CN104278079A - 用核酸层析技术检测核酸的试纸条和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用核酸层析技术检测核酸的试纸条和方法，具体地，公开了一种用核酸层析技术检测核酸的试纸条，包含：含光致发光微球标记的核酸检测探针的标记物垫、含有核酸捕获探针的捕获膜。本发明还公开了一种用核酸层析技术检测核酸的方法，包括：将含待测核酸的溶液滴加到前述试纸条的样品垫上，反应一段时间后用检测仪检测信号。

Description

用核酸层析技术检测核酸的试纸条和方法

技术领域

本发明涉及纳米材料技术、分子生物学技术、侧流层析技术等领域。更具体的，本发明涉及一种用核酸层析技术检测核酸的试纸条；此外，本发明还涉及一种用核酸层析技术来检测核酸的方法。

背景技术

引起疾病的病原微生物很多，如流感病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、结核杆菌以及金黄色葡萄球菌等。无论是病人血液中微生物的检测还是食品中微生物的检测，目前比较成熟的方法还是用免疫学技术检测微生物对应的抗原或抗体，而检测核酸的分子生物学技术还处于发展阶段。

检测抗原或抗体的免疫学方法需要等到微生物的量足够多，这样才有足够的抗原或抗体被检测到，所以无论是血液中致病微生物的检测还是食品中致病微生物的检测在早期用免疫学方法都检测不出来，这样不仅病人的病情会加重，还会耽误治疗，而食品中的微生物因为漏检而不处理也会导致食用者中毒。

除了病原微生物可以通过核酸检测以外，肿瘤、心血管疾病、胎儿或新生儿遗传病等都有特异的核酸标志物，肿瘤、心血管疾病的核酸标志物如血液中的微小RNA（microRNA）等，胎儿或新生儿遗传病的核酸标志物如染色体的突变、缺失或数目的变化，这些也都可以通过核酸检测来协助诊断。

目前，能够更早检测病原微生物或疾病的核酸检测方法开始发展起来。检测核酸的分子生物学方法一般包括3个步骤：核酸提取、核酸扩增和核酸检测。核酸检测方法主要有凝胶电泳、杂交后的荧光检测或化学发光检测以及核酸测序等方法。凝胶电泳通过电泳将样品中的核酸电泳分离后用溴化乙锭染色，再在紫外光照射下显色。杂交显色方法中的引物或探针上标记有荧光物质或酶，扩增或杂交后利用荧光检测仪或者化学发光检测仪检测信号来检测核酸。目前在核酸扩增的同时定量检测的方法只有实时PCR法（Real-Time PCR方法）。不扩增核酸就能定量检测的方法比较少，因为无论是荧光标记还是酶标记，引物或探针上能够标记的荧光分子或酶分子都比较少，所以信号不够强，灵敏度比较低。即使核酸的浓度足够高，也需要核酸提取、与探针杂交、洗脱掉未结合的探针，用荧光检测仪或化学发光检测仪检测，步骤繁多，反应过程慢，而且需要专业人员在实验室用昂贵设备检测，不能满足快速、方便、高灵敏度检测核酸的需要。

发明内容

本发明旨在解决本领域中的上述各种问题和实现以下目标。具体地，本发明的目的就是要提供一种方便、快速而且高灵敏度地检测样品中的核酸的试纸条和方法。

具体的，本发明提供了一种用核酸层析技术检测样品中的核酸的试纸条。

在一种实施方式中，本发明提供了一种用核酸层析技术检测核酸的试纸条，包含标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有光致发光微球标记的核酸检测探针，所述捕获膜含有核酸捕获探针。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含镧系元素复合物的荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是磷光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述磷光微球是含铂复合物的磷光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是二氧化硅微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是聚苯乙烯微球。

在另一种实施方式中，本发明提供了一种用核酸层析技术检测核酸的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条的样品垫上滴加含核酸的样品，反应后检测信号。

详细说明

用荧光核酸层析技术检测样品中核酸的试纸条如图1示，包括样品垫1，标记物垫2，捕获膜3，吸水垫4，支撑底板5。捕获膜3上含有C线6和T线7。

其中样品垫一般为玻璃纤维、滤纸或滤血膜。标记物垫可为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜。当样品垫与标记物垫材质相同时可整合在一起，用一条玻璃纤维、滤纸或聚酯膜来实现样品垫和标记物垫的功能。所述标记物垫上含有光致发光微球标记的核酸检测探针，还可以含有光致发光微球标记的其他核酸作阳性对照。

捕获膜可以是硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜等，所述捕获膜的T线含有核酸捕获探针，C线含有阳性对照核酸探针。光致发光微球标记的核酸检测探针可以结合样品中的核酸后被T线上的核酸捕获探针捕获，也可以直接结合T线上的核酸捕获探针被捕获。

用核酸层析技术检测样品中核酸的方法，如图1示，当样品溶液滴加到试纸条的样品垫1上后，液体将沿水平箭头方向移动，先到达标记物垫2，样品中的核酸将与标记物垫2中光致发光微球标记的核酸检测探针结合形成复合物，即‘样品核酸-核酸检测探针～光致发光微球’，随着溶液的继续移动，该复合物将到达捕获膜的T线并与此处的核酸捕获探针形成‘核酸捕获探针-样品核酸-核酸检测探针～光致发光微球’复合物并被固定在T线上。随后用检测仪来检测T线上的光信号，并与光信号-核酸拷贝数标准曲线比较计算出待测样品中的核酸拷贝数。

由于T线处核酸捕获探针捕获的光致发光微球包含有很多光致发光分子（荧光分子或磷光分子），所以T线处可以检测到很强的光信号，从而使这种核酸层析技术检测核酸的方法有很高的灵敏度。当光致发光分子是时间分辨荧光复合物或磷光复合物时，由于发射光有数百微秒到数毫秒的荧光寿命，可以在激发光撤掉后数十微秒到数百微秒检测发射光信号，此时激发光和背景荧光都已经消失，只有光致发光分子特异的荧光或磷光信号，所以检测的特异性和灵敏度都大大提高。

本发明中的‘病原微生物’指可通过呼吸道、消化道、皮肤、血液传播、传染的能够引起动物疾病的微生物，包括原核生物、细菌、病毒、真菌等。更具体的，前述原核生物包括疟原虫，细菌包括导致肺结核的结核杆菌、引起炭疽病的炭疽杆菌、引起肺炎的链球菌或假单胞菌、引起梅毒的苍白螺旋体、引起食物中毒的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌、支原体、衣原体等，病毒包括HIV、各种流感病毒、SARS冠状病毒、肝炎病毒、埃博拉病毒等，真菌包括酵母、烟曲霉菌、黄曲霉菌等。

本发明中的‘探针’是指能够与待测核酸序列部分杂交的DNA片段或包含部分待测核酸序列的DNA片段，这里待测核酸包括病原微生物基因组中特异的核酸片段，或者是肿瘤、心血管疾病特异的核酸标志物，如血液中的某些微小RNA，胎儿或新生儿遗传病中某些染色体片段（其突变、缺失或是拷贝变化能引起疾病）等，也可以是个体基因组中特有的核酸片段，或者是动植物种属特异的核酸片段。

本发明中的‘微球’可以是二氧化硅（SiO₂）微球、聚苯乙烯微球或其他高分子微球，微球直径在10nm到10μm之间，其表面可带有羧基、氨基或酮基等官能团。

本发明中的‘光致发光微球’指球体中包埋了光致发光分子的微球。所述‘光致发光分子’包括荧光素、罗丹明等荧光分子或其衍生物、铕复合物、钐复合物、铽复合物等镧系元素复合物荧光分子以及铂复合物、钯复合物等磷光分子，其中铕复合物为铕与配体螯合后再与其他有机分子形成的复合物，铂复合物为铂与配体（包括卟啉、卟吩、吡啶及其衍生物）螯合形成的复合物，其中铕复合物又为时间分辨荧光复合物，铂复合物又为磷光复合物。

本发明中的‘光致发光微球标记的核酸检测探针’指跟光致发光微球耦联的核酸探针。其中，‘核酸检测探针’能与待测核酸序列的一部分杂交。更具体的，核酸探针带有生物素，生物素再与光致发光微球耦联的链亲和素或生物素抗体结合，从而使核酸检测探针被光致发光微球标记。或者，核酸探针带有地高辛等其他小分子，地高辛等其他小分子再与其光致发光微球耦联的抗体结合。

本发明中的‘核酸捕获探针’指结合在试纸条捕获膜上的核酸探针，它可以与待测核酸序列的一部分杂交，同光致发光微球标记的核酸检测探分别与待测核酸系列的不同部分结合，也可以包含待测核酸序列的一部分，与待测核酸序列竞争结合光致发光微球标记的核酸检测探针。该核酸探针可通过紫外光照射结合在NC膜上，也可与牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白耦联后结合在NC膜上。

本发明中试纸条捕获膜上的‘T线’指核酸捕获探针所在的区域，也就是待测样品与核酸捕获探针结合的区域。试纸条捕获膜上的‘C线’指阳性对照核酸探针所在的区域，也就是核酸检测探针与阳性对照核酸探针结合的区域，或者是光致发光微球标记的阳性对照核酸与阳性对照核酸探针结合的区域。

本发明通过核酸层析技术检测样品中的核酸，如病原微生物的核酸或肿瘤、心血管疾病、胎儿或新生儿遗传病等特异的核酸片段或其突变、缺失、拷贝数变化等，可以快速、方便、高灵敏度地检测相应的核酸标志物，尽可能地在早期发现相应的疾病甚至发生该疾病的倾向，早预防，早治疗，为人们的健康生活提供指导和保障。本发明也可通过检测人、动物、植物特异的核酸序列来追踪、确定个体或个体的种属。

附图说明

根据一个或多个不同的实施方式，参考下列附图对本发明进行了详细描述。附图仅为示例目的而提供，并且仅描述本发明典型或示例性的实施方式。这些附图被提供以促进读者对本发明的理解，将不被认为限制本发明的宽度、范围或应用性。

图1是本发明中核酸层析技术检测核酸的试纸条示意图。图1中，附图标记1-7说明：1-样品垫；2-标记物垫；3-捕获膜；4-吸水垫；5-支撑底板；6-C线；7-T线。

图2是实施例中用核酸层析技术检测HIV核酸所得荧光强度与核酸拷贝数的关系曲线。

具体实施方式

实施例1，用核酸层析技术检测HIV核酸的试纸条的制备

图1所示的用核酸层析技术检测HIV核酸的试纸条准备方法如下：

1，羧基修饰的含铕复合物的SiO₂微球合成以及微球与链亲和素的耦联均由长春志昂生物科技有限公司完成，生物素标记的核酸检测探针、核酸捕获探针以及阳性对照核酸探针由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。

该核酸检测探针及核酸捕获探针分别与HIV衣壳蛋白（gag）基因的一段核酸编码序列互补，它们的序列分别如下：

核酸检测探针，5‘-CAGAATGGGA TAGATTGCAT-Biotin-3’；

核酸捕获探针，5‘-GACCATCAAT GAGGAAGCTG-3’；

阳性对照核酸探针，这里它与核酸检测探针互补，5‘-ATGCAATCTATCCCATTCTG TTT-3’；

HIV核酸序列中目标序列如下，该序列含有探针结合区：

5‘-TGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCTCAT CTGGCCTGGTGCAATAGGCC CTGCATGCAC TGGATGCAAT CTATCCCATTCTGCAGCTTC CTCATTGATG GTCTCTTTTA ACATTTGCATGGCTGCTTGA TGTCCCCCCA CT-3’。

2，光致发光微球耦联的链亲和素与生物素标记的核酸检测探针结合以标记核酸检测探针。

将200μl10mM Tris-HCl,pH8.0，蛋白浓度0.5mg/ml的荧光微球耦联的链亲和素与200μl10mM Tris-HCl,pH8.0,50μM生物素标记的核酸检测探针混合，常温保温30分钟，12,000rpm离心10分钟，去掉上清用200μl10mM Tris-HCl,pH8.0、0.1%Tween20、5%蔗糖洗3次，最后再用200μl10mM Tris-HCl,pH8.0、0.1%Tween20、5%蔗糖重悬荧光微球标记的核酸检测探针。

3，光致发光微球标记的核酸检测探针处理标记物垫，核酸捕获探针以及阳性对照核酸探针处理捕获膜（此处为NC膜）

将光致发光微球标记的核酸检测探针溶液用BioDot公司喷膜仪喷到标记物垫（Millipore公司玻璃纤维）上，喷速为10μl/cm。将0.5mM核酸捕获探针以及0.5mM阳性对照核酸探针用BioDot公司喷膜仪划线NC膜（Millipore公司），划线速度为3μl/cm。然后将喷好的标记物垫和NC膜置于37°C恒温箱中干燥1小时，再将NC膜于紫外光下照射1分钟以使核酸捕获探针和阳性对照核酸探针结合到NC膜上。将标记物垫上含有光致发光微球标记的核酸检测探针的部分切割下来，得到5mm宽，30cm长的条带。

4，试纸条大卡的组装与切割

按照图1中试纸条的结构所示，将NC膜首先粘贴在支撑底板（Millipore公司塑料底板）上，在靠T线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫（Millipore公司），在靠C线一侧粘贴吸水垫（Millipore公司吸水纸），然后用BioDot公司切割机切割成5mm宽的试纸条，于铝箔袋中封闭保存备用。

实施例2，用核酸层析技术检测样品中的HIV病毒

将100μl含0、10、100、10³、10⁴拷贝的HIV病毒目标核酸序列分别滴加到核酸层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后用荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对核酸拷贝数的对数作图得荧光强度对核酸拷贝数的标准曲线如图2。

用病毒核酸提取试剂盒（长春志昂生物科技有限公司）在生物安全实验室中提取已灭火的HIV病毒样品中的核酸，将所得核酸样品取100μl滴加到荧光核酸层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测荧光信号，将荧光强度结合标准曲线计算得RNA拷贝数为10³个，与之前荧光定量PCR检测的结果一致，说明荧光核酸层析技术定量检测核酸的方法是可靠的。

实施例3，用核酸层析技术检测肺癌标志物miR-15b的试纸条制备

羧基修饰的含铂复合物的聚苯乙烯微球合成以及微球与链亲和素的耦联均由长春志昂生物科技有限公司完成，生物素标记的核酸检测探针、核酸捕获探针以及阳性对照核酸探针由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。光致发光微球耦联的链亲和素与生物素标记的核酸检测探针结合、标记物垫与捕获膜的处理以及试纸条大卡的组装与切割方法同实施例1，最后获得标记物垫含有铂复合物聚苯乙烯微球标记的核酸检测探针、捕获膜含核酸捕获探针的试纸条。

miR-15b检测相关核酸序列如下：

核酸检测探针，5‘-GTGGTGTATG TGCTGCTA-Biotin-3’

核酸捕获探针，5‘-GTTGTTGTGT AAACCATG-3’

阳性对照核酸探针，5‘-TAGCAGCACA TACACCAC-3’

miR-15b核酸序列：5‘-UAGCAGCACA UCAUGGUUUA CA-3’

miR-15b对应的DNA序列：5‘-TAGCAGCACA TCATGGTTTA CA-3’

实施例4，用核酸层析技术检测样品中的miR-15b

将100μl含0、10、100、10³、10⁴拷贝的miR-15b对应的DNA序列（上海金斯瑞合成）分别滴加到核酸层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后用检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测磷光信号，然后用磷光强度相对核酸拷贝数的对数作图得磷光强度对核酸拷贝数的标准曲线。

用RNA提取试剂盒（长春志昂生物科技有限公司）提取肺癌病人血样中的核酸，将所得核酸样品取100μl（RNA浓度：10ng/ml）滴加到核酸层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测磷光信号，将磷光强度结合标准曲线计算得RNA拷贝数为60个，与之前荧光定量PCR检测的结果一致，说明核酸层析技术定量检测核酸的方法是可靠的。

实施例5，用核酸层析技术检测肺癌标志物miR-15b的试纸条制备

羧基修饰的含荧光素的聚苯乙烯微球合成以及微球与链亲和素的耦联均由长春志昂生物科技有限公司完成，生物素标记的核酸检测探针、核酸捕获探针以及阳性对照核酸探针由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。光致发光微球耦联的链亲和素与生物素标记的核酸检测探针结合、标记物垫与捕获膜的处理以及试纸条大卡的组装与切割方法同实施例1，最后获得标记物垫含有荧光素聚苯乙烯微球标记的核酸检测探针、捕获膜含核酸捕获探针的试纸条。

miR-15b检测相关核酸序列如下：

核酸检测探针，5‘-GTGGTGTATG TGCTGCTA-Biotin-3’

核酸捕获探针，5‘-GTTGTTGTGT AAACCATG-3’

阳性对照核酸探针，5‘-TAGCAGCACA TACACCAC-3’

miR-15b核酸序列：5‘-UAGCAGCACA UCAUGGUUUA CA-3’

miR-15b对应的DNA序列：5‘-TAGCAGCACA TCATGGTTTA CA-3’

实施例6，用核酸层析技术检测样品中的miR-15b

将100μl含0、100、10³、10⁴、10⁵拷贝的miR-15b对应的DNA序列（上海金斯瑞合成）分别滴加到核酸层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后用检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对核酸拷贝数的对数作图得荧光强度对核酸拷贝数的标准曲线。

用RNA提取试剂盒（长春志昂生物科技有限公司）提取肺癌病人血样中的核酸，将所得核酸样品取100μl（RNA浓度：10ng/ml）滴加到核酸层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测磷光信号，将磷光强度结合标准曲线计算得RNA拷贝数为300个，与之前荧光定量PCR检测的结果一致，说明核酸层析技术定量检测核酸的方法是可靠的。

虽然本申请详细描述了具体的实施例，但本申请不限于这些实施例，相反，其意图涵盖包括在实施例的精神和范围内的各种修改和等同方案，在一些具体情况下，可以缺少和增加某个或某些技术特征而不脱离本发明的精神和范围，本申请的范围仅由权利要求书限定。

Claims (10)

1.一种用核酸层析技术检测核酸的试纸条，包含标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有光致发光微球标记的核酸检测探针，所述捕获膜含有核酸捕获探针。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是荧光微球。

3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

4.如权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含镧系元素复合物的荧光微球。

5.如权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的荧光微球。

6.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是磷光微球。

7.如权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述磷光微球是含铂复合物的磷光微球。

8.如权利要求1-7任一项所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是二氧化硅微球。

9.如权利要求1-7任一项所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是聚苯乙烯微球。

10.一种用核酸层析技术检测核酸的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条的样品垫上滴加含核酸的样品，反应后检测信号。