KR102135979B1

KR102135979B1 - 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법

Info

Publication number: KR102135979B1
Application number: KR1020170166156A
Authority: KR
Inventors: 배진현
Original assignee: (주)루녹스
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2020-07-20
Also published as: KR20180081445A

Abstract

본 발명은 (a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법과 상기 방법을 이용한 질병의 신속 진단방법에 관한 것이다.
본 발명은 빠르고 신속하게 PCR 결과를 확인하는 방법을 제공하며, 이에 따라 전문가 및 특정 설비 없이도 단시간에 결과를 분석함으로서 응급 및 현장에서의 신속한 진단이 가능하다. 이는 특히 최근에 휴대용 PCR 장치가 개발된 것과 결합되어, 그 시너지를 낼 수 있다.

Description

핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법{Method for rapidly detecting nucleic acid and rapid diagnosic method of disease using thereof}

본 발명은 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법과 상기 방법을 이용한 질병의 신속 진단방법에 대한 것이다.

호흡기 바이러스는 급성 호흡기 감염의 주요 원인이며, 나이나 성별에 관계없이 가장 흔한 질병이라 할 수 있다. 특히 영아나 노인, 심폐기능과 면역기능이 저하된 사람들의 경우 후유증을 유발하여 사망에 이를 수 있는 것으로 알려져 있다. 호흡기 바이러스와 관련된 질환은 가장 흔하게는 감기 증상으로 시작하여, 인두염, 만성 천식의 악화, 폐렴에 이르기까지 다양하다. 이런 호흡기 바이러스를 조기에 진단하게 되면 불필요한 항생제의 남용을 예방할 수 있고, 바이러스의 유형을 조기에 발견하여 적절한 환자 치료를 수행할 수 있는 장점이 있다. 특히 신종 인플루엔자 H1N1 바이러스의 경우처럼, 신·변종 인플루엔자 바이러스에 의한 대유행이 발생했을 때, 현재의 백신(vaccine) 개발 기술력으로는 이른 시간 내에 예방 백신을 개발할 수 없으며, 현재 사용되고 있는 항바이러스(antiviral) 치료제들은 감염 초기(감염 후 최소 48 시간 이내)에 투약을 해야 하는 제한적 효능성의 한계가 있다.

이처럼 팬더믹(pandemic) 인플루엔자가 발생했을 때, 예방 백신의 개발 시점까지 항바이러스 치료제의 효능을 최대화하기 위하여, 의료 기관을 거치지 않고 실시간으로 감염 여부를 판단하여 적절한 치료를 받을 수 있도록, 현장에서 신속하게 조기 진단할 수 있는 장치의 개발이 절실히 필요하다. 이러한 장치의 개발은 국민의 불안감 해소와 의료비 절감 등과 같이, 국가·사회적으로 그 파급 효과가 매우 크다고 할 수 있다.

기존에 이러한 호흡기 바이러스의 진단방법은 세포배양법, 신속항원검사법 등이 있다. 세포 배양법의 경우는 검사결과를 확인하는데 5~9일 이상이 소요되어 호흡기 바이러스 감염의 조기 진단과 치료에 어려움이 있으며, 이런 단점을 보안하기 위해 24~72시간 내에 결과를 확인하면서 민감도는 전통 배양법과 비슷한 R-mix 바이러스 배양법 등이 시행되고 있지만 역시 조기 진단과 치료에는 한계를 보이고 있다. 신속항원검사법은 빠른 시간에 결과를 확인할 수 있지만 민감도가 전통 배양법 보다 낮아 위음성이 많은 문제점이 있다.

좀 더 구체적으로, 환자에게 항바이러스제 및 항플루제의 신속한 사용을 결정할 필요가 있는 의사나 신종인플루엔자의 감염여부에 대한 확진결과를 기다리는 보호자에게 있어 현장에서 바로 인플루엔자의 감염여부를 확인 할 수 있는 검사방법은, 인플루엔자의 항원을 검출하는 항체 기반의 면역 크로마토그래피(신속항원검사)인 ‘신속인플루엔자검사(Rapid Influenza Diagnostic Test; RIDT)’가 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 RIDT의 경우 인플루엔자 바이러스 진단의 표준검사법(Cold standard)인 바이러스 배양(viral culture) 방법이나 최근 많이 사용되고 있는 실시간 중합효소연쇄반응(Realtime-RT-PCR)에 비해 민감도가 떨어진다는(계절 인플루엔자에 대해 Viral culture 대비 50-70%의 민감도) 점이 신종인플루엔자 발생 이전부터 인플루엔자 진단에 있어 주의해야 할 사항으로 지적되어 왔다. 실제 2009년도 신종인플루엔자 발생 이후 다양한 RIDT를 이용한 많은 코호트(cohort)에서 신종인플루엔자 진단에 대한 민감도 및 특이도 평가가 이루어졌고, 그 결과 다양한 범위의 민감도(11-70%)를 나타냈으며, 상당수의 RIDT가 환자의 신종인플루엔자 감염 확진에 사용되기에는 미흡한 민감도를 나타내어 신종인플루엔자 진단에 부적합한 것으로 나타났다.

결과적으로, RIDT를 통한 인플루엔자 바이러스의 진단은 신속한 결과를 얻는 장점이 있지만, 검사방법의 특성상 Viral culture 및 Realtime RT-PCR에 비하여 민감도가 떨어지는 단점이 있고, 필요시 RIDT에 의해 음성 판정이 나온 환자에 대해서 Viral culture 및 Realtime RT-PCR 통한 재검사가 필요하다(질병관리본부 감염병센터 인플루엔자바이러스과 이화중, 인플루엔자 진단을 위한 신속진단검사의 고찰,2012,pp.1-5).

그러나 상기 PCR을 이용하는 경우에 있어서, PCR은 비교적 높은 신뢰성을 가지는 분자적 진단방법이지만, PCR 산물에 의하여 결과를 도출, 분석 및 해석하는데 있어서 특정한 전문 인력에 의존해야하는 문제점이 있었다.

[비특허문헌 1] 질병관리본부 감염병센터 인플루엔자바이러스과 이화중, 인플루엔자 진단을 위한 신속진단검사의 고찰,2012,pp.1-5

이에 본 발명자들은, 질병의 존재 유무의 검출에 있어서 정확성 및 신뢰도가 높으면서도 기존 신속항원진단법과 같이 결과의 도출이 용이하고 검사 시간이 짧은 질병 검출방법을 고안하고자 연구하던 중, 본 발명의 신속 핵산 검출방법을 이용하면 신속하고 용이하게 높은 감도로 질병 검출이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 (a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 환자의 검체로부터 수득한 핵산 시료에 대하여, 질병 마커 핵산의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 질병의 신속 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 환자의 검체로부터 수득한 핵산 시료에 대하여, 질병 마커 핵산의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 질병의 신속 진단 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

(a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;

(b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계

를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법을 제공한다.

본 발명에서 용어“목적 핵산”이란, 본 발명에서 시료 내에 존재하고 있는지 여부를 검출하고자 하는 물질로서, 특정 서열(sequence)을 이루는 다수 핵산물질 중합체를 의미한다. 상기 핵산 물질의 종류는 이에 제한되지 않으나, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 등 일 수 있으나, 가장 바람직하게 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 목적 핵산은 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적 핵산은 마커로서 기능하는 것으로서, 시료 속에 상기 목적 핵산의 존재 유무를 검출함으로써 특정 질병(또는 병태)의 존재 유무를 확인할 수 있다.

본 발명의 목적 핵산 검출 방법은 다양한 질병(또는 병태)의 검출에 이용가능한 것으로서 그 질병의 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 감염성 질환; 또는 유전자 변이를 동반하는 질환(돌연변이성 질환 포함)으로서 암(cancer), 염증성 질환, 대사성 질환, 신경계 질환, 근골격계 질환, 소화기계 질환, 알러지 질환, 면역관련 질환, 내분비계 질환, 심혈관계 질환, 비뇨생식기계 질환, 호흡기계 질환 및 피부질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 검출하고자하는 질병의 종류에 따라, 당업자가 질병 마커로서 상기 목적 핵산을 용이하게 구성할 수 있다.

상기 목적 핵산이 질병 마커인 경우, 상기 질병 마커 핵산은 감염원으로부터의 외래 유전자(foreign gene) 또는 개체의 내재 돌연변이 핵산(유전자) 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

상기 감염원은 공지의 병원성 미생물이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 곰팡이균(fungi) 또는 기생충 등을 포함한다. 일례로 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 지카바이러스, 메타뉴모 바이러스, 아데노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 라이노바이러스, 아데노바이러스, 홍역 바이러스, 로타바이러스, HIV 바이러스, 노로바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일례로 상기 박테리아는 슈도모나스 (Pseudomonas), 엑세리키아 (Excherichia), 클레브실라 (Klebsiella), 엔트로박터 (Enterobacter), 프로테우스 (Proteus), 세라티아 (Serratia), 캔디다 (Candida), 스트라필로코시 (Staphylococci), 스트렙토코시 (Streptococci), 클라미디아 (Chlamydia), 미코플라즈마 (Mycoplasma) 속(genus)의 박테리아 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 내재 돌연변이 핵산은 특정 질병(또는 병태) 상태에서 개체의 내재 유전자(endogenus gene)에 돌연변이가 일어난 것을 의미하는 것으로서, 공지의 암(cancer) 마커들과 같이 개체 내에서 자연발생적으로 생성된 것일 수 있고 또는 상기 외래 유전자의 개체 내(세포 내) 도입에 의하여 발생되는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 “돌연변이”는 변이가 유발되지 않은 대조군과 비교하여 유전자 수준에서 변이가 발생하여, 이러한 변이로 인해 표현형(특히 질병상태)의 특징에 차이가 유발된 것으로, 자연에서 발견되는 돌연변이는 물론 인위적으로 도입된 돌연변이를 모두 포함하는 것이다. 돌연변이는 무작위 또는 특정 위치에서 발생한 돌연변이, 유전자를 이루는 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 및/또는 치환 등에 의한 돌연변이를 모두 포함하는 것이다.

바람직하게, 상기 질병 마커 핵산은 감염원으로부터의 외래 유전자(foreign gene) 또는 상기 외래 유전자의 도입에 의한 내재 돌연변이 핵산일 수 있다.

상기 목적 핵산 또는 질병 마커 핵산의 구체적 서열은, 진단 등에 있어서 정보를 얻고자 하는 구체적 질병의 종류에 따라 당업자가 그 목적하는 구체적 서열을 결정할 수 있다. 일례로 당업계에는 인플루엔자 바이러스의 항원 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 또는 뉴라미니다아제(Neuraminidase) 코딩 핵산을 인플루엔자 감염의 진단을 위한 목적 핵산으로 할 수 있음이 개시되어 있다.

본 발명에서 용어“시료”란 검출하고자 하는 목적 핵산이 포함되어 있는 분석 대상물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 특정 질병이 있는 것으로 의심되는 개체(또는 환자)의 검체로부터 수득되는 것 일 수 있다. 상기 시료는 검체 자체일 수 있고, 또는 상기 검체에 분쇄, 추출, 정제 등의 임의의 처리를 가한 가공물 일 수 있다. 상기 검체란 검사에 필요한 재료를 의미하는 것으로, 조직, 세포, 전혈(혈액), 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 혈액 또는 타액 일 수 있다.

(a) 단계에서는, 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응( PCR )을 수행한다.

본 발명에서 용어“프라이머(primer, 시발체)”는 자유 3’말단 수산화기를 가지는 짧은 핵산 서열로, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)과 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 상기 프라이머는 5개 내지 50개, 바람직하게는 10개 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 센스 및 안티센스 핵산(즉, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머) 쌍으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

상기 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 전술한 목적 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하는 것으로, 목적 핵산 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도이면 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게 상기 프라이머는 목적 핵산 서열에 완전 상보적 (perfectly complementary)인 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머는 5’말단에 태그(tag)가 부착되는 것을 특징으로하며, 상기 태그는 후술하는 (b) 단계에서의 포획성분(capture element)과 부착 내지 결합하는 물질을 통칭한다.

상기 태그는 임의의 적절한 방법에 의해 프라이머에 부착되거나 포함될 수 있는 것으로, 상기 태그는 그 자체가 직접 프라이머에 결합되거나 또는 링커 분자를 통하여 결합될 수 있다. 상기 결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있으며, 태그 물질의 구체적 성분에 따른 이의 부착방법은 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

태그는, PCR에 의해 상기 태그가 부착된 프라이머를 시발점으로 신장된 핵산 서열이 고체 지지체에 부착된 포획 성분(또는 수용체)과 직접적 또는 간접적으로 결합할 수 있도록 한다. 상기 포획 성분은 전형적으로 태그와의 상호작용에 있어 매우 특이적이거나, 그 다음의 처리 단계 동안 결합을 유지하도록 선택(또는 설계)된다. 태그는 고체 지지체 상의 공간적으로 정해진 위치에, 상기 태그가 부착된 프라이머를 시발점으로 신장된 핵산 서열을 위치시킬 수 있다. 따라서, 서로 다른 태그들은 서로 다른 핵산 서열을 고체 지지체 상의 서로 다른 공간적으로 정의된 곳에 위치시킬 수 있다.

상기 태그는 함께 사용되는 포획성분 물질에 따라 그 종류를 당업자가 결정할 수 있는 것으로서, 상기 태그 또는 포획성분은 이에 제한되지 않으나 구체적으로 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당, 다당, 항체, 애피바디(affibody), 항체 모조체, 세포 수용체, 리간드, 지질, 이러한 구조들의 임의의 단편 또는 유도체를 포함한다. 일반적으로 태그는, 그것 자체 또는 태그에 부착된 프라이머 분자와 내적으로 상호작용하지 않도록 구성된다.

포획성분과 이에 특이적으로 결합하는 태그 물질의 조합은, 바람직하게 태그와 포획성분의 결합이 비오틴-아비딘 결합, 비오틴-스트렙타비딘 결합, 비오틴-엑스트라비딘 결합, 비오틴-뉴트라비딘 결합, 벤질구아닌-SNAP 결합, 벤질시토신-CLIP 결합, 효소-기질 결합, 항원-항체 결합, 금속-히스티딘 결합, 금속화합물-단백질 결합, 단백질-단백질 결합 또는 핵산 간의 상보적 결합에 의한 것일 수 있고, 바람직하게는 비오틴-아비딘 결합, 비오틴-스트렙타비딘 결합, 비오틴-엑스트라비딘 결합 또는 비오틴-뉴트라비딘 결합에 의한 것일 수 있다.

상기 태그가 비오틴인 경우, 상기 포획 성분은 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 엑스트라비딘과 같은 비오틴 결합 단백질일 수 있다. 반대로 포획 성분이 비오틴이고 태그가 비오틴 결합 단백질 일 수 있다.

상기 태그가 폴리히스티딘(polyhistidine)인 경우, 상기 포획 성분은 니켈(nickel), 코발트(cobalt), 철(iron)과 같은 금속 이온 또는 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid; NTA)과 킬레이트될 때 폴리-히스티딘과 배위 화합물을 형성할 수 있는 임의의 다른 금속 이온과 킬레이트화된 니트릴로트리아세트산일 수 있다. 마찬가지로 태그와 포획성분이 반대될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용될 수 있으며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명에서 용어‘PCR(polymerase chain reaction)’또는‘핵산증폭반응’은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture), Mg2 + 등의 2가 이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성 또는 신장되는 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 본 문서에서는 “증폭산물” 또는 “PCR 산물”이라고 지칭하였다.

상기 PCR의 종류는, 검출을 원하는 특정 유전물질(목적 핵산)을 증폭하는 PCR 방법으로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일례로, 단일 PCR, nested PCR, 다중 PCR, 마이크로 PCR, RNA를 대상으로 역전사효소를 이용하여 complementary DNA를 합성하고 이를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하는 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 등을 포함한다.

본 발명의 검출방법에서 채택되는 PCR 반응조건은, PCR의 종류 예컨대 단일 PCR, nested PCR, 다중 PCR, 마이크로 PCR 등에 따라 통상의 PCR 반응조건을 채택하거나 일부 변형하여 실시할 수 있으며, 이는 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 구성할 수 있는 범주에 해당된다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서의 PCR은 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침은, 핵산 서열 신장 시 핵산 이중 가닥(double strand)에 특이적으로 결합하는 것으로 당업계에 알려진 형광염료(dye)라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 SYBR green, Picogreen, Evagreen, Hoechst 33258, Hoechst 33342, ethidium bromide, acridine orange, propidium iodide, mithramycin, TO-PRO-3, TOTO, YOYO, YOPRO-1 등을 포함한다.

상기 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침은 태그가 부착된 프라이머, DNA 중합효소, 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 등과 함께 PCR 반응 혼합물에 포함되어 제공되며, PCR 반응으로 합성된 이중가닥 핵산 서열(DNA 또는 RNA 서열)에 결합하여 형광신호를 발생한다. 상기 형광신호로부터 목적 핵산(표적 유전자)의 존재여부를 알 수 있다.

(a) 단계를 통하여 목적 핵산 서열의 증폭 반응이 일어나며, 이중 가닥으로 신장된 핵산 서열에 형광 탐침이 부착하고 5’말단에는 태그가 부착된 PCR 산물이 생성된다.

(b) 단계는, 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계이다.

상기 포획성분과 태그의 종류, 이들의 조합 및 결합관계에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 상기 용어‘집적’은 다량의 포획 성분이 고체상(solid phage)의 특정 위치에서 특정 모양으로 고정되어 모여있는 상태를 의미하는 것으로, 상기 포획 성분은 고체상에서 선(line), 도트(dot) 등 다양한 모양으로 집적될 수 있다.

상기 고체상은 “테스트 스트립(test strip)”의 일부 또는 전체를 구성하는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 테스트 스트립은 본 명세서에서 분석 스트립(assay strip) 등의 용어와 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 고체상(solid phage)은 일반적으로 면역크로마토그래피 분석에 사용되는 것으로 당업계에 알려진 패드, 멤브레인 등의 고체 지지수단이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.

상기 테스트 스트립은 상기 (a) 단계에서 이용되는 태그에 특이적으로 결합하는 포획성분을 이용하여 구성되는 것이라면 구체적인 제조형태 및 제조방법이 제한되지 않으며, 시료 패드(sample pad), 콘쥬게이트 패드(conjugate pad) 및 흡수 패드(absorbent pad)를 포함한다. 상기 테스트 스트립은 당업계에 공지된 면역 크로마토그래피 테스트 스트립 구성 방법을 참조로 할 수 있다.

통상적으로 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 분석물질과 반응하여 검출 신호를 나타낼 수 있는 임의의 반응물질을 포함하는 분석스트립(assay strip) 또는 상기 분석스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다. 통상적인 분석스트립은 액상 검체(시료)를 수용하는 검체(시료) 패드, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드, 검체 중의 분석물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제(항체 또는 항원)를 고정시킨 다공성 멤브레인 패드(콘쥬게이트 패드) 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결 및 부착되어 연속적으로 배열된다. 상기 분석스트립이 플라스틱 케이스 내부에 장착되어 사용되는 경우, 케이스의 상부에는 검체(시료) 패드의 위치에 검체(시료)를 적하하기 위한 검체 투입구가, 다공성 멤브레인 패드의 결합제가 고정된 위치에는 검사 결과를 확인하기 위한 결과 확인창이 형성된다. 이와 같이, 분석스트립을 이용한 면역 크로마토그래피 분석법에 있어서, 검체(시료) 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 다공성 멤브레인 패드(콘쥬게이트 패드)를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 이때, 상기 접합체 패드에 함유되어 있던 접합체도 액상 검체와 함께 이동하여, 검체 중에 분석하고자 하는 물질이 존재하면, 접합체가 분석물질을 매개하여 다공성 멤브레인 패드에 고정된 결합제와 결합하거나(통상, "샌드위치(sandwich) 반응"이라 한다.), 접합체와 분석물질이 경쟁적으로 결합제와 결합함으로서(통상, "경쟁(competition) 반응"이라 한다.), 검체 중 분석물질의 존재 여부를 육안으로 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있다.

본 발명에서 상기 (b) 단계에 사용되는 테스트 스트립은 면역 크로마토그래피에 통상적으로 사용되는 테스트 스트립과 비교하여 별도의 접합체 패드를 필요로 하지 않으며, 이는 (a) 단계에서 PCR 수행 시 이중가닥 핵산에 결합하는 탐침을 미리 처리하는 것에 기인한다. 이로써 통상적인 분석스트립에서, 접합체 패드에 건조된 형태로 고정되어 있는 접합체가 모세관 현상에 의해 이동하는 액상 검체와 혼합될 때, 접합체와의 결합이 균일하게 이루어지지 못하여 개별 분석스트립 마다 편차가 발생할 수 있고 접합체로 사용되는 항체(일반적으로 단백질)의 변성이 발생할 수도 있는데, 이로부터 검체 분석의 정확도와 재현성이 저하될 수 있는 문제점이 감소된다.

따라서 본 발명의 테스트 스트립은 바람직하게, 시료 패드(sample pad), 콘쥬게이트 패드(conjugate pad) 및 흡수 패드(absorbent pad)가 순차적으로 연결되어 이루어지는 것일 수 있다. 상기 콘쥬게이트 패드에는 태그 입자와 복합체를 이루는 포획 성분이 고정되는 것을 특징으로 한다. 상기 콘쥬게이트 패드는 니트로셀룰로우스 멤브레인(Nitrocellurose membrane) 또는 PVDF 멤브레인 상에 포획 성분을 고정화하는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 PCR 산물의 처리는, 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상, 즉 콘쥬게이트 패드에 직접 처리 또는 간접 처리되는 형태를 모두 포함한다. 상기 간접처리는 바람직하게 테스트 스트립(분석 스트립) 상의 시료 패드에 PCR 산물이 적하되고, 패드 상의 모세관현상에 의하여 PCR 산물이 상기 콘쥬게이트 패드를 통과하는 것일 수 있다.

태그와 포획성분의 결합 반응을 통하여, 태그가 부착된 PCR 산물은 테스트 스트립 상에 존재하는 포획 성분의 모양을 따라 해당 위치에만 특이적으로 존재하게 되며, PCR 산물에 부착된 형광 탐침에 의하여 해당 위치에서만 특수한 강도의 형광 신호를 발산하게 된다.

(c) 단계에서는 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계이다.

형광의 검출은 전술한 (a) 단계에서 사용되는 형광 탐침의 종류 및 성질에 따라 당업자가 그 검출 방법을 용이하게 결정할 수 있다. 형광 탐침의 종류에 따라 광원으로서 예를들면, Mecury lamp, Metal Halide lamp, Xenon lamp, UV lamp, LED lamp, Halogen lamp, laser 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 광원을 이용하여 해당 형광 탐침의 발광 또는 발색에 적합한 특정 파장의 빛을 조사 할 수 있다.

본 발명의‘목적 핵산의 신속 검출 방법’은 PCR 방법을 기반으로 하여 목적 핵산의 특이적 검출 정확도가 높으면서도, PCR 산물에 대한 증폭 결과를 테스트 스트립상의 특정 발색(형광)반응을 통해 위치적으로 파악함으로써 시각적으로 매우 신속하게 분석 가능한 것이 장점이다. 통상 테스트 스트립은 소형으로 휴대 및 사용이 간편하고 편리한 장점이 있다. 이는 기존에 PCR 산물의 분석에 있어서 기존에 전기영동 또는 ELISA 등의 특정 분석 장치를 이용하는 경우에, 이에 따라 상당한 추가 분석 시간 및 전문 인력이 필요한 것과는 대비되는 것이다. 전기영동법을 이용하는 경우, gel 등을 제작하여야하고 전기를 흘려주는 특수한 장치가 필요할 뿐만아니라 분자량에 따른 핵산의 분리에 비교적 상당한 시간이 소요된다. ELISA 방법 또한 별도의 ELISA kit 및 reader 장치가 필요한데, 이러한 방법에 쓰이는 장치들은 통상 전문 실험실에 비치되어 사용되는 것으로서, 해외여행자의 입국 시 등의 현장진단 또는 기타 응급한 진단이 필요한 경우에 곧바로 현장에 적용되기 어려운 문제점이 있다. 이에 반해 본 발명은 테스트 스트립을 이용하기 때문에 현장 적용에 유리하며, 특히 휴대용 PCR 장치(예, 아람바이오 Palm PCR) 등과 함께 응급 현장에서 사용되는 경우, 질병의 신속 정확 검출 측면에서 시너지 효과를 가진다.

상기 (a),(b) 및 (c) 단계를 포함하는, 본 발명의 목적 핵산의 신속 검출 방법은 하기 (d) 단계를 추가로 포함하여 수행되는 것일 수 있다;

(d) 상기 (c) 단계의 형광 검출 결과가 상기(b) 단계에서 포획 성분이 집적된 위치와 일치하면 목적 핵산이 존재하는 것으로 판정하는 단계.

상기 (d) 단계는 목적 핵산의 특이적 증폭에 의한 형광 시그널과 비특이적 형광 시그널을 구분하기 위한 것으로, 정해진 위치 이외에서 형광 신호가 탐지되는 경우 즉, 목적 핵산 이외의 다른 핵산들 간의 혼성화 등에 의해 나타날 수 있는 위양성 반응을 배제하는 단계이다. 태그가 부착된 PCR 산물은 테스트 스트립 상에 존재하는 포획 성분의 모양을 따라 해당 위치에만 특이적으로 존재하게 되며, 따라서 상기 위치에서만 특수한 강도의 형광 신호를 발산하게 된다.

전술한 본 발명의 목적 핵산 신속 검출방법은, 검출하고자 하는 목적 핵산이 특정 질병(또는 병태)을 나타내는 마커인 경우, 신속하게 질병의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다는 것에 그 이점이 있다.

따라서 본 발명은

(a) 환자의 검체로부터 수득한 핵산 시료에 대하여, 질병 마커 핵산의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응( PCR )을 수행하는 단계;

를 포함하는, 신속하게 질병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한 상기 방법은

(d) 상기 (c) 단계의 형광 검출 결과가 상기(b) 단계에서 포획 성분이 집적된 위치와 일치하면 질병마커 핵산이 존재하는 것으로 판정하는 단계;

를 추가로 포함할 수 있다.

상기 질병 마커 및 (a) 내지 (d) 단계에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명은 태그로 표지된 프라이머, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침 및 상기 태그에 특이적인 포획성분이 고정된 테스트 스트립을 이용하여 빠르고 신속하게 PCR 결과를 확인하는 방법을 제공하며, 이에 따라 전문가 및 특정 설비 없이도 단시간에 결과 분석이 가능함으로서 응급 및 현장에서의 진단을 할 수 있다. 결과분석에 대한 과정을 간소화함으로서 현장에서 손쉽게 결과 분석이 가능하고 응급한 상황에서 진단을 할 수 있다. 또한 전문가가 동행하지 않아도 신뢰도 높은 결과 분석이 가능함으로써 PCR이 가진 장점을 시간적, 공간적 한계에 구애 받지 않고 사용할 수 있는 장점이 있다. 이는 특히 최근에 휴대용 PCR 장치가 개발된 것과 결합되어, 그 시너지 효과를 낼 수 있다.

본 발명에 의하면, 메르스나 지카바이러스와 같은 전염성이 강하며 그 피해가 막심한 바이러스에 대하여, 지역 병원, 또는 해외여행자의 입국 시 의심환자를 대상으로 단시간에 진단을 내림으로써 바이러스의 확산방지 및 환자의 예후에 도움을 줄 수 있다. 또한, 성병감염자의 진단 시 시료를 전문가에게 보내 확진 받는데 통상 1주일의 시간이 소요되는데, 이러한 경우에도 본 발명을 통해 조기 진단하여 확진함으로써 질병확산을 막을 수 있다. 그리고, AI 등 가축질병에 대하여 현장검사를 빠르게 실행함으로써 질병확산으로 인한 축산농가의 피해를 최소화할 수 있으며, 기타 응급한 진단 및 현장진단이 필요한 수요에 대응함으로써 다양한 파급효과를 가질 것으로 기대된다.

도 1은 태그로서 Biotin이 부착(표지)된 primer를 이용한 PCR에서, 목적 핵산(주형 핵산)과 프라이머의 결합관계를 나타낸다.
도 2는 PCR 산물이 아비딘(포획 성분)이 고정된 탐지선(test line)에 부착된 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 테스트 스트립 상에 형광이 검출되는 원리를 나타낸 모식도이다.
도 4는 다양한 핵산이 혼합된 시료 중에서, 본 발명에 따라 SIT1 유전자 핵산의 특이적 검출을 시험한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따라 테스트 스트립 상에서 SIT1 유전자 핵산이 특이적 검출된 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

PCR 및 면역 크로마토그래피 기반, 신속 핵산 검출 방법

<1-1> 아비딘 기반 테스트 스트립(test strip) 제조

플라스틱 패드(Millipore社, 독일)에 검출층으로 사용되는 니트로셀룰로스 멤브레인(180 sec Nitrocellulose, Millipore社, 독일)과 흡수패드(Millipore社, 독일)를 붙인 후, 디스펜서(Dispenser) 시스템(MDS)을 사용하여 증류수에 녹인 Avidin(A9275-1MG, Sigma-Aldrich, 미국) 1 mg/mL 용액을 각각 6 cm/sec 속도로 멤브레인에 선을 그어 각각 탐지선(test line)을 형성하였다. 상기 멤브레인을 건조시킨 후, 절단기에 넣어 3 mm 간격으로 절단하였다. 시료 패드(C068, Millipore社, 독일)는 0.5％ 트윈(Tween) 20, 5％ 수크로스, 5％ 덱스트란, 0.05％ 아지드화나트륨(sodium azide) 수용액에 담근 후 건조하여 10×3 mm 정도로 절단하여 제작하였다. 최종적으로 본 발명의 테스트 스트립은 Avidin으로 탐지선을 그은 니트로셀룰로오스 멤브레인을 중심으로 한쪽 말단에는 시료패드를 다른 쪽 말단에는 흡수패드를 부착하는 형태로 이루어졌다(도 3참조).

<1-2> 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 비오티닐화 핵산의 생성

다양한 유전자의 핵산이 혼합된 시료로부터, SIT1(NCBI sequence ID: XM_005660221, 서열번호 1)의 유전자가 존재하는지를 검출하고자 하였다. 하기 표 1과 같이, SIT1 유전자의 dsDNA 서열 일부분과 상보적인 서열을 가지는 비오티닐화된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다(도 1 참조). PCR 장비로는 Applied Biosystems사의 veriti를 사용하였다. TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Mastet Mix(QPK-201)를 이용하여 하기 표 2와 같은 조성으로 PCR 반응용액을 제조하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 2분간 변성시킨 다음, 변성(95℃에서 20초), 결합 (55℃에서 40초) 및 연장 (72℃에서 1분)을 총 35회 반복하는 방식으로 수행하였다.

	Sequence (5'->3')
Forward primer (서열번호 2)	Biotin-GCTGCAGAAGAGGTGATGTGCTA
Reverse primer (서열번호 3)	TGAGATGGGTCGGTCACAACT

PCR 반응액 조성	용량
SYBR Green Realtime PCR Mastet Mix	10 ul
Forward primer	0.4 ul
Reverse primer	0.4 ul
DNA	2 ul (30 ng)
DW	7.2 ul
Total	20 ul

<1-3> 테스트 스트립 상에서 목적 핵산의 특이적 검출

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 테스트 스트립에 상기 <1-2>에서 제조된 PCR 산물을 처리하여, PCR 산물에 포함된 비오틴과 상기 스트립 상에 고정된 아비딘 사이에 결합반응을 유도한 후(도 2 참조), SYBR green dye에 의한 형광 패턴을 검출 및 분석하였다. 시료패드 부분에, PCR 산물 20 ul에 150 ul의 D.W(증류수)를 추가하여 도포하고 1분 후, 470nm LED 빛을 상기 패드에 조사하여 SYBr green의 emission 신호를 확인하였다(도 3 참조).

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, 아비딘(avidin)을 집적시킨 부분에서 즉각적인 형광신호가 나타남을 확인하였다.

또한, 도 5에서 보는 바와 같이, 아비딘(avidin)을 집적시킨 부분에서 즉각적인 형광신호가 나타나, 본 발명의 테스트 스트립 상 특정 검출 위치에서 목적 핵산이 특이적으로 검출됨을 확인하였다.

이로써, 상기 실시예는 본 발명의 방법에 따라 빠르고 신속하게 PCR 결과를 확인할 수 있음을 제시한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 (a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법과 상기 방법을 이용한 질병의 신속 진단방법에 관한 것이다.

본 발명은 빠르고 신속하게 PCR 결과를 확인하는 방법을 제공하며, 이에 따라 전문가 및 특정 설비 없이도 단시간에 신뢰도 높은 분석 결과를 제공함으로써 응급 현장에서의 신속한 진단이 가능하다. 이는 특히 최근에 휴대용 PCR 장치가 개발된 것과 결합되어, 그 시너지 효과를 낼 수 있다. 본 발명에 의하면, 메르스나 지카바이러스와 같은 전염성이 강하며 그 피해가 막심한 바이러스에 대하여, 지역 병원, 또는 해외여행자의 입국 시 의심환자를 대상으로 단시간에 진단을 내림으로써 바이러스의 확산방지 및 환자의 예후에 도움을 줄 수 있다. 또한, 성병감염자의 진단 시 시료를 전문가에게 보내 확진 받는데 통상 1주일의 시간이 소요되는데, 이러한 경우에도 본 발명을 통해 조기 진단하여 확진함으로써 질병확산을 막을 수 있다. 그리고, AI 등 가축질병에 대하여 현장검사를 빠르게 실행함으로써 질병확산으로 인한 축산농가의 피해를 최소화할 수 있으며, 기타 응급한 진단 및 현장진단이 필요한 수요에 대응함으로써 다양한 파급효과를 가질 것으로 기대되므로 산업상 이용 가능성이 높다.

<110> BAE, Jin Hyun <120> Method for rapidly detecting nucleic acid and rapid diagnosic method of disease using thereof <130> NP16-0159P <150> KR 10-2017-0002346 <151> 2017-01-06 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIT1(Signaling Threshold Regulating Transmembrane Adaptor 1,NCBI sequence ID: XM_005660221) <400> 1 gctgcagaag aggtgatgtg ctataccagt ctgcagctgc ggcctcctca gggccggatc 60 cccagccctg caagccccat caaatactca gaggtggtgc tggactctga gccagagccc 120 caggcttcag gtcctgagcc ggagctctac gcctcagtgt gtgcccagac ccgcagagcc 180 cgggcttcct ttccagacca ggcctacgcc aacagccagc ctgcacccag ctgagatgga 240 gggcctggca cactggggca cgcatctccc ccacctcctc tgttgcaggg gttactgcta 300 ccctgtctga ggtgtgactg ttttccaacc ccccctgaag acaagcagcc attgcccagt 360 cacagggggg gtgttccctt aacttctttt ctgagttgtg accgacccat ctca 414 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SIT1(biotin tagged) <400> 2 gctgcagaag aggtgatgtg cta 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SIT1 <400> 3 tgagatgggt cggtcacaac t 21

Claims

(a) 목적 핵산 서열의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
(b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계로,
상기 단계는 시료 패드(sample pad) 및 이와 연결된 콘쥬게이트 패드(conjugate pad)를 포함하는 테스트 스트립(test strip)에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하는 것으로서,
상기 고체상은 상기 테스트 스트립(test strip) 중 콘쥬게이트 패드(conjugate pad)로서 제공되며,
상기 테스트 스트립은 시그널을 발생시키는 표지가 리간드에 접합된 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드를 포함하지 않으며,
상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물은 상기 시료 패드에 처리되는 것을 특징으로 하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 형광 검출 결과가 상기 (b) 단계에서 포획 성분이 집적된 위치와 일치하면 목적 핵산이 존재하는 것으로 판정하는 단계
를 포함하는, 목적 핵산의 신속 검출방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 태그와 포획성분의 결합은 비오틴-아비딘 결합, 비오틴-스트렙타비딘 결합, 비오틴-엑스트라비딘 결합, 비오틴-뉴트라비딘 결합, 벤질구아닌-SNAP 결합, 벤질시토신-CLIP 결합, 효소-기질 결합, 항원-항체 결합, 금속-히스티딘 결합, 금속화합물-단백질 결합, 단백질-단백질 결합, 또는 핵산간의 상보적 결합에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 태그는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 폴리펩티드(polypeptide), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당(oliggosaccharide), 다당(polysaccharide), 항체(antibody), 애피바디(affibody), 항체 모조체(antibody mimic), 세포 수용체(cell receptor), 리간드(ligand), 지질(lipid), 비오틴(biotin), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(strepavidin), 엑스트라비딘(Extravidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 금속(metal) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 포획성분은 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 폴리펩티드(polypeptide), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 잠금 핵산(locked nucleic acid), 올리고당(oliggosaccharide), 다당(polysaccharide), 항체(antibody), 애피바디(affibody), 항체 모조체(antibody mimic), 세포 수용체(cell receptor), 리간드(ligand), 지질(lipid), 비오틴(biotin), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(strepavidin), 엑스트라비딘(Extravidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 금속(metal) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침은 SYBR green, Picogreen, Evagreen, Hoechst 33258, Hoechst 33342, ethidium bromide, acridine orange, propidium iodide, mithramycin, TO-PRO-3, TOTO, YOYO 및 YOPRO-1으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 환자의 검체로부터 수득한 핵산 시료에 대하여, 질병 마커 핵산의 일부영역과 상보적인 서열을 가지고 태그가 부착된 프라이머(tagged primer)를 이용하여, 이중가닥 핵산에 결합하는 형광탐침과 함께 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
(b) 상기 태그가 부착되는 포획 성분이 특정 위치에 집적된 고체상에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하여 태그와 포획성분의 결합 반응을 유도하는 단계로,
상기 단계는 시료 패드(sample pad) 및 이와 연결된 콘쥬게이트 패드(conjugate pad)를 포함하는 테스트 스트립(test strip)에 상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물을 처리하는 것으로서,
상기 고체상은 상기 테스트 스트립(test strip) 중 콘쥬게이트 패드(conjugate pad)로서 제공되며,
상기 테스트 스트립은 시그널을 발생시키는 표지가 리간드에 접합된 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드를 포함하지 않으며,
상기 (a) 단계에서 생성된 PCR 산물은 상기 시료 패드에 처리되는 것을 특징으로 하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 고체상으로부터 형광을 검출하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 형광 검출 결과가 상기(b) 단계에서 포획 성분이 집적된 위치와 일치하면 질병 마커 핵산이 존재하는 것으로 판정하는 단계
를 포함하는, 신속하게 질병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 질병은 감염성 질환, 암, 염증성 질환, 대사성 질환, 신경계 질환, 근골격계 질환, 소화기계 질환, 알러지 질환, 면역관련 질환, 내분비계 질환, 심혈관계 질환, 비뇨생식기계 질환, 호흡기계 질환 및 피부질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 질병 마커 핵산은 감염원으로부터의 외래 유전자(foreign gene) 또는 개체의 내재 돌연변이 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.