CN105154565A

CN105154565A - 一种用胶体金层析技术进行多重核酸检测的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105154565A
Application number: CN201510658968.8A
Authority: CN
Inventors: 李先强; 姜昕; 陈巨
Original assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Current assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2015-10-12
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明公开了一种用胶体金层析技术进行多重核酸检测的方法及试剂盒，属于医学生物技术领域。本发明提供核酸检测试纸条，将通用探针标记上胶体金颗粒后固定于玻璃纤维素膜上，其设计为通用序列，试纸条的NC膜上有检测线和质控线，检测线处包被一段核酸序列，能特异性杂交结合相应的特异探针B系列，检测线有一条或一条以上；质控线处包被一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合特异探针A系列，特异探针A系列和通用探针互补配对杂交；特异探针A系列和特异探针B系列将金标探针和核酸扩增片段串联结合到一块，实现核酸片段的特异检测。本方法对实验人员技术要求低，所需检测时间短，无需特殊的仪器设备，易于向基层及偏远农村医疗机构的推广。

Description

一种用胶体金层析技术进行多重核酸检测的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及医学生物技术，特别涉及一种用胶体金层析技术进行多重核酸检测的方法及试剂盒。

背景技术

核酸检测技术是检测病原体核酸（DNA和RNA）的一系列技术的总称。比起常规的血清学检测，核酸检测是直接检测病原体的脱氧核糖核酸或核糖核酸，具有特异性强、灵敏度高等特点，可以大幅提高病原体检出率、缩短检测窗口期，是对免疫学检测方法的重要补充。

现在的核酸检测技术有很多，大多是基于PCR技术发展起来的，如最常见的是荧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)技术。也有一些恒温的扩增技术应用到核酸检测领域，如，依赖核酸序列的扩增技术（NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA），滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)，环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP），转录介导的扩增技术(TranscriptionMediatedAmplifi-cation，TMA)等。无论是荧光定量PCR还是等温扩增技术，在定性检测核酸时都要借助高端、昂贵的仪器设备，而且很难实现病原体的多重检测。因此，一种操作简单、快速、价格低廉，可实现多重核酸检测的方法仍是值得探索和研究的。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种多重核酸检测的胶体金标检测试剂盒，包括：

（1）、胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维素膜、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线），所述检测线处包被一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合相应的特异探针B系列，检测线有一条或一条以上；所述C线处包被另一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合特异探针A系列；通用探针5’端巯基化修饰，也可进行其他化学基团修饰，如-NH₂，然后标记胶体金颗粒，且能与特异探针A系列互补配对杂交，将标记胶体金后的通用探针固定于试纸条的玻璃纤维素膜上；

（2）、分别盛有特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：特异探针A系列包括三个部分，其一端可与通用探针杂交，中间能与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上C线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异探针B系列包括两部分，其一端可与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上相应T线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，分别装在不同的探针管里。

所述通用探针序列为：5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他的化学基团修饰，如-NH₂（氨基）等。

所述的核酸多重检测的胶体金标检测试剂盒可用于病原体核酸的多重检测，所述的病原体是寄生虫、真菌、细菌、病毒、支原体以及衣原体。

本发明提供一种核酸多重检测的胶体金标快速检测方法，将胶体金免疫层析技术的操作简单、快速、价格低廉等特点应用到核酸的多重检测中来。包括如下步骤：

（1）、设计探针：通用探针、针对每一种待测核酸的特异探针A系列和特异探针B系列，其中，通用探针的5’端巯基化修饰后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交；特异探针A系列包括三个部分，其一端可与通用探针杂交，中间可以与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上C线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；特异探针B系列包括两部分，其一端可与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上相应T线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交。

（2）、制备胶体金试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维素膜、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线）；所述检测线处包被一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合针对一种待测核酸的特异探针B系列，检测线有一条或一条以上；所述C线处包被另一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合特异探针A系列；将标记胶体金后的通用探针置于试纸条的胶体金垫上，将特异探针A系列、特异探针B系列和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在样品垫上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效。

所述通用探针可用于检测每个待检核酸分子，在设计时必须注重GC%的比例，尽量避免与金颗粒的非特异结合；通用探针还必须注意和其他探针结合部分的Tm值，尽量提高在较低温度条件下杂交的有效性，经过实验效果的比较，所公布的通用探针序列为最优设计序列。所述通用探针序列为：

5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他的化学基团修饰，如-NH₂（氨基）等。

结合工作原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：

1、设计三种探针：通用探针、特异探针A（可以有多条，如A1、A2......）、特异探针B（可以有多条，如B1、B2......）。其中，通用探针5’端巯基化修饰后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交；特异探针A系列包括三个部分，其一端可与通用探针杂交，中间可以与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上C线处的核酸杂交；特异探针B系列包括两部分，其一端可与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上T线处的核酸杂交。

2、NC膜上“T线”（检测线）处包被一段序列，该序列可以与特异探针B系列杂交，捕获特异探针B，形成T线；“C线”（质控线）处包被另一序列，该序列可以与特异探针A杂交，用来捕捉特异探针A和游离的金标通用探针杂交复合物，形成C线。

3、通用探针标记胶体金颗粒后，可以和特异探针A系列杂交，形成金颗粒通用探针--特异探针A复合物。

4、当有待测核酸片段时，待测核酸可以和特异探针B系列杂交结合，形成待测核酸--特异探针B复合物。

5、将4中形成的待测核酸--特异探针B复合物与3中形成的金颗粒通用探针--特异探针A复合物进行杂交结合，形成金颗粒通用探针--特异探针A--待测核酸--特异探针B复合物。

6、步骤5中得到的胶体金复合物在试纸条上通过毛细现象沿纤维膜向前流动，当到达T线处，特异探针B系列上的序列与T线处包被的序列杂交结合，从而将5中得到的复合物滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带，此为阳性（如图1）。或者，

7、当待测核酸片段不存在时，就不会发生4～5步，就不能形成金颗粒通用探针--特异探针A--特异扩增产物--特异探针B复合物，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性（如图2）。

8、无论有无待测核酸片段，金颗粒通用探针--特异探针A复合物都会有富余，则多余的改复合物会越过T线继续沿着纤维膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的序列结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效。

本发明将胶体金免疫层析技术成功的应用到核酸片段的检测中来，实现核酸的快速、简单、多重检测。本发明采用的是核酸直接标金技术制备标检测探针，两者之间的连接是通过共价键结合的，效果要比胶体金通过静电吸附标记于半抗原抗体好。本发明在设计时所用的金标探针序列为一段通用序列，该段通用序列5’端被巯基化（也可以是其他的化学基团修饰，如-NH₂（氨基）等）修饰后标记上胶体金颗粒，作为通用的有色探针，可以用于所有病原体核酸的检测。有了标金的通用探针后，在同一试纸条上就可以实现多重病原体核酸的检测。在多重检测病原体核酸时，所有病原体核酸都共用这一种有色探针，只要设计针对不同病原体核酸的特异探针即可完成同一张试纸条多种核酸的检测，避免了胶体金颗粒探针一病原体一标记的麻烦，可以大幅降低检测成本。

本发明所应用的所有检测探针除通用探针标记胶体金颗粒外，其余探针都是普通设计，对所要检测的核酸片段也没有特别的要求，不需要待检核酸片段有任何标记和修饰。这就为病原体核酸片段的扩增提供了很大方便，极大的降低了病原体核酸扩增引物的设计要求（扩增引物不用任何修饰）。本发明可以检测所有方法扩增出的核酸片段，应用性极广。

本发明在检测一种病原体核酸时，设计两套特异探针，即特异探针A和特异探针B。两套探针的使用，使得其中任何一套探针和病原体核酸扩增片段杂交失败，都不能够形成被试纸条检出的复合物，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。

本发明在设计时引入的特异探针A和特异探针B有桥分子成分的作用，两种探针成功的将金标探针和待检核酸片段串联结合到一块，实现核酸片段的特异检测。桥分子的引入可以根据待检核酸片段的不同区域，多设计一些特异探针A（如特异探针A1、A2、A3……），实现一条待检核酸片段结合多条金标探针，大大提高检测灵敏度。BrittanyA.Rohrman等人用胶体金免疫层析技术检测HIV病毒核酸扩增产物时，并没有针对HIV核酸扩增片段的多位点设计多条特异探针，而只是将一种探针标记胶体金颗粒后作为特异探针去杂交结合HIV核酸扩增产物，HIV核酸扩增片段的另一端被包被在NC膜上的另一特异探针直接捕获，从而将复合物捕获在T线处形成肉眼可见的条带。这是胶体金检测核酸的一次成功例子。但是这种特异单探针捕获法的灵敏度并不高，必须借助金显色增强液（goldenhancementsolution）来增强显色，提高灵敏度。本发明在设计时，特异探针A和特异探针B都可以根据待检核酸片段不同区域设计多条，可以实现一条检测核酸分子上有多个胶体金颗粒富集，大大提高灵敏度。本发明也正是应用了这种桥分子设计，也可以实现病原体核酸片段的多重检测。根据不同的病原体核酸片段，我们只需要将特异探针A的中间部分序列和特异探针B重新设计即可，不需要修改质控线和金标探针的设计，这样更简便、成本也降低了很多。

本发明作为一种核酸试纸条检测技术，成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，只需将核酸特异扩增物和检测探针混合后滴到检测试纸上即可，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。

附图说明

图1为用胶体金层析技术（通用探针、特异探针A、B）检测待测核酸阳性结果的原理示意图

图2为用胶体金层析技术（通用探针、特异探针A、B）检测待测核酸阴性结果的原理示意图

图3为核酸检测试纸条的组装结构图

图4为用胶体金层析技术检测样品效果图，其中，A为含有CP和MP的检测结果，B为含有CP的检测结果，C为含有MP的检测结果，D为阴性的检测结果。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版（NewYork:ColdSpringHarborlaboratoryPress,2005)中所述的条件进行。

【实施例1】通用核酸探针标记胶体金颗粒

1、设计巯基化的通用探针序列：

5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’

2、将设计好的通用探针（浓度0.1mM）20μl加入到10μl的TCEP-HCl（浓度100mM）中，用水补足110μl，室温还原巯基化DNA通用探针；

3、将处理后的通用探针加入到30nm直径颗粒的胶体金液中，室温过夜孵育。

4、加入2%SDS液使其终浓度为0.01%，室温孵育30min。

5、向溶液中逐滴加入2M的NaCl，至终浓度为0.15M。

6、离心纯化金标核酸探针：15000rpm离心15min，沉淀用洗涤液（0.15MNaCl，

0.01%SDS）洗四次，胶体金沉淀重悬于重悬液（0.15MNaCl，5%BSA，0.25%Tween，10%蔗糖）中，既得标记好的通用核酸探针标记胶体金颗粒。

【实施例2】核酸检测试纸条的制备

在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜（NC膜）、样本垫、吸水纸、PVC底板等。

1、胶体金垫的制备：将玻璃纤维膜切割成0.5×1cm见方小模块，每个模块上用枪均匀滴加10μl的标金核酸探针液，室温使之干燥，封闭保存备用。

2、喷膜：

检测线（T线）：能够捕获结合特异探针B序列，（5uM），喷膜量：2~3μl/cm；

质控线（C线）：能够捕获结合特异探针A序列，（5uM），喷膜量：2~3μl/cm；

喷膜完毕后，将膜条置于室温干燥，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2小时，存于干燥环境中备用。

3、试纸条组装

分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、吸附金标探针的玻璃纤维膜、样品垫从上到下依次固定于PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。

【实施例3】通用多重检测试纸条检测肺炎支原体（MP）和肺炎衣原体（Cpn）核酸扩增片段

扩增MP核酸的引物序列：

R引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTCGTGAACTTGGTGTGGTTT-3’

F引物：5’-GGCAGTCAGACGATGATTACAGGC-3’

检测MP的特异探针A1、序列（两条）为：

5’-GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTCCTCCAGCTCTGAACGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’

5’-GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTATGATAAGGCTTCAAGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’

检测MP的特异探针B1、北序列（两条）为：

5’-GGTTCGCCTCGAAGAATTTTCTGTAGGAATGAATGT-3’

5’-CCCTCGACCAAGCCAATTTTCTGTAGGAATGAATGT-3’

检测MP的T线包被序列为：5’-ACATTCATTCCTACAG-3’

扩增Cpn核酸的引物序列：

R引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATACGTGAGCAGCTCTCTCGTT-3’

F引物：5’-AGACTTCATGCAAATTGTTTCC-3’

检测Cpn的特异探针A1、序列（两条）为：

5’-GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTTTGTGGAGTTACTGTATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’

5’-GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTGGAGCTACTTTAGTTGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’

检测Cpn的特异探针B1、B2序列（两条）为：

5’-TGTCAGATCAACAAGTTTTTGTAGGCCTCTAAGCCGTCCA-3’

5’-TTAAATCTAGAAAAGCTTTTGTAGGCCTCTAAGCCGTCCA-3’

检测Cpn的T线包被序列为：5’-TGGACGGCTTAGAGGCCTAC-3’

C线处包被序列：5’-CTAATGAGGACGTGGCTCGAAC-3’

a、T7线性扩增肺炎支原体和肺炎衣原体核酸片段：

组分	体积（μL）
		MP/CP核酸（或裂解物）	2
扩增反应液：含dNTPs、NTPs、引物R&F以及各种盐离子	17
		合计	19

95℃，2min，42℃，2min后补加扩增酶混合液（AMV&T7聚合酶&RNaseH）1μl，在42℃反应45min后，待检。

b、检测a中的肺炎支原体和肺炎衣原体特异扩增产物：

MP/CPn扩增产物10μl

CPn-特异探针B1（1uM）1μl

CPn-特异探针B2（1uM）1μl

CPn-特异探针A1（10uM）1μl

CPn-特异探针A2（10uM）1μl

MP-特异探针B1（1uM）1μl

MP-特异探针A1（10uM）1μl

MP-特异探针A2（10uM）1μl

层析液（10×SSC+0.4%SDS）至100μl

42℃10min后点在试纸条上5min后观察结果（如图4）。

SEQUENCELISTING

<110>武汉中帜生物科技股份有限公司

<120>一种用胶体金层析技术进行多重核酸检测的方法及试剂盒

<130>1

<160>16

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>通用探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>5’端为巯基修饰

<400>1

catcttccagcggccttatgcagttgctctccatttttagaaggcgtccgtctttgaggc60

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增MP核酸的R引物

<400>2

taatacgactcactatagggagactcgtgaacttggtgtggttt44

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增MP核酸的F引物

<400>3

ggcagtcagacgatgattacaggc24

<210>4

<211>67

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>检测MP的特异探针A1

<400>4

gttcgagccacgtcctcattagttttcgtcagctcgtgtcgttttgcctcaaagacggac60

gccttct67

<210>5

<211>68

<212>DNA

<213>Artificial

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<223>检测MP的特异探针A2

<400>5

gttcgagccacgtcctcattagttttatgataaggcttcaagttttgcctcaaagacgga60

cgccttct68

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>检测MP的特异探针B1

<400>6

ggttcgcctcgaagaattttctgtaggaatgaatgt36

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial

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<223>检测MP的特异探针B2

<400>7

ccctcgaccaagccaattttctgtaggaatgaatgt36

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>检测MP的T线包被序列

<400>8

acattcattcctacag16

<210>9

<211>45

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增Cpn核酸的R引物

<400>9

taatacgactcactatagggagaatacgtgagcagctctctcgtt45

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

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<223>扩增Cpn核酸的F引物

<400>10

agacttcatgcaaattgtttcc22

<210>11

<211>68

<212>DNA

<213>Artificial

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<223>检测Cpn的特异探针A1

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gttcgagccacgtcctcattagttttctgagaatttgatcttttttgcctcaaagacgga60

cgccttct68

<210>12

<211>68

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>检测Cpn的特异探针A2

<400>12

gttcgagccacgtcctcattagttttggagctactttagttgttttgcctcaaagacgga60

cgccttct68

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>检测Cpn的特异探针B1

<400>13

tgtcagatcaacaagtttttgtaggcctctaagccgtcca40

<210>14

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>检测Cpn的特异探针B2

<400>14

ttaaatctagaaaagcttttgtaggcctctaagccgtcca40

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>检测Cpn的T线包被序列

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tggacggcttagaggcctac20

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<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>C线处包被序列

<400>16

ctaatgaggacgtggctcgaac22

Claims

1.一种核酸多重检测的胶体金标检测试剂盒，包括：

（1）、胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线），所述检测线处包被一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合相应的特异探针B系列，检测线有一条或一条以上；所述C线处包被另一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合特异探针A系列；通用探针5’端巯基化修饰，也可进行其他化学基团修饰，如-NH₂（氨基），然后标记胶体金颗粒，且能特异探针A系列互补配对杂交，将标记胶体金后的通用探针固定于试纸条的玻璃纤维素膜上；

（2）、分别盛有特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：特异探针A系列包括三个部分，其一端可与通用探针杂交，中间能与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上C线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针A系列可以有一种以上，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异探针B系列包括两部分，其一端可与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上相应T线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针B系列可以有一种以上，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里。

2.根据权利要求1所述的核酸多重检测的胶体金标检测试剂盒，其特征在于：所述通用探针序列为：5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他的化学基团修饰，如-NH₂。

3.权利要求1-2所述的核酸多重检测的胶体金标检测试剂盒在病原体核酸检测中的应用，其特征在于：所述的病原体是寄生虫、真菌、细菌、病毒、支原体以及衣原体。

4.一种核酸多重检测的胶体金标快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、设计探针：通用探针、针对每一种待测核酸的特异探针A系列和特异探针B系列，其中，通用探针的5’端巯基化修饰后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交；特异探针A系列包括三个部分，其一端可与通用探针杂交，中间可以与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上C线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针A系列可以有一种以上，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；特异探针B系列包括两部分，其一端可与待测核酸杂交，另一端可以与包被在NC膜上相应T线处的核酸杂交，对应于一种待测核酸的特异探针B系列可以有一种以上，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；

（2）、制备胶体金试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线）；所述检测线处包被一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合针对一种待测核酸的特异探针B系列，检测线有一条或一条以上；所述C线处包被另一段核酸序列，该序列能特异性杂交结合特异探针A系列；将标记胶体金后的通用探针置于试纸条的胶体金垫上，将特异探针A系列、特异探针B系列和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在样品垫上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效。

5.根据权利要求5所述的核酸多重检测的胶体金标快速检测方法，其特征在于：

所述通用探针序列为：5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他的化学基团修饰，如-NH₂。