WO2010032991A2 - 엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법 - Google Patents

엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법 Download PDF

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WO2010032991A2
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polymerase chain
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윤홍란
변상진
박해준
박한오
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(주)바이오니아
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus

Definitions

  • the present invention relates to primers for detecting enteroviruses, probes, and methods for detecting enteroviruses using the same, and more particularly, to primers, probes for detecting enteroviruses in body fluids, body tissues, environmental samples, and the like, and methods for detecting the same using the same. will be.
  • Enteroviruses include four types of polioviruses, polioviruses, coxsackie viruses, echoviruses, and other enteroviruses. There are three types of polioviruses, 33 species of ecoviruses, and 61 species of other enteroviruses. Poliovirus is a causative agent of polio. The incubation period is 3 to 35 days and occurs frequently in children under 15 years of age, especially children 1 to 3. Echovirus mainly infects children 1 to 4 years of age, causing various diseases such as aseptic meningitis, upper respiratory infections, rashes, other febrile diseases, and diarrhea in infants. The coxsackie virus is divided into group A and B (23 types in group A and 6 types in group B).
  • the period of incubation of coxsackie virus that causes various diseases is 2 to 9 days. It causes herpes stomatitis and hand and foot disease, and Coxsackie B virus causes various diseases in the heart, pleura, pancreas and liver, causing lateral chest pain, myocarditis and pericarditis. Both groups A and B can affect the meninges and motor units, causing aseptic meningitis and paralysis.
  • enterovirus 71 causes meningitis and 70 causes acute hemorrhagic conjunctivitis.
  • Enteroviruses are transmitted through the fecal-oral route, and diseases caused by enteroviruses are seasonal and are particularly common in summer. Although most enterovirus infections do not show any symptoms and are treated by themselves, prevention is important because of the grouping and lack of specific drugs in people with low immunity, especially children. However, a vaccine against polioviruses has been developed, but vaccines against other enteroviruses other than polioviruses have not been developed. Therefore, it is urgent to block the virus propagation path.
  • enteroviruses are treated by themselves after being infected with the human body, but diseases caused by enteroviruses are still harmful to health and there are not many cases of enteroviruses.
  • Japan for example, Takako Shima et.al.Enterovirus detection status of patients with herpangina and hand, foot and mouth disease in epidemic season 2007, Kanagawa, reported in 2008.
  • 2,496 cases and 22 deaths occurred in China due to Enterovirus 71 disease, and the National Institutes of Health reported that in May 2006, Ecovirus 5 and Ecovirus 6 were identified in a sample of aseptic meningitis patients. It was.
  • the infection caused by enterovirus can cause death, and the incubation period occurs several days to several days, so prevention is important, and blocking the propagation path is important to prevent the spread of the disease.
  • gel electrophoresis can be used to overcome the hassle of determining the presence of viral nucleic acid, and the sensitivity is much higher, so it can also detect a low concentration of virus (Uta). Dierssen et al., JCV, vol 42, p58-64, 2008).
  • the present inventors completed the present invention by confirming that various types of enteroviruses can be detected even at low concentrations by real-time polymerase chain reaction using the primers and probes of the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a new and efficient detection method capable of detecting a variety of enteroviruses without limitation.
  • the present invention provides a primer for detecting an enterovirus composed of a part of a coxsackievirus A16 sequence (Gen Bank accession no. U05876) or a part of a complementary sequence thereof.
  • the present invention provides a primer for detecting an enterovirus consisting of 5 to 40 base sequences within the 462 to 649 th bases of the base sequences.
  • the present invention provides a primer for detecting an enterovirus selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1-6.
  • the present invention provides a probe for detecting an enterovirus composed of a part of a coxsackievirus A16 sequence (Gen Bank accession no. U05876) or a part of a complementary sequence thereof.
  • the present invention provides a probe for detecting an enterovirus consisting of 5 to 40 base sequences within the 462 to 649 th bases of the base sequences.
  • the present invention provides a probe for detecting an enterovirus selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 17.
  • the present invention provides a method for detecting enterovirus, wherein the sample is obtained from a clinical sample or an environmental sample.
  • the present invention provides a kit for detecting an enterovirus, comprising the primer of [1] or the probe of [4].
  • the primer is selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 and the probe is an enterovirus detection selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 to 17.
  • the probe is an enterovirus detection selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 to 17.
  • the present invention provides primers and probes necessary for detecting enteroviruses via real time polymerase chain reaction or general polymerase chain reaction.
  • the real-time polymerase chain reaction of the present invention monitors the reaction results in real time by using oligonucleotide probes chemically bonded to the primer and the fluorescent material.
  • the probe binds to the complementary sequence in the nucleic acid of the sample, like the two primers, and is located slightly away from the primer.
  • Probe of the present invention is a structure in which both the reporter (quencher) and the reporter (quencher) is attached to both ends of the reporter and the quencher in close proximity to each other to cancel the fluorescence of the reporter, but the amplification proceeds Therefore, when the reporter is separated from the quencher, the reporter's fluorescence is detected. Thus, the intensity of fluorescence increases gradually as the amplification cycle increases.
  • the primers and probes of the present invention include a part of the coxsackievirus A16 sequence (GenBank accession no. U05876) or a part of its complementary sequence, and preferably 5 to 5th base in the 462 to 649th base of the base sequence. It consists of 40 base sequences, More preferably, it is a forward primer which is a base sequence shown by SEQ ID NO: 1-3, and a reverse primer which is a base sequence shown by SEQ ID NOs: 4-6. In addition, there are 11 probes, 4 of which are (SEQ ID NOS: 7 to 10) are forward probes, and the remaining 7 (SEQ ID NOs: 11 to 17) are reverse probes.
  • the primers and probes may be any combination as long as it consists of two primers (one forward and one reverse) and a probe.
  • the primer and the reverse primer described in SEQ ID NO: 4 and Reverse probes as set forth in SEQ ID NO: 13 can be used.
  • the primer of the present invention can be used not only for real-time polymerase chain reaction but also for general polymerase chain reaction.
  • the reporter of the probe is preferably FAM (6-carboxyfluorescein), quencher BHQ1 (butylhydroquinone-1), but is not limited thereto.
  • Virus types number Coxsackie virus A group 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24 Coxsackie virus group B 1 2 3 4 5 Echovirus 3, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 30, 32, AMS573 Poliovirus 1, 2, 3 Other enteroviruses 46, 69, 71, 74, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 84, 87, 88, 91, 94, 97, 100, 101, B, yanbian96-83csf, yanbian96-85csf, 5666 / sin / 002109, 5865 / sin / 000009
  • the primers and probes of the present invention were made based on the gene sequence of Coxsackie virus A16, since the sequence was made in the conserved sequence of the enterovirus gene, the part matching 100% of the gene of the enterovirus was matched. It is. As confirmed above, 67 kinds of enteroviruses can be detected using the primers and probes of the present invention, and thus, most types of enteroviruses can be detected at present.
  • the virus can be detected, especially in real time polymerase chain reaction, the amplification can be observed immediately during the amplification process. There is no need for a separate amplification product identification step.
  • the present invention provides a kit for enterovirus detection comprising the primer or probe.
  • the kit includes amplification buffers, dNTPs, controls, detection reagents, and the like, in addition to the primers or probes of the present invention, and may include additional components according to the purpose as long as the kit does not affect the reaction.
  • Figure 1 shows the results of real-time reverse transcription polymerase chain reaction using the Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal block device with all combinations of the primers and probes of the present invention described in SEQ ID NOS: 1 to 17, PCR efficiency is good It is a graph showing the result of performing 17 real-time reverse transcriptase chain reaction after selecting 17 sets.
  • Figure 2 shows the results of real-time reverse transcription polymerase chain reaction using the ABI7500 fast system with all combinations of the primers and probes of the present invention described in SEQ ID NOS: 1 to 17, 16 PCR good set of good efficiency again It is a graph showing the results of real-time reverse transcription polymerase chain reaction.
  • Exicycler TM Shows a graph of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the standard template of enterovirus using 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (each curve is 10 To 10 7 Copy, Internal Positive Control (IPC) is Dvl-1 and NTC represents the blank as negative control).
  • Figure 5 shows a graph of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction of the standard template of the enterovirus using the real-time polymerase chain reaction device ABI7500 fast system (each curve is 10 to 10 6 copies).
  • Figure 7 shows the poliovirus 1 (PV1), ecovirus 6 (echo6), coxsackievirus A9 (coxA9), coxsackievirus B5 with the enterovirus primer and probe of the present invention using an Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal block. (coxB5) and hepatitis A virus (HAV) were detected and the graph is shown.
  • FIG. 8 shows a graph of the virus detected using the ABI7500 fast system.
  • template RNA was first prepared. Specifically, 301 ⁇ 683 (383 bp) portion of coxsackievirus A16 (accession no. U05876) was synthesized by gene synthesis method ( NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203), and part of pGEM was synthesized. -T-Easy Vector (Cat: A1360, manufactured by Promega, USA).
  • Plasmid DNA was extracted from the pellets using a plasmid DNA prep kit (manufactured by Bioneer, Korea). Plasmid DNA was measured using a UV spectrometer (manufactured by Shimazu, Japan) to measure the concentration and purity, and then confirmed that the purity was between 1.8 and 2.0. Plasmid DNA was transcribed into RNA using an in vitro transcription kit (Ambion, USA). After the transcription, the concentration and purity were measured by UV spectrometer, and when the purity was between 1.8 and 2.0, it was used as template RNA in the subsequent real-time polymerase chain reaction. RNA copy number was calculated by the following formula.
  • the copy number of the template RNA was calculated and then diluted 10 ⁇ with 1 ⁇ TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) and stored at ⁇ 70 ° C. until use.
  • the base sequence was arbitrarily selected between the base sequences 462 and 649 of coxsackievirus A16 (NCBI accession no. U05876) to have a length of 18-22 bp and a Tm value of 55 ° C to 62 ° C.
  • the length was between 20 to 30 bp and the Tm value was 67 to 72 ° C.
  • the nucleotide sequence was randomly selected as a probe, and the Tm value was checked using a Primer3Plus program.
  • the template RNA was diluted to 10 1 ⁇ 10 7 magnification in Example 1 to each 1 ⁇ l so that the final total capacity was 20 ⁇ l.
  • the probe was used by custom manufacturing (manufactured by Bioeer) to attach FHQ fluorescence at the 5 'region and BHQ1 at the 3' region.
  • the reaction was carried out at 45 ° C. for 5 minutes to synthesize cDNA, and then denatured at 95 ° C. for 5 minutes, followed by 40 cycles of reaction at 95 ° C. for 10 seconds and 55 ° C. for 30 seconds.
  • 17 sets (Table 3) and 16 sets (Table 4) with excellent PCR efficiency were selected, the former for Exicycler TM Quantitative Thermal Block (FIG. 1) and the latter for the 7500 Fast Real-Time PCR System.
  • Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction was performed again under the same conditions using (FIG. 2).
  • the numbers 1 to 17 of FIG. 2 and the numbers 2 to 16 of FIG. 3 represent a combination of primers and probes as shown in Tables 3 and 4, respectively.
  • the PCR amplification efficiency among the primers and probes was selected to be the highest (forward primer of SEQ ID NO: 1, reverse primer of SEQ ID NO: 4, reverse probe of SEQ ID NO: 13) and used in subsequent experiments. It was.
  • F forward primer
  • R reverse primer
  • Primer and probe and Exicycler TM Quantitative Thermal Block manufactured by Bioneer
  • 7500 Fast Real-Time PCR System using RNA prepared in Example 1 as a template and described in SEQ ID NOs: 1, 4, and 13 selected in Example 2 (Applied Biosystems, USA) was used to perform real time reverse transcription polymerase chain reaction.
  • Example 2 45 cycles of real-time reverse transcription polymerase chain reaction were carried out under the same conditions as in Example 2, and the internal positive control (IPC: Iinternal positive control) was used with Dvl-1 (mouse dishevelled segment polarity protein, manufactured by Bioneer).
  • the negative control (NTC) was a blank sample in which only the enterovirus template was replaced with DEPC distilled water.
  • template RNA was detected by the copy number according to the method of Example 1, and at least 10 copies were detected.
  • the slope was -3.21 to -3.73
  • the straight line was Sex R 2 values were 0.997 to 0.998 (FIGS. 3 to 6).
  • R 2 is a correlation coefficient showing the linearity of the graph when a standard graph of the real-time polymerase chain reaction is drawn, and the closer to 1 (the closer to the straight line), the PCR proceeded properly.
  • Enteroviruses poliovirus 1 (ATCC VR 1464, provided by Chungbuk National University Microbiology), Ecovirus 6 (ATCC VR-1044) using primers and probes described in SEQ ID NOs: 1, 4, and 13 prepared in Example 2 , Co., Ltd., Department of Microbiology, Chungbuk National University), Coxsackievirus A9 (ATCC VR-186, provided by Chungbuk National University) and Coxsaki Virus B5 (ATCC VR-185, Provided by the Department of Microbiology Chungbuk National University) were tested.
  • Virus RNA Accuprep ® Extracted with Viral RNA Extraction kit (manufactured by Bioeer) and Exicycler TM Real-time reverse transcription polymerase chain reaction was performed using the Quantitative Thermal Block and 7500 Fast Real-Time PCR System under the same conditions as in Example 2. This is When the primer and probe of the present invention is applied not only to the standard template of Example 3 but also to the actual sample, the same result is obtained. In addition, RNA was extracted from hepatitis A virus, not enterovirus, and real-time polymerase chain reaction was performed to examine whether cross-reaction with other viruses occurred.

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Abstract

본 발명은 엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 체액, 체조직, 환경 시료 등에서 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 방법에 비해 많은 종류의 엔테로바이러스를 저농도에서도 검출할 수 있어 광범위하게 이용될 수 있다.

Description

엔테로바이러스 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법
본 발명은 엔테로바이러스를 검출하는 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 엔테로바이러스 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 체액, 체조직, 환경 시료 등에서 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
엔테로바이러스는 장염과 관련된 바이러스로서 폴리오바이러스, 콕사키 바이러스, 에코바이러스, 기타 엔테로바이러스의 4 종류가 있다. 폴리오바이러스에는 3종, 에코바이러스에는 33종이 있으며 기타 엔테로바이러스에는 61종이 있다. 폴리오바이러스는 소아마비의 원인체로 잠복기간은 3~35일이며 15세 이하, 특히 1~3세 소아에서 많이 발생한다. 에코바이러스는 주로 1~4세 소아에 감염되어 무균성 수막염, 상부 호흡기 감염, 발진, 기타 열성 질환, 유아의 설사 등 다양한 질환을 유발한다. 콕사키바이러스는 다시 A군과 B군(A군에는 23종, B군에는 6종)으로 나뉘는데 다양한 질병을 일으키는 콕사키바이러스의 잠복기간은 2~9일로 콕사키A군 바이러스는 피부와 점막에 포진성 구협염과 수족구병을 일으키며, 콕사키B군 바이러스는 심장, 늑막, 췌장, 간 등에 다양한 질병을 일으켜 측흉통, 심근염, 심막염을 유발한다. A군과 B군은 모두 뇌막과 운동신경 단위에 영향을 미쳐 무균성 수막염과 마비를 일으킬 수 있다. 엔테로바이러스의 분류 중 '기타 엔테로바이러스'란 수많은 엔테로바이러스의 종류에 관한 분류의 편의를 위해, 1969년 이후 새로 분리된 균주에 대해 단순히 숫자만 부여한 것이다. 기타 엔테로바이러스 중 엔테로바이러스 71은 수막염을 일으키며 70은 급성 출혈성 결막염을 일으킨다.
엔테로바이러스는 분변-구강 경로를 통해 전파되고 엔테로바이러스에 의한 질병은 계절성을 띠고 있어 특히 여름에 많이 발병한다. 비록 대부분의 엔테로바이러스에 의한 감염은 증상이 나타나지 않고 스스로 치료가 되지만, 면역력이 약한 사람, 특히 어린이들에게 발병하면 집단성을 띠고 특효약이 없기 때문에 그 예방을 중요시하고 있다. 그런데, 폴리오바이러스에 대한 백신은 개발되어 있으나 폴리오바이러스를 제외한 다른 엔테로바이러스들에 관한 백신은 아직 개발되어 있지 않아 바이러스의 전파경로를 차단하는 것이 급선무가 되고 있다.
한편, 대부분의 엔테로바이러스가 인체에 감염된 후 스스로 치료가 된다고 하지만 엔테로바이러스에 의한 질병은 지금도 끊임없이 건강에 해를 끼치고 있고 엔테로바이러스에 의한 발병사례도 적지 않게 발표되고 있다. 예를 들면 일본에서는 콕사키바이러스에 의한 헤르팡기나(Takako Shima et.al. Enterovirus detection status of patients with herpangina and hand, foot and mouth disease in epidemic season 2007, Kanagawa)에 대해 보도하였고, WHO는 2008년 5월에 엔테로바이러스 71에 의한 질병으로 중국에서 4,496명이 발병하고 22명이 사망하였다고 보고하였으며, 국립보건연구원은 2006년 5월에 무균성 수막염 환자의 검체에서 에코바이러스 5와 에코바이러스 6을 확인하였다고 보고하였다. 이처럼 엔테로바이러스에 감염되어 발병하면 사망도 초래할 수 있고, 잠복기가 수일에서 수십일로서 집단적으로 발병하므로 무엇보다도 예방이 중요하며 발병의 확산을 방지하기 위하여서는 전파경로를 차단하는 것이 중요하다.
바이러스의 전파경로를 차단하기 위해서는 바이러스의 유무를 빠른 시간 내에 정확히 판별하는 것이 필요하다. 이런 필요성에 따라 엔테로바이러스 검출에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔으며 그 검출방법으로는 세포배양법(R.M.pinto et al., Appl. Environ. Microbiol., 1811-1813, Vol 62, No. 5, 1996)으로부터 시작하여 현재는 분자생물학적 방법인 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의한 방법이 실시되고 있다. 더 나아가 배양시간을 3~4일로 단축시키고 중합효소 연쇄반응의 단점인 활성이 없는 바이러스도 검출이 되는 점을 극복할 수 있는 세포배양연계 중합효소 연쇄반응법(Integrated Cell Culture-Polymerase chain reaction; ICC-PCR)이 개발되어 활발히 사용되어 왔다(Yoe-jin Choo et.al., The Journal of Microbiology, p.162-170, 2006). 그러나 모두 3~5일 정도의 시간을 소요하고 낮은 농도의 바이러스는 검출할 수 없는 단점을 갖고 있다. 근래에는 분자생물학의 발전에 따라 중합효소 연쇄반응을 기초로 한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응법(Real-Time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction; Real-Time RT PCR)을 사용함으로써, 바이러스 핵산이 증폭되는 과정에서 곧바로 바이러스 존재여부를 판단할 수 있게 되었다. 따라서, 일반 중합효소 연쇄반응을 진행한 후 젤 전기영동으로 바이러스 핵산 존재여부를 판단하여야 하는 번거로움을 극복할 수 있으며 민감도도 훨씬 높아, 낮은 농도의 바이러스도 검출해 낼 수 있는 장점이 있다(Uta Dierssen et al., JCV, vol 42, p58-64, 2008).
본 발명자들은 본 발명의 프라이머 및 탐침을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하여 낮은 농도로도 다양한 종류의 엔테로바이러스를 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다양한 엔테로바이러스를 제한없이 검출할 수 있는 새롭고 효율적인 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해
[1] 본 발명은 콕사키바이러스 A16 염기서열(Gen Bank accession no. U05876)의 일부 또는 그 상보적인 염기서열의 일부로 구성된 엔테로바이러스 검출용 프라이머를 제공한다.
[2] 본 발명은 상기 염기서열의 462 내지 649 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열로 구성된 엔테로바이러스 검출용 프라이머를 제공한다.
[3] 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔테로바이러스 검출용 프라이머를 제공한다.
[4] 본 발명은 콕사키바이러스 A16 염기서열(Gen Bank accession no. U05876)의 일부 또는 그 상보적인 염기서열의 일부로 구성된 엔테로바이러스 검출용 탐침을 제공한다.
[5] 본 발명은 상기 염기서열의 462 내지 649 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열로 구성된 엔테로바이러스 검출용 탐침을 제공한다.
[6] 본 발명은 서열번호 7 내지 17로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔테로바이러스 검출용 탐침을 제공한다.
[7] 본 발명은
1) 검체를 주형으로 상기 [1]의 프라이머 또는 상기 [4]의 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
2) 상기 단계 1의 증폭산물의 유무 및 증폭산물의 크기를 비교하는 단계를 포함하는 엔테로바이러스 검출방법을 제공한다.
[8] 본 발명은 상기 검체가 임상 시료 또는 환경 시료로부터 습득되는 것인 엔테로바이러스 검출방법을 제공한다.
[9] 본 발명은 상기 [1]의 프라이머 또는 상기 [4]의 탐침을 포함하는 엔테로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
[10] 본 발명은 상기 프라이머가 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 탐침은 서열번호 7 내지 17로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔테로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응 또는 일반적인 중합효소 연쇄반응을 통해 엔테로바이러스를 검출하는데 필요한 프라이머 및 탐침을 제공한다.
본 발명의 실시간 중합효소 연쇄반응은 프라이머와 형광물질이 화학적으로 결합하여 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써 반응 결과를 실시간으로 모니터한다. 이 탐침은 중합효소 연쇄반응 과정에서 두 개의 프라이머와 같이 검체의 핵산에 있는 상보서열에 결합하게 되는데 위치는 프라이머에서 약간 떨어진 부분이다. 본 발명의 탐침은 양끝에 리포터(reporter)와 소광제(quencher)라는 형광물질이 붙어 있는 구조로서 리포터와 소광제가 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나, 증폭이 진행됨에 따라 리포터가 소광제로부터 떨어지면 리포터의 형광이 감지되는 것이다. 따라서, 형광의 강도는 증폭사이클이 증가함에 따라 점점 증가하게 된다.
본 발명의 프라이머 및 탐침은 콕사키바이러스 A16 염기서열(GenBank accession no. U05876)의 일부 또는 그 상보적 염기서열의 일부를 포함하는 것으로서, 바람직하게는 상기 염기서열의 462 내지 649 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열로 구성되고, 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 3으로 기재되는 염기서열인 정방향 프라이머 및 서열번호 4 내지 6으로 기재되는 염기서열인 역방향 프라이머이다. 또한, 탐침은 11개이며 그 중 4개(서열번호 7 내지 10)는 정방향 탐침이고, 나머지 7개(서열번호 11 내지 17)는 역방향 탐침이다.
상기 프라이머 및 탐침들은 프라이머 2개(정방향 1개, 역방향 1개) 탐침 1개의 구성이면 임의의 조합이 가능하나, 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머 및 서열번호 13으로 기재되는 역방향 탐침을 사용할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 실시간 중합효소 연쇄반응 뿐 아니라 일반적인 중합효소 연쇄반응에도 사용될 수 있다. 탐침의 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 소광제는 BHQ1(butylhydroquinone-1)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용하여 본 발명의 프라이머(서열번호 1 및 4) 및 탐침(서열번호 13)과 동시에 100% 매치(match)되는 유전자를 검색한 결과, 67종의 엔테로바이러스가 검색되었으며 이는 다음과 같다.
표 1
바이러스 종류 번호
콕사키바이러스 A군 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24
콕사키바이러스 B군 1, 2, 3, 4, 5
에코바이러스 3, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 30, 32, AMS573
폴리오바이러스 1, 2, 3
기타 엔테로바이러스 46, 69, 71, 74, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 84, 87, 88, 91, 94, 97, 100, 101, B, yanbian96-83csf, yanbian96-85csf, 5666/sin/002109, 5865/sin/000009
이는 본 발명의 프라이머 및 탐침이 콕사키 바이러스 A16의 유전자 서열을 기초로 만들어졌을지라도 상기 엔테로바이러스 유전자의 보존서열(conserved sequence) 내의 서열로 이루어졌기 때문에 상기 엔테로바이러스의 유전자와 100% 매치되는 부분이 있는 것이다. 상기에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 탐침을 이용하면 67종의 엔테로바이러스의 검출이 가능하므로 현재로써는 가장 많은 종류의 엔테로바이러스를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 검체를 주형으로 상기 프라이머 또는 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
2) 상기 단계 1의 증폭산물의 유무 및 증폭산물의 크기를 비교하는 단계를 포함하는 엔테로바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 검출방법에 의하면, 민감도가 높아 매우 적은 양의 엔테로바이러스 핵산이 시료 내에 존재하더라도 바이러스를 검출할 수 있으며 특히 실시간 중합효소 연쇄반응의 경우 증폭이 진행되는 동안 곧바로 증폭여부를 관찰할 수 있고 별도의 증폭산물 확인단계가 필요하지 않다.
아울러, 본 발명은 상기 프라이머 또는 탐침을 포함하는 엔테로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 본 발명의 프라이머 또는 탐침 외에 증폭용 완충용액, dNTP, 대조군, 검출 시약 등을 포함하며, 반응에 영향이 없는 한 목적에 따라 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머, 탐침 및 검출방법을 사용하면, 기존에 검출할 수 있는 종류가 제한적이었던 엔테로바이러스를 훨씬 다양한 종류에 대해 낮은 농도에서도 간편하게 검출할 수 있다.
도 1은 서열번호 1 내지 17로 기재되는 본 발명의 프라이머 및 탐침의 모든 조합으로 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block 기기를 사용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과를 보고, PCR 효율이 좋은 세트 17개를 선별하여 다시 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 서열번호 1 내지 17로 기재되는 본 발명의 프라이머 및 탐침의 모든 조합으로 ABI7500 fast system을 사용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과를 보고, PCR 효율이 좋은 세트 16개를 선별하여 다시 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시간 중합효소 연쇄반응기기 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block를 사용한 엔테로바이러스의 표준 주형의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 그래프를 나타낸다(각 곡선은 10 ~107 카피, IPC(Internal Positive Control)은 Dvl-1이며, NTC는 음성대조군으로서 공시료를 나타낸다).
도 4는 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용한 엔테로바이러스의 표준 주형 그래프의 표준 곡선을 나타낸다(기울기: -0.3261, R2: 0.9999).
도 5는 실시간 중합효소 연쇄반응기기 ABI7500 fast system을 사용한 엔테로바이러스의 표준 주형의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 그래프를 나타낸다(각 곡선은 10~106 카피).
도 6은 ABI7500 fast system을 사용하였을 때의 엔테로바이러스의 표준 주형 그래프의 표준 곡선을 나타낸다(기울기: -3.7326이고 R2는 0.9976).
도 7은 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 본 발명의 엔테로바이러스 프라이머 및 탐침으로 폴리오바이러스 1(PV1), 에코바이러스 6(echo6), 콕사키바이러스 A9(coxA9), 콕사키바이러스 B5(coxB5) 및 A형 간염바이러스(HAV)를 검출한 결과 그래프를 나타낸다.
도 8은 ABI7500 fast system을 사용하여 상기의 바이러스를 검출한 결과 그래프를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.
<실시예 1> 주형 RNA 제조
이후에 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해, 먼저 주형 RNA를 제조하였다. 구체적으로 콕사키바이러스 A16(accession no. U05876)의 301~683(383 bp) 부분을 유전자 합성방법(NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203)으로 합성하고 그 중 일부를 pGEM-T-Easy Vector(Cat: A1360, Promega사제, 미국)에 클로닝하였다. 구체적으로 2X rapid ligation buffer(Promega사제, 미국) 5 ㎕, T-Easy Vector(Promega사제, 미국) 1 ㎕, T4 DNA ligase 1 ㎕(Promega사제, 미국), 합성된 유전자 3 ㎕(8 ng)를 동일한 튜브에 넣어 혼합한 다음 37℃에서 1시간 정온배치하였다. 그 후, E. coli 만능세포(competent cell) 50 ㎕에 상기의 정온배치한 반응액 5 ㎕을 넣고 얼음 상에 40분간 놓아둔 뒤 42℃에서 40초 배양하고 다시 얼음 상에 2분 놓아두었다. 앰피실린, IPTG, X-Gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하였다.
색이 흰 콜로니를 취하여 LB 액체 배지에서 16시간 정도 배양한 후 원심분리하여 상층액은 버리고 Accuprep 　plasmid DNA prep kit(Bioneer사제, 한국)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu사제, 일본)로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8~2.0 사이인 것을 확인하고 MAXIscipt　In vitro transcription Kit(Ambion사제, 미국)를 사용하여 플라스미드 DNA를 RNA로 전사시켰다. 전사 후 UV 분광계로 농도와 순도를 측정하여 순도가 1.8~2.0 사이에 있으면 이후의 실시간 중합효소 연쇄반응에서 주형 RNA로 사용하였다. RNA 카피수(copy number)는 아래의 공식에 의하여 계산하였다.
6.02×1023× 농도(UV 분광계로 측정된 농도 g/ml)/(3015+383)× 340
[3015 bp: T-easy vector의 크기, 383 bp: 엔테로바이러스 주형 RNA의 크기]
주형 RNA의 카피수를 계산한 다음 1X TE buffer(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)로 10진 희석하여 사용시까지 -70℃에 보관하였다.
<실시예 2> 프라이머 및 탐침 디자인
콕사키바이러스 A16(NCBI accession no. U05876)의 염기서열 462 부터 649 사이에서 길이는 18~22 bp, Tm 값은 55℃ 내지 62℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머로 하였다. 또한, 염기서열 462 부터 649 사이에서 길이는 20~30 bp 사이, Tm 값은 67~72℃ 사이에서 임의로 염기서열을 선택하여 탐침으로 하였고 Tm 값은 Primer3Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다. 모든 프라이머와 모든 탐침을 세트로 조합하여(표 2) ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(Bioneer사제) 및 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems사제, 미국)을 각각 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 구체적으로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 각각 10pmol, 탐침 5pmol, 10X RT Buffer 2㎕, Taq polymerase 1U, MMLV RTase 350U(이상 Bioneer사제), dNTP 20mM, DTT 50mM, RNasin 15U 및 DEPC(Diethylpyrocarbonate) 증류수를 넣고 혼합한 후 1 웰당 19㎕가 되도록하여 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이 때 주형 RNA는 실시예 1에서 101~107까지의 배율로 희석한 것을 각각 1㎕씩 사용하여 최종 총 용량이 20㎕가 되도록 하였다. 또한, 탐침은 5’부위에 FAM 형광, 3’부위에는 BHQ1이 부착되도록 주문제작(Bioneer사제)하여 사용하였다.
이를 45℃에서 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 10초, 55℃에서 30초씩 40 사이클을 반응시켰다. 반응결과 PCR 효율이 우수한 17개 세트(표 3) 및 16개 세트(표 4)를 선택하고, 각각에 대해 전자는 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(도 1)을, 후자는 7500 Fast Real-Time PCR System(도 2)를 이용하여 같은 조건으로 다시 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 도 2의 1 내지 17의 숫자와 도 3의 2 내지 16의 숫자는 각각 하기 표 3 및 표 4와 같은 프라이머 및 탐침의 조합을 나타낸다.
실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 결과, 상기 프라이머 및 탐침 중 PCR 증폭효율이 가장 높은 것(서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 역방향 탐침)을 선택하여 이후의 실험에 사용하였다.
표에서 F는 정방향(forward) 프라이머 R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 나타낸다.
표 2
F-탐침 1 F-탐침 2 F-탐침 3 F-탐침 4 R-탐침 1 R-탐침 2
F1, R1 F1, R1 F1, R1 F1, R1 F1, R1 F1, R1
F2, R1 F2, R1 F2, R1 F2, R1 F2, R1 F2, R1
F3, R1 F3, R1 F3, R1 F3, R1 F3, R1 F3, R1
F1, R2 F1, R2 F1, R2 F1, R2 F1, R2 F1, R2
F2, R2 F2, R2 F2, R2 F2, R2 F2, R2 F2, R2
F3, R2 F3, R2 F3, R2 F3, R2 F3, R2 F3, R2
F1, R3 F1, R3 F1, R3 F1, R3 F1, R3 F1, R3
F2, R3 F2, R3 F2, R3 F2, R3 F2, R3 F2, R3
F3, R3 F3, R3 F3, R3 F3, R3 F3, R3 F3, R3
R-탐침 3 R-탐침 4 R-탐침 5 R-탐침 6 R-탐침 7
F1, R1 F1, R1 F1, R1 F1, R1 F1, R1
F2, R1 F2, R1 F2, R1 F2, R1 F2, R1
F3, R1 F3, R1 F3, R1 F3, R1 F3, R1
F1, R2 F1, R2 F1, R2 F1, R2 F1, R2
F2, R2 F2, R2 F2, R2 F2, R2 F2, R2
F3, R2 F3, R2 F3, R2 F3, R2 F3, R2
F1, R3 F1, R3 F1, R3 F1, R3 F1, R3
F2, R3 F2, R3 F2, R3 F2, R3 F2, R3
F3, R3 F3, R3 F3, R3 F3, R3 F3, R3
표 3
1 F1, R1, R-탐침 3 10 F1, R1, F-탐침 3
2 F2, R1, R-탐침 3 11 F2, R1, F-탐침 3
3 F1, R1, R-탐침 2 12 F2, R1, F-탐침 4
4 F1, R1, R-탐침 1 13 F1, R1, F-탐침 2
5 F2, R1, R-탐침 5 14 F2, R1, F-탐침 2
6 F1, R1, R-탐침 4 15 F1, R1, F-탐침 4
7 F1, R1, R-탐침 6 16 F2, R1, R-탐침 6
8 F1, R1, R-탐침 5 17 F2, R1, R-탐침 1
9 F2, R1, R-탐침 4
표 4
1 F1, R1, R-탐침 3 9 F2, R1, R-탐침 4
2 F2, R1, R-탐침 3 10 F1, R1, F-탐침 3
3 F1, R1, R-탐침 2 11 F2, R1, F-탐침 3
4 F1, R1, R-탐침 1 12 F2, R1, F-탐침 4
5 F2, R1, R-탐침 5 13 F1, R1, F-탐침 2
6 F1, R1, R-탐침 4 14 F2, R1, F-탐침 2
7 F1, R1, R-탐침 6 15 F1, R1, F-탐침 4
8 F1, R1, R-탐침 5 16 F2, R1, R-탐침 6
<실시예 3> 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 1에서 제작한 RNA를 주형으로 하고 상기 실시예 2에서 선택된 서열번호 1, 4, 및 13으로 기재되는 프라이머 및 탐침 및 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(Bioneer사제) 및 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems사제, 미국)을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실행하였다.
상기 실시예 2와 동일한 조건으로 45 사이클의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였고, 내부 양성 대조군(IPC: Iinternal positive control)은 Dvl-1(mouse dishevelled segment polarity protein, Bioneer사제)을 사용하였고, 음성대조군(NTC: negative control)은 엔테로바이러스 주형만 DEPC 증류수로 대체한 공시료를 사용하였다.
그 결과, 실시예 1의 방법대로 카피수를 계산하여 주형 RNA는 최저 10 카피까지 검출이 가능하였고, 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성한 경우, 기울기는 -3.21 ~ -3.73, 직선성 R2 값은 0.997~0.998이었다(도 3 내지 도 6). R2은 실시간 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 그렸을 때 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로, 1에 가까울수록(직선에 가까울수록) PCR이 제대로 진행되었음을 의미한다.
<실시예 4> 엔테로바이러스 및 A형 간염바이러스 검출 실험
상기 실시예 2에서 제작한 서열번호 1, 4, 및 13으로 기재되는 프라이머 및 탐침을 이용하여 엔테로바이러스인 폴리오바이러스 1(ATCC VR 1464, 충북대학교 미생물학과 제공), 에코바이러스 6(ATCC VR-1044, 충북대학교 미생물학과 제공), 콕사키바이러스 A9(ATCC VR-186, 충북대학교 미생물학과 제공), 콕사키바이러스 B5(ATCC VR-185, 충북대학교 미생물학과 제공)에 대해 검출시험을 하였다. 바이러스의 RNA는 Accuprep®Viral RNA Extraction kit(Bioneer사제)로 추출하고 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block 및 7500 Fast Real-Time PCR System을 이용하여 실시예 2와 같은 조건으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 이는 본 발명의 프라이머 및 탐침을 상기 실시예 3의 표준 주형 뿐 아니라 실제 검체에 적용하였을 때에도 동일한 결과가 나오는지 확인하기 위한 것이다. 이와 더불어, 엔테로바이러스가 아닌 A형 간염 바이러스의 RNA를 추출하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행함으로써 다른 바이러스에 대해 교차반응이 일어나는지도 알아보았다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 탐침으로 상기의 모든 바이러스를 검출할 수 있었고, 교차반응도 일어나지 않음을 확인하였다(도 7 및 도 8).
서열목록 참조

Claims (10)

  1. 콕사키바이러스 A16 염기서열(Gen Bank accession no. U05876)의 일부 또는 그 상보적인 염기서열의 일부로 구성된 엔테로바이러스 검출용 프라이머.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 염기서열의 462 내지 649 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열로 구성된 엔테로바이러스 검출용 프라이머.
  3. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 1 내지 6으로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔테로바이러스 검출용 프라이머.
  4. 콕사키바이러스 A16 염기서열(Gen Bank accession no. U05876)의 일부 또는 그 상보적인 염기서열의 일부로 구성된 엔테로바이러스 검출용 탐침.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 염기서열의 462 내지 649 번째 염기 내의 5 내지 40 개의 염기서열로 구성된 엔테로바이러스 검출용 탐침.
  6. 청구항 4에 있어서,
    서열번호 7 내지 17로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔테로바이러스 검출용 탐침.
  7. 1) 검체를 주형으로 청구항 1의 프라이머 또는 청구항 4의 탐침을 사용하여 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1의 증폭산물의 유무 및 증폭산물의 크기를 비교하는 단계를 포함하는 엔테로바이러스 검출방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 검체는 임상 시료 또는 환경 시료로부터 습득되는 것인 엔테로바이러스 검출방법.
  9. 청구항 1의 프라이머 또는 청구항 4의 탐침을 포함하는 엔테로바이러스 검출용 키트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6으로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 탐침은 서열번호 7 내지 17로 기재되는 염기서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔테로바이러스 검출용 키트.
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