CN111455099A

CN111455099A - 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111455099A
Application number: CN202010214225.2A
Authority: CN
Inventors: 李先强; 姜昕; 陈巨; 黄永伟; 陈佳
Original assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Current assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN111455099B

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒（2019‑nCoV）检测胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使新型冠状病毒（2019‑nCoV）核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

Description

一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒(2019-nCoV) 检测胶体金层析试剂盒及其应用。

背景技术

冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales) 冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒 (SARSr-CoV)。新型冠状病毒2019-nCoV为一种属于β属的新型冠状病毒。目前对其理化特性认知相对较少，相关特性认知多来自对SARS-CoV和MERS-CoV 的研究。

截至目前搜集到的新型冠状病毒肺炎(以下简称COVID-19)病例，显示本次疫情以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。

国家卫生健康委和国家中医药管理局发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》在确诊病例符合疑似病例标准的基础上，强调了对核酸的检测。随后1 月11日和12日，国内外专家与世界卫生组织分享新型冠状病毒2019-nCoV全基因组序列。基于国内外专家在GISAID平台上发布的新型冠状病毒2019-nCoV 基因组序列信息，进行相关引物和探针的设计制备新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测试剂盒，以辅助呼吸道感染性疾病新型冠状病毒的早期鉴别诊断，是十分必要的。目前新型冠状病毒2019-nCoV的检测主要为荧光PCR法，可直接检测核酸，灵敏度高、特异性强，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势。但是PCR的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，在RNA恒温扩增技术的基础上，结合胶体金层析技术，建立一种操作简单、快速、价格低廉的2019-nCoV的诊断方法具有非常重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述疫情防控对于病原体快速检测的需求，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC 膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的 RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，对新型冠状病毒(2019-nCoV)能做到快速高效检测，对疫情的蔓延和防治有极大的帮助。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV)检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl₂，70mMK Cl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括三组：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab 基因、E基因以及内质控(人18SrRNA)各一对扩增引物，具体的：

(1)新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因的一段保守区序列的扩增引物：

ORF1ab-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAgtctgaacaactggtgtaa g 3’(下划线处为T7启动子序列)；

ORF1ab-F引物：5’ggttagatgatgatagtcaa 3’；

(2)新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因的一段保守区序列的扩增引物：

E-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAaacaatattgcagcagtacg3’ (下划线处为T7启动子序列)；

E-F引物：5’cgtttcggaagagacaggta3’；

(3)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：

内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTC AGCTAAGAGCA3’(下划线处为T7启动子序列)；

内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’；

本发明在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，同时设计了新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因和E基因的扩增引物，任一基因检测阳性均证明该病毒检测阳性，更是双倍提升了该病毒的检测效率和灵敏性。本发明设计的各对引物R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；

3)细胞裂解液(购至美国Signosis公司，货号CL-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；

4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

(1)金探针：

金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：

5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGC TCGAGCACTGCG-3’；

(2)新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因特异探针序列：

ORF1ab-LES1:5’cagacaactactattcaaTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

ORF1ab-LES2:5’acaattgttgaggttcaaTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

ORF1ab-LES3:5’cctcaattagagatggaaTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC 3’；

ORF1ab–CES1:5’caaactgttggtcaacaaTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’；

ORF1ab–CES2:5’gacggcagtgaggacaatTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’；

(3)新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因特异探针序列：

E-LES1：5’tcgtggtattcttgctagTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

E-LES2：5’ttacactagccatccttaTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

E–LES3：5’ctgcgcttcgattgtgtgTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

E-CES1：5’cgttaatagttaatagcgTTTTAAATTTTATCGACGTGGTAGGCATAGA CGTACT3’；

E-CES2：5’tacttctttttcttgcttTTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACGTACT3’；

(4)人内参基因特异探针序列：

内参LES1:5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC3’；

内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC3’；

内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTTGTGGAAGATTATAGC3’；

内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTGTGGAAGATTATAGC3’；

(5)C线显色探针序列：

5’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’；

5)试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、N C膜、吸水纸；NC膜上有C线(质控线)和三条T线(检测线)，从样品垫到吸水纸方向分别为E-T、ORF1ab-T、内参-T和C线(如图3)；E-T处包被E包被探针、ORF1ab-T处包被ORF1ab包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C 线处包被C线包被探针，具体序列为：

C线包被探针序列：

5’GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA3’；

内参线包被探针序列：

5’GCTATAATCTTCCACTTTTGCTATAATCTTCCAC3’；

E线包被探针序列：

5’AGTACGTCTATGCCTACCACGTCGATTTTTAGTACGTCTATGCCTACC ACGTCGAT3’；

ORF1ab线包被探针序列：

5’TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTTGGGCTACGACTTAGAGGCC3’。

本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因核酸的试剂盒检测新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的方法，包括如下步骤：

(1)RNA恒温扩增

本发明检测指标有三个：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的 RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在F引物和反转录酶的 DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有 T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA分子产物(如图1)

本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。

(2)金探针层析

a，设计特异探针、金探针和包被探针

特异探针：每个指标特异探针包括两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在NC膜上对应检测线处的包被探针结合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和标记在胶体金颗粒上的巯基化探针结合，起到富集胶体金在检测线处显色的作用，这两个部分用 4～5个T链接。

金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记在胶体金颗粒上，可以与特异探针LES系列的一端及质控线检测探针的一部分结合。

包被探针：包被探针被包被在NC膜上，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。每条包被探针包含两个拷贝，每个拷贝之间用3～5个T连接。

C线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个T链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在NC膜上的C线包被探针结合。在层析时，无论有无RNA扩增产物，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被NC膜上的C线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。

所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同金探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。

所述特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。

b，试纸条检测

所用试纸条有检测线和质控线，所述检测线包括E-T线、ORF1ab-T线和内参-T线，其中内参-T线为内参检测线，包被的内参包被探针能够特异性结合内参CES系列探针的一端，E-T线处包被的E包被探针能够特异性结合新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因CES系列探针的一端；ORF1ab-T线处包被的ORF1ab 包被探针能够特异性结合新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因CES系列探针的一端。所述质控线(C线)上包被C线包被探针能特异性结合C线显色探针。将特异探针CES、特异探针LES、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效 (如图2)。

结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：

(1)核酸提取

采集疑似新型冠状病毒(2019-nCoV)患者的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒RNA分子。

(2)RNA恒温扩增

向17μL的含有新型冠状病毒(2019-nCoV)和内参引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增45分钟。待测样本中若有新型冠状病毒(2019-nCoV)的核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。

(3)试纸条层析

a，预杂交

将RNA恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及C线显色探针) 混合，42℃预杂交10分钟。扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同NC膜上的包被探针结合；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”。

b，层析检测

将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着NC膜向吸水纸方向层析，当有待测RNA扩增产物时，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被NC膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性(如图4)。

若无待测RNA产物扩增，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4)。

无论有无待测RNA产物扩增，C线显色探针都可以形成“C线显色探针--- 金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着NC膜向前流动，当到达C线时，与 C线处包被的序列结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。

第二方面，提供上述新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测胶体金层析试剂盒在制备新型冠状病毒(2019-nCoV)检测试剂中的应用。

本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：

1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。

2、本发明在设计引物时同时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。

3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将试纸条上的包被探针和RNA核酸扩增片段以及金探针串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在试纸条上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab和E基因RNA拷贝的最低检测限为100拷贝/mL。本发明试剂与参比试剂对551例临床样本测定结果进行比较，通过计数资料的χ²检验表明两种方法的检测结果无差别，阳性符合率、阴性符合率、总符合率都在95％以上，一致性Kappa值在0.75以上，说明本发明试剂与参比试剂符合性、一致性良好，而且与临床确诊/排除结果符合性达到 100％、一致性系数Kappa(K)为1。

4、本发明采用RNA恒温扩增技术和试纸条层析技术，即应用了RNA恒温扩增对仪器要求低的特点，又成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备。

附图说明

图1RNA恒温扩增原理图；

图2试纸条显色原理图；

图3试纸条组成示意图；

图4检测阴阳性示意图；

a：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因阳性、新型冠状病毒(2019-nCoV) E基因阳性、内参阳性；

b：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因阳性、新型冠状病毒(2019-nCoV) E基因阴性、内参阳性；

c：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因阴性、新型冠状病毒(2019-nCoV) E基因阳性、内参阳性；

d：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因阴性、新型冠状病毒(2019-nCoV) E基因阴性、内参阳性；

e：新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因阴性、新型冠状病毒(2019-nCoV) E基因阴性、内参阴性；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2005)中所述的条件进行。

【实施例1】核酸检测试纸条的制备

在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(NC膜)、样本垫、吸水纸、PVC底板等。

1、喷膜：

检测线E-T线：能够捕获结合新型冠状病毒(2019-nCoV)E基因特异探针CES序列，(10μM)，喷膜量：2～3μL/cm；

检测线ORF1ab-T线：能够捕获结合新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab 基因特异探针CES序列，(10μM)，喷膜量：2～3μL/cm；

检测线内参-T线：能够捕获结合内参特异探针CES序列，(10μM)，喷膜量： 2～3μL/cm；

质控线(C线)：能够捕获结合C线显色探针序列，(10μM)，喷膜量： 2～3μL/cm；

喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2 小时，存于干燥环境中备用。

2、试纸条组装

分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、样品垫从上到下依次固定于 PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。

【实施例2】灵敏度测试

选取已知浓度的含有2019-nCoV靶基因的假病毒，进行10倍浓度梯度稀释，每个梯度的稀释液单独重复3份，将具有100％阳性检出率的最低稀释度浓度作为估计检测限，估计检测限确定后，将2019-nCoV假病毒稀释到估计检测限浓度值附近，并用试剂盒进行检测，每个浓度检测20次，以对最低检测限浓度进行进一步精确确定(选阳性率在95％以上的稀释度作为本试剂盒检测限灵敏度)。

表1. 2019-nCoV假病毒实验结果-估计检测限的确定

表2. 2019-nCoV假病毒实验结果-检测限的确定

从以上数据可以看出，本试剂盒最低检测限为：1×10²copies/mL。

【实施例3】特异性验证

与2019新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体(如季节性甲型H1N1流感病毒，新型甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型流感H3N2，H5N1， H7N9，乙型流感Yamagata，乙型流感Victoria，呼吸道合抱病毒A型，呼吸道合抱病毒B型，副流感I型，副流感II型，副流感III型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D型，人间质肺病毒(人偏肺病毒)，EB病毒，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘-带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病毒(HKU1，OC43，NL63，229E)，MERS冠状病毒)进行了交叉反应测试，以验证试剂盒检测的特异性，结果如下：

表3其他病原微生物及人基因组DNA的交叉反应验证结果

结论：从以上数据可以看出，本试剂盒对其余微生物的检测结果都为阴性，证明该试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。

【实施例4】临床样本的验证

1、本发明试剂与参比试剂检测结果分析

在临床单位应用本发明试剂和参比试剂共测定样本551例，其中咽拭子样本 498例，痰液样本153例，样本按照本发明试剂盒和参比试剂说明书进行检测，结果如下：

表4本发明试剂和参比试剂检测结果(四格表)

阳性符合率/临床灵敏度：213/(213+0)×100％＝100％

阴性符合率/临床特异性：337/(1+337)×100％＝99.70％

总符合率：(213+337)/(213+1+0+337)×100％＝99.82％

一致性系数Kappa(K)值计算

＝0.99(Kappa≥0.75表明两者一致性良好，0.75>Kappa≥0.4表明一致性一般， Kappa<0.4则表明二者一致性较差)，本试验中Kappa值＝0.99，大于0.75，可认为二者一致性良好。

不一致的样本医院诊断结果为“新型冠状病毒肺炎，CT检测为两肺感染，考虑病毒性肺炎”，即医院诊断结果为新型肺炎确诊病例，本试剂盒检测结果和医院诊断结果一致。

2、本发明试剂检测结果与临床确诊/排除结果比较分析

临床验证以《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》、《新型冠状病毒感染的肺炎病例监测方案(第二版)》推荐方法得到的确诊/排除结果做比对，在临床试验中共入组有“临床确诊/排除”结果的病例数为531例，将本发明试剂盒试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行统计分析如下：

表5本发明试剂检测结果和临床确诊/排除结果(四格表)

临床灵敏度：203/(203+0)×100％＝100％

临床特异性：328/(0+328)×100％＝100％

总符合率：(201+328)/(201+0+0+328)×100％＝100％

一致性系数

(Kappa≥0.75表明两者一致性良好，0.75>Kappa≥0.4表明一致性一般，Kappa<0.4则表明二者一致性较差)。本试验中Kappa值＝1，大于0.75，可认为二者结果一致。

由上述结果可知，对本发明试剂与参比试剂对临床样本测定结果进行比较，通过计数资料的χ2检验表明两种方法的检测结果无差别，阳性符合率、阴性符合率、总符合率都在95％以上，一致性Kappa值在0.75以上，说明本发明试剂与参比试剂符合性、一致性良好，与临床确诊/排除结果符合性、一致性良好。因此，本发明试剂盒具有良好的临床应用性能。

序列表

<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司

<120> 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactataggg agagtctgaa caactggtgt aag 43

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttagatga tgatagtcaa 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg agaaacaata ttgcagcagt acg 43

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtttcggaa gagacaggta 20

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg agacaccaga gacactcagc taagagca 48

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagcagccgc ggtaattc 18

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctactctgc agtgctccat cgtacgtctg tcatttttgc tcagagctcg agcactgcg 59

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagacaacta ctattcaatt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acaattgttg aggttcaatt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctcaattag agatggaatt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caaactgttg gtcaacaatt ttggcctcta agtcgtagcc ca 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacggcagtg aggacaattt ttggcctcta agtcgtagcc ca 42

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcgtggtatt cttgctagtt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttacactagc catccttatt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgcgcttcg attgtgtgtt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgttaatagt taatagcgtt ttaaatttta tcgacgtggt aggcatagac gtact 55

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tacttctttt tcttgctttt ttatcgacgt ggtaggcata gacgtact 48

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaagctcgta gttggatctt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttgggagcgg gcgggcggtt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tccgccgcga ggcgagcctt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

accgcccgtc cccgcccctt tttcgcagtg ctcgagctct gagc 44

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agctccaata gcgtatattt ttgtggaaga ttatagc 37

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taaagttgct gcagttaatt ttgtggaaga ttatagc 37

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcagatcact atgtactttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtacatagtg atctgatttt gtacatagtg atctga 36

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctataatct tccacttttg ctataatctt ccac 34

<210> 27

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agtacgtcta tgcctaccac gtcgattttt agtacgtcta tgcctaccac gtcgat 56

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgggctacga cttagaggcc tttttgggct acgacttaga ggcc 44

Claims

1.一种新型冠状病毒（2019-nCoV）检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl₂，70 mMKCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM；其中扩增引物包括三组：新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因、E基因以及内质控各一对扩增引物，具体的：

（1）新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因的一段保守区序列的扩增引物：

ORF1ab-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTCTGAACAACTGGTGTAAG 3’；

ORF1ab -F引物：5’GGTTAGATGATGATAGTCAA 3’；

（2）新型冠状病毒（2019-nCoV）E基因的一段保守区序列的扩增引物：

E-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAAACAATATTGCAGCAGTACG3’；

E-F引物：5’CGTTTCGGAAGAGACAGGTA3’；

（3）内参基因的扩增引物：

内参-R引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGAGACACTCAGCTAAGAGCA3’；

内参-F引物：5’CAGCAGCCGCGGTAATTC3’;

2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地所述逆转录酶为AMV或M-MLV；

3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；

4）检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

（1）金探针：

金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：

5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGAGCACTGCG-3’；

（2）新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因特异探针序列：

ORF1ab-LES1: 5’CAGACAACTACTATTCAATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

ORF1ab-LES2: 5’ACAATTGTTGAGGTTCAATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

ORF1ab-LES3: 5’CCTCAATTAGAGATGGAATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

ORF1ab–CES1: 5’CAAACTGTTGGTCAACAATTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’ ；

ORF1ab–CES2: 5’GACGGCAGTGAGGACAATTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA3’ ；

（3）新型冠状病毒（2019-nCoV）E基因特异探针序列：

E-LES1：5’TCGTGGTATTCTTGCTAGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

E-LES2：5’TTACACTAGCCATCCTTATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

E–LES3：5’CTGCGCTTCGATTGTGTGTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

E-CES1：5’CGTTAATAGTTAATAGCGTTTTAAATTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACGTACT3’ ；

E-CES2：5’TACTTCTTTTTCTTGCTTTTTTATCGACGTGGTAGGCATAGACGTACT3’ ；

（4）人内参基因特异探针序列：

内参LES1: 5’AAAGCTCGTAGTTGGATCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

内参LES2：5’TTGGGAGCGGGCGGGCGGTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

内参LES3：5’TCCGCCGCGAGGCGAGCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

内参LES4：5’ACCGCCCGTCCCCGCCCCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

内参CES1：5’AGCTCCAATAGCGTATATTTTTGTGGAAGATTATAGC3’ ；

内参CES2：5’TAAAGTTGCTGCAGTTAATTTTGTGGAAGATTATAGC3’ ；

（5）C线显色探针序列：

5’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC3’ ；

5）试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有质控线C线和三条检测线T线，从样品垫到吸水纸方向分别为E-T、ORF1ab-T、内参-T和C线；E-T处包被E包被探针、ORF1ab-T处包被ORF1ab包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：

C线包被探针序列：

5’GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA3’ ；

内参线包被探针序列：

5’GCTATAATCTTCCACTTTTGCTATAATCTTCCAC3’ ；

E线包被探针序列：

5’AGTACGTCTATGCCTACCACGTCGATTTTTAGTACGTCTATGCCTACCACGTCGAT3’ ；

ORF1ab线包被探针序列：

5’TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTTGGGCTACGACTTAGAGGCC3’ 。

2.权利要求1所述的试剂盒在制备新型冠状病毒（2019-nCoV）检测试剂中的应用。