CN104059996A - 同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229e和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法 - Google Patents

同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229e和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括各病原体的特异性引物、各病原体的基因探针。本发明的上述可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。

Description

同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，具体涉及一种同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法。
背景技术
流感的某些病状多是由于副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒中的一种或者几种共同感染引起，比如在所有病原体感染的呼吸道疾病中1.9％感染了多种细菌类病原体，2.1％感染了多种病毒类病原体，15.2％共感染了细菌和病毒类病原体。而现有的对于引起上述病状病原的检测多采用两种：1)通过组织培养：对细胞中的病毒或直接检测存在于呼吸道分泌物中的病毒进行分离提取，使用免疫荧光实验、PCR、酶联免疫反应测定等方法进行逐一检测；2)针对病菌感染后检测在血清中产生的IgG特异性抗体或检测单一血清标本中特异性抗体IgM，通过特异性抗体的结果便逆推特异性的病原的类型。
上述检测方法，一次只能检测一种病原体，通过重复多次实现所有病原体的检测。临床上，引起感染症状的病原体可能多达几十种，如果采用传统的方法，则要进行几十个PCR反应，工作量巨大，耗时较长，很可能会耽误控制疾病蔓延的时机。所以，为了节约成本的需要，一种准确有效的能同时检查多种疾病的技术的出现，变得非常必要。2006年旅美华人韩健博士发明了Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR，靶序列富集多重PCR技术)能在一次反应中对多重靶序列进行高灵敏度和特异性的扩增和检测，为MDD(molecular differential diagnoses，分子鉴别诊断)带来革命性的变化。其利用多色荧光检测是通过对不同靶特异的检测探针标记不同波长的荧光基团，使不同的探针实现彼此的区分，从而根据实时PCR各探针荧光信号的升起的情况对不同靶的进行检测，从而通过这一技术实现多种病原体的同时检测。但是，在实施中PCR仪中可检测的单色荧光通道数目毕竟有限，最多可以有3-5个，因此在使用中无 法满足一次进行更多种病原体的同时检测。而且进一步地Tem-PCR仍有一些不足之处，比如在实施过程中，当几种荧光标记共同混合时产生敏感性低于real-time PCR，扩增时间较传统PCR长，检测时打开PCR反应管造成实验室污染和假阳性的可能，以及靶基因的扩增和检测尚未一体化等。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种在不增加单色荧光管通道下，能够快速、高灵敏度地同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括：
副流感病毒1型上游引物5’-GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA-3’；
副流感病毒1型下游引物5’-CCTACGGGACATCTCCAGAA-3’；
副流感病毒2型上游引物5’-ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC-3’；
副流感病毒2型下游引物5’-TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT-3’；
副流感病毒3型上游引物5’-TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC-3’；
副流感病毒3型下游引物5’-ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT-3’；
副流感病毒4型上游引物5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；
副流感病毒4型下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；
冠状病毒229E上游引物5’-ATGGCTACAGTCAAATGGGC-3’；
冠状病毒229E下游引物5’-CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA-3’；
鼻病毒上游引物5’-TGGACAGGGTGTAAAGAGC-3’；
鼻病毒下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；
病原体基因探针包括：
副流感病毒1型基因探针
5’-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-3’；
副流感病毒2型基因探针
5’-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3’；
副流感病毒3型基因探针5’-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’；
副流感病毒4型基因探针
5’-ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT-3’；
冠状病毒229E基因探针
5’-CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3’；
鼻病毒基因探针5’-TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3’。
本发明的上述可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
本发明进一步还提出一种利用可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒进行病原体检测方法，包括如下步骤：
提取病患标样中的病原体核酸；
将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；
将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基因探针标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相同；
将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系；
将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。
采用本发明的可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，以试剂盒为基础，采用荧光对探针进行多色组合探针编码，替代现有的单色荧光标记探针方法，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目；然后进一步在检测过程中用特异性引物同源加尾通用引物形成加尾引物进行RT-PCR反应，且特异性引物设计其两端存在互补tag序列，因此引物的各单链两端互补会各自形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的进行成为通用引物扩增的模板，从而大大的降低了引物二聚体的产生；提升了反应效率，也使得用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例阳性对照检测中六重荧光标记的RT-PCR扩增曲线；
图2为本发明实施例阳性对照检测中副流感病毒1型随PCR循环的扩增曲线；
图3为阳性对照检测中副流感病毒1型随PCR循环的扩增的标准曲线；
图4为本发明实施例阳性对照检测中副流感病毒2型随PCR循环的扩增曲线；
图5为阳性对照检测中副流感病毒2型随PCR循环的扩增的标准曲线；
图6为本发明实施例阳性对照检测中副流感病毒3型随PCR循环的扩增曲线；
图7为阳性对照检测中副流感病毒3型随PCR循环的扩增的标准曲线；
图8为本发明实施例阳性对照检测中副流感病毒4型随PCR循环的扩增曲线；
图9为阳性对照检测中副流感病毒4型随PCR循环的扩增的标准曲线；
图10为本发明实施例阳性对照检测中冠状病毒229E随PCR循环的扩增曲线；
图11为阳性对照检测中冠状病毒229E随PCR循环的扩增的标准曲线；
图12为本发明实施例阳性对照检测中鼻病毒病原体随PCR循环的扩增曲线；
图13为阳性对照检测中鼻病毒随PCR循环的扩增的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实例提供了一种同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括阳性对照、荧光标记物、buffer缓冲液、病原体特异性引物、病原体基因探针：
其中，阳性对照为：连有副流感病毒1型基因片段的大肠杆菌、连有副流感病毒2型基因片段的大肠杆菌、连有副流感病毒3型基因片段的大肠杆菌、连有副流感病毒4型基因片段的大肠杆菌、连有冠状病毒229型基因片段的大肠杆菌、连有鼻病毒基因片段的大肠杆菌。
病原体特异性引物为根据副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒特异性设计的RT-PCR引物，包括：
副流感病毒1型特异性引物
上游引物：GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA(5’-3’)；
下游引物：CCTACGGGACATCTCCAGAA(5’-3’)；
副流感病毒2型特异性引物
上游引物：ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC(5’-3’)；
下游引物：TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT(5’-3’)；
副流感病毒3型特异性引物
上游引物：TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC(5’-3’)；
下游引物：ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT(5’-3’)；
副流感病毒4型特异性引物
上游引物：CCTGGAGTCCCATCAAAAGT(5’-3’)；
下游引物：GCATCTATACGAACACCTGCT(5’-3’)；
冠状病毒229E特异性引物
上游引物：ATGGCTACAGTCAAATGGGC(5’-3’)；
下游引物：CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA(5’-3’)；
鼻病毒特异性引物
上游引物：TGGACAGGGTGTAAAGAGC(5’-3’)；
下游引物：GCATCTATACGAACACCTGCT(5’-3’)；
病原体基因探针包括：
副流感病毒1型基因探针
5’-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-3’；
副流感病毒2型基因探针
5’-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3’；
副流感病毒3型基因探针5’-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’；
副流感病毒4型基因探针
5’-ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT-3’；
冠状病毒229E基因探针
5’-CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3’；
鼻病毒基因探针5’-TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3’。
采用本发明的试剂盒，在进行检测过程中可以利用多色组合探针编码(Multicolor Recombination Probe Coding，MCPC)技术的基本原理，将靶特异的检测探针用不同的荧光组合进行标记，使其获得一个独特编码，不同编码的探针可以置于同一反应管，通过实时PCR给出的编码探针信号进行靶的检测。
其中上述副流感病毒4型基因探针，相比其它特异性的探针，将荧光淬灭基团标记于5’往3’端方向的第15个“T”碱基位置；因为在荧光标记中5’用于标记荧光报告基团，而副流感病毒4型基因探针的寡核苷酸序列长度大大超出一般的探针序列长度，如果进一步将荧光淬灭基团标记于3’会由于距离长导致荧光淬灭集团无法抑制5’的荧光报告基团发出的荧光，从而使结果被误认为是产生了新的复制链，因此，将荧光淬灭基团标记于第15个“T”碱基位置；同时，将3’端用磷酸封闭，防止3’之后持续引导基因链的复制。
特异性引物在使用中用通用引物进行同源加尾，使上游引物和下游引物分别加上相同的标签，然后进行PCR反应。原本在HAND系统进行PCR反应时，不同的引物用通用引物加尾之后容易形成引物二聚体，使不同的荧光探针无法继续保持较高的扩增效率。但是本发明中特异性引物设计时其两端存在互补tag序列，因此引物的各单链两端互补会各自形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的进行成为通用引物扩增的模板，从而大大的降低了引物二聚体的产生。因此有效抑制引物二聚体的机制，使得多色组合探针编码体系能保持较高的扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
本发明上述试剂盒进行检测，荧光标记物中的荧光报告基团包括FAM，HEX，JOE，ROX和CYS中的一种或者多种；在本发明中除了特异性的引物和探针的设计之外，检测中采用荧光对探针进行多色组合探针编码，目的是在荧光的种类不增加的情况下，提高可以在检测中识别的标记探针的种类；其原理是将靶特异的检测探针用不同的荧光报告基团组合进行标记，使其获得一个 独特编码，不同编码的探针可以置于同一反应管，荧光所标记的探针便可以进行区分。因为若将每种荧光看成基本元素，通过相互组合可以形成多种不同的类型，例如，有A、B和C三种元素，可以分别构成A、B、C、A+B、A+C、B+C、A+B+C共七种组合，依据数学上的组合规则，对于n种荧光基本元素，总共可以得到N＝Cn 1+Cn 2+…+Cn n＝∑Cn i，(i＝1～n)＝2n-1种荧光组合。其中的任何一种荧光组合都可以标记一种靶特异的检测探针，若以一二进制进行编码，就可以得到N种具有不同编码的荧光探针，故就可以检测N种不同的靶序列。
因此在本发明中如果采用上述五种荧光报告基团中的四种如FAM、HEX、ROX和CYS时，如果用现有的单色荧光标记探针方法，仅可以标记C4 1＝4种探针，每种探针可以检测一种靶序列；当用两种基本荧光元素组合进行探针标记时，具有FAM+HEX，FAM+ROX，FAM+CYS，HEX+ROX，HEX+CYS和ROX+CYS共C4 2＝6种不同的荧光组合，故可以编码6种探针，就可以区分6种靶序列。依次类推，因此采用四种荧光元素进行探针标记编码时，共可以编码15种探针，实现区分15种靶序列。而目前的实时PCR都是采用单色荧光标记探针的模式，故能标记的探针的数量只占组合编码的其中一项即CN 1。本发明的多色组合探针编码用荧光组合标记探针来代替传统的单色荧光标记探针，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目。当然，在上述荧光标记物中，在实时荧光PCR过程中，还需要在引物的末端标记与荧光报告基团配合的荧光淬灭基团，用于抑制荧光报告基团发出的荧光信号，其中荧光淬灭基团的选择可以采用现有的淬灭基团即可实现。
本发明的上述同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
在上述实施方式中，阳性对照中采用的大肠杆菌其目的是作为目的病原体的目的靶基因的片段的载体，大肠杆菌趋于获得便易性、酶切位点成熟、拷贝数比较多，因此在本发明中优选在阳性对照组中采用大肠杆菌作为载体；当然，在实施也可以采用其他的载体进行，只要能实现相同的目的即可。而且，基于一般对于检测的特异性的准确度，上述靶基因一般选择为病原体的保守基因进 行。
进一步地，本发明进一步提出采用上述同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒进行病原体检测方法，可以参考如下步骤进行：
S10，采集待测标样(如患者的咽拭子、痰液、部分组织液、患处组织细胞等)；
S20，提取病患标样中的病原体核酸；
S30，将病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；
S40，用荧光标记物中的一种或者多种混合，对副流感病毒1型基因探针、副流感病毒2型基因探针、副流感病毒3型基因探针、副流感病毒4型基因探针、冠状病毒229E基因探针和鼻病毒基因探针进行多色组合探针编码，并且使不同病原体基因探针的荧光标记不相同；
S50，用加尾后的流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒特异性引物，以及标记后的荧光探针与病原体核酸组成RT-PCR反应系进行RT-PCR扩增；其中控制条件可以参考下述：
42℃下反应10min；
95℃下反应10s；
40次循环：95℃下变性5s、然后60℃下退火1min。
S60、在RT-PCR过程中，检测荧光的变化量，并对扩增结果进行检测。
在上述步骤S10中，基于本发明试剂盒的主要用于离体检测的目的，待测标样选择的是病患的离体组织(比如咽拭子、痰液、或者患处的组织细胞等)；当然，出于本发明的试剂盒所能实现的功能，所检测的待测标样也可以拓展到类似的食品检疫等领域，需要进行检疫的食品的标样也可；只要是功能和目的相同，均可以采用本发明的试剂盒和检测方法进行实施，并不仅仅限定于辅助疾病的检测。
在步骤S50中，其原理过程基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术，在RT-PCR过程中除了本发明上述所需要用到的物质成分之外，还需要添加各种反应的酶液、通用引物、缓冲液等等。而在这一步骤中利用Takara One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)在ABI Viia7构建六重荧光RT-PCR体系，通过调整体系内各组分的浓度以及反应条件，使RT-PCR扩增曲线更好，并监控荧光的变化；RT-PCR扩增体系中个组分的终浓度参考如下：
1×buffer缓冲液；副流感病毒1型上游引物0.4μM；副流感病毒1型下游引物0.4μM；副流感病毒2型上游引物0.4μM；副流感病毒2型下游引物0.4μM；副流感病毒3型上游引物0.4μM；副流感病毒3型下游引物0.4μM；副流感病毒4型上游引物0.4μM；副流感病毒4型下游引物0.4μM；冠状病毒229E上游引物0.4μM；冠状病毒229E下游引物0.4μM；鼻病毒上游引物0.4μM；鼻病毒下游引物0.4μM；副流感病毒1型基因探针0.2μM；副流感病毒2型基因探针0.2μM；副流感病毒3型基因探针0.2μM；副流感病毒4型基因探针0.2μM；冠状病毒229E基因探针0.2μM；鼻病毒基因探针0.2μM。最后控制RNA为0.5uL。这里的RNA可以是患者的细胞中提取的RNA、或者是阳性对照的标准RNA样本、或者阴性对照的标准RNA样本。
将体系内的各物质浓度调整至上述浓度后，进行RT-PCR并检测随着循环数Ct的增加荧光标记探针所标记的病原体的荧光变化量，可以采用在ABI Viia7中构建六重荧光RT-PCR体系，采用单管对副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、冠状病毒229E和鼻病毒进行六重荧光分析。在实施过程中本发明中选用荧光标记的基本元素可以选择上述五种荧光标记物或者任意组合中，对6种病原体一一对应进行特异性标记；RT-PCR完成后进行灵敏度及扩增效率测定，步骤可以进一步包括：
S100，采用质粒作为基因运载体，与从扩增产物中提取的病原体核酸进行重组，获取重组质粒；
S200，用SalⅠ内切酶使病原体重组质粒线性化；
S300，对线性化处理后得到的线性病原体基因，进行体外转录，并搜集转录后的RNA；
S400，用BioPhotometer(Eppendorf，Hamburg，Germany)在260nm波长下测定各病原体的RNA浓度，并通过公式Copies＝(RNA ng数×10-9×6.02×1023)/(RNA碱基数×345)计算各病原体的拷贝数；
S500，将副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、冠状病毒229E和鼻病毒的RNA用缓冲液按照10倍稀释梯度稀释至105-102，对每个稀释度RNA按构建的体系作3个重复，做标准曲线并计算扩增效率和变异系数。
为了使本发明的试剂盒产品和测量方法更加的利于理解，并且使采用本发 明试剂盒产品和检测方法的优点更加明确，以下通过多个实施例进行举例说明：
实施例1
本发明同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括，
阳性对照：连有副流感病毒1型基因片段的大肠杆菌、连有副流感病毒2型基因片段的大肠杆菌、连有副流感病毒3型基因片段的大肠杆菌、连有副流感病毒4型基因片段的大肠杆菌、连有冠状病毒229型基因片段的大肠杆菌、连有鼻病毒基因片段的大肠杆菌。
病原体特异性引物：
副流感病毒1型特异性引物
上游引物：GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA(5’-3’)；
下游引物：CCTACGGGACATCTCCAGAA(5’-3’)；
副流感病毒2型特异性引物
上游引物：ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC(5’-3’)；
下游引物：TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT(5’-3’)；
副流感病毒3型特异性引物
上游引物：TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC(5’-3’)；
下游引物：ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT(5’-3’)；
副流感病毒4型特异性引物
上游引物：CCTGGAGTCCCATCAAAAGT(5’-3’)；
下游引物：GCATCTATACGAACACCTGCT(5’-3’)；
冠状病毒229E特异性引物
上游引物：ATGGCTACAGTCAAATGGGC(5’-3’)；
下游引物：CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA(5’-3’)；
鼻病毒特异性引物
上游引物：TGGACAGGGTGTAAAGAGC(5’-3’)；
下游引物：GCATCTATACGAACACCTGCT(5’-3’)；
病原体基因探针：
副流感病毒1型基因探针
5’-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-3’；
副流感病毒2型基因探针
5’-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3’；
副流感病毒3型基因探针5’-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’；
副流感病毒4型基因探针
5’-ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT-3’；
冠状病毒229E基因探针
5’-CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3’；
鼻病毒基因探针5’-TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3’。
荧光标记物：HEX、ROX、FAM、JOE这四种荧光标记基团，以及对应的荧光淬灭集团；
buffer缓冲液；
RT-PCR中所需的反应酶液。
用这一试剂盒中的阳性对照的标准样品做标准性测试，参考如下步骤：
S10，取标准阳性对照的菌液5ul；
S20，提取阳性对照菌液中病原体的RNA；在这一步骤中，可以采用实验室中常用的TROzlo法进行；
S30，采用通用引物对副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的特异性引物进行同源加尾；
S40，用多色组合探针编码方式对副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的基因探针进行标记，具体可以参考如下：
副流感病毒1型基因探针5’端用JOE荧光基团标记，3’端上标记对应的荧光淬灭集团；副流感病毒2型基因探针5’端用ROX荧光基团标记，3’端上标记对应的荧光淬灭集团；副流感病毒3型基因探针5’端用FAM荧光基团标记，3’端上标记对应的荧光淬灭集团；副流感病毒4型基因探针5’端用FAM和JOE两种荧光基团共同标记，5’端往3’端方向的第十五个碱基“T”碱基上上标记对应的荧光淬灭集团；冠状病毒229E基因探针5’端用FAM和ROX两种荧光基团共同标记，3’端上标记对应的荧光淬灭集团；鼻病毒基因探针5’端用ROX和JOE两种荧光基团共同标记，3’端上标记对应的荧光淬灭集团；标记后的基因探针如下：
副流感病毒1型基因探针
5’-JOE-AGG AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-ECLIPSE-3’；
副流感病毒2型基因探针
5’-ROX-AGC TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-ECLIPSE-3’；
副流感病毒3型基因探针5’-FAM-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’-MGB；
副流感病毒4型基因探针
5’-FAM/JOE-ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT-3’，5’端往3’端方向的第十五个碱基“T”碱基上标记对应的荧光淬灭集团，且3’用磷酸封闭；
冠状病毒229E基因探针
5’-FAM/ROX-CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-ECLIPSE-3’；
鼻病毒基因探针5’-ROX/JOE-TCC TCC GGC CCC TGA ATG-ECLIPSE-3’。
S50，将所提取的阳性对照的RNA、加尾后的副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的特异性引物，上述标记后的基因探针于Takara One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)在ABI Viia7构建六重荧光RT-PCR体系；并控制浓度如下：
1×buffer缓冲液；副流感病毒1型上游引物0.4μM；副流感病毒1型下游引物0.4μM；副流感病毒2型上游引物0.4μM；副流感病毒2型下游引物0.4μM；副流感病毒3型上游引物0.4μM；副流感病毒3型下游引物0.4μM；副流感病毒4型上游引物0.4μM；副流感病毒4型下游引物0.4μM；冠状病毒229E上游引物0.4μM；冠状病毒229E下游引物0.4μM；鼻病毒上游引物0.4μM；鼻病毒下游引物0.4μM；副流感病毒1型基因探针0.2μM；副流感病毒2型基因探针0.2μM；副流感病毒3型基因探针0.2μM；副流感病毒4型基因探针0.2μM；冠状病毒229E基因探针0.2μM；鼻病毒基因探针0.2μM。最后控制RNA为0.5uL。
然后进行RT-PCR反应，并在反应过程中对机器接收的荧光信号进行设定，监控反应过程中的荧光变化量。六重荧光标记的RT-PCR扩增曲线如图1所示。
S60，在上述步骤完成之后，对RT-PCR后的扩增产物进一步进行灵敏度及扩增效率测定，具体如下：
S100，采用质粒作为基因运载体，与从扩增产物中提取的病原体核酸进行重组，获取重组质粒；
S200，用SalⅠ内切酶使病原体重组质粒线性化；
S300，对线性化处理后得到的线性病原体基因，进行体外转录，并搜集转录后的RNA；
S400，用BioPhotometer(Eppendorf，Hamburg，Germany)在260nm波长下测定各病原体的RNA浓度，并通过公式Copies＝(RNA ng数×10-9×6.02×1023)/(RNA碱基数×345)计算各病原体的拷贝数；
S500，将副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、冠状病毒229E和鼻病毒的RNA用缓冲液按照10倍稀释梯度稀释至105-102，对每个稀释度RNA按构建的体系作3个重复，做标准曲线并计算扩增效率和变异系数。
按照上述以阳性对照为标样进行上述检测过程，所得的结果分析如下：
从中阳性对照中提取病原体RNA后进行上述六重荧光RT-PCR，按照上述步骤S100-S500的步骤进行扩增产物的结果测量。其中步骤S400中计算得到副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、冠状病毒229E和鼻病毒的拷贝数分别为1.71×1012、1.90×1012、1.79×1012、1.68×1012、1.73×1012、1.57×1012。进一步然后按照S500的步骤进行继续操作分析结果。
在多色荧光RT-PCR步骤中，各中荧光标记的荧光信号变化量如下：
其中，A型流感病毒的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表1，以及A型流感病毒随PCR循环的扩增曲线参见附图1-2：
其中，副流感病毒1型病原体的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表1，以及副流感病毒1型病原体随PCR循环的扩增曲线参见附图2-3：
表1副流感病毒1型的结果分析数据(JOE标记)
副流感病毒2型病原体的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表2，以及副流感病毒2型病原体随PCR循环的扩增曲线参见附图4-5：
表2副流感病毒2型的结果分析数据(ROX标记)
副流感病毒3型病原体的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表3，以及副流感病毒3型病原体随PCR循环的扩增曲线参见附图6-7：
表3副流感病毒3型的结果分析数据(FAM标记)
副流感病毒4型病原体的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表4，以及副流感病毒4型病原体随PCR循环的扩增曲线参见附图8-9：
表4副流感病毒4型的结果分析数据(FAM和JOE标记)
冠状病毒229E病原体的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表5，以及冠状病毒229E病原体随PCR循环的扩增曲线参见附图10-11：
表5冠状病毒229E的结果分析数据(FAM和ROX标记)
鼻病毒病原体的Ct值、标准差和变异系数的结果见下表6，以及鼻病毒病原体随PCR循环的扩增曲线参见附图12-13：
表6鼻病毒的结果分析数据(ROX和JOE标记)
从上述以阳性对照进行验证的检测过程可以看出，在实验中前三种病原体的基因探针采用的单一荧光标记，而后三种病原体采用两种荧光标记混合进行的标记方式进行，保证病原体基因探针之间标记的荧光类型互不相同即可。实施中可以参考上述多色组合探针编码的方式进行拓展，均可以实现相同的效果。
从检测上述结果分可知，采用阳性对照进行一次同时测量的验证，每一种病原体都发生了符合预期的扩增曲线；当然理解的是，如果病患的标样中甘博然的病原体不存在上述某一种病毒，那么荧光扩增曲线信号基本不会随着PCR循环的过程变化，基本为一个平的信号线。而且通过上述其精确度测量结果中整体RT-PCR反应过程根据需要达到预期目标的循环数进行操作，次数、标准 差和变异系数的体现均可以看出本发明检测的灵敏度较高，而且整体时长大致为2个小时左右，相比Tem-PCR5个小时的检测时长大大缩短。而且不需要重复多次进行每一种单独病原体的单独检测，可以一次实现多种病原体的同时检测，大大缩短了检测时间。
而且采用本发明的可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，以试剂盒为基础，采用荧光对探针进行多色组合探针编码，替代现有的单色荧光标记探针方法，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高实时PCR单管中能够检测的靶的数目；然后进一步在检测过程中用特异性引物同源加尾通用引物形成加尾引物进行RT-PCR反应，且特异性引物设计其两端存在互补tag序列，因此引物的各单链两端互补会各自形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的进行成为通用引物扩增的模板，从而大大的降低了引物二聚体的产生；提升了反应效率，也使得用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；
其中，所述病原体特异性引物包括：
副流感病毒1型上游引物5’-GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA-3’；
副流感病毒1型下游引物5’-CCTACGGGACATCTCCAGAA-3’；
副流感病毒2型上游引物5’-ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC-3’；
副流感病毒2型下游引物5’-TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT-3’；
副流感病毒3型上游引物5’-TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC-3’；
副流感病毒3型下游引物5’-ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT-3’；
副流感病毒4型上游引物5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；
副流感病毒4型下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；
冠状病毒229E上游引物5’-ATGGCTACAGTCAAATGGGC-3’；
冠状病毒229E下游引物5’-CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA-3’；
鼻病毒上游引物5’-TGGACAGGGTGTAAAGAGC-3’；
鼻病毒下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；
所述病原体基因探针包括：
副流感病毒1型基因探针
5’-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-3’；
副流感病毒2型基因探针
5’-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3’；
副流感病毒3型基因探针5’-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’；
副流感病毒4型基因探针
5’-ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT-3’；
冠状病毒229E基因探针
5’-CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3’；
鼻病毒基因探针5’-TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3’。
2.如权利要求1所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照；
所述阳性对照包括连有副流感病毒1型基因片段的载体、连有副流感病毒2型基因片段的载体、连有副流感病毒3型基因片段的载体、连有副流感病毒4型基因片段的载体、连有冠状病毒229型基因片段的载体、连有鼻病毒基因片段的载体。
3.如权利要求1或2所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光标记物，该荧光标记物包括FAM、HEX、JOE、ROX和CYS中的一种或者多种。
4.如权利要求2所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，所述载体为大肠杆菌。
5.如权利要求1至4任一项所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取病患标样中的病原体核酸；
将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；
将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基因探针标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相同；
将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系；
将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。
6.如权利要求5所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，其特征在于，所述将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记步骤中，所述副流感病毒4型基因探针用荧光标记物进行标记过程中，荧光淬灭集团标记于所述副流感病毒4型基因探针5’往3’端方向的第15个碱基上。
7.如权利要求5或6所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，其特征在于，所述混合反应系中副流感病毒1型上游引物为0.4μM；副流感病毒1型下游引物为0.4μM；副流感病毒2型上游引物为0.4μM；副流感病毒2型下游引物为0.4μM；副流感病毒3型上游引物为0.4μM；副流感病毒3型下游引物为0.4μM；副流感病毒4型上游引物为0.4μM；副流感病毒4型下游引物为0.4μM；冠状病毒229E上游引物为0.4μM；冠状病毒229E下游引物为0.4μM；鼻病毒上游引物为0.4μM；鼻病毒下游引物为0.4μM；副流感病毒1型基因探针为0.2μM；副流感病毒2型基因探针为0.2μM；副流感病毒3型基因探针为0.2μM；副流感病毒4型基因探针为0.2μM；冠状病毒229E基因探针为0.2μM；鼻病毒基因探针为0.2μM。
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