KR20140121221A

KR20140121221A - 양자점 및 fret 현상에 기반한 dna 메틸화 검출 방법

Info

Publication number: KR20140121221A
Application number: KR1020130037727A
Authority: KR
Inventors: 하상수; 이은정
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-05
Filing date: 2013-04-05
Publication date: 2014-10-15

Abstract

본 발명은 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 이용하여 DNA 메틸화를 검출하는 방법, 및 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

Description

양자점 및 FRET 현상에 기반한 DNA 메틸화 검출 방법{Method for detection of DNA methylation based on quantum dots and FRET}

DNA 메틸화(methylation)는 고등생물의 발달에 매우 중요한 생화학적 프로세스로서, 메틸기 하나가 시토신 피리미딘 고리의 5번째 위치에 추가되거나 아데닌 퓨린 고리의 6번 질소에 추가됨으로써 수행될 수 있다. 이 변화는 세포 분화를 통해서 유전될 수 있다. 특히, 게놈의 염기서열에서 C와 G의 두 염기가 나란히 존재하는 것을 CpG라고 하는데, 그 중 DNA의 프로모터 영역에 CpG가 많이 존재하는 부분을 CpG 아일랜드(island)라고 부른다. 이 배열에서 시토신이 메틸화되는 경향이 많아 인간 게놈의 경우 전체 시토신 중 3 내지 4%는 메틸화되어 있다.

CpG는 진화과정을 거치면서 진핵생물 게놈에서는 점진적으로 감소되어 온 경향이 있으나, 포유동물 게놈에는 여전히 남아있다. 게놈에 존재하는 CpG의 메틸화 정도와 패턴은 포유동물의 종에 따라 다르고 조직에 따라서도 다른 매우 특이적인 양상을 보이고 있다. 구체적으로, 포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 CpG 아일랜드라는 부위가 존재하며, 이 부위는 0.5 내지 0.4kb 정도로 게놈의 유전자와 밀접한 연관성을 가지고 있는 것으로 보고되었으며, 이 CpG 아일랜드의 전사과정을 조절하는 서열은 프로모터 부근에 위치한다고 알려져 있다. 그러나, 세포 내에 존재하는 대부분의 CpG 아일랜드는 메틸화되지 않은 상태이며, 따라서 메틸화된 CpG 아일랜드의 존재 여부 및 위치는 생물학적으로 중요한 의미를 가지고 있다.

CpG 메틸화은 외부에서 유입되는 트랜스포존과 같은 이동성 유전자들의 기능을 무력화시키는 방어 기작이 되기도 한다. 외부 유입유전자들의 프로모터에 위치한 CpG 아일랜드가 메틸화되어 유전자발현이 원천 봉쇄된다. 시간이 경과함에 따라 메틸기가 붙은 시토신이 티민으로 치환되어 결국에는 이동성 유전자들은 점차 기능을 상실하게 된다. 또한, 중요하게도 암을 억제하는 유전자의 기능이 이들 유전자의 CpG 아일랜드의 메틸화로 암이 발생한 것이라는 연구결과도 나오고 있다. 암 억제 유전자의 기능소실은 특히, 다양한 돌연변이, 또는 프로모터 부위의 메틸화로 인하여 일어나게 되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 메틸화된 DNA 탐색 기술은 암의 조기 발견과 관련된 연구 및 항암치료를 위한 표적 유전자로 활용하기 위한 연구에 있어 중요한 부분을 차지한다.

지금까지 거의 대부분의 DNA 메틸화 연구는 암세포에서 기능이 소실된 유전자를 발굴하는 일이었다. 최근에는 대규모의 검색시스템을 이용해 암 게놈에서 전체 메틸화 패턴을 분석해 미지의 유전자를 발굴하는 노력이 시도되고 있고, 이에 이어서 CpG 아일랜드의 메틸화 정도를 정량하고자 하는 시도가 이어지고 있다. 또한, 암에 걸리는 원인으로 여러 가지를 꼽고 있지만, 그 중 가장 무게가 실렸던 것이, 태어날 때부터 DNA의 염기서열에 암을 일으킬만한 유전자를 가지고 태어난다는 것이었으나, 최근에는 DNA 서열의 메틸화가 암과 관련이 있다는 연구도 많이 발표된 바 있다. 이러한 대장암에 영향을 미치는 유전자들에는 APC, hMLH1, hMSH2, hMSH6, hPMS1, hPMS2, STK11 및 SMAD4(DPC4) 등이 있으며, 특히, hMLH1(MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli))은 3번 염색체에 위치하는 인간 유전자로서, 유전적인 비용종성 결장암과 관련된 것으로 알려져 있다. 이러한 DNA 메틸화를 측정하기 위하여 기존에는 바이설파이트가 처리된 DNA 시료를 Cy5-dCTP의 존재하에 증폭시켜 DNA 메틸화를 측정하는 방법이 사용되었으나, 사용되는 Cy5-dCTP는 값이 매우 고가이며, DNA에 존재하는 시토신의 수에 따라 삽입되는 양이 달라질 수 있어 높은 민감도로 DNA 메틸화를 측정하기에는 한계가 있었다. 따라서, 이러한 배경 하에 DNA 메틸화를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되어 왔다.

양자점(Quantum dot, QD)은 형광성 반도체 결정으로서, 나노미터 크기를 지닌다. 상기 QD는 광안전성(phostostability), 좁은 방출 밴드(narrow emission band) 또는 넓은 여기 스펙트럼(broad excitation spectrum) 등의 형광적 특성을 지니며, 그의 물리적 크기에 의하여 결정된 파장에서 넓은 스펙트럼 범위 및 형광에 걸쳐 빛을 흡수하고, 정확하며 좁은 스펙트럼에서 빛을 방출하기 때문에, 빛을 효과적으로 흡수하면서 고도로 안정화된 형광 방출을 가져올 수 있는 이점을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, 양자점은 이의 방출 파장과 유사한 흡수 파장을 지닌 염료와 FRET을 나타낼 수 있는 이점을 지니는 것으로 알려져 있다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은, 보다 높은 안정도 및 특이도로 DNA 메틸화를 검출할 수 있는 방법을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 이중나선 DNA에 삽입되는 염료와 양자점 간의 FRET 반응을 이용하여 DNA 메틸화를 정량하는 방법을 개발하였으며, 상기 방법을 이용하는 경우 적은 양의 DNA 시료를 사용하여도 DNA 메틸화를 효과적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, DNA 메틸화를 효과적으로 정량할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계; 및 (c) 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계를 포함하는, DNA 메틸화를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 분리된 암 의심 환자의 시료로부터 수득된, 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계; 및 (c) 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계; 및 (c) 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계를 포함하는, DNA 메틸화를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 DNA 메틸화를 검출하는 방법은, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료와 양자점 간의 FRET을 이용하여 DNA 메틸화를 정량적으로 검출하는 방법이다. 구체적으로, 바이설파이트를 처리하여 비메틸화된 시토신은 우라실로 전환되고 메틸화된 시토신은 우라실로 전환되지 않은 DNA 시료를 주형으로 하여, 상기 메틸화된 표적 DNA에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 메틸화된 표적 DNA 만을 특이적으로 PCR 증폭하여 이에 대한 증폭산물을 수득한 다음, 증폭산물에 결합되어 있는 이중가닥 DNA에 결합하는 염료와 증폭산물의 말단에 존재하는 양자점 간의 FRET을 이용하여 FRET 신호 정도를 측정함으로써 DNA 메틸화를 검출, 나아가 정량화하는 방법이다. 본 발명의 방법은 염료가 표지된 dNTP(예; Cy5-dCTP) 또는 Cy5-표지된 프라이머를 사용하지 않고 이중가닥 DNA에 결합하는 염료를 사용함으로써, DNA 합성효소의 중합 반응을 저해시키지 않으며, 경제적으로도 저렴한 이점을 지닐 뿐만 아니라, 증폭하고자 하는 표적 DNA 부위의 A/T 및 G/C의 함량에 관계없이 증폭산물에 결합하여 DNA 메틸화 정도를 보다 정확히 검출할 수 있는 이점을 지닌다.

하기에서, 상기 방법의 각 단계를 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계는 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계이다.

이와 같이 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시킨 DNA를 주형으로 하고 메틸화된 표적 DNA에 상보적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 반응을 수행하는 경우, 시토신이 우라실로 전환되지 않은, 메틸화된 표적 DNA 부분만이 PCR 증폭되어 증폭산물을 생성하고, 시토신이 우라실로 전환된 비메틸화된 표적 DNA 부분은 PCR 증폭되지 않아 증폭산물을 만들어내지 않는다. 이때, PCR 반응은 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에 수행하므로, 생성된 증폭산물에는 염료가 결합되어 있다.

본 발명에서 용어, "비메틸화된 시토신이 우라실로 전환된 DNA"는 PCR 반응으로 그 존재 및 양을 검출하고자 하는 표적 DNA 부위를 포함하는 DNA 분자로서, 비메틸화된 시토신은 우라실로 전환된 형태의 DNA이다. 상기 비메틸화된 시토신이 우라실로 전환된 DNA는 메틸화 정도를 검출하고자 하는 DNA 시료에 비메틸화된 시토신을 변형시키는 화합물, 예컨대 바이설파이트(Bisulfite)를 처리하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 바이설파이트가 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시키는 과정에 대해서는 도 2에 나타내었다.

본 발명에서 용어, "표적 DNA"는 본 발명의 방법을 이용하여 메틸화를 검출하고자 하는 DNA의 부위로서, PCR로 증폭 여부를 확인하고자 하는 DNA 부분을 의미한다. 본 발명의 방법을 통하여 메틸화를 검출하고자 하는 표적 DNA의 비제한적인 예로는, VHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor), GSTP1(glutathione S-transferase pi gene), CDKN2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), RARβ2(retinoic acid receptor, beta), RASSF1A(Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1), 라미닌5(laminin5), APC(adenomatosis polyposis coli), DAPK(death associated protein kinase), REPRIMO, CDH1, hMLH1 및 MGMT로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자가 있다(도 10). 특히, hMLH1(mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)) 유전자의 경우, 대장암과 밀접한 관련성을 지니며, 대장암에서 상기 hMLH1 유전자의 프로모터 부위가 메틸화되어 있는 것이 알려져 있으므로, hMLH1 유전자의 메틸화를 측정함으로써 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

그 중에서도 본 발명에서는 대표적인 예로 서열번호 1로 구성된 메틸화된 hMLH1(mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli))의 프로모터를 표적 DNA로 선정하였고, 본 발명의 방법을 이용하는 경우 상기 부위의 메틸화 여부를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하여, 본 발명의 방법이 다양한 유전자의 메틸화를 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "메틸화"는 염기에 메틸기가 붙어 유전자 발현양상이 변하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 메틸화는 VHL, GSTP1, CDKN2A, TIMP3, RARβ2, RASSF1A, 라미닌5, APC, DAPK, REPRIMO, CDH1, hMLH1 및 MGMT로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서 일어나는 것을 포함한다. 본 발명의 메틸화는 구체적으로 상기 하나 이상의 유전자의 염기서열에 C와 G의 염기들이 연속해서 존재하는 CpG가 밀집되어 있는 CpG섬의 시토신에서 일어나는 것을 포함하고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것을 포함한다.

본 발명에서 용어, "CpG 섬(CpG island)"은 CpG가 예외적으로 높은 빈도로 모여 있는 게놈 영역을 의미하며, C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 상기 CpG에서, C는 시토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 시토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포디에스테르 결합을 의미한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다. 정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다. 포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 시토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착되며, CpG의 C는 메틸 그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. 이러한 CpG의 메틸화는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 상보적인 프라이머 쌍"는 표적 DNA를 PCR 증폭하기 위하여 사용되는 프라이머 쌍으로서, 5'에 바이오틴이 연결되어 있는 형태의 프라이머이다. 상기 프라이머에 연결되어 있는 바이오틴은 아비딘과 결합하는 특성을 지닌다.

상기 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 시토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있으며, 그 예로 hMLH1에 대한, 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "증폭산물(amplicon)"은 증폭(amplification) 또는 복제(replication)에 의한 DNA 또는 RNA 생산물을 의미한다. 본 발명에서 상기 증폭산물은 PCR로 표적 DNA를 증폭시킨 산물이며, 메틸화된 표적 DNA에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하여 수득한 산물을 의미한다.

본 발명의 방법은 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재하에 PCR 반응을 수행하므로, (a) 단계에서 수득한 증폭산물은 이중가닥 DNA에 결합하는 염료가 결합된 형태이다.

본 발명에서 용어, "이중가닥 DNA에 결합하는 염료"는 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타낼 수 있는 염료로서, 특히 이중가닥 DNA에 삽입(intercalation)하여 형광을 나타낼 수 있는 물질을 의미한다. 상기 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 비제한적인 예로서는 YOYO-1, YOYO-3, BOBO-3, SYBR 그린(SYBR Green), 헥스트 염료(Hoechst dye) 33258, 피코그린(PicoGreen) 또는 POPO-3가 있다.

특히, 본 발명에 사용되는 이중가닥 DNA에 결합하는 염료는 형광 수여체로서 작용하여 양자점과 FRET을 나타내어 증폭산물의 존재 또는 양을 검출할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에서 용어, "양자점(Quantum dot, QD)"은 형광성 반도체 결정으로서,나노미터 크기를 지닌다. 본 발명의 목적상 상기 양자점은 FRET에서 형광 공여체로서 사용되며, 본 발명의 QD-앱타머 결합체에 사용될 형광 수여체의 여기 파장에 따라, 적절한 여기 파장 및 방출 파장을 가지는 것으로 선택될 수 있다. 또한, 상기 QD는 광안전성(phostostability), 좁은 방출 밴드(narrow emission band) 또는 넓은 여기 스펙트럼(broad excitation spectrum) 등의 형광적 특성을 지니는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기와 같은 특성을 지니는 양자점은 그의 물리적 크기에 의하여 결정된 파장에서 넓은 스펙트럼 범위 및 형광에 걸쳐 빛을 흡수하고, 정확하며 좁은 스펙트럼에서 빛을 방출하기 때문에, 빛을 효과적으로 흡수하면서 고도로 안정화된 형광 방출을 가져올 수 있으므로 FRET을 이용함에 있어 유용하게 사용될 수 있는 이점을 지닌다. 본 발명에서 사용되는 양자점은 사용하는 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 흡수 파장을 고려하여, FRET 반응을 가져올 수 있는 방출 파장을 가지는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "FRET(fluorescence resonance energy transfer)"은 두 종류의 형광 물질이 가까운 거리에 있을 때 공명에 의해 에너지를 전달하는 현상을 의미한다. 에너지를 전달하는 공여체(donor)가 들뜬 상태에서 바닥 상태로 내려오면서 광자를 내놓을 때, 두 형광 분자가 가까운 거리에 있다면 수여체가 이를 받아들여서 파장이 다른 빛을 내놓게 되는 현상이다. 본 발명에서는, 메틸화된 표적 DNA를 증폭시킨 산물에 결합시킨, 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET 측정함으로써 메틸화된 DNA의 양을 검출한다.

본 발명의 방법에서 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계이다.

아비딘은 바이오틴과 결합하는 특성이 있으므로, 양자점이 연결된 아비딘을 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물과 반응시키게 되면, 증폭산물에 결합되어 있는 바이오틴과 아비딘이 결합하면서 증폭산물의 말단에 양자점을 위치시킬 수 있다.

따라서, 본 단계를 수행함으로써 증폭산물에 결합되어 있는 이중가닥 DNA에 결합하는 염료와 양자점 간의 FRET 반응이 일어날 수 있게 된다.

본 발명의 방법에서 상기 (c) 단계는 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계이다.

메틸화된 DNA가 존재하여 증폭산물이 생성되는 경우, FRET 신호가 검출되고 따라서 FRET 신호의 증가 여부를 측정함으로써 DNA 메틸화를 측정할 수 있다. 이와 같은 FRET 신호의 측정은 형광 공여체의 방출 파장, 형광 수여체의 방출 파장 또는 둘 다를 측정함으로써 수행될 수 있다. 이때, 형광의 세기 측정은 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 왈락/빅터 형광(Wallac/Victor Fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer) 등을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업자에게 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 측정 장치라면 모두 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 DNA 메틸화를 정량적으로 검출할 수 있는 방법으로서, (c) 단계에서 측정한 FRET 값을 정량 보정선에 대입함으로써, DNA 메틸화를 정량할 수 있다. 정량 보정선은 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시키지 않은, 양을 알고 있는 DNA에 본 발명의 방법을 적용하여 FRET 신호를 측정함으로써 도출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에서 사용한 대표적인 이중가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 염료인 SYBR 그린을 이용하여, 이의 존재 하에 5'-말단에 바이오틴이 접합된 형태의 프라이머를 이용하여 바이설파이트가 처리된 hMLH1의 프로모터 부분에 대한 DNA를 증폭시켰으며, 그 다음 수득한 증폭 산물에 아비딘을 코팅시킨 양자점과 반응을 시킨 다음, 양자점과 SYBR 그린 간의 FRET 형광을 측정하였다(실험예 2-1 및 도 8 참고). 또한 상기 방법을 적용하여 양을 알고 있는 DNA에 사용하여 정량보정선을 작성하였고, 이때 본 발명의 방법은 12.8ng의 적은 양의 DNA를 검출할 수 있는 정도의 신호를 생성함을 확인하여, 본 발명의 방법이 DNA 메틸화 측정에 있어 민감도가 높음을 확인하였다(실험예 2-2). 아울러, 본 발명에서는 이를 메틸화된 DNA 양을 모르는 샘플에 적용하여 FRET 신호를 측정한 다음, 이를 상기 정량보정선에 대입하였고, 메틸화된 DNA의 양 및 비메틸화된 DNA의 양을 산출하였다(실험예 2-3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 암 의심 환자의 시료로부터 수득된, 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계; 및 (c) 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 각 단계에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "시료"는 본 발명의 방법을 이용하여 DNA 메틸화를 검출하고자 하는 시료로서, 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

DNA 메틸화는 암과 매우 밀접한 관련성이 있으므로(JCO November 15, 2004 vol. 22 no. 22 4632-4642), 상기 시료로부터 수득한 DNA를 주형으로 하여 암의 발병 또는 진행시 메틸화되는 DNA의 특정 부분을 표적으로 하여 이의 메틸화 정도를 측정함으로써 암을 진단할 수 있으며, 그 예로 VHL, GSTP1, CDKN2A, TIMP3, RARβ2, RASSF1A, 라미닌5, APC, DAPK, REPRIMO, CDH1, hMLH1 및 MGMT로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 메틸화 정도를 측정함으로써 상기 유전자의 특정 부분, 예컨대 프로모터 부위의 메틸화 정도가 높은 경우 암이 발병 또는 진행되고 있는 것으로 판별할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은, 이중가닥 DNA에 삽입된 SYBR 그린 및 QD 간의 FRET 반응을 이용하여, DNA 메틸화를 높은 정확도 및 민감도로 검출할 수 있는 이점을 가진다.

도 1은, 이중가닥에 특이적으로 삽입되는 형광물질을 이용한, PCR 기반의 DNA 정량법의 개요를 나타낸 도이다. 도 1 A는 이중가닥에 특이적으로 삽입되는 대표적인 형광물질인 SYBR 그린을 이용한 PCR 과정을 나타낸 것이며, 도 1 B는 DNA 메틸화 유무에 따라, 바이설파이트(Bisulfite) 처리에 따른 PCR 증폭 여부의 차이를 표로 간단하게 나타낸 것이다.
도 2는, 바이설파이트 변형(Bisulfite modification)의 원리를 도로 나타낸 것이다. DNA를 바이설파이트로 처리하게 되면 C(Cytosine)가 U(Uracil)로 변환되나, 메틸화된 C는 변하지 않는다.
도 3은, C_T 값 측정 원리를 도로 나타낸 것이다. C_T는 한계 싸이클(threshold cycle)을 뜻한다. 구체적으로, C_T는 PCR 싸이클이 증가함에 따라 주형이 없는 대조군(no template control)과 비교했을 때, 존재하는 이중가닥 DNA의 총량에 차이를 보이는 첫 번째 싸이클을 뜻하고, 도 4에서 보는 바와 같이, 이 값으로 원래 존재했던 DNA 주형의 양을 정량할 수 있다.
도 4는, SYBR 그린이 있는 조건에서 PCR로 증폭시킨 것의 형광 신호 크기와 DNA 정량 관계를 나타낸 도이다. 도 4의 A에서 보는 바와 같이, 주어진 DNA의 양에 따라 C_T 값이 변화하게 되고, 이 값을 통해 주어진 DNA의 정량이 가능하다.
도 5는, 주어진 DNA의 메틸화 여부 및 그 정량적 분석을 위한 4가지 경우에 대한 PCR 증폭 실험 결과를 나타낸 도이다. 도 1의 ①, ③, ④에 해당하는 경우에는 PCR 증폭이 되므로, 주어진 DNA의 초기 양이 많은 경우 상대적으로 낮은 C_T 값을 얻게 되지만, ②의 경우처럼 PCR 증폭이 되지 않는 경우, 주어진 DNA의 초기 양이 많더라도 상대적으로 높은 C_T 값을 얻게 된다.
도 6은, 주어진 DNA의 메틸화 여부 및 그 정량적 분석을 위한 실제 실험 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 메틸화된 DNA과 메틸화되지 않은 DNA가 섞여있는 샘플에 대하여, 도 1에 모식도로 나타낸 방법을 적용하여 C_T 값을 측정하여, 도 4의 B에서 얻은 정량 보정선에 대입하면 메틸화되지 않은 DNA 0.9pg과 메틸화된 DNA 0.1pg이라는 정량값을 얻었다. 즉, 도 1의 방법을 통해 메틸화되지 않은 DNA과 메틸화된 DNA의 양을 얻을 수 있고, 또한 그 상대적인 비인 9:1이라는 값도 얻을 수 있었다.
도 7은, 양자점(quantum dots)과 SYBR 그린 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 현상을 이용한, 본 발명의 DNA 메틸화 정량법의 원리를 나타낸 도이다. 바이오틴(biotin)이 5'에 존재하는 프라이머를 이용해서 도 1에서와 같은 조건에서 PCR 증폭한 후, 미리 준비한 아비딘(avidin)으로 코팅된 양자점과 반응을 시키면, 아비딘과 바이오틴의 결합반응으로 인해서 SYBR 그린이 삽입(intercalation)된 이중가닥의 DNA가 양자점에 결합하게 된다. 이 때 356 nm의 빛으로 양자점을 여기(excitation)시키면 도 1의 ①, ③ 및 ④의 경우에는 양자점에서 방출된 450nm의 빛이 FRET 현상에 의해 이중가닥 DNA에 삽입되어 있는 SYBR 그린의 형광으로 전환되지만, ②의 경우처럼 PCR 증폭이 되지 않는 경우에는 FRET 현상이 일어나지 않고 양자점의 형광만 검출되게 된다.
도 8은, 양자점과 SYBR 그린 간의 FRET 현상을 이용한 DNA 메틸화 정량 결과를 나타낸 도이다. 도 8A는 도 7에서와 같이, 바이오틴(biotin)이 5'에 존재하는 프라이머를 이용해서 도 1에 나타낸 것과 같은 조건에서 18회의 PCR 증폭을 수행한 후, 미리 준비한 아비딘(avidin)으로 코팅된 양자점과 반응을 시켰다. 이 경우, 아비딘과 바이오틴의 결합반응으로 인해서 SYBR 그린이 삽입된 이중가닥의 DNA가 양자점에 결합하게 되므로, 이때 356 nm의 빛으로 양자점을 여기(excitation)시키면 도 1의 ①, ③, ④ 경우에는 양자점에 의한 450 nm의 빛이 FRET 현상에 의해 이중가닥 DNA에 삽입되어 있는 SYBR 그린의 형광빛으로 전환되게 되지만, ②의 경우처럼 PCR 증폭이 되지 않는 경우에는 FRET 현상이 일어나지 않고 양자점의 형광빛만 검출되게 된다. 도 8B는 도 4의 원리를 이용하여 PCR 증폭 전에 존재하는 DNA 양을 확인하여 LOD(limit of detection)을 확인해본 결과, 12.8 ng(0.29 pmol)의 LOD를 보이는 결과를 나타내었다. 특히, 본 발명의 방법의 경우, FRET 현상에 의해 SYBR 그린으로부터 나오는 520 nm에서의 형광세기와 주어진 DNA 양 사이의 관계가 선형 관계를 나타내었다.
도 9는, 주어진 DNA의 메틸화 여부와 그 정량적 분석을 위해 양자점과 SYBR 그린 간의 FRET 현상을 이용한 DNA 메틸화 정량을 확인한 결과이다. 구체적으로, 메틸화된 DNA과 메틸화되지 않은 DNA가 섞여있는 샘플에 대하여, 본 발명의 방법을 적용하여 520 nm에서의 형광세기를 측정한 다음, 도 8B에서 얻은 정량 보정선에 대입하였고, 그 결과 메틸화되지 않은 DNA 11 pmol과 메틸화된 DNA 7 pmol이라는 정량값을 얻었다. 즉, 본 발명을 통해 메틸화되지 않은 DNA과 메틸화된 DNA의 양을 얻을 수 있고, 또한 그 상대적인 비도 얻을 수 있음을 확인하였다.
도 10은, 암 진단에 사용되고 있는 후성적 바이오마커 현황을 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화학 물질의 준비

본 발명에서 쓰인 화학 물질들은 공급회사로부터 얻을 수 있고, 다른 정제과정없이 사용하였다. RT-PCR(realtime-PCR)은 LineGene K(BIOER)를 사용하였고, UV 흡광도는 Agilent 8453 UV-Visible 분광광도계를 사용하여 측정하였으며 형광세기는 Synergy Mx 분광형광 광도계를 사용하여 측정하였다. 모든 실험은 두 번 이상 수행되었다.

비메틸화된 DNA 주형은 hMLH1 서열 중 37034875번에서 37034945번까지 부위를 하기 프라이머(표 1)를 사용하여 증폭하여 사용하였다(이중가닥 DNA 주형). 또한, 메틸화된 DNA 주형으로는 수득한 비메틸화된 DNA 주형을 DNA 메틸전이효소를 처리함으로써 수득하였다.

유전자	서열(5'->3')	서열번호
hMLH1	5'-GAC TGG CAT TCA AGC TGT CCA ATC AAT AGC TGC CGC TGA AGG GTG GGG CTG GAT GGC GTA AGC TAC AGC T-3’	1
hMLH1	5'-AGC TGT AGC TTA CGC CAT CCA GCC CCA CCC TTC AGC GGC AGC TAT TGA TTG GAC AGC TTG AAT GCC AGT C-3’	2

본 발명의 방법으로 hMLH1 상기 부위의 메틸화 정도를 알아보기 위한 검출 방법에서는 하기 서열을 가진 프라이머를 사용하였다(표 2).

유전자	서열(5'->3')	서열번호
hMLH1 for PCR amplification	5'-AGC TGT AGC TTA CGC CAT CCA-3’	3
hMLH1 for PCR amplification	5'-GAC TGG CAT TCA AGC TGT CCA-3'	4

본 발명에서 사용한 SYBR 그린(SYBR 그린)은 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX (SYBR 그린, Enzynomics, cat #: RT500S)를 사용하였고, 바이설파이트(bisulfite) 처리를 위해 EZ DNA Methylation-Gold kit(Zymoresearch, cat No. D5005)를, 양자점(Quantum dot, QD)으로는 CdSSe/ZnS core/shell QDs with carboxylic acid group(Nanotech Ocean)을 사용하였다(cat No. QSH-450-04, emission : 450nm).

실시예 2: PCR 조건 확립

본 발명에서는 하기 표 3 및 4와 같이 PCR 조건을 확립하였으며, 35 싸이클의 조건하에서 실시하였다.

온도(℃)	time
94	5 min
94	30 s
51	30 s
72	40 s
72	2 min

SYBR 그린 premix 2x	10㎕
DNA	variable
정방향 및 역방향 프라이머	0.2 μM
total	20 ㎕

실시예 3: 아비딘 ( avidin ) 코딩된 양자점의 제조

아비딘이 코딩된 양자점을 제조하기 위하여, QD(80pmole)를 붕산염(borate) 완충액에 녹인 다음, 카르복실산을 먼저 활성화시켰다. 이를 위하여, QD에 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, sigma) 0.05mg, NHS(N-Hydroxysuccinimide, sigma, cat No. 130672) 0.1mg을 넣고 20분 동안 반응시켰다. 20분 후 5mM 아지드화 나트륨(sodium azide, samchun chemical, cat No. S0316)에 녹인 스트렙타아비딘(streptavidin) 10㎍을 넣어주었다. 그 다음, 반응이 충분히 잘 일어날 수 있도록, 3시간 정도 배양한 다음(4℃, dark), 반응이 완료되면 스트렙타아비딘이 결합된 QD 만을 분리하기 위해 100K 마이크론(Microcon, Amicon Ultra-0.5ml Ultracel- 100K Membrane, Millipore, cat No. UFC510024)을 이용하여 분리과정을 수행하였다.

실험예 1: DNA 이중가닥에 특이적으로 결합하는 염료를 이용한 DNA 메틸화 정량

실험예 1-1: SYBR 그린이 있는 조건에서, PCR 로 증폭시킨 것의 형광 신호 크기 및 DNA 정량과의 관계

본 발명에서는, DNA 메틸화가 일어날 것이라 예측되는 hMLH1 유전자 프로모터의 특정 부위(37034875번에서 37034945번까지)에 대한 이중 가닥을 주형으로 하고, DNA 이중가닥에 특이적으로 결합하는 염료, 예컨대 SYBR 그린의 존재하에 PCR 반응을 수행한 다음, 삽입된 염료의 형광을 측정함으로써 DNA 양을 정량하였다. 상기 방법의 원리에 대해서는 도 1에 나타내었다.

우선, 양을 알고 있는 DNA(0ng, 0.438ng, 0.875ng, 1.26ng 및 1.75ng)를 SYBR 그린이 있는 조건에서 실시예 2의 조건으로 PCR 증폭하여 상기 도 4A와 같은 실험 결과를 얻었다. 이를 바탕으로 정량 보정선을 그렸고, 이를 도 4B에 나타내었다.

그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 주어진 DNA 양에 따라 C_T 값이 변화하게 되어, 이값을 통하여 주어진 DNA의 정확한 정량을 할 수 있음을 나타내었다.

실험예 1-2: DNA 메틸화 여부 및 바이설파이트 처리에 따른 PCR 증폭 실험 결과

바이설파이트(Bisulfite)는 메틸화된 시토신(Cytosine)을 우라실(Uracil)로 전환시키지 않는 반면, 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시킨다. 본 발명에서는 이를 이용하여, 검출하고자 하는 시료에 바이설파이트를 처리한 다음, 전환되지 않은 DNA 주형에 결합하는 정방향 및 역방향 프라이머를 처리하여 PCR 반응을 수행하여 메틸화된 DNA 만을 특이적으로 증폭시켰다.

구체적으로, hMLH1의 실시예 1의 이중가닥 DNA(서열번호 1 및 2)를 주형으로 하여, 이로부터 비메틸화된 이중가닥 DNA 시료와 DNA 메틸전이효소를 처리한 메틸화된 이중가닥 DNA 시료를 준비하였다. 또한, 상기 비메틸화된 이중가닥 DNA 시료 및 메틸화된 이중가닥 DNA 시료 각각에 바이설파이트를 처리하여, 도 1에 나타낸 총 4가지 시료를 준비하였다.

상기 DNA 시료 각각에 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였고, 이때 PCR 반응은 SYBR 그린 존재 하에 이루어졌다. PCR 반응을 통하여 PCR 증폭 그래프 및 C_T 값을 얻은 다음, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 도 1의 ①, ③, ④에 해당하는 경우 경우에는 PCR 증폭이 되어, 이중가닥 DNA에 삽입되어 있는 SYBR 그린의 형광으로 주어진 DNA의 초기 양이 많은 경우 상대적으로 낮은 값의 C_T값을 나타내었지만, ②의 경우처럼 PCR 증폭이 되지 않는 경우, 주어진 DNA의 초기 양이 많더라도 상대적으로 높은 C_T값을 나타내었다.

실험예 1-3: DNA 메틸화 여부 및 바이설파이트 처리에 따른 PCR 증폭 실험 결과

양을 알지 못하는, 메틸화된 DNA와 메틸화되지 않은 DNA 혼합물을 이용하여, 바이설파이트를 처리한 다음, SYBR 그린이 있는 조건에서 실시예 2의 조건으로 PCR 증폭하였다. 이때, 프라이머는 바이설파이트에 의해 전환되지 않은 DNA 주형에 결합하는 것을 사용하였다.

PCR 반응을 수행한 다음, C_T값을 측정하고 이값을 도 4A의 정량보정선에 대입하여 메틸화되지 않은 DNA 및 메틸화된 DNA의 양을 정량하였다.

그 결과, 도 6과 같은 실험결과를 얻었고, 이를 통해 메틸화된 DNA는 0.1pg(빨간선)이며, 메틸화되지 않은 DNA는 0.9pg(파란선)의 양으로 존재함을 나타내었다.

실험예 2: DNA 이중가닥에 삽입된 염료 및 양자점 간의 FRET 을 이용한 DNA 메틸화 정량법 개발

실험예 2-1: SYBR 그린 및 양자점 간의 FRET 측정

상기 실험예 1에서는, 바이설파이트를 처리한 DNA를 주형으로 하여, 바이설파이트에 의해 전환되지 않은 DNA에 상보적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 SYBR 그린 존재하에서 PCR 증폭 반응을 수행하는 경우, DNA 메틸화를 측정할 수 있으며, 나아가 정량적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

상기 방법에서 나아가, 본 발명자들은 SYBR 그린과 같은 DNA 이중가닥에 삽입된 염료와 QD 간의 FRET 반응을 이용하여 메틸화된 DNA를 정량하기 위하여 하기와 같은 과정을 수행하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 바이설파이트를 처리한 DNA를 주형으로 하고, 바이설파이트에 의해 전환되지 않은 DNA에 상보적으로 결합하는 5'-말단에 바이오틴이 접합된 형태의 프라이머를 사용하여 이중가닥 DNA 삽입 염료인 SYBR 그린의 존재하에 표적 부위를 증폭시켰다. 상기 PCR 증폭 반응을 수행한 다음, 증폭된 시료를 아비딘을 코팅된 양자점과 반응을 시켰고, 그 다음 양자점과 SYBR 그린 간의 FRET 형광을 측정하였다. 상기 과정의 원리에 대해서는 도 7에 나타내었다.

보다 구체적으로, 바이오틴(biotin)이 5'에 존재하는 프라이머(표 3)를 이용해서 도 1과 같은 4가지 조건에서 hMLH1의 프로모터 부위를 주형으로 하여 18회 PCR 증폭을 시도한 다음, 아비딘으로 코팅된 양자점과 반응을 시켰다. 이때, 아비딘과 바이오틴 간의 결합반응을 통하여 SYBR 그린이 삽입된 이중가닥의 DNA가 양자점에 결합하게 된다. 따라서, 여기에 양자점의 여기 파장(excitation wavelength)인 356nm의 빛으로 양자점을 여기시키면 도 1의 ①, ③ 및 ④에 해당하는 경우에는 양자점에 의한 450nm의 방출 파장(emission wavelength)이 FRET 현상에 의해 이중가닥 DNA에 삽입되어 있는 SYBR 그린의 형광 빛으로 전환되게 되지만, ②의 경우처럼 PCR 증폭이 되지 않는 경우에는 FRET 현상이 일어나지 않고 양자점의 형광 빛만 검출될 것이므로, 본 발명에서는 이를 이용하여 메틸화된 DNA의 양을 검출하였다.

이를 확인하기 위하여 본 발명자들은 hMLH1의 프로모터 부위를 주형으로 하여 바이오틴이 5'에 존재하는 프라이머로, SYBR 그린 존재하에 PCR 증폭시키고, 증폭된 시료에 양자점이 결합된 아비딘을 반응시킨 다음, 양자점의 여기 파장을 조사하여 양자점 방출 파장 및 SYBR 그린 형광 파장을 측정하여, 대조군인 QD만을 포함하는 시료와 비교하였다.

그 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 실험군인 QD-DNA 시료의 경우, QD의 방출파장인 450nm의 빛은 감소하는 반면, SYBR 그린 형광인 520nm의 빛은 증가하는 결과를 나타내어, 양자점 및 이중가닥 DNA에 삽입된 SYBR 그린 간의 FRET이 일어나는 것을 확인하였다.

실험예 2-2: SYBR 그린 및 양자점 간의 FRET 측정을 통한 정량보정선 작성

DNA 양에 따라, SYBR 그린 및 양자점 간의 FRET 신호가 비례적으로 증가하는지 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

구체적으로, hMLH1 유전자 프로모터의 특정 부위(37034875번에서 37034945번까지)에 대한 이중 가닥을 주형으로 하고, 프라이머로서 5'-바이오틴-AGC TGT AGC TTA CGC CAT CCA-3'(서열번호 3) 및 5'-바이오틴-GAC TGG CAT TCA AGC TGT CCA-3'(서열번호 4)를 사용하여 18회 PCR 증폭하였다.

PCR 증폭 후, 아비딘이 코팅된 양자점(QD)를 반응시킨 다음, 양자점의 여기 파장인 365nm를 조사한 다음, SYBR 그린의 형광인 520nm의 형광 세기를 측정하여 정량보정선을 구하였고, 이를 도 8B에 나타내었다.

그 결과, 도 8B에 나타낸 바와 같이, QD 및 이중가닥에 삽입된 SYBR 그린 간의 FRET을 측정하는 본 발명의 방법의 경우, 12.8ng(0.29 pmol)의 LOD(limit of detection)를 나타내어 민감도가 높을 뿐 아니라, 520nm의 형광 세기와 주어진 DNA 양 간의 관계가 직선관계를 나타내어, 본 발명의 방법이 DNA 정량에 있어 정확도가 높은 방법임을 시사하였다.

실험예 2-3: SYBR 그린 및 양자점 간의 FRET 측정을 통한 DNA 메틸화 정량

상기 실험예 2-1 및 2-2를 기초로, 메틸화된 DNA과 메틸화되지 않은 DNA가 섞여있는 샘플에 대하여, 본 발명의 방법을 적용하여 520 nm에서의 형광세기를 측정한 다음, 이를 실험예 2-2에서 얻은 정량보정선(도 8B)에 대입하였다.

그 결과, 상기 샘플에는 메틸화되지 않은 DNA 11 pmol, 메틸화된 DNA 7 pmol이라는 정량값을 얻었다. 즉, 본 발명을 통해 메틸화되지 않은 DNA과 메틸화된 DNA의 양을 얻을 수 있고, 또한 그 상대적인 비도 얻을 수 있음을 시사하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Method for detection of DNA methylation based on quantum dots and FRET <130> PA121136KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA (hMLH1 gene) <400> 1 gactggcatt caagctgtcc aatcaatagc tgccgctgaa gggtggggct ggatggcgta 60 agctacagct 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA (hMLH1 gene) <400> 2 agctgtagct tacgccatcc agccccaccc ttcagcggca gctattgatt ggacagcttg 60 aatgccagtc 70 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMLH1 primer for PCR amplification <400> 3 agctgtagct tacgccatcc a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMLH1 primer for PCR amplification <400> 4 gactggcatt caagctgtcc a 21

Claims

(a) 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계; 및
(c) 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계를 포함하는, DNA 메틸화를 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 DNA는 VHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor) 유전자, GSTP1(glutathione S-transferase pi gene), CDKN2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), RARβ2(retinoic acid receptor, beta), RASSF1A(Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1), 라미닌5(laminin5), APC(adenomatosis polyposis coli), DAPK(death associated protein kinase), REPRIMO, CDH1(cadherin-1), hMLH1(MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)) 및 MGMT(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 표적 DNA는 서열번호 1로 구성된 메틸화된 hMLH1(mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli))의 프로모터인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA에 결합하는 염료는 YOYO-1, YOYO-3, BOBO-3, SYBR 그린(SYBR Green), 헥스트 염료(Hoechst dye) 33258, 피코그린(PicoGreen) 및 POPO-3로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 DNA 메틸화 정량을 위한 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 (c) 단계에서 측정한 FRET 형광 값을 정량 보정선에 대입하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
(a) 분리된 암 의심 환자의 시료로부터 수득된, 주형인 비메틸화된 시토신(cytosine)이 우라실(uracil)로 전환된 DNA를, 이중가닥 DNA에 결합하는 염료의 존재 하에, 바이오틴이 5'에 연결된 메틸화된 표적 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시켜 증폭산물(amplicon)을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 증폭산물에 양자점(Quatum dot, QD)이 연결된 아비딘(avidin)을 반응시켜, 바이오틴 및 아비딘 간의 결합으로 증폭산물의 말단에 양자점을 연결시키는 단계; 및
(c) 양자점 및 이중가닥 DNA에 결합하는 염료 간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 표적 DNA는 VHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor) 유전자, GSTP1(glutathione S-transferase pi gene), CDKN2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), TIMP3(TIMP metallopeptidase inhibitor 3), RARβ2(retinoic acid receptor, beta), RASSF1A(Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1), 라미닌5(laminin5), APC(adenomatosis polyposis coli), DAPK(death associated protein kinase), REPRIMO, CDH1(cadherin-1), hMLH1(MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)) 및 MGMT(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자인 것인 방법.