nucleicos totalmente complementarias se denominan "condiciones estrictas de hibridación" o "condiciones de hibridación específicas de secuencia". No obstante, se pueden obtener cadenas dobles estables de ácidos nucleicos sustancialmente complementarias bajo condiciones de hibridación menos estrictas, en cuyo caso, el grado de desapareamiento tolerado puede ajustarse mediante ajuste apropiado de las condiciones de hibridación. El experto en Ia materia puede determinar empíricamente Ia estabilidad de un dúplex teniendo en cuenta diversas variables, tales como, Ia longitud y concentración de pares de bases de las sondas, Ia fuerza iónica y Ia incidencia de los pares de bases desapareados, siguiendo las directrices del estado de Ia técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N. Y. (1989); y Wetmur, Critica! Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26 (3/4):227-259 (1991 )).
Las sondas de Ia invención son complementarias o sustancialmente complementarias a secuencias diana específicas contenidas en los genomas de dichos virus causantes de infecciones respiratorias en humanos (virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano) de manera que permitan Ia detección genérica de los mismos.
La longitud de las sondas de Ia invención puede variar dentro de un amplio intervalo aunque, por razones prácticas, se prefieren sondas de longitud pequeña, típicamente comprendida entre 15 bases y 30 bases, preferentemente, entre 19 bases y 23 bases. El empleo de sondas de mayor o menor longitud no afectaría a Ia sensibilidad o especificidad de Ia técnica, pero podría precisar de Ia realización de una serie de modificaciones sobre las condiciones en las que se realiza Ia misma al variar Ia temperatura de fusión de las mismas y su contenido en GC, Io cual afectaría a Ia temperatura y tiempo de hibridación, fundamentalmente.
En una realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus influenza tipo A mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ia nucleoproteína o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Dichas sondas se pueden emplear por separado o juntas para aumentar Ia sensibilidad de Ia detección. . . En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus influenza tipo B mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia nucleoproteína o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Dichas sondas se pueden emplear por separado o juntas para aumentar Ia sensibilidad de Ia detección.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus influenza tipo C mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia nucleoproteína o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluye el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 5.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus respiratorio sincitial humano tipo A mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína de fusión (proteína F) o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Dichas sondas se pueden emplear por separado o juntas para aumentar Ia sensibilidad de Ia detección.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus respiratorio sincitial humano tipo B mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína de fusión (proteína F) o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 8.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de adenovirus humano mediante hibridación específica
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína hexón o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 9. . En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus parainfluenza humano tipo 1 mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína hemaglutinina o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 10.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus parainfluenza humano tipo 2 mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína hemaglutinina o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 11.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus parainfluenza humano tipo 3 mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína hemaglutinina o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 12.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de virus parainfluenza humano tipos 4A y 4B mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína hemaglutinina o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 13 que permite detectar Ia presencia de los virus parainfluenza humanos tipos 4A ó 4B pero no permite su distinción.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de enterovirus mediante hibridación específica que
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en Ia región 5' no codificante o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 14. . En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de rhinovirus mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en Ia región 5' no codificante o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 15.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de coronavirus humano tipo 229E mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína espicular o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 16.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de coronavirus humano tipo OC43 mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína espicular o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 17.
En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína espicular o su cadena complementaria. Ejemplos ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 18. En otra realización particular, Ia invención proporciona sondas para Ia detección e identificación de metapneumovirus humano mediante hibridación específica que incluyen polinucleótidos de 15 a 30 bases capaces de hibridar bajo condiciones estrictas de hibridación con una secuencia de ácido nucleico localizada en el gen de Ia proteína polimerasa o su cadena complementaria. Ejemplos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ilustrativos de dichas sondas incluyen el polinucleótido identificado como SEQ ID NO: 19.
Las sondas proporcionadas por esta invención permiten llevar a cabo Ia detección e identificación simultánea de los principales virus causantes de infección respiratoria en humanos e incluso su tipado y/o subtipado simultáneo.
Las sondas de Ia invención, en particular, las sondas cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en las SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 19, presentan varias ventajas ya que su corta longitud (23 bases como máximo) hace que su síntesis sea muy económica y, además, permiten Ia detección genérica de los principales virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, incluyendo serotipos de los mismos, tales como virus influenza de todos los subtipos del tipo A, todas las variantes de virus influenza tipo B, virus variantes de influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, todos los tipos de adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, variantes del coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y cepas variantes del metapneumovirus humano. De este modo, el empleo de dichas sondas permite detectar e identificar cientos de virus causantes de infección respiratoria con un bajo coste, por Io que constituyen un paso importante para producir una herramienta diagnóstica que reúna todas las ventajas de las técnicas de hibridación para Ia detección e identificación simultánea de los principales virus causantes de infección en el tracto respiratorio humano.
Otras ventajas asociadas con el empleo de sondas oligonucleotídicas para Ia detección e identificación de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, tales como las sondas de Ia invención, incluyen:
- Ia posibilidad no sólo de identificar y caracterizar los virus causantes de las infecciones respiratorias sino, además, de conocer si son sensibles o resistentes a los antivirales disponibles; - los ensayos de hibridación mediante sondas oligonucleotídicas permiten, también, cuantificar Ia carga viral en Ia muestra a analizar con el fin de monitorizar en tiempo real Ia eficacia de Ia terapia antiviral en el paciente; y
- se pueden emplear para estudios epidemiológicos en tiempo real por su rapidez en detección y tipado simultáneo de múltiples virus al mismo tiempo.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Para llevar a cabo Ia detección e identificación simultánea de los principales virus causantes de infección respiratoria en humanos e incluso su tipado y/o subtipado simultáneo, las sondas de Ia invención, ventajosamente, están inmovilizadas en un soporte sólido, tal como se describirá más adelante. Dichos soportes sólidos en los que se han inmovilizado las sondas de Ia invención, que constituyen unas plataformas de hibridación, representan un aspecto adicional de esta invención.
Con el fin de facilitar Ia inmovilización de las sondas al soporte sólido, las sondas pueden incorporar características adicionales que permitan Ia inmovilización al soporte pero que no alteren su característica principal (hibridar con secuencias complementarias de ácido nucleico). A modo ilustrativo, dichas sondas pueden contener un grupo amino en el extremo 5' para facilitar Ia inmovilización de Ia sonda y orientar espacialmente Ia sonda sobre Ia membrana o en caso de soporte de cristal, el tratamiento de Ia superficie con poli-L-lisina permite Ia inmovilización de las sondas sin orientación espacial.
Plataforma de hibridación
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda de Ia invención inmovilizada sobre dicho soporte sólido.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "soporte sólido" se refiere a un material insoluble, o que puede convertirse en ¡nsoluble mediante una reacción posterior. Dicho soporte sólido puede elegirse en función de su capacidad intrínseca para inmovilizar una sonda oligonucleotídica, o bien puede incorporar un receptor adicional con capacidad para inmovilizar Ia sonda oligonucleotídica de modo que permita una unión indirecta de Ia sonda al soporte sólido a través de dicho receptor. Dicho receptor adicional puede ser una sustancia cargada con una carga opuesta a Ia de Ia sonda o bien puede ser un miembro de unión específica inmovilizado sobre (o unido a) el soporte sólido con capacidad para inmovilizar Ia sonda a través de una reacción de unión específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina que permite Ia inmovilización de sondas de oligonucleótidos biotinilados. El soporte sólido puede estar constituido por cualquier material apropiado que permita Ia inmovilización, directa o indirecta, de Ia sonda a dicho soporte sólido, por ejemplo, plásticos, plásticos derivatizados, polímeros, látex, fibra óptica, superficies de vidrio o silicio, superficies cerámicas, superficies metálicas, etc. Dichos materiales pueden utilizarse
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) en cualquier configuración apropiada conocida por los expertos en Ia materia, por ejemplo, en forma de membranas, láminas, films, placas, chips, etc., o bien pueden estar recubriendo, total o parcialmente, o unidos a, portadores inertes tales como papel, nylon, vidrio, films plásticos, tejidos, etc. Adicionalmente, si se desea, el 5. soporte sólido puede estar recubierto para facilitar Ia inmovilización de las sondas a su superficie. En una realización particular, dicho soporte sólido es una membrana de nylon o una superficie de vidrio o cristal, por ejemplo, un portaobjetos, opcionalmente recubiertos, por ejemplo, con membranas, soportes de silicona, soportes poliméricos, etc. 0 En una realización particular, Ia sonda de Ia invención inmovilizada sobre dicho soporte sólido se selecciona del grupo formado por los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ 5 ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y sus mezclas. Aunque Ia plataforma de hibridación puede contener un número variable de sondas de Ia invención inmovilizadas sobre el soporte sólido, en una realización particular, Ia plataforma de hibridación de Ia invención comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 de dichas sondas (SEQ ID NO: 1 - SEQ 0 ID NO: 19). Ventajosamente, Ia plataforma de hibridación de Ia invención comprende dichas 19 sondas de Ia invención (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19).
Las sondas de Ia invención pueden estar dispuestas sobre el soporte sólido en una disposición orientada (conocida) o no orientada. Tal como aquí se utiliza, el término "disposición orientada" significa que Ia sonda está inmovilizada sobre el 5 soporte en una localización definida (posición conocida). Por tanto, en una realización particular, Ia plataforma de hibridación de Ia invención comprende dos o más sondas de Ia invención inmovilizadas sobre dicho soporte sólido en una disposición no orientada. Alternativamente, en otra realización particular, Ia plataforma de hibridación de Ia invención comprende dos o más sondas de Ia 0 invención inmovilizadas sobre dicho soporte sólido en una disposición orientada. Ventajosamente, las sondas de Ia invención están inmovilizadas sobre el soporte sólido en una disposición orientada, constituyendo una matriz o chip.
Los biochips o arrays de DNA implican Ia disposición en zonas puntuales de un soporte de un conjunto de sondas específicas. Puesto que Ia deposición de las 5 sondas se realiza en puntos microscópicos, se puede aplicar en un solo biochip una
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) cantidad muy elevada de sondas distintas, del orden de 10.000-500.000 sondas distintas por biochip, Io que permite detectar simultáneamente diversos patógenos virales causantes de infecciones respiratorias en humanos eventualmente presentes en una única muestra clínica. Además de detectar e identificar el virus causante de Ia infección, el biochip también permitiría cuantificar Ia carga viral e incluso identificar el fármaco antiviral frente al cual es sensible o resistente, con objeto de facilitar el tratamiento del paciente.
Prácticamente cualquier método conocido por los técnicos en Ia materia puede ser utilizado para inmovilizar las sondas de Ia invención al soporte sólido. Un método habitualmente utilizado consiste en el recubrimiento no covalente del soporte sólido con un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, estreptavidina, y Ia inmovilización de sondas de oligonucleótidos biotiniladas. Alternativamente, las sondas oligonucleotídicas se pueden unir directamente al soporte sólido mediante reacciones de acoplamiento de tipo epóxido/amina. En una realización particular, el soporte sólido es una membrana que posee una superficie de carga negativa, tal como una membrana de nylon. En este caso, antes de Ia unión de las sondas, Ia membrana se trata con 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) para activar los grupos carboxilo presentes en Ia superficie de Ia membrana. Las sondas, en este caso, están diseñadas para contener un grupo amino en el extremo 5' con el fin de orientar espacialmente Ia sonda sobre Ia membrana.
En otra realización particular, el soporte sólido es un portaobjetos de cristal (vidrio), tal como un portaobjetos, opcionalmente sometido a un tratamiento con poli- L-lisina con el fin de disponer sobre Ia superficie de cristal grupos amino que se van a unir por interacciones electroestáticas a los grupos fosfato de las sondas, que no quedan orientadas espacialmente sobre Ia superficie.
La concentración de las sondas en el soporte sólido puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores, entre los que se encuentran Ia naturaleza y tipo de soporte sólido, Ia naturaleza de Ia sonda, etc.; no obstante, en una realización particular, cuando el soporte sólido es una membrana de nylon, las sondas se pueden utilizar a una concentración comprendida entre aproximadamente 60 y aproximadamente 400 pmoles por carril, preferentemente, entre 0,8 y 1 pmoles/μl. Alternativamente, cuando el soporte sólido es un portaobjetos de cristal, Ia concentración de las sondas puede estar comprendida
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40 pmol/μl, preferentemente, 20 pmol/μ! aproximadamente.
Método de detección e identificación de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método para identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, en adelante método de Ia invención, seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1, virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos, eventualmente presentes en una muestra de ensayo, que comprende: a) poner en contacto ácidos nucleicos procedentes de dicha muestra de ensayo con una plataforma de hibridación de Ia invención que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda de Ia invención inmovilizada sobre dicho soporte sólido, en donde cada una de dichas sondas es sustancialmente complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria; y b) detectar Ia posible hibridación de dichas secuencias diana con dichas sondas.
Tal como aquí se utiliza, el término "muestra de ensayo" se refiere a cualquier muestra biológica sospechosa de contener uno o más virus causantes de infección respiratoria en humanos, tales como virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y metapneumovirus humano. El genoma de dichos virus contiene secuencias diana que permiten su detección e identificación mediante hibridación de dichas secuencias diana con las sondas apropiadas, posibilitando además, en ocasiones, su tipado simultáneo. La muestra de ensayo puede proceder
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de cualquier fuente biológica, por ejemplo, muestras de origen humano de fluidos o tejidos biológicos, tales como sangre, esputo, gargarismo, frotis (faríngeo o nasofaríngeo), aspirados (nasofaríngeo, bronquial, traqueal o pleural), etc., así como de productos de Ia sangre (plasma, suero, leucocitos). Asimismo, Ia muestra de ensayo puede proceder de cultivos celulares de virus. La muestra de ensayo puede ser utilizada bien directamente, tal como se obtiene de Ia fuente, o bien después de ser sometida a un tratamiento previo a su uso con el fin de modificar sus características, por ejemplo, diluyendo fluidos viscosos, inactivando agentes interferentes, convirtiendo ácidos nucleicos de cadena doble en ácidos nucleicos monocatenarios, acumulando, purificando o amplificando secuencias diana, etc.
Aunque Ia plataforma de hibridación puede contener una única sonda de Ia invención, en Ia práctica se prefiere que dicha plataforma de hibridación contenga dos o más sondas de Ia invención, preferentemente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 de las sondas de Ia invención cuyas secuencias de nucleótidos se seleccionan entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. Ventajosamente, Ia plataforma de hibridación de Ia invención comprende dichas 19 sondas de Ia invención (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19).
Prácticamente cualquier sonda de Ia invención, cuya secuencia de nucleótidos sea complementaria o sustancialmente complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria puede ser utilizada en Ia puesta en práctica del método de Ia invención ya que Ia hibridación de las sondas con las secuencias diana es indicativa de Ia presencia del virus correspondiente en Ia muestra analizada. No obstante, en una realización particular del método. de Ia invención, las sondas de Ia invención inmovilizadas sobre dicho soporte sólido se seleccionan del grupo formado por los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. En este caso:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ia hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 y/o sus mezclas es indicativa de Ia presencia de virus influenza tipo A en Ia muestra;
Ia hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o sus mezclas es indicativa de Ia presencia de virus influenza tipo B en Ia muestra;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 5 es indicativa de Ia presencia de virus influenza tipo C en Ia muestra;
Ia hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o sus mezclas es indicativa de Ia presencia de virus respiratorio sincitial humano tipo A;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 8 es indicativa de Ia presencia de virus respiratorio sincitial humano tipo B;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 9 es indicativa de Ia presencia de adenovirus humano;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 10 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 1 ;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 11 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 2;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 12 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 3;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 13 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 4A y 4B;
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 14 es indicativa de Ia presencia de enterovirus;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 15 es indicativa de Ia presencia de rhinovirus;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 16 es indicativa de Ia presencia de coronavirus humano tipo 229E;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 17 es indicativa de Ia presencia de coronavirus humano tipo OC43;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 18 es indicativa de Ia presencia de coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS); y
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 19 es indicativa de Ia presencia de metapneumovirus humano.
La detección de Ia hibridación de las secuencias diana con las sondas de Ia invención puede llevarse a cabo mediante cualquier método apropiado conocido por los expertos en Ia materia. El mareaje del material genético (ácidos nucleicos) a hibridar será diferente en función del método de detección seleccionado. El marcador puede estar incorporado bien en Ia secuencia diana a hibridar con Ia sonda o bien en Ia propia sonda. En una realización particular, Ia detección de Ia hibridación [etapa b)] se realiza mediante un método radiactivo, mientras que, en otra realización particular, Ia detección de Ia hibridación [etapa b)] se realiza mediante un método no radiactivo, por ejemplo, mediante un método fluorescente, colorimétrico o luminiscente (bioluminiscente o quimioluminiscente). A modo ilustrativo, puede efectuarse un mareaje con fluoresceína o biotina para detección quimioluminiscente, o bien un mareaje con digoxigenina para detección quimioluminiscente o quimiofluorescente, etc.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Para la puesta en práctica del método de Ia invención, los ácidos nucleicos virales pueden ser detectados e identificados sin necesidad de aislar las partículas virales.
En una realización particular, el método de Ia invención comprende Ia realización de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos virales antes de efectuar Ia etapa de hibridación [etapa a)]. Esta alternativa resulta particularmente interesante cuando Ia concentración de los virus causantes de infecciones respiratorias humanas a detectar presente en las secreciones respiratorias es baja
(Io que sucede habitualmente) ya que entonces Ia cantidad de material genético (ácido nucleico) de virus que contiene Ia secuencia diana para Ia hibridación con Ia sonda de Ia invención es también baja. Para aumentar su concentración, se puede llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos antes de efectuar Ia etapa de hibridación [etapa a)].
Por tanto, en una realización particular, Ia invención proporciona un método para identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, en donde dichos virus se seleccionan entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos, eventualmente presentes en una muestra de ensayo, que comprende:
(i) poner en contacto ácido nucleico procedente de dicha muestra de ensayo con iniciadores que flanquean secuencias diana específicas de dichos virus causantes de infección respiratoria;
(ii) someter Ia mezcla resultante de Ia etapa (i) a una reacción de amplificación enzimática para amplificar secuencias diana de dichos virus causantes de infección respiratoria eventualmente presentes en dicha muestra de ensayo;
(iii) poner en contacto los productos de amplificación resultantes de Ia etapa (ii) con una plataforma de hibridación de Ia invención que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda de Ia invención, orientada o no, inmovilizada sobre dicho soporte sólido, en donde cada una de dichas sondas es sustancialmente complementaria a una
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria eventualmente presente en Ia muestra de ensayo; y
(iv) detectar Ia posible hibridación de dichas secuencias diana con dichas sondas.
La amplificación de una región de ácido nucleico que contiene Ia secuencia diana puede llevarse a cabo mediante prácticamente cualquier método de amplificación de secuencias diana, tal como, por ejemplo, Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), Ia reacción en cadena de Ia ligasa (LCR), Ia amplificación por desplazamiento de banda [véase, en general, G. Walker et al., (1992). Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:392-396; G. Walker et al., (1992). Nucleic Acid Res. 20:1691- 1696], Ia amplificación basada en Ia transcripción [D. Kwoh et al., (1989). Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173-1177], Ia replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) [J. Guatelli et al., (1992). Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1874-1878], el sistema de Ia replicasa Qβ [P. Lizardi et al., (1988). BioTechnology 6:1197-1202], Ia amplificación basada en Ia secuencia de ácido nucleico (NASBA) [R. Lewis, (1992). Genetic Engineering News 12(9):1], Ia reacción de reparación en cadena (RCR) [R. Lewis, (1992). Genetic Engineering News 12(9):1] y Ia amplificación por Ia polimerasa del fago ph¡29 [L. Blanco et al., (1989) J Biol Chem. 264:8935-8940]. Con carácter previo a Ia amplificación puede ser necesario llevar a cabo una reacción de transcripción reversa o retrotranscripción (RT) para obtener el cDNA, ya que Ia mayoría de los virus causantes de infección respiratoria en humanos poseen un genoma constituido por RNA.
Aunque Ia reacción de amplificación puede llevarse a cabo sin extraer los ácidos nucleicos contenidos en Ia muestra de ensayo, ventajosamente, se extraen dichos ácidos nucleicos presentes en Ia muestra antes de llevar a cabo Ia reacción de amplificación. Prácticamente cualquier método apropiado para extraer ácidos nucleicos puede ser utilizado; no obstante, en una realización preferida los ácidos nucleicos contenidos en Ia muestra de ensayo se extraen mediante el empleo de un protocolo de extracción de ácidos nucleicos en un solo paso. A partir de cualquiera de ellos se realiza una extracción del material genético de Ia muestra, tanto RNA como DNA, puesto que aunque prácticamente todos los virus respiratorios presentan un genoma de RNA, los adenovirus poseen un genoma de DNA. Se pueden emplear métodos comerciales como RNeasy (Qiagen) aunque también pueden utilizarse otros métodos, por ejemplo, métodos basados en Ia extracción con un tampón de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) lisis con base de tiocianato de guanidinio [Casas et al., 1995, J Viral Methods 53:25-
36].
En una realización particular, Ia amplificación de las regiones de los ácidos nucleicos virales que contienen las secuencias dianas (regiones destinadas a ser amplificadas, detectadas o analizadas), se lleva a cabo mediante RT-PCR múltiple.
Para ello, se utilizarán los iniciadores apropiados que flanqueen Ia secuencia diana a amplificar.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles en Ia reacción de RT y en Ia PCR múltiple para amplificar Ia secuencia diana del genpma de virus influenza tipos A, B y C, virus respiratorio sincitial humano tipos A y B y adenovirus respiratorios se mencionan en Coiras y cois., 2003, Journal of Medical Virology 69:132-144.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles en Ia reacción de RT y en Ia PCR múltiple para amplificar Ia secuencia diana del genoma de virus parainfluenza humano tipos 1, 2, 3, 4A y 4B, coronavirus humanos tipos 229E y OC43, rhinovirus y enterovirus se mencionan en Coiras y cois., 2004, Journal of Medical Virology
72(3):484-495.
Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles para amplificar Ia secuencia diana del genoma del coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS) se mencionan en Drosten y cois., 2003, N Engl Med 348(20):1967-1976. Ejemplos ilustrativos de iniciadores útiles para amplificar Ia secuencia diana
, del genoma de metapneumovirus humanos se mencionan en Van Den Hoogen y cois., J Infecí Dis. 2003 Nov 15; 188(10):1571-7.
Una RT-PGR múltiple para Ia detección y tipado simultáneo de los virus influenza tipos A, B y C, los virus respiratorio sincitial humano tipos A y B y una detección genérica de adenovirus humanos se describe en Coiras et al., 2003, J
Med Viral 69:132-144.
Las características de Ia muestra de ensayo y de Ia plataforma de hibridación de Ia invención ya han sido mencionadas previamente en relación con el método de
Ia invención (general). Prácticamente cualquier sonda de Ia invención, cuya secuencia de nucleótidos sea complementaria o sustancialmente complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria puede ser utilizada en Ia puesta en práctica del método de Ia invención ya que Ia hibridación de las sondas con las secuencias diana es indicativa de Ia presencia del virus correspondiente en Ia muestra analizada. Aunque Ia plataforma de hibridación puede contener una única sonda de Ia invención, en Ia práctica se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) prefiere que dicha plataforma de hibridación contenga dos o más sondas de Ia invención, preferentemente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19 de las sondas de Ia invención cuyas secuencias de nucleótidos se seleccionan entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. Ventajosamente, Ia plataforma de hibridación de Ia invención comprende dichas 19 sondas de Ia invención (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 19). Dichas sondas permiten Ia identificación de los virus causantes de infecciones respiratorias en humanos previamente mencionados.
La detección de Ia hibridación entre las secuencias diana del genoma viral presente en los productos resultantes de Ia reacción de amplificación (amplicones) con las sondas de Ia invención puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los métodos previamente mencionados en relación con Ia detección de Ia hibridación entre las secuencias diana del genoma viral (sin amplificar) con las sondas de Ia invención. En una realización particular, Ia detección de Ia hibridación se realiza mediante un método radiactivo, mientras que, en otra realización particular, se realiza mediante un método no radiactivo, por ejemplo, mediante un método fluorescente, colorimétrico o luminiscente (bioluminiscente o quimioluminiscente). A modo ilustrativo, puede efectuarse un mareaje con fluoresceína o biotina para detección quimioluminiscente, o bien un mareaje con digoxigenina para detección quimioluminiscente o quimiofluorescente, etc. En este caso, el mareaje se puede realizar durante el proceso de amplificación o de manera posterior, por ejemplo mediante el uso de Ia polimerasa Klenow en presencia de aminoalil-dUTP (Wang et al., 2002, Proc Nati Acad Sci U S A. 99(24):15687-15692) o bien utilizando kits comerciales de mareaje como los kits CyScribe de Amersham Life Sciences.
En una realización particular, cuando el soporte sólido sobre el que se inmovilizan las sondas de Ia invención es una membrana de nylon, es conveniente marcar el material genético de Ia muestra durante el proceso de amplificación con biotina unida a un dNTP (ya sea dATP, dUTP, dCGP o dCTP), posterior tratamiento con estreptavidina-peroxidasa y revelado quimioluminiscente con luminol. En otra realización particular, cuando el soporte sólido al que están unidas las sondas es una superficie de cristal, se recomienda emplear un marcador fluorescente, tal como
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Cy3 o Cy5 (Amersham Life Sciences) unido a un dNTP (ya sea dATP, dUTP, dCGP o dCTP), Io que posibilita su posterior detección con un scanner.
Aunque los sistemas de detección pueden ser variados (métodos radiactivos o no radiactivos) se prefiere efectuar una detección quimioluminiscente cuando el soporte sea una membrana de nylon o un portaobjetos con una membrana adherida a su superficie (por ejemplo, Vivid™ Gene Array Slides, PaII Life Sciences). Para ello, como ya se ha comentado anteriormente, se añade a Ia reacción de PCR empleada para amplificar el material genético viral de partida uno de los nucleótidos marcado con biotina, por ejemplo dCTP (Perkin Elmer Life Sciences) o dUTP (Roche Diagnostics) para obtener productos de PCR marcados con biotina. Tras Ia reacción de hibridación entre las sondas fijadas al soporte y las cadenas desnaturalizadas del producto de PCR se añade estreptavidina-peroxidasa en una concentración recomendada de 1 :4000, que permitirá el revelado quimioluminiscente mediante el empleo de luminol en presencia de agua oxigenada (por ejemplo, ECL Detection System, Amersham Biosciences), según instrucciones del fabricante.
En el caso de utilizar un soporte de cristal funcionalizado con, por ejemplo, poli-L-lisina, se recomienda realizar el mareaje de las muestras utilizando un fluorocromo, por ejemplo los fluorocromos CyDye de Amersham Biosciences: Cy3 o Cy5. Para realizar el mareaje con este fluorocromo existen kits comercializados por Amersham Biosciences para Ia obtención de cDNA o RNA marcados. No obstante, con estas sondas se han empleado los fluorocromos mencionados unidos a un nucleótido como dUTP o dCTP, realizando un mareaje del producto de PCR semejante al mencionado anteriormente para el caso del mareaje del producto de PCR con biotina. La lectura de los resultados se realiza utilizando un scanner apropiado.
Los límites de detección han sido muy similares en todos los soportes utilizados. La cuantificación de los límites de detección se ha realizado mediante plásmidos que contienen el fragmento resultado de Ia amplificación por PCR. El límite de detección ha sido de 10-100 copias de plásmido en todos los casos. El método de Ia invención presenta numerosas ventajas frente a otros métodos utilizados para Ia detección e identificación de virus, entre las que pueden citarse las siguientes:
- sensibilidad superior a Ia de las técnicas convencionales: aislamiento en cultivos celulares, inmunofluorescencia indirecta; - especificidad elevada;
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) - escasa dependencia del tipo de muestra o de sus condiciones de conservación y transporte; escasa dependencia de contaminación bacteriana de Ia muestra;
- menor contaminación ambiental de amplicones que las técnicas de amplificación genómica (por Io que no es necesario tener dependencias separadas para los distintos pasos de Ia técnica); posibilidad de detectar e identificar (tipado) simultáneamente los principales virus causantes de infección respiratoria en humanos;
- fácil rutinización de Ia técnica; - posibilidad de adaptación a distintos formatos en función de las necesidades del laboratorio (es decir, posibilidad de adaptar a distintos formatos para producir un kit diagnóstico comercializable); y
- además, al permitir Ia posibilidad de detectar co-infecciones , causadas por dos o más virus distintos en Ia misma muestra e identificarlos, se pueden realizar estudios epidemiológicos precisos, Io que ayudaría a determinar Ia contribución de estas co-infecciones a Ia gravedad de Ia infección en el paciente, así como al pronóstico de Ia enfermedad.
Además, el empleo de sondas oligonucleotídicas para Ia detección e identificación de virus causantes de infecciones respiratorias en humanos, tales como las sondas de Ia invención, presenta ventajas adicionales sobre técnicas convencionales basadas en el aislamiento en cultivos celulares o IF, entre las que pueden citarse las siguientes: (i) respecto al aislamiento en cultivos celulares, las técnicas basadas en hibridación son más rápidas y sensibles (sobre todo en el caso de virus de crecimiento lento o con especiales requerimientos para ello); y (ii) respecto a las técnicas basadas en IF, son más específicas.
Kits
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un kit, en adelante kit de Ia invención, para Ia identificación de un virus causante de infección respiratoria seleccionado entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) metapneumovirus humano, en una muestra biológica, mediante el método de Ia invención, que comprende, al menos, una sonda de Ia invención, opcionalmente inmovilizada sobre un soporte sólido (plataforma de hibridación de Ia invención). Ventajosamente, el kit de Ia invención comprende una plataforma de hibridación de Ia invención constituido por un soporte sólido en el que están inmovilizadas una o más sondas de Ia invención. En una realización particular, el kit de Ia invención comprende una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido sobre el que se han inmovilizado sondas de Ia invención seleccionadas del grupo formado por los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y sus mezclas. Dichas sondas pueden estar dispuestas en disposiciones orientadas o no orientadas. El kit de Ia invención incluye los reactivos necesarios para llevar a cabo el método de Ia invención, así como instrucciones para ello. Adicionalmente puede contener, si se desea, iniciadores específicos para Ia amplificación de secuencias diana (en caso de que antes de Ia hibridación se proceda a realizar una reacción de amplificación) así como controles positivos y negativos. Los siguientes ejemplos ilustran Ia invención y no deben ser considerados en sentido limitativo del alcance de Ia misma.
EJEMPLO 1
Detección de cepas de referencia de patógenos virales causantes de infecciones respiratorias en muestras procedentes de cultivos celulares
La detección de cepas de referencia de patógenos virales causantes de infecciones respiratorias en muestras procedentes de cultivos celulares inoculados con dichas cepas virales, se llevó a cabo mediante un ensayo basado en Ia hibridación de fragmentos de material genético amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas en membrana de nylon, siguiendo un protocolo adaptado a partir del previamente descrito por Kaufhold y cois. (Kaufhold y cois., 1994, FEMS Microbiology Letters 119:19-25).
1.1 Materiales 1.1.1 Muestras
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Las muestras utilizadas para Ia realización de este ensayo fueron muestras procedentes de cepas de referencia de virus respiratorios causantes de infecciones respiratorias crecidas en cultivos celulares. Dichas cepas de referencia fueron suministradas por laboratorios de reconocido prestigio y están aceptadas como cepas de referencia por Ia comunidad científica internacional, según se enumeran a continuación:
Virus Cepa
Virus influenza tipo A A/Panama/2007/99 Virus influenza tipo B B/Yamanash¡/166/98 Virus influenza tipo C C/Johannesburg/1 /66
Virus respiratorio sincitial humano tipo A (RSVA) Long Virus respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB) RSN-2
Adenovirus humano Serotipo 1 (ADV1)
Virus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1 ) C-35
Virus parainfluenza humano tipo 2 (PIV2) Greer
Virus parainfluenza humano tipo 3 (PIV3) C-243
Virus parainfluenza humano tipo 4B (PIV4B) M-25
Coronavirus humano 229E
Coronavirus humano OC43
Echovirus humano 30 (Echo30) Bastianni
Rhinovirus 14 (Rhino14) 1059
Metapneumovirus humano 00
Las concentraciones de virus utilizadas fueron calculadas en cada caso: 100 TCID50 en los virus influenza tipos A y B; una dilución 10"3 de una preparación de virus influenza tipo C con un título 2048 por inhibición de Ia hemaglutinación; una dilución 10'3 de RSVA y RSVB, equivalente a detectar una célula infectada por inmunofluorescencia indirecta; diluciones 10"3 de ADV1, virus parainfluenza humano tipos 1 , 2, 3 y 4B, coronavirus humano 229E, coronavirus humano OC43, y metapneumovirus humano, todas ellas equivalentes a 105 copias de plásmldo; así como diluciones 10"4 de Echo30 y Rhino14, equivalentes a 0,1 TCID50.
1.1.2 Sondas
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Se han utilizado en cada caso sondas homologas a Ia cadena molde de cada virus, así como a Ia cadena complementaria, Independiente y/o conjuntamente, con el fin de comprobar el mejor resultado de sensibilidad. Las concentraciones de cada sonda son las anteriormente descritas. La localización de las sondas se especifica en cada caso (Figura 1). Las sondas utilizadas en este ensayo se indican en Ia Tabla 1.
Tabla 1 Sondas utilizadas
Figure imgf000031_0001
Dichas sondas poseen un grupo hexílamino en el extremo 5', según describieron Kaufhold y cois. (FEMS Microbiol. Lett. 1994 Jun 1 ;119(1-2):19-25). La presencia del grupo amino facilita Ia inmovilización de Ia sonda y permite orientar espacialmente Ia sonda sobre Ia membrana. Para su inmovilización sobre Ia membrana, las sondas se diluyeron en una solución recién preparada de NaHCO3 500 mM, pH 8,4, siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG. J Clin Microbiol 2000, 38:2595-2601]. En este caso, todas las sondas se utilizaron a una concentración de 0,8 μM.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 1.1.3 Membrana
La membrana utilizada en este ensayo fue una membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, PaII Life Sciences) de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de Ia unión de las sondas a Ia membrana, ésta se trató con una solución recién preparada de 1 -etil-3-
(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) al 16% en agua, durante, al menos, 15 minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 40C en papel de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
1.2 Métodos
1.2.1 Extracción de material genético
A partir de las muestras (apartado 1.1.1) se llevó a cabo Ia extracción del material genético, tanto RNA como DNA, mediante métodos convencionales. En este caso se empleó un método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio, descrito previamente por Casas y cois (Casas y cois., 1995, J Virol
Methods 53:25-36).
1.2.2 Amplificación enzimática
El material genético extraído se sometió a una reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar fragmentos que contenían las secuencias homologas a las sondas utilizadas (Tabla 1 ) para Ia detección de los distintos patógenos virales (virus influenza tipos A, B y C, RSVA, RSVB, ADV1 , PIV1 , PIV2, PIV3, PIV4, coronavirus, echovirus, rhinovirus y metapneumovirus) inmovilizadas sobre una membrana de nylon.
Las reacciones de amplificación enzimática de los distintos fragmentos se llevaron a cabo utilizando los iniciadores descritos por Coiras y cois. (Coiras y cois., Journal of Medical Virology 69:132-144 (2003); y Coiras y cois., Journal of Medical Virology 72(3):484-495 (2004)). La amplificación se llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP y dCTP 200 μM, dTTP 130 μM y biotina-16-dUTP 70 μM, por reacción con el fin de marcar el material genético (productos de amplificación o amplicones) a hibridar.
1.2.3 Inmovilización de las sondas a Ia membrana de nylon
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La inmovilización de las sondas utilizadas en este ensayo (Tabla 1) a Ia membrana de nylon se llevó a cabo siguiendo sustancialmente un protocolo descrito previamente [Vinjé J1 Koopmans MPGJ Clin Microbiol 2000, 38:2595-2601].
Para su inmovilización sobre Ia membrana, las sondas se diluyeron en una solución recién preparada de NaHCO3 500 mM, pH 8,4, siguiendo el protocolo descrito previamente. Asimismo, antes de Ia unión de las sondas a Ia membrana de nylon, ésta se trató con una solución recién preparada de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) al 16% en agua, durante, al menos, 15 minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 40C en papel de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
Las sondas sometidas al tratamiento previamente indicado se inmovilizaron sobre Ia membrana de nylon previamente preparada por métodos convencionales [Vinjé & Koopmans citado supra] basándose en el hecho de que el grupo amino presente en las sondas se une covalentemente a los grupos carboxilo activados procedentes del tratamiento de Ia membrana con EDAC. Para ello, brevemente, Ia membrana de nylon se introdujo en un miniblotter de 45 canales (Biometra). Los canales que no iban a contener sonda se rellenaron con una solución recién preparada de NaHCO3 500 mM, pH 8,4, mientras que los canales que iban a contener las sondas se rellenaron con diluciones de las sondas preparadas en el momento tal como se ha indicado previamente. Las sondas se incubaron en contacto con Ia membrana a temperatura ambiente (18-220C) durante 10 minutos. A continuación, el líquido fue aspirado de los canales con una bomba de vacío. Los grupos esteres que permanecían activados en Ia membrana se hidrolizaron mediante incubación a temperatura ambiente con una solución de NaOH 100 mM durante un periodo de tiempo no superior a 10 minutos. Finalmente, Ia membrana con las sondas se enjuagó con agua destilada ultrapura varias veces. La concentración de las sondas en Ia membrana de nylon era de, aproximadamente, 0,8-5 pmoles/μl (ó 120-750 pmoles por carril) en un volumen final de 150 μl, que llenaba completamente el carril del miniblotter (Biometra). Las sondas se dispusieron sobre Ia membrana siguiendo siempre el mismo orden en los carriles. El análisis de los resultados se hizo mediante una plantilla que permitía identificar rápidamente los virus que habían sido detectados en la(s) muestra(s).
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 1.2.4 Hibridación del material genético, amplificado v marcado con las sondas inmovilizadas en Ia membrana de nylon
Antes de proceder a hibridar el material genético (producto de amplificación) marcado, Ia membrana con las sondas se sometió a un tratamiento de prehibridación. Para ello, Ia membrana con las sondas se lavó con una solución de
SSPE 2X (NaCI 360 mM, NaH2PO4 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,2) en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,1% durante 10 minutos a 560C.
Para Ia hibridación del material genético con las sondas inmovilizadas, Ia membrana con las sondas se colocó en un miniblotter girada 90° con respecto a Ia posición anterior. Diez microlitros del material genético marcado se diluyeron en 150 μl de tampón de hibridación (SSPE 2x, 0,5% SDS). Dado que el producto a hibridar es DNA de doble cadena, se sometió durante 10 minutos a un calentamiento a 990C y posteriormente se enfrió rápidamente durante 1 minuto a 40C. Después de mantener a temperatura ambiente durante 1 minuto se procedió a efectuar Ia hibridación. El proceso de hibridación se llevó a cabo durante 2 horas aproximadamente, a 480C aproximadamente, con agitación suave.
A continuación, Ia membrana se lavó a través de los colectores de filtración o
"manifolds" (Biometra) con 150 mi de una solución de SSPE 2x con 0,5% de SDS
(dodecilsulfato sódico). La membrana se sacó del miniblotter y se lavó dos veces más con 50 mi de Ia solución anterior, en agitación, durante 10 minutos cada vez, a
4O0C.
1.2.5 Detección e identificación de los patógenos virales La membrana de nylon con las sondas y los productos de amplificación marcados, que eventualmente habían hibridado con las sondas, se incubó con estreptavidina-peroxidasa (1 :4000), durante un periodo de tiempo de 45 minutos, a 37°C. A continuación, se realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno utilizando en los dos primeros solución de SSPE2x 0,5% SDS y SSPE2x 0,1% SDS, respectivamente, a 370C y con agitación, y el tercero con una solución de SSPE2x sólo, a temperatura ambiente, con agitación. Finalmente se procedió a efectuar el revelado quimioluminiscente con luminol en presencia de agua oxigenada utilizando un kit comercial (ECL Detection System, Amersham Biosciences), siguiendo las instrucciones del fabricante. La visualización de los resultados se realizó mediante impresión de películas de rayos X (Kodak) durante 5 minutos, 30 minutos y 4 horas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 1.3 Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 1 y ponen de manifiesto Ia especificidad y sensibilidad de Ia técnica ensayada que permite identificar simultáneamente las cepas prototipo de diferentes patógenos virales causantes de infecciones respiratorias. Cada, producto de amplificación marcado con biotina interacciona de manera específica solamente con su sonda complementaria, y, en ningún caso, se observan hibridaciones inespecíficas, a pesar de que Ia cantidad de molde utilizado para Ia reacción de amplificación era elevado. Mediante Ia aplicación de una plantilla sobre Ia película impresionada es posible identificar rápida y claramente el(los) virus que ha(n) sido detectado(s) por Ia técnica.
EJEMPLO 2
Detección de virus respiratorios aislados de muestras clínicas del tracto respiratorio inoculadas en cultivos celulares La detección de diversos virus respiratorios causantes de infecciones respiratorias en muestras procedentes de cultivos celulares se llevó a cabo mediante un ensayo basado en Ia hibridación a las sondas inmovilizadas en una membrana de nylon, de los fragmentos de material genético amplificados y marcados con biotina.
2.1 Materiales
2.1.1 Muestras
Las muestras utilizadas para Ia realización de este ensayo fueron muestras procedentes de los virus respiratorios causantes de infecciones respiratorias, aislados de muestras clínicas del tracto respiratorio inoculadas en cultivos celulares. Dichos virus fueron los siguientes: virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus respiratorio sincitial humano tipo A (RSVA), virus respiratorio sincitial humano tipo B (RSVB), adenovirus humano (ADV) (varios serotipos) y virus parainfluenza humano tipo 3 (PIV3).
Con el fin de comprobar Ia sensibilidad de Ia técnica se emplearon diluciones seriadas en base diez, de virus aislados en cultivos celulares a partir de muestras respiratorias de pacientes. Las diluciones empleadas para cada virus fueron las siguientes: las diluciones iniciales, marcadas como -1 (Figura 2), fueron de 100 TCID50 en los virus influenza tipos A (carriles 1-4) y B (carriles 5-8), una dilución 10"3 de RSVA (carriles 9-12) y RSVB (carriles 13-16), ADV (carriles 17-20), equivalentes a detectar una célula infectada por inmunofluorescencia indirecta, y una dilución 10"3
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de virus parainfluenza humano tipo 3 (carriles 21-24), equivalente a detectar 105 copias de un plásmido que contiene el fragmento amplificado por Ia RT-PCR.
2.1.2 Sondas Se han utilizado en cada caso sondas homologas a Ia cadena molde de cada virus, así como a Ia cadena complementaria, independiente y/o conjuntamente, con el fin de comprobar el mejor resultado de sensibilidad. Las sondas utilizadas en este ensayo se indican en Ia Tabla 2.
Tabla 2
Sondas utilizadas
Figure imgf000036_0001
Las sondas diseñadas para Ia detección de los virus influenza tipos A y B y RSVA se utilizaron conjunta o separadamente, a una concentración final de 0,8 μM. Las demás sondas se utilizaron a concentraciones de 5, 1 y 0,8 μM con objeto de observar Ia diferente sensibilidad en función de Ia variación de Ia concentración.
Dichas sondas poseen un grupo hexilamino en el extremo 5', según describieron Kaufhold y cois. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1;119(1-2): 19-25). La presencia del grupo amino facilita Ia inmovilización de Ia sonda y permite orientar espacialmente Ia sonda sobre Ia membrana. Para su inmovilización sobre Ia membrana, las sondas se diluyeron en una solución recién preparada de NaHCO3 500 mM, pH 8,4, siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG.. J Clin Microbiol 2000, 38:2595-2601].
2.1.3 Membrana
La membrana utilizada en este ensayo fue una membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, PaII Life Sciences), de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) previamente [Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de Ia unión de las sondas a Ia membrana, ésta se trató con una solución recién preparada de EDAC al 16% en agua, durante, aí menos, 15 minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 40C en papel de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
2.2 Métodos
2.2.1 Extracción de material genético
A partir de las muestras (apartado 2.1.1.) se llevó a cabo Ia extracción del material genético, tanto RNA como DNA, mediante métodos convencionales. En este caso se empleó un método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio, descrito previamente por Casas y cois (J Virol Methods, 1995, 53:25-36).
2.2.2 Amplificación enzimática El material genético extraído se sometió a una reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar fragmentos que contenían las secuencias homologas a las sondas utilizadas (Tabla 2) para Ia detección de los distintos patógenos virales (virus influenza tipos A y B, RSVA, RSVB, ADV y virus parainfluenza humano tipo 3), inmovilizadas sobre una membrana de nylon. Las reacciones de amplificación enzimática de los distintos fragmentos específicos de los patógenos virales virus influenza tipos A y B, RSVA, RSVB, ADV y virus parainfluenza humano tipo 3 se llevaron a cabo utilizando los iniciadores descritos por Coiras y cois. (Coiras y cois., Journal of Medical Virology 69:132-144 (2003); y Coiras y cois., Journal of Medical Virology 72(3):484-495 (2004)). En todos los casos, Ia amplificación se llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dCTP 200 μM, dTTP 130 μM y biotina-16-dUTP 70 μM, por reacción con el fin de marcar el material genético (productos de amplificación o amplicones) a hibridar.
2.2.3 Inmovilización de las sondas a Ia membrana de nylon La inmovilización de las sondas utilizadas en este ensayo (Tabla 2) a Ia membrana de nylon se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.3.
2.2.4 Hibridación del material genético amplificado con las sondas inmovilizadas en Ia membrana de nylon
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La hibridación del material genético amplificado con las sondas inmovilizadas en Ia membrana de nylon se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.4.
2.2.5 Detección e identificación de los patógenos virales
La detección e identificación de los patógenos virales se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.5.
2.3 Resultados Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 2 y ponen de manifiesto Ia especificidad y sensibilidad de Ia técnica ensayada que permite identificar diferentes patógenos virales causantes de infecciones respiratorias, aislados de muestras clínicas del tracto respiratorio inoculadas en cultivos celulares. Se aprecia Ia variación en Ia sensibilidad de Ia detección en función de Ia dilución del virus y de Ia distinta concentración de Ia sonda utlizada, así como de si las sondas para Ia detección de virus influenza tipos A y B y del RSV tipo A se utilizan juntas o por separado. La especificidad es, en todos los casos, muy elevada.
EJEMPLO 3 Detección de virus influenza tipo A presente en muestras clínicas
La detección directa de virus influenza tipo A presente en Ia muestra clínica ensayada se llevó a cabo mediante un ensayo basado en Ia hibridación de fragmentos de material genético amplificados y marcados con sondas inmovilizadas en membrana de nylon.
3.1 Materiales 3.1.1 Muestras
Las muestras utilizadas para Ia realización de este ensayo fueron frotis faríngeos tomados a pacientes que presentaban síntomas indicativos de cuadro gripal, con objeto de intentar identificar el virus productor de dicho cuadro clínico.
3.1.2 Sondas
Las sondas utilizadas en este ensayo (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) se diseñaron con un grupo hexilamino en el extremo 5', según describieron Kaufhold y cois. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1;119(1 -2):19-25). La presencia del grupo
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) amino facilita Ia inmovilización de Ia sonda y permite orientar espacialmente Ia sonda sobre Ia membrana. Para su inmovilización sobre Ia membrana, las sondas se diluyeron en una solución recién preparada de NaHGO3 500 mM, pH 8,4, siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG.. J Clin Microbiol 2000, 38:2595-2601]. En este caso, todas las sondas se utilizaron a una concentración de 0,8 μM.
3.1.3 Membrana
La membrana utilizada en este ensayo fue una membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, PaII Life Sciences) de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de Ia unión de las sondas a Ia membrana, ésta se trató con una solución recién preparada de EDAC al
16% en agua, durante, al menos, 15 minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 40C en papel de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
3.2 Métodos
3.2.1 Extracción de material genético A partir de las muestras (apartado 3.1.1) se llevó a cabo Ia extracción del material genético, tanto RNA como DNA, mediante métodos convencionales En este caso se empleó un método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio, descrito previamente por Casas y cois. (Casas y cois., 1995, J Viral Methods 53:25-36).
3.2.2 Amplificación enzimática
El material genético extraído se sometió a una reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar fragmentos que contenían las secuencias homologas a las sondas utilizadas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) para Ia detección del patógeno viral (virus influenza tipo A) fijadas a una membrana de nylon. La reacción de amplificación enzimática (RT-PCR) de los distintos fragmentos se llevó a cabo utilizando los iniciadores y las condiciones descritos por Coiras y cois. (Coiras y cois., Journal of Medical Virology 69:132-144 (2003)). En todos los casos, Ia amplificación se llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dCTP 200 μM, dTTP
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 130 μM y biotina-16-dUTP 70 μM por reacción, con el fin de marcar ei material genético (productos de amplificación o amplicones) a hibridar.
3.2.3 Inmovilización de las sondas a Ia membrana de nylon La inmovilización de las sondas utilizadas en este ensayo (SEQ ID NO: 1 y
SEQ ID NO: 2) a Ia membrana de nylon se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.3.
3.2.4 Hibridación del material genético amplificado con las sondas inmovilizadas en Ia membrana de nylon
La hibridación del material genético amplificado con las sondas inmovilizadas en Ia membrana de nylon se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.4.
3.2.5 Detección e identificación del patógeno viral
La detección e identificación del patógeno viral se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.5.
3.2.6 PCR anidada Con el fin de comprobar Ia sensibilidad de Ia técnica utilizada previamente basada en Ia hibridación de productos amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas en una membrana de nylon, se procedió a realizar una PCR anidada siguiendo una metodología descrita previamente (Coiras y cois., Journal of Medical Virology, 2003, 69:132-144). Los iniciadores utilizados tanto para Ia amplificación de los fragmentos que contenían secuencias homologas a las sondas, como los utilizados para realizar Ia PCR anidada, así como las condiciones de realización de Ia PCR anidada se describen en dicha publicación (Coiras y cois., 2003, citado supra).
3.3 Resultados
En Ia Figura 3A se observan los resultados de Ia hibridación del material genético procedente de los virus de Ia muestra clínica, con las sondas inmovilizadas en Ia membrana (Carriles 1-12). No se detectó virus influenza A en las muestras 2, 7 y 8. Estos resultados ponen de manifiesto Ia especificidad y sensibilidad de Ia
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) técnica ensayada que permite identificar el virus influenza tipo A en muestras clínicas.
Con objeto de analizar esta sensibilidad y especificidad utilizando una técnica referenciada, se realizó simultáneamente al proceso de hibridación una PCR anidada, cuyos resultados se muestran en Ia Figura 3B, donde los carriles 1-12 . corresponden a los carriles 1-12 observados en Ia Figura 3A. El carril M de Ia Figura 3B corresponde con el marcador XIV de pesos moleculares, suministrado por Roche Diagnostics (marcador de 100 pb). En todos los carriles (excepto 2, 7 y 8) se observa una banda de 721 pares de bases (pb), correspondiente al fragmento amplificado del gen de Ia nucleoproteína del virus influenza tipo A, y una banda de 837 pb, correspondiente al control interno utilizado como control del proceso de extracción del material genético a partir de Ia muestra, así como de Ia reacción de PCR (el plásmido del control interno y los iniciadores para su amplificación se describen en Coiras y cois., (2003) citado supra, donde se describen asimismo los iniciadores y las condiciones para realizar Ia PCR anidada).
EJEMPLO 4
Detección del coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS) La detección del coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) se llevó a cabo mediante un ensayo basado en Ia hibridación de fragmentos de material genético amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas en membrana de nylon.
4.1 Materiales
4.1.1 Muestras
Las muestras utilizadas para Ia realización de este ensayo fueron material genético procedente de virus inactivado y de un plásmido que incluye un fragmento de Ia polimerasa de coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS)1 amablemente cedidos por el Dr. Christian Drosten (Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, National Reference Center for Tropical Infectious Diseases, Hamburgo, Alemania). Se han empleado diluciones seriadas del virus inactivado a partir de Ia dilución 10~3, equivalentes a diluciones seriadas realizadas a partir de una dilución 105 de plásmido que incluye el fragmento del gen de Ia polimerasa amplificado a partir del genoma del CoV-SARS.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 4.1.2 Sondas
La sonda utilizada en este ensayo (SEQ ID NO: 18) se diseñó con un grupo hexilamino en el extremo 5', según describieron Kaufhold y cois. (FEMS Microbiol Lett. 1994 Jun 1 ;119(1-2):19-25). La presencia del grupo amino facilita Ia inmovilización de Ia sonda y permite orientar espacialmente Ia sonda sobre Ia membrana. Se ensayaron dos concentraciones de dicha sonda (0,8 μM y 5 μM) tal como se recoge en Ia Figura 4. Para su inmovilización sobre Ia membrana, las sondas se diluyeron en una solución recién preparada de NaHCO3 500 mM, pH 8,4, siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé Jy Koopmans MPG. J Clin
Microbiol 2000, 38:2595-2601].
4.1.3 Membrana
La membrana utilizada en este ensayo fue una membrana con superficie de carga negativa (Biodyne C, PaII Life Sciences) de un tamaño aproximado de 14,5 cm x 14,5 cm. Dicha membrana fue preparada siguiendo un protocolo descrito previamente [Vinjé & Koopmans citado supra]. Brevemente, antes de Ia unión de las sondas a Ia membrana, ésta se trató con una solución recién preparada de EDAC al
16% en agua, durante, al menos, 15 minutos, y, a continuación, se enjuagó con agua. La membrana así preparada se usó inmediatamente o bien se almacenó a 40C en papel de filtro hasta su uso durante un máximo de 1 semana.
4.2 Métodos
4.2.1 Extracción de material genético A partir de las muestras (apartado 4.1.1) se llevó a cabo Ia extracción del material genético, tanto RNA como DNA, mediante métodos convencionales En este caso se empleó un método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio, descrito previamente por Casas y cois (1995, J Virol Methods 53:25-36).
4.2.2 Amplificación enzimática
El material genético extraído se sometió a una reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar fragmentos que contenían las secuencias homologas a las sondas utilizadas (SEQ ID NO: 18) para Ia detección del patógeno viral (coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS)) fijadas a una membrana de nylon. La reacción de amplificación enzimática de los distintos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) fragmentos se llevó a cabo utilizando los iniciadores y las condiciones descritas por Drosten C y cois. (Drosten C y cois., 2003, N Engl J Med. May 15;348(20): 1967-76). La amplificación se llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dCTP 200 μM, dTTP 130 μM y biotina-16-dUTP 70 μM, por reacción con el fin de marcar el material genético (productos de amplificación o amplicones) a hibridar.
4.2.3 Inmovilización de las sondas a Ia membrana de nylon La inmovilización de Ia sonda utilizada en este ensayo (SEQ ID NO: 18) a Ia membrana de nylon se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.3.
4.2.4 Hibridación del material genético amplificado con las sondas inmovilizadas en
Ia membrana de nylon
La hibridación del material genético amplificado con Ia sonda inmovilizada en Ia membrana de nylon se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.4.
4.2.5 Detección e identificación del patógeno viral
La detección e identificación del patógeno viral se llevó a cabo de forma sustancialmente idéntica a como se menciona en el Ejemplo 1.2.5.
4.3 Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 4 y ponen de manifiesto Ia validez de Ia sonda utilizada para Ia detección del material genético procedente del coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y Ia sensibilidad del ensayo.
EJEMPLO 5 Detección de adenovirus humano presente en muestras clínicas La detección genérica de adenovirus humanos presentes en muestras clínicas se llevó a cabo mediante un ensayo basado en Ia hibridación de fragmentos de material genético amplificados y marcados, con sondas inmovilizadas, no orientadas, en portaobjetos de cristal.
5.1 Materiales
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 5.1.1 Muestras
Las muestras utilizadas para Ia realización de este ensayo fueron secreciones respiratorias procedentes de pacientes con cuadros respiratorios. El material genético se extrajo directamente de las muestras clínicas y se analizó el posible virus presente en las mismas mediante dos RT-PCR múltiples seguidas de
PCRs anidadas descritas previamente por Coiras y cois. (Coiras y cois., Journal of
Medical Virology, 2003, 69:132-144; y Coiras y cois., Journal of Medical Virology,
2004, 72(3):484-495). Una vez conocida Ia presencia de adenovirus humanos en dichas muestras clínicas, el mismo material genético fue utilizado para ser hibridado con Ia sonda SEQ ID NO: 9, diseñada para poder hibridarse a cualquier adenovirus de origen humano, independientemente de su serotipo.
5.1.2 Sondas
La sonda utilizada en este ensayo (SEQ ID NO: 9) se inmovilizó directamente sobre una superficie de cristal (portaobjetos), en disposición no orientada en el espacio, a una concentración de 20 μM. Las sondas se preparan a Ia concentración recomendada en un volumen aproximado de 40 μl diluidas en SSC 3x, dispuestas en pocilios de una placa de 96, preferiblemente de fondo en U o en V para facilitar el acceso de las agujas de impresión. A diferencia del método de hibridación en membrana de nylon, estas sondas no presentan modificaciones en el extremo 5'.
5.1.3 Soporte de cristal
Se han empleado portaobjetos comunes a los que se somete a un tratamiento con poli-L-lisina con objeto de disponer sobre Ia superficie de cristal grupos amino que se van a unir covalentemente a los grupos fosfato de las sondas.
Las sondas no quedan orientadas espacialmente sobre Ia superficie del portaonjetos funcionalizado con poli-L-lisina, sino que quedan adheridas a ella en toda su longitud. Este tratamiento fue descrito por (Schena y cois., 1995, Science 270(5235):467-470.).
5.2 Métodos
5.2.1 Extracción de material genético
A partir de las muestras (apartado 5.1.1) se llevó a cabo Ia extracción del material genético, tanto RNA como DNA, mediante métodos convencionales En este
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) caso se empleó un método de extracción basado en el uso de tiocianato de guanidinio, descrito previamente por Casas y cois (J Viral Methods, 1995, 53:25-36).
5.2.2 Amplificación enzimática El material genético extraído se sometió a una reacción de amplificación enzimática con el fin de amplificar fragmentos de Ia secuencia del gen de Ia proteína del hexón, homologas a Ia sonda utilizada (SEQ ID NO: 9) para Ia detección de adenovirus, fijada a una membrana de nylon. La reacción de amplificación enzimática se llevó a cabo utilizando los iniciadores y las condiciones descritas en Coiras y cois. (Journal of Medical Virology, 2003, 69:132-144). La amplificación se llevó a cabo en presencia de dATP, dGTP, y dTTP 200 μM, dCTP 180 μM y Cy3- dCTP 20 μM por reacción, con el fin de marcar el material genético (productos de amplificación o amplicones) a hibridar.
5.2.3 Inmovilización de las sondas al soporte de cristal
La inmovilización de Ia sonda utilizada en este ensayo (SEQ ID NO: 9) a Ia superficie de cristal se realizó disponiendo dicha sonda por triplicado sobre el portaobjetos mediante un sistema de Pin&Ring con un Arrayer GMS 417 (Affymetrix Inc.). Los grupos amino que han quedado libres en Ia superficie del portaobjetos funcionalizado e impreso, se bloquean con anhídrido succínico disuelto en un disolvente polar (n-metil-pirrolidinona), según describen Eisen y Brown, 1999, Methods Enzymol 303:179-205 . A continuación los portaobjetos se sumergen en agua a 9O0C durante 2 minutos y luego en etanol absoluto momentáneamente con objeto de facilitar su secado, que se completa mediante centrifugación a temperatura ambiente. Una vez bloqueados, los portaobjetos se almacenan en desecador, protegidos de Ia luz, a temperatura ambiente, al menos 24 horas antes de realizar Ia hibridación con las muestras..
5.2.4 Hibridación del material genético amplificado con las sondas inmovilizadas en el soporte de cristal
La hibridación del material genético amplificado y marcado, con Ia sonda inmovilizada en el soporte de cristal, se llevó a cabo mediante el protocolo siguiente.
Brevemente, 10 μl del material genético marcado se diluyeron en 15-20 μl de tampón de hibridación (SSC 2x, 0,2% SDS), se calentaron a 950C durante 10 minutos y posteriormente se enfriaron rápidamente 1 minuto a 40C. La muestra se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) depositó sobre Ia región del portaobjetos donde estaban impresas las sondas y se tapó con un cubreobjetos. A continuación se introdujo en una cámara de hibridación donde se mantuvo en condiciones de humedad y saturación de sales, y Ia hibridación se realizó durante 2 horas a 420C en agitación suave.
5.2.5 Detección e identificación del patógeno viral
La detección e identificación del patógeno viral se llevó a cabo después de realizar lavados de los portaobjetos con SSC Ix-SDS 0,2%, SSC O1Ix-SDS 0,2%, y por último con SSC 0,1x, durante 10 minutos cada uno, en agitación, a temperatura ambiente y protegidos de Ia luz. Después de secarlos en una centrífuga de portaobjetos se procedió a Ia lectura inmediata de los resultados.
5.3 Resultados
La lectura de los resultados se realizó utilizando un Scanner GMS 418 (Affymetrix Inc.). Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 5 y ponen de manifiesto Ia validez de Ia sonda utilizada para Ia detección del material genético procedente de muestras clínicas infectadas con cualquier adenovirus de origen humano. En Ia Figura 5 se observa Ia fluorescencia emitida por las moléculas de
Cy3 presentes en el producto de amplificación obtenido mediante los oligonucleótidos iniciadores específicos para adenovirus humano. Se han utilizado para Ia amplificación y el mareaje mediante PCR (condiciones y oligonucleótidos en
Coiras y cois., Journal of Medical Virology 69:132-144 (2003)), diluciones de adenovirus humanos causantes de infección respiratoria y pertenecientes a los serotipos 1 (imagen 1), 2 (imagen 2), 4 (imagen 3), 5 (imagen 4) y 7 (imagen 5), equivalentes estas diluciones a 103 copias de un plásmido que contiene el fragmento del gen de Ia proteína del hexón amplificado en las condiciones descritas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una sonda que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ-ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.
2. Una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda según Ia reivindicación 1 , inmovilizada sobre dicho soporte sólido.
3. Plataforma de hibridación según Ia reivindicación 2, que comprende un conjunto de dos o más de dichas sondas inmovilizadas sobre dicho soporte sólido en una disposición orientada.
4. Plataforma de hibridación según Ia reivindicación 2, que comprende un conjunto de dos o más de dichas sondas inmovilizadas sobre dicho soporte sólido en una disposición no orientada.
5. Un método para identificar virus causantes de infecciones respiratorias en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y sus mezclas, eventualmente presentes en una muestra de ensayo, que comprende: a) poner en contacto ácidos nucleicos procedentes de dicha muestra de ensayo con una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido y, al menos, una sonda inmovilizada sobre dicho soporte, en donde cada sonda es sustancialmente complementaria a una secuencia diana específica de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria eventualmente presentes en dicha muestra de ensayo; y
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) b) detectar Ia posible hibridación de dichas secuencias diana con dichas sondas.
6. Método según Ia reivindicación 5, en el que dichas sondas inmovilizadas sobre dicho soporte sólido se seleccionan del grupo formado por los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y sus mezclas, y en el que
Ia hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 y/o sus mezclas es indicativa de Ia presencia de virus influenza tipo A en Ia muestra;
Ia hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o sus mezclas es indicativa de Ia presencia de virus influenza tipo B en Ia muestra;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 5 es indicativa de Ia presencia de virus influenza tipo C en Ia muestra;
Ia hibridación de una secuencia diana con una sonda seleccionada entre los polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o sus mezclas es indicativa de Ia presencia de virus respiratorio sincitial humano tipo A;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 8 es indicativa de Ia presencia de virus respiratorio sincitial humano tipo B;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 9 es indicativa de Ia presencia de adenovirus humano;
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 10 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 1;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO:. 11 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano, tipo 2;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 12 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 3;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 13 es indicativa de Ia presencia de virus parainfluenza humano tipo 4A y 4B;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 14 es indicativa de Ia presencia de enterovirus;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 15 es indicativa de Ia presencia de rhinovirus;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 16 es indicativa de Ia presencia de coronavirus humano tipo 229E;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 17 es indicativa de Ia presencia de coronavirus humano tipo OC43;
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 18 es indicativa de Ia presencia de coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS); y
Ia hibridación de una secuencia diana con Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 19 es indicativa de Ia presencia de metapneumovirus humano.
7. Método según Ia reivindicación 5, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra sospechosa de contener uno o más virus causantes de infección respiratoria en humanos seleccionados entre virus influenza tipo A, virus influenza
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y sus mezclas.
8. Método según Ia reivindicación 7, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra biológica de origen humano o una muestra procedente de un cultivo celular de virus.
9. Método según Ia reivindicación 8, en el que dicha muestra biológica de origen humano es una muestra de un fluido biológico o una muestra de un tejido biológico.
10. Método según Ia reivindicación 9, en el que dicha muestra biológica de origen humano se selecciona entre sangre, esputo, gargarismo, frotis faríngeo, frotis nasofaríngeo y aspirado nasofaríngeo, bronquial, traqueal o pleural.
11. Método según Ia reivindicación 5, en el que dicho soporte sólido es una membrana de nylon o una superficie de vidrio o cristal.
12. Método según Ia reivindicación 5, en el que dichas sondas están dispuestas sobre el soporte sólido en una disposición orientada.
13. Método según Ia reivindicación 5, en el que dichas sondas están dispuestas sobre el soporte sólido en una disposición no orientada.
14. Método según Ia reivindicación 5, en el que dichas sondas están dispuestas sobre el soporte sólido constituyendo un array.
15. Método según Ia reivindicación 5, en el que dicho soporte sólido es un biochip en el que las sondas inmovilizadas están dispuestas en una disposición orientada constituyendo un array.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
16. Método según Ia reivindicación 5, en el que Ia detección de Ia hibridación [etapa b)] se realiza mediante un método radiactivo.
17. Método según Ia reivindicación 5, en el que Ia detección de Ia hibridación [etapa. b.)] se realiza mediante un método no radiactivo.
18. Método según Ia reivindicación 17, en el que dicho método no radiactivo es un método fluorescente, colorimétrico, luminiscente, bioluminiscente o quimioluminiscente.
19. Método según Ia reivindicación 5, en el que, antes de realizar Ia etapa a), se lleva a cabo una reacción de amplificación de los ácidos nucleicos de dichos virus causantes de infección respiratoria en humanos eventualmente presentes en Ia muestra de ensayo, utilizando iniciadores que flanquean secuencias diana específicas de cada uno de dichos virus causantes de infección respiratoria.
20. Método según Ia reivindicación 19, en el que dicha reacción de amplificación comprende una reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) multiplex o una reacción de transcripción inversa (RT) - PCR multiplex.
21. Un kit para Ia identificación de un virus causante de infección respiratoria seleccionado entre virus influenza tipo A, virus influenza tipo B, virus influenza tipo C, virus respiratorio sincitial humano tipo A, virus respiratorio sincitial humano tipo B, adenovirus humano, virus parainfluenza humano tipo 1 , virus parainfluenza humano tipo 2, virus parainfluenza humano tipo 3, virus parainfluenza humano tipos 4 A y 4 B, enterovirus, rhinovirus, coronavirus humano tipo 229E, coronavirus humano tipo OC43, coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), metapneumovirus humano y combinaciones de los mismos, en una muestra de ensayo, mediante un método según Ia reivindicación 5, que comprende, al menos, una sonda según Ia reivindicación 1 , o, al menos, una plataforma de hibridación según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
22. Kit según Ia reivindicación 21 , que comprende una plataforma de hibridación que comprende un soporte sólido sobre el que se han inmovilizado una sonda seleccionada del grupo formado por los polinucleótidos identificados como
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y sus mezclas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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