CN116875440A - 一种基于层析的多重核酸检测仪、试纸及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于层析的多重核酸检测仪、试纸及方法，包括：气源装置，所述气源装置的出气端用于与扩增试剂管的一端连通；加热装置；盖板组件，安装于所述加热装置，所述盖板组件上形成有观察窗，所述盖板组件和/或所述加热装置上形成有PCR管路安装位，用于安装PCR管路，所述加热装置用于对所述PCR管路加热；所述观察窗的位置用于安装试纸。本发明技术方案中，加热装置与气源装置的配合会对PCR管路中的待测核酸样本进行快速扩增，而试纸则会直接对扩增完成后的待测核酸样本进行直接判读，从而本发明所提供的基于层析的多重核酸检测仪将结合PCR扩增及层析检测的优点，对核酸检测结果进行快速及准确的判读。
Description
技术领域
本发明涉及生物学检测的领域，特别涉及一种基于层析的多重核酸检测仪、试纸及方法。
背景技术
当下，核酸检测在刑事侦查、病原微生物检测、疾病诊断等多种领域中得到了广泛的应用。一般情况下，环境样本或生理样本中靶标核酸含量非常少，为使结果更准确，需要对靶标核酸片段进行扩增。其中，聚合酶链式反应(PCR)是应用最为广泛的核酸扩增技术。PCR技术获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳的方法根据条带的大小来判断阴阳性，操作繁琐、费时、容易产生污染，并且特异性低。现也另有通过荧光定量PCR方法检测，受检测通道的影响，限制了单管检测靶标的数量。同时，目前的PCR技术需要配合PCR仪使用，同时大都使用通用的200uL八连管耗材进行扩增以及光学检测，检测成本高。
层析技术是一种快速诊断技术，该技术将胶体金等显色颗粒作为示踪物应用于抗原抗体反应，具有快速、简便、经济的优点，无需任何特殊仪器设备，但由于其检测灵敏度较低、特异性不强，适用范围窄，主要适用于蛋白水平的快速初筛。
目前，PCR检测的特异性较强、灵敏度高，层析反应较为快速及简便，因此亟需一种可结合二者优点的检测仪器，以对核酸进行筛查。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种基于层析的多重核酸检测仪，旨在结合PCR检测特异性强、灵敏度高及层析反应快速、简便的优点，对核酸进行筛查。
为实现上述目的，本发明提出的一种基于层析的多重核酸检测仪，包括：
气源装置，所述气源装置的出气端用于与扩增试剂管的一端连通；
加热装置；
盖板组件，安装于所述加热装置，所述盖板组件上形成有观察窗，所述盖板组件和/或所述加热装置上形成有PCR管路安装位，用于安装PCR管路，所述加热装置用于对所述PCR管路加热；所述观察窗的位置用于安装试纸；
其中，所述扩增试剂管的另一端用于与PCR管路的一端连通，所述PCR管路的另一端用于将扩增后的样本输出至所述试纸。
可选地/在一实施例中，所述加热装置包括底板和加热组件，所述盖板组件设置在所述底板上，所述加热组件设置在所述盖板组件与所述底板之间，且所述加热组件用于对所述PCR管路加热。
可选地/在一实施例中，所述加热组件包括高温件、低温件及恒温件，所述高温件、低温件及恒温件皆设置在底板上，且所述高温件、低温件及恒温件分别以不同温度同时对所述PCR液路管加热。
可选地/在一实施例中，所述盖板组件包括盖板、第一卡扣组和第二卡扣组，所述盖板可拆卸连接在所述底板上，所述第一卡扣组和所述第二卡扣组皆配置为若干卡扣，所述第一卡扣组和第二卡扣组分别设置在所述盖板面向底板的面的两边上，且所述第一卡扣组的长度方向与所述第二卡扣组的长度方向相平行，所述PCR管路依次绕设于所述第一卡扣组与所述第二卡扣组且呈蛇形分布。
可选地/在一实施例中，所述底板面向盖板的一面上开设有两条T型槽，两条所述T型槽的长度方向互相平行，所述第一卡扣组和所述第二卡扣组分别嵌设在两条T型槽中，所述底板上还设置有用于限定盖板位置的限位块。
可选地/在一实施例中，所述观察窗开设在所述盖板背离底板的面上，同侧上还开设有用于容纳扩增试剂管的试管槽，所述盖板面向底板的面上则形成有PCR管路安装位。
可选地/在一实施例中，还包括机体，所述加热装置设置在所述机体上，所述气源装置包括气泵及气管，所述气泵设置在所述机体内，所述气管的两端分别连接所述气泵及扩增试剂管。
可选地/在一实施例中，所述气管与扩增试剂管连接的一端上设置有气管接口盖，所述气管接口盖螺纹连接在所述扩增试剂管上。
本发明还提出一种基于层析的多重核酸检测试纸，应用于上述多重核酸检测仪。
本发明还提出一种基于层析的多重核酸检测方法，应用与上述多重核酸检测试纸及多重核酸检测仪，包括如下步骤：
S1、设计多重PCR扩增试剂组；
S2、变温扩增；
S3、试纸读取结果。
可选地/在一实施例中，所述多重PCR扩增试剂组包括混合酶、PCR反应体系和特异性引物；
所述混合酶为逆转录酶、DNA聚合酶和UNG酶；
所述PCR反应体系为RNA酶抑制剂、dNTP(dUTP)、Tris-HCL、KCL、MgCl2；
所述特异性引物包括第一引物及第二引物，所述第一引物上设置有标志物，所述第二引物上设置有标记序列。
可选地/在一实施例中，所述标志物为生物素、FAM、VIC、FITC及地高辛中的一种，所述试纸上设置有标记物垫，所述标记物垫上设置有用于与标志物结合的显色物质。
可选地/在一实施例中，所述标记序列为与样本及靶序列无关的核酸序列，所述试纸上设置有T/C线，所述T/C线上设置有用于与所述标记序列特异性结合的核酸捕获探针。
可选地/在一实施例中，所述第一引物及第二引物的可特异性扩增长度100-150bp。
可选地/在一实施例中，所述变温扩增包括如下步骤：
A1、恒温区52-55℃逆转录；
A2、高温区97-99℃变性；
A3、低温区57-59℃退火延伸；
A4、重复A2-A3若干次。
本发明技术方案中，加热装置与气源装置的配合会对进入至PCR管路中的待测核酸样本进行快速扩增，而试纸则会直接对扩增完成后的待测核酸样本进行直接判读，从而本发明所提供的基于层析的多重核酸检测仪将结合PCR检测及层析的优点，对核酸进行快速及准确的判读；另外，利用试纸进行判读，即实现了基因检测结果的可视化，且相较于传统的PCR扩增检测，试纸的结果判读更为简单且即时，从而提高了检测效率，并且检测过程不需要昂贵的专业仪器设备，降低了检测成本；再者，本发明提供了基于层析的多重核酸检测方法，应用于上述多重核酸检测仪及试纸，本发明所提供的多重核酸检测方法在保障了核酸检测结果的准确性的同时，可检测多重核酸，即做到一次取样快速筛查，实现了多至13重靶序列的同时扩增，提高了检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明多重核酸检测仪的整体结构示意图；
图2为本发明的扩增试剂管及气管的连接示意图；
图3为本发明多重核酸检测仪的结构爆炸示意图；
图4为本发明PCR管路的结构示意图；
图5为本发明底板及加热组件的结构示意图；
图6为图5中A部分的放大示意图；
图7为本发明试纸装配示意图；
图8为本发明试纸的结构示意图；
图9为RSV、ADV、HPIV1、MP和HRV多重基因扩增阴性和单靶标DNA/RNA的层析检测结果图；
图10为RSV、ADV、HPIV1、MP和HRV多重基因扩增双靶标DNA/RNA的层析检测结果图；
图11为RSV、ADV、HPIV1、MP和HRV多重基因扩增三靶标DNA/RNA的层析检测结果图；
图12为RSV、ADV、HPIV1、MP和HRV多重基因扩增四靶标DNA/RNA和五靶标DNA/RNA的层析检测结果图；
图13为核酸层析多重基因RSV、ADV、HPIV1、MP和HRV靶标DNA/RNA检测的灵敏度结果图。
附图标号说明：
| 标号 | 名称 | 标号 | 名称 |
| 100 | 机体 | 200 | 扩增试剂管 |
| 210 | 出液口 | 300 | 气源装置 |
| 310 | 气泵 | 320 | 气管 |
| 330 | 气管接口盖 | 410 | 盖板组件 |
| 411 | 盖板 | 412 | 窗槽 |
| 413 | 试纸槽 | 414 | 试管槽 |
| 415 | 液路槽 | 416 | 第一卡扣组 |
| 417 | 第二卡扣组 | 420 | 加热装置 |
| 421 | 底板 | 422 | 高温区 |
| 423 | 恒温区 | 424 | 低温区 |
| 425 | 限位块 | 426 | T型槽 |
| 427 | 槽口 | 430 | 加热组件 |
| 431 | 低温件 | 432 | 高温件 |
| 433 | 恒温件 | 440 | PCR管路 |
| 500 | 试纸 | 510 | 样品垫 |
| 520 | 标记物垫 | 530 | 捕获膜 |
| 540 | 吸水垫 | 550 | 支撑底板 |
| 560 | C线 | 570 | T线 |
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，若全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
参照图1，本发明提出一种基于层析的多重核酸检测仪，能快速对样本进行多重核酸筛查，在保障筛查的灵敏度及准确率的同时提高核酸筛查效率。本发明所提出的多重核酸检测仪包括如下部分：机体100、加热装置420、气源装置300及盖板411组件；其中，扩增试剂管200内装有待测的核酸样本，加热装置420则设置在机体100的一侧上，且加热装置420将对PCR管路440进行加热，即加热装置420将对待测核酸样本进行加热，以达到核酸扩增时的温度条件；盖板411组件则会将PCR管路440固定在加热装置420上；气源装置300则设置于机体100内，气源装置300会将扩增试剂管200内的待测核酸样本推入至PCR管路440中以完成待测核酸样本的扩增；试纸500则为层析试纸500，试纸500会对完成扩增后的待测核酸样本进行检测，并转化为可视化的核酸检测结果。
参照图1、图2，具体地，在本发明实施例中，为了让待测核酸样本从扩增试剂管200进入至PCR管路440内，扩增试剂管200的底部设置有出液口210，出液口210则与PCR管路440相连接，从而待测核酸样本将直接由出液口210进入至PCR管路440中。而为了将待测核酸样本从扩增试剂管200中推出，机体100内的气源装置300包括气泵310和气管320，气泵310设置在机体100内，气管320的两端则分别连接在气泵310的出气端及扩增试剂管200的顶部，从而气泵310工作时，气流将会通过气管320进入至扩增试剂管200中，使得扩增试剂管200中的气压增大，进而将待测核酸样本推入至PCR管路440中，且采用气泵310即可通过控制气泵310的工作状态来控制扩增试剂管200内的气压，进而控制待测核酸样本的流速；相应地，为了将气管320固定在扩增试剂管200的顶部上，气管320的端部上设置有气管320接口盖330，气管320接口盖330则可拆卸连接在扩增试剂管200上；在本实施例中，气管320接口盖330螺纹连接在扩增试剂管200上，从而在不影响气管320与扩增试剂管200之间的可拆卸连接的情况下保障了气管320与扩增试剂管200之间的气密性；也可使用其它可拆卸方式连接气管320与扩增试剂管200；另外也可在气管320接口盖330与扩增试剂管200体之间垫上过滤材料，以减少杂质随气流进入至扩增试剂管200之中的可能性。
参照图3、图4在待测核酸样本进入至PCR管路440后，加热装置420将对其进行加热以完成扩增，具体地，加热装置420包括底板421及加热组件430，底板421设置在机体100的一侧上，盖板411组件则设置在底板421的上方，加热组件430设置在底板421上且位于盖板411组件与底板421之间，PCR管路440设置在盖板411组件上且同样位于盖板411组件与底板421之间；加热组件430将会对PCR管路440进行加热，以满足PCR过程中的逆转录-变性-退火延伸三个阶段的温度需求；待测核酸样本则会在PCR管路440中移动，并受到加热组件430的加热。
参照图3、图4，在本实施例中，盖板411组件包括盖板411、第一卡扣组416和第二卡扣组417，待测核酸样本将会在PCR管路440中流动，第一卡扣组416和第二卡扣组417则会将PCR管路440固定在盖板411上。具体地，第一卡扣组416和第二卡扣组417均包括若干卡扣，第一卡扣组416和第二卡扣组417分别设置在盖板411同一面的两条边上，且第一卡扣组416的长度方向和第二卡扣组417的长度方向皆与盖板411的长度方向平行；PCR管路440则依次绕设于第一卡扣组416卡扣和第二卡扣组417的卡扣上，从而PCR管路440呈蛇形分布；第一卡扣组416和第二卡扣组417的设置将会为PCR管路440提供固定，且盖板411上还开设有供PCR管路440嵌入的液路槽415，以进一步提高PCR管路440的稳定性；而PCR管路440的蛇形分布则会增加长度，从而增加了在其内流动的待测核酸样本的PCR反应时间，进而增加了待测核酸样本的数量级，方便了后续的检测；需要说明的是，盖板411上开设有供扩增试剂管200放入的试管槽414，PCR管路440的一端与出液口210相连，即试管槽414的底部开设有供PCR管路440的端部嵌入的管槽，管槽上还设置有接口，便于PCR管路440与出液口210相连；PCR管路440的另一端则会在待测核酸样本经由加热装置420扩增后将其直接滴入试纸500上判读。
参照图4、图5，在本发明实施例中，为了完成对PCR管路440的加热，即完成待测核酸样本的PCR扩增，底板421面向盖板411的面上分别设置有恒温区423、高温区422和低温区424，需要说明的是，恒温区423所对应位置即为试管槽414相应位置，高温区422则对应于第一卡扣组416，低温区424则对应于第二卡扣组417；恒温区423会先对看扩增试剂管200进行加热，使得待测核酸样本在扩增试剂管200中时即发生逆转录；经过一定时间后气源装置300会将待测核酸样本推入至PCR管路440中；待测核酸样本气源装置300的推动下将会先经过高温区422，而后再到达低温区424，以完成变性及退火延伸；而后，待测核酸样本会随PCR管路440不断经过高温区422与低温区424，从而不断扩增；待测核酸样本经由PCR管路440而到达试纸500上时，已完成数量级的增长，从而易于利用试纸500对待测核酸样本进行判读。
参照图5，相对应地，加热组件430则包括三个加热件，三个加热件分别为低温件431、高温件432及恒温件433，恒温件433设置在恒温区423上，温度设定在52-55℃；高温件432设置在高温区422上，温度设定在97-99℃；低温件431设置在低温区424上，温度设定在57-59℃。在本发明实施例中，低温件431、高温件432及恒温件433皆采用加热膜；加热膜的选择除了能较快达到设定温度外，还易于控制温度的变化；另外，加热膜的设置缩小了盖板411与底板421间的空隙，使得PCR管路440能尽可能的贴合底板421，从而使得PCR管路440更容易受热，保障了加热组件430对PCR管路440的加热效果，即保障了待测核酸样本的扩增。
参照图3、图6，具体地，为了保障加热效果，即为了保障盖板411与底板421之间的固定关系，底板421上开设有供第一卡扣组416与第二卡扣组417嵌入的T型槽426，需要具体说明的是，T型槽426远离机体100的一端贯通设置，在实际安装或拆卸过程中，盖板411将从底板421远离机体100的一端向另一端滑移，滑移时，卡扣的头部将嵌入至T型槽426中，而T型槽426的槽口427则会对卡扣的头部进行限位，阻挡卡扣从T型槽426中脱出，从而将盖板411固定在底板421上。而为了保障恒温区423与试管槽414的对应，即保障加热组件430对PCR管路440的加热效果，底板421上还设置有限位块425，限位块425的设置将限定盖板411在底板421上的可移动范围，在安装时，只需将盖板411推至与限位块425相抵触，即可保障盖板411位置的安装正确。
参照图7，在本发明实施例中，盖板411上开设有窗槽412，所述窗槽412的槽底上还开设有试纸500槽413，试纸500嵌设在试纸500槽413中，PCR管路440的一端则延伸至试纸500处，从而待测核酸样本在完成扩增后会滴落至试纸500上；窗槽412内则可以安装观察窗，观察窗可以是玻璃及树脂等透明材料制成，从而方便结果判读。
以下说明本发明的具体使用实例：
进行核酸筛查时，先将待测核酸样本放入至扩增试剂管200中，同时将试纸500放入试纸500槽413中，而后通过机体100上的开关启动气源装置300及加热装置420，气泵310则会工作以在扩增试剂管200内产生气压而将待测核酸样本推入至PCR管路440中，加热组件430则会对PCR管路440进行加热，待测核酸样本则会在PCR管路440中完成扩增；扩增完成后的待测核酸样本则会滴落在试纸500上，而后试纸500将会对扩增完成后的待测核酸样本检测结果进行判读。
结合上述使用过程，以下结合本发明设计的具体原理进行进一步说明：
本发明还提出了一种基于层析的多重核酸检测方法。在本发明中，采用层析试纸对待测DNA/RNA的扩增产物进行检测；具体地，基于PCR变温扩增和侧向层析技术原理，对多至13个靶标序列同时扩增，再利用侧向层析试纸进行检测和判读。
本发明所提出的多重核酸检测方法是这样实现的，其具体步骤包括：
S1、设计多重PCR扩增试剂组；
S2、变温扩增；
S3、试纸读取结果。
其中，多重PCR扩增试剂组包括混合酶、PCR反应体系和特异性引物。
混合酶为逆转录酶、DNA聚合酶和UNG酶，其中逆转录酶为M-MLV逆转录酶，DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；
PCR反应体系为RNA酶抑制剂、dNTP(dUTP)、Tris-HCL、KCL、MgCl2；
特异性引物为根据不同靶序列设计的可特异性扩增长度100-150bp的第一引物及第二引物。
需要说明的是，混合酶作用主要是将待测RNA反转录成cDNA，并完成DNA的复制；PCR反应体系为酶提供一个最适催化反应条件；用于多重靶标扩增的第一引物及第二引物除了可以针对性结合待测样本中的靶标DNA/RNA，还需要在第一引物上标记标志物，第二引物上标记有与靶序列及样本无关的核酸序列。
其中，标志物最优为生物素，也可以是FAM，VIC，FITC，地高辛等引物常见修饰标记物；标记序列为与靶序列及样本无关的核酸序列，不同靶标分别标记不同的序列，在本发明以下说明中，记作B1、B2、B3……；
变温扩增则包括如下步骤：
A1、恒温区52-55℃逆转录；
A2、高温区97-99℃变性；
A3、低温区57-59℃退火延伸；
A4、重复A2-A3若干次。
而在本发明中，试纸的结构如图8所示，包括样品垫，标记物垫，捕获膜，吸水垫，支撑底板。捕获膜上含有C线和T线组合。
样品垫用来承载样品溶液，对待测样本具有一定的过滤和缓冲作用，降低样本中离子强度或酸碱度对检测结果的干扰。标记物垫为显色物质所标记的结合显色物，需要说明的是，显色物质可以为彩色微球等；而结合显色物可以结合样本中第一引物所标记的生物素或其他标记物；捕获膜承载核酸捕获探针且为杂交反应发生的重要区域，预先包被上的核酸捕获探针即为检测线T线和质控线C线，能够与第二引物上所标记的B1、B2、B3……发生碱基互补配对结合，使结合显色物在检测线发生聚集，根据检测线的显色状况进行判读结果。吸水垫提供层析的动力，通过吸水垫的吸水作用和捕获膜的毛细作用使液体样品向上流动，带动样品垫的样本核酸向上移动，从而与检测线的核酸捕获探针发生反应；支撑底板对整个检测试纸起支撑的作用。
需要说明的是，样品垫为玻璃纤维、滤纸或滤血膜；标记物垫为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜。当样品垫与标记物垫材质相同时可整合在一起，用一条玻璃纤维、滤纸或聚酯膜来实现样品垫和标记物垫的功能。标记物垫上显色物质所标记的结合显色物最优为SA(链霉亲和素)，也可以为FAM，VIC，FITC，地高辛的对应单抗。捕获膜可以是硝酸纤维素膜(NC膜)、尼龙膜等；T线含有核酸捕获探针，C线含有阳性对照核酸捕获探针。核酸捕获探针包被的浓度为10-30μM，序列长度范围是20-45bp，两端各加10-25bp的随机序列；吸水垫为无纺材料；支撑底板为塑料板。
工作过程如图1示，当样本溶液加到试纸的样品垫1上后，液体将沿水平箭头方向移动，先到达标记物垫2，样本中的第一引物上标记的标志物将与标记物垫2中显色物质(如彩色微球)标记的结合显色物结合形成复合物，即‘标志物—结合显色物～彩色微球’，随着溶液的继续移动，到达捕获膜的T线/C线，第二引物所标记的标记序列与此处的核酸捕获探针形成‘核酸捕获探针—标记序列’复合物并被固定在T线/C线上。溶液继续向前移动，被试纸末端的吸水垫吸收。最后，根据检测线和质控线的显色情况进行结果判定。
当有待测核酸片段时，将形成‘核酸捕获探针—标记序列～样本核酸～标志物—结合显色物～彩色微球’复合物滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带，此为阳性。
当待测核酸片段不存在时，不能形成‘核酸捕获探针—标记序列～样本核酸～标志物—结合显色物～彩色微球’复合物，彩色微球就不能在T线聚集，不会形成肉眼可见的有色条带，此为阴性。
无论有无待测核酸片段，都会形成‘核酸捕获探针—标记序列～阳性对照核酸～标志物—结合显色物～彩色微球’复合物，并在C线聚集，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效。若质控线不显色，为试纸失效。
以下结合具体实施例对本发明进行说明：
实施例1：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，核酸捕获探针的序列长度是35bp，两端各加15bp的随机序列。
实施例中，DNA/RNA扩增模板、标记有标志物的第一引物、标记有标记序列的第二引物、核酸捕获探针和结合显色物委托生物技术公司合成，且本实施例中，标志物为生物素，结合显色物为标记有彩色微球的SA。
本实施例中，以多重核酸层析检测试纸检测项目为呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒1(HPIV1)、肺炎支原体(MP)和鼻病毒(HRV)，质控基因RNP为例。
多重核酸层析检测试纸的制备：
1)将彩色微球标记的SA溶液用喷膜仪喷到标记物垫上，喷速为1μL/cm，喷好的标记物垫置于37℃恒温箱中干燥1小时。将标记物垫上含有彩色微球标记的SA的部分切割下来，得到5mm宽，30cm长的条带。
2)将核酸捕获探针以及阳性对照核酸探针用喷膜仪划线捕获膜，划线速度为0.6μL/cm，划好的捕获膜置于37℃恒温箱中干燥16小时。
3)按照图8中试纸的结构所示，将捕获膜首先粘贴在支撑底板上，在靠T线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫，在靠C线一侧粘贴吸水垫，然后用切割机切割成3.08mm宽的试纸于铝箔袋中封闭保存备用。
参照基于层析的多重核酸检测方法的检测原理进行检测：(1)以靶标质粒为模板，进行基因多重扩增；(2)将多重扩增核酸产物滴加在长条形层析试纸的样品垫上，多重扩增核酸产物从样品垫流经到彩色微球标记物垫，与其上的标记彩色微球的结合物特异性结合，再流经捕获膜上的检测线和质控线，最后流到吸水垫上，观察检测线和质控线的颜色，确定检测结果。
实施例2：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为10μM，序列长度是35bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
实施例3：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为30μM，序列长度是35bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
实施例4：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是45bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
实施例5：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是20bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
实施例6：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是35bp，两端各加10bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
实施例7：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是35bp，两端各加25bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
实施例8：PCR的变温中三块的恒温区温度为52℃，高温区温度为98℃，低温区温度为58℃，其余设置与实施例1相同。
实施例9：PCR的变温中三块的恒温区温度为52℃，高温区温度为97℃，低温区温度为59℃，其余设置与实施例1相同。
实施例10：PCR的变温中三块的恒温区温度为54℃，高温区温度为97℃，低温区温度为57℃，其余设置与实施例1相同。
实施例11：PCR的变温中三块的恒温区温度为55℃，高温区温度为99℃，低温区温度为58℃，其余设置与实施例1相同。
实施例12：PCR的变温中三块的恒温区温度为55℃，高温区温度为97℃，低温区温度为59℃，其余设置与实施例1相同。
对比例1：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为8μM，序列长度是35bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
对比例2：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为35μM，序列长度是35bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
对比例3：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是15bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
对比例4：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是50bp，两端各加15bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
对比例5：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是35bp，两端各加7bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
对比例6：多重核酸层析检测试纸的核酸捕获探针包被的浓度为25μM，序列长度是35bp，两端各加28bp的随机序列，其余设置与实施例1相同。
对比例7：PCR的变温中三块的恒温区温度为51℃，高温区温度为98℃，低温区温度为58℃，其余设置与实施例1相同。
对比例8：PCR的变温中三块的恒温区温度为51℃，高温区温度为97℃，低温区温度为59℃，其余设置与实施例1相同。
对比例9：PCR的变温中三块的恒温区温度为52℃，高温区温度为96℃，低温区温度为58℃，其余设置与实施例1相同。
对比例10：PCR的变温中三块的恒温区温度为52℃，高温区温度为100℃，低温区温度为57℃，其余设置与实施例1相同。
对比例11：PCR的变温中三块的恒温区温度为54℃，高温区温度为98℃，低温区温度为56℃，其余设置与实施例1相同。
对比例12：PCR的变温中三块的恒温区温度为54℃，高温区温度为97℃，低温区温度为60℃，其余设置与实施例1相同。
性能检测
1、多重核酸层析显色测试
为了测试核酸捕获探针包被的浓度、序列长度及两端添加不同长度随机序列的层析显色效果，使用同一扩增后的样本进行层析显色对比测试。
检测方法：扩增质控基因RNP(模板质粒浓度为100copies/μL)作为统一样本，制备不同条件的RNP核酸捕获探针层析试纸条，使用不同条件的层析试纸条测试统一样本的层析显色效果，每种条件进行三个重复测试，记录显色程度。
检测结果：
表1实施例1-7的层析显色结果
注：将显色程度分为显色非常清楚(+++)、显色比较清楚(++)、显色比较弱(+)、未显色(-)四种。
根据表1可知，实施例1-7的层析显色效果都为比较清楚和非常清楚，表明本申请的多重核酸层析检测效果良好。实施例1的显色效果都为非常清楚，说明实施例1的层析显色效果明显优于其他实施例。
表2实施例1与对比例1-6的层析显色结果
注：将显色程度分为显色非常清楚(+++)、显色比较清楚(++)、显色比较弱(+)、未显色(-)四种。
根据表2可知，实施例1的层析显色效果都为非常清楚，而对比例1-6的层析显色效果都比较弱或未显色，表明本发明的多重核酸层析检测效果良好。
2、特异性测试
为了验证该方法的特异性，分别测试不同的检测线是否能特异的检出对应的样本，即存在待测样本时，质控线显色且对应检测线显色，否则只有质控线显色。
检测方法：按照实施例1的方式准备RSV、ADV、HPIV1、MP、HRV和质控基因RNP的6重层析试纸条。分别扩增0个/1个/2个/3个/4个/5个靶基因(都带有质控基因RNP)，将扩增产物使用层析试纸条测试扩增产物的情况，以验证检测的特异性。
参照图9-图12，结果显示，如果扩增的产物中含有检测的5种靶标DNA/RNA，五条检测线以及质控线都会显色；如果只含有部分靶标DNA/RNA，则只有对应检测线和质控线显色；如果不含有此五种靶标DNA/RNA，则五条检测线都不显色，只有质控线显色。体现了本发明所提供的多重核酸检测方法检测靶标DNA/RNA的特异性强。
3、灵敏度测试
为了验证本发明所提供的多重核酸检测方法的灵敏度，使用已标定浓度的含靶基因的质粒测试该方法的最低检测限。
检测方法：使用已标定浓度的含靶基因的质粒，进行10倍浓度梯度稀释，每个梯度重复3份，将具有100％阳性检出率的最低稀释度浓度作为估计检测限，估计检测限确定后，将质粒稀释到估计检测限浓度值附近，并用按照实施例1的方式制备的层析试纸条进行检测，每个浓度检测20次，以对最低检测限浓度进行进一步精确确定(选阳性率在95％以上的稀释度作为本方法的最低检测限)。
参照图13，结果显示，本发明所提供的多重核酸检测方法的最低检测限为1copies/uL。
4、稳定性测试
为了检测该方法的稳定性采用加速稳定性试验。
检测方法：将同一批次的试纸条分别放置于45℃和55℃烘箱，并在45℃90天和55℃45天进行检测，测试试纸的灵敏度和特异性。
表3实施例1-7与对比例1-6经高温加速后的灵敏度和特异性情况
结果表明，本申请的多重核酸层析检测试纸在45℃90天和55℃45天时最低检测限浓度的样本均能检出，特异性符合要求，产品性能保持稳定。
5、PCR变温温度测试
为了测试本发明所提供的多重核酸检测方法中，PCR变温过程中的温度设置范围，使用同一模板样本进行变温扩增且对扩增产物进行检测。
检测方法：将质控基因RNP(模板质粒浓度为100copies/μL)作为统一样本，分别对恒温区、高温区和低温区芯片进行温度设置，将扩增产物使用同一批试纸条测试层析显色效果，每种条件进行三个重复测试，记录显色程度。
表4实施例8-12的层析显色结果
注：将显色程度分为显色非常清楚(+++)、显色比较清楚(++)、显色比较弱(+)、未显色(-)四种。
根据表4可知，实施例8-12的层析显色效果都为比较清楚和非常清楚，表明本申请的PCR变温过程中的温度设置范围合理，检测效果良好。实施例8的显色效果都为非常清楚，说明实施例8的温度设置扩增效果明显优于其他实施例。
表5实施例8与对比例7-12的层析显色结果
注：将显色程度分为显色非常清楚(+++)、显色比较清楚(++)、显色比较弱(+)、未显色(-)四种。
根据表5可知，实施例8的层析显色效果都为非常清楚，而对比例7-12的层析显色效果都比较弱或未显色，表明本申请的PCR变温过程中的温度设置范围合理，检测效果良好。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (15)
1.一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于，包括：
气源装置，所述气源装置的出气端用于与扩增试剂管的一端连通；
加热装置；
盖板组件，安装于所述加热装置，所述盖板组件上形成有观察窗，所述盖板组件和/或所述加热装置上形成有PCR管路安装位，用于安装PCR管路，所述加热装置用于对所述PCR管路加热；所述观察窗的位置用于安装试纸；
其中，所述扩增试剂管的另一端用于与PCR管路的一端连通，所述PCR管路的另一端用于将扩增后的样本输出至所述试纸。
2.如权利要求1所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：所述加热装置包括底板和加热组件，所述盖板组件设置在所述底板上，所述加热组件设置在所述盖板组件与所述底板之间，且所述加热组件用于对所述PCR管路加热。
3.如权利要求2所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：所述加热组件包括高温件、低温件及恒温件，所述高温件、低温件及恒温件皆设置在底板上，且所述高温件、低温件及恒温件分别以不同温度同时对所述PCR液路管加热。
4.如权利要求2所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：所述盖板组件包括盖板、第一卡扣组和第二卡扣组，所述盖板可拆卸连接在所述底板上，所述第一卡扣组和所述第二卡扣组皆配置为若干卡扣，所述第一卡扣组和第二卡扣组分别设置在所述盖板面向底板的面的两边上，且所述第一卡扣组的长度方向与所述第二卡扣组的长度方向相平行，所述PCR管路依次绕设于所述第一卡扣组与所述第二卡扣组且呈蛇形分布。
5.如权利要求4所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：所述底板面向盖板的一面上开设有两条T型槽，两条所述T型槽的长度方向互相平行，所述第一卡扣组和所述第二卡扣组分别嵌设在两条T型槽中，所述底板上还设置有用于限定盖板位置的限位块。
6.如权利要求4所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：所述观察窗开设在所述盖板背离底板的面上，同侧上还开设有用于容纳扩增试剂管的试管槽，所述盖板面向底板的面上则形成有PCR管路安装位。
7.如权利要求1所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：还包括机体，所述加热装置设置在所述机体上，所述气源装置包括气泵及气管，所述气泵设置在所述机体内，所述气管的两端分别连接所述气泵及扩增试剂管。
8.如权利要求7所述的一种基于层析的多重核酸检测仪，其特征在于：所述气管与扩增试剂管连接的一端上设置有气管接口盖，所述气管接口盖可拆卸连接在所述扩增试剂管上。
9.一种基于层析的多重核酸检测试纸，其特征在于：应用于如权利要求1至8任意一项所述的多重核酸检测仪。
10.一种基于层析的多重核酸检测方法，应用于如权利要求1至8任意一项所述的多重核酸检测仪及如权利要求9所述的多重核酸检测试纸，其特征在于，所述多重核酸检测方法包括如下步骤：
S1、设计多重PCR扩增试剂组；
S2、变温扩增；
S3、试纸读取结果。
11.如权利要求10所述的一种基于层析的多重核酸检测方法，其特征在于：所述多重PCR扩增试剂组包括混合酶、PCR反应体系和特异性引物；
所述混合酶为逆转录酶、DNA聚合酶和UNG酶；
所述PCR反应体系为RNA酶抑制剂、dNTP(dUTP)、Tris-HCL、KCL、MgCl2；
所述特异性引物包括第一引物及第二引物，所述第一引物上设置有标志物，所述第二引物上设置有标记序列。
12.如权利要求11所述的一种基于层析的多重核酸检测方法，其特征在于：所述标志物为生物素、FAM、VIC、FITC及地高辛中的一种，所述试纸上设置有标记物垫，所述标记物垫上设置有用于与标志物结合的结合显色物。
13.如权利要求11所述的一种基于层析的多重核酸检测方法，其特征在于：所述标记序列为与靶序列及样本无关的序列，所述试纸上设置有T/C线，所述T/C线上设置有用于与所述标记序列特异性结合的核酸捕获探针。
14.如权利要求11所述的一种基于层析的多重核酸检测方法，其特征在于：所述第一引物及第二引物的可特异性扩增的长度为100-150bp。
15.如权利要求10所述的一种基于层析的多重核酸检测方法，其特征在于，所述变温扩增包括如下步骤：
A1、恒温区52-55℃逆转录；
A2、高温区97-99℃变性；
A3、低温区57-59℃退火延伸；
A4、重复A2-A3若干次。
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