KR20200093466A - Dna 메틸화 저해 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

Dna 메틸화 저해 약물 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단분자 FRET 기술과 DNA B-Z 구조전이를 이용하여 DNA 메틸전달효소의 활성을 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것으로, 본 발명의 방법 및 키트를 이용하면 DNA 분자의 구조전이를 정밀하고 민감하게 검출할 수 있어, 소비되는 샘플의 양을 극단적으로 줄일 수 있어 경제적이고, 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출할 수 있게 해주므로 제약 분야에서 신규 약물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

DNA 메틸화 저해 약물 스크리닝 방법{A SCREENING METHOD OF DNA METHYLTRANSFERASE INHIBITORS}
본 발명은 생체 분자 검출에 의한 생물학적, 의학적 응용에 관한 것으로 구체적으로는 단분자 FRET 기술을 이용하여, DNA 메틸전달효소의 활성을 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
DNA 메틸화(methylation)는 고등생물의 발달에 매우 중요한 생화학적 프로세스로서, 후성유전학의 중요한 주제 중 하나이다. 메틸기 하나가 시토신 피리미딘 고리의 5번째 위치에 추가되거나 아데닌 퓨린 고리의 6번 질소에 추가되는 것으로, 이 변화는 세포 분화를 통해서 유전될 수 있다. 특히, 게놈의 염기서열에서 C와 G의 두 염기가 나란히 존재하는 것을 CpG 라고 하는데, 그 중 DNA의 프로모터 영역에 CpG가 많이 존재하는 부분을 CpG 아일랜드(island)라고 부른다. 이 배열에서 시토신이 메틸화되는 경향이 많으며, 인간 게놈의 경우 전체 시토신 중 3 내지 4%는 메틸화되어 있다.
포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 CpG 아일랜드라는 부위가 존재하며, 이 부위는 0.5 내지 0.4kb 정도로 게놈의 유전자와 밀접한 연관성을 가지고 있는 것으로 보고되었다. 또한, 중요하게도, 암을 억제하는 유전자의 기능이 이들 유전자의 CpG 아일랜드의 메틸화로 억제됨으로써, 암이 발생한 것이라는 연구결과도 나오고 있다. 암 억제 유전자의 기능소실은 특히, 다양한 돌연변이, 또는 프로모터 부위의 메틸화로 인하여 일어나게 되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 메틸화된 DNA 탐색 기술은 암의 조기 발견과 관련된 연구 및 항암치료를 위한 표적 유전자로 활용하기 위한 연구에 있어 중요한 부분을 차지한다. 특히, 메틸전달효소 저해제는 잠재적 항암제로서 이의 효과적인 스크리닝 방법의 개발이 필요하다.
지금까지, 연구된 DNA 메틸전달효소 작용의 검출 및 분석은 크게 두 가지 방법을 이용한다. 메틸화에 민감성을 갖는 제한효소를 거의 필수적으로 이용하고, 미량의 반응산물을 PCR로 증폭하여, 신호의 변화를 측정할 수 있다.
그러나 이들 방법은 제한 효소의 기능에 결정적으로 의존하며, 제한효소, 항체 등 기타 단백질들을 필수로 포함한다. 대부분 미약한 신호를 증폭하는 별도의 메커니즘을 사용하기 때문에 추가적인 항체, 효소, 나노입자 등이 필요하기도 하며, 증폭에 의해 노이즈도 함께 증폭되어, 결과의 불확실성을 높일 수 있고, 측정 방법이 여러 단계를 포함하여 매우 복잡하다는 단점이 있다. 특히, 불충분한 감도의 측정장치를 사용하므로 다양한 신호 증폭 방법을 사용하는데, 특별한 종류의 제한효소, 다수의 프라이머 올리고(primer oligo), 특별한 서열의 DNA 등, 다양한 요구 사항, 분석 과정의 복잡성이 있어서 정량적인 비교가 어렵고, 측정 오차나 시약의 농도 등 많은 요소들에 영향을 받는다. 따라서, 이러한 배경 하에서, DNA 메틸전달효소 작용의 검출 및 분석을 위한 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 보다 간단하고, 광학적 방법을 이용하여 일반 DNA와 메틸화된 DNA를 구별하고 소량이라도 메틸화된 DNA의 정량적 검출 또는 DNA 메틸전달효소 작용의 검출이 가능한 기술을 개발하고자 연구하던 중, B-Z 구조전이 양상이 DNA 메틸화에 큰 영향을 받는다는 점에 착안하여, DNA의 이중가닥 상에 각각 존재하는 형광염료 쌍에서 발생하는 단분자 FRET을 이용하여 DNA의 구조전이를 측정하고, 상기 DNA 구조전이의 정도에 따라 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출, 정량 할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이러한 측면에서 본 발명의 하나의 목적은 단분자 FRET 기술과 DNA의 B-Z 구조전이를 이용해 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단분자 FRET 기술과 DNA의 B-Z 구조전이를 이용해 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소 및 후보약물을 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
b) 대조군으로서 상기 a)와 동일한 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소를 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
c) 상기 a) 와 b)의 메틸화된 이중가닥 DNA 각각을 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 제1 형광염료와 제2 형광염료 사이의 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하여, 각각 독립적으로 상기 a)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하고, b)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하는 것; 및
d) 상기 b)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율과 비교해서, a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 낮은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 저해제로 분류하고; a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 높은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 촉진제로 분류하는 것을 포함하는 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비오틴 및 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자; 메틸전달효소; 1가 또는 2가의 양이온성 염을 포함하는 용액, 및 아비딘으로 코팅된 기재를 포함하고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명의 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법 및 키트는, DNA의 메틸화 정도에 따라, 특정 염이 존재하는 조건에서 DNA의 B-Z 구조전이 양상이 다르게 나타나는 것을 이용하여, 이중가닥 DNA에 각각 부착된 염료 쌍 사이의 FRET 변화를 통해서 DNA 메틸화를 검출할 수 있다. 본 발명의 단분자 FRET을 이용한 분석법은 메틸화 검출을 위해서 시료의 증폭을 별도로 요구하지 않으며, 고감도로 구조전이의 측정이 가능하여 정확성이 우수하다는 장점 뿐만 아니라, 특정 효소를 이용하지 않아 경제적으로도 저렴한 이점을 지니며, 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출할 수 있다는 이점을 가져, 새로운 약을 개발하고 테스트하는 효과적인 방법을 제시한다.
이하에서, 보다 상세하게 본 발명의 방법 및 키트를 설명한다.
본 발명의 스트리닝 방법은 a) 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열(CpG 반복 서열)을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소 및 후보약물을 처리하여 메틸화 반응시키는 것; b) 대조군으로서 상기 a)와 동일한 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소를 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
c) 상기 a) 와 b)의 메틸화된 이중가닥 DNA 각각을 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 제1 형광염료와 제2 형광염료 사이의 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하여, 각각 독립적으로 상기 a)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하고, b)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명에서 용어 "DNA 메틸화"란 유전자에 나타나는 화학적 변형 중 하나로, DNA에 메틸기가 부가되는 과정을 의미한다. 구체적으로 DNA의 시토신의 피리미딘 고리 5번째 위치에 메틸기가 부가되는 것을 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 CpG반복 서열을 포함하는 DNA 분자를 이용해서, 상기 반복 서열 내 시토신에 메틸기가 부가되는 DNA 메틸화로 확인하였다.
본 발명에서 용어 "이중가닥 DNA 분자"는 두 개의 올리고뉴클레오티드 가닥이 서로 상보적으로 결합된 핵산분자를 의미하는 것이다. 본 발명에서 메틸전달효소 및/또는 후보약물과 함께 반응하여 메틸화되는 기질로서 사용되며, 이후 DNA의 B-Z 구조전이 양상을 통해서 메틸화 여부 및 메틸화된 염기의 양을 정량적으로 검출하여 메틸전달효소의 활성 또는 후보약물의 성질을 결정하기 위한 정보를 제공한다.
구체적인 예로, 본 발명의 스크리닝 방법 또는 키트에서 사용되는 이중가닥 DNA는 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 DNA 분자는 5 내지 50nt의 길이일 수 있고, 이중 가닥 DNA 분자 중에서 제1 가닥과 제2가닥의 길이가 상이할 수도 있다.
상기 2 내지 40개의 CpG 반복 서열은 제1 또는 제2 단일 가닥 DNA의 중심에 포함될 수 있다.
상기 DNA 분자의 구체 예로, 상기 이중가닥 DNA는 메틸화된 시토신을 포함하지 않는 제1 단일 가닥과 제2 단일 가닥으로 이루어진 비메틸(UM) DNA; CpG 반복 서열에서 모든 시토신이 메틸화된 제1 단일 가닥과 메틸화된 시토신을 포함하지 않는 제2 단일 가닥으로 이루어진 반-메틸(HM) DNA; 제1 단일 가닥과 제2 단일 가닥의 시토신이 모두 메틸화된 완전-메틸(FM) DNA; CpG 반복 서열에서 1개 이상의 시토신이 메틸화(모두 메틸화된 경우 제외)된 제1 단일 가닥과 메틸화된 시토신을 포함하지 않는 제2 단일 가닥으로 이루어진 일부-메틸(실시예에서 사용한 것은, 메틸화된 시토신이 약 1/4이므로 quarter methylated (QM) DNA) DNA이거나 CpG 반복 서열에서 1개 이상의 시토신이 메틸화(모두 메틸화된 경우 제외)된 제1 단일 가닥과 모든 시토신이 메틸화된 제2 단일 가닥으로 이루어진 일부-메틸(실시예에서 사용한 것은, 메틸화된 시토신이 약 3/4이므로 three-quarter methylated (TM) DNA) DNA일 수 있다.
상기 제1 단일 가닥 DNA 및 제2 단일 가닥 DNA는 메틸화된 시토신 염기를 포함하지 않거나, 일부 또는 전부 메틸화된 시토신 염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 DNA의 메틸화 정도, 즉, DNA 분자에 포함된 메틸화된 시토신의 개수에 따라서 동일한 염 농도 조건에서도 DNA 분자의 B-Z 구조전이가 상이하게 나타남을 구체적인 실시예를 통해서 확인한 바, 본 발명에서는 메틸전달효소의 특성, 효소의 양, 후보약물의 농도, 염의 종류, 염농도 조건에 따라서, DNA 분자를 다르게 선택하여 메틸화 반응을 수행할 수 있다.
상기 DNA 분자는 효소적 방법으로, 즉, 메틸전달효소(methyltransferase)를 이용하여 원하는 특정 서열 상의 시토신에 메틸기를 첨가하는 방법으로 제조할 수 있다. 메틸전달효소를 이용하여 완전히 메틸화시킨 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 분리하고, 상기 분리된 메틸화된 가닥에 메틸화 시토신을 포함하지 않는 다른 단일 가닥 DNA를 혼성화하는 방법으로, 반(hemi)-메틸 DNA도 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 효소적으로 제조된 반-메틸화(HM) DNA 분자는 CpG 코어의 불완전한 메틸화와 염료 표지에 의한 간섭 때문에 그 효율이 낮았으나, 메틸화는 합성된 DNA와 비슷한 경향을 보였다. 효소적으로 제조된 완전-메틸화 코어(FM) DNA 분자 역시, 아주 약간 낮은 효율을 보였을 뿐, 합성 DNA 분자와 유사한 경향을 나타냄을 확인하였는바(실험결과 1), 합성적으로 메틸화된 올리고뉴클레오티드의 높은 비용을 감안할 때, 효소적으로 메틸화된 DNA는 전이 효율이 합성된 DNA와 크게 다르지 않기 때문에, 본 연구에 대한 유용한 옵션이 될 수 있다.
또한, 다른 일 예로 DNA를 인공적으로 합성하는 과정에서 메틸화된 시토신을 삽입하여 제조할 수 있다. 이러한 방법으로 메틸화된 DNA 분자를 제조하는 경우, 원하는 위치에 가장 확실하게 메틸기를 삽입할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서 용어 "메틸전달효소"는 메틸로 이루어진 작용기를 전달해주는, 즉 메틸기 전이를 촉매하는 효소를 모두 포함하는 의미이다. 기질을 메틸화하므로 메틸화효소 또는 메틸전이효소라고도 불린다.
상기 메틸전달효소는 일 예로 M.SssI 또는 DNMT1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 M.SssI 또는 DNMT1은 효소가 활성된 상태에서 이중가닥 DNA를 기질로 하여 시토신에 메틸기를 전달하여 시토신을 메틸화할 수 있다. 구체적으로 M.SssI는 비메틸 DNA, 반-메틸 DNA 또는 일부 메틸 DNA를 메틸화 할 수 있고, DNMT1은 반-메틸 DNA 또는 일부 메틸 DNA를 메틸화하는 특성을 갖는다.
본 발명에서 용어 "형광 염료"는 가시광이나 자외선광으로 형광을 발하는 염료를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 핵산분자 등을 표지하기 위한 형광 표지 염료를 의미한다. 상기 형광 염료를 이용하여 통상적으로 사용되는 화학반응을 통해 RNA, DNA 등과 같은 핵산 분자를 포함하는 생체 분자에 직접 표지 할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출방법에서는 이러한 형광 염료(분자)가 표지된 핵산 분자를 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 방법 및 키트는 한 쌍의 형광염료를 포함하며, 상기 한 쌍의 형광염료는 DNA 이중가닥에 대하여 각 가닥에 각각의 형광 염료가 결합된 것 일 수 있다.
본 발명에서 이중가닥 DNA에 각각 표지된, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터일 수 있다.
상기 형광염료는 형광염료는 시아닌(cyanine)계, 플루오레세인계, 로다민, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 쿠마린, 알로피코시아닌, R-피코에리트린, 알렉사 플루오르, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 시아닌(cyanine) 계 형광염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7일 수 있고, 상기 플루오레세인계 염료는 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-카복사미드 헥산산 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명) 염료, 예를 들면 알렉사플루오르 488(상표명) 또는 알렉사플루오르 594(상표명)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 이중가닥 DNA 분자에서 도너로 Cy3을 하나의 단일가닥에 표지하고, 억셉터로서 Cy5를 다른 하나의 단일가닥에 표지한, DNA 분자를 기질로, 메틸화 여부를 검출하는 시험을 수행하였다. 이를 통해서, DNA 분자의 B-Z 구조전이를 통해서 나타나는 형광신호의 변화를 통해서, Z-형 DNA의 비율을 결정하고, 이에 따라 DNA의 메틸화 여부를 검출 및 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다.
상기 DNA 분자는 상기 제1 단일 가닥 DNA와 제2 단일 가닥 DNA 중 어느 하나는 DNA 5' 또는 3' 말단에 비오틴이 결합된 것일 수 있다. 바람직한 예로, 형광염료가 결합된 뉴클레오티드 가닥의 다른 일 말단에 비오틴이 결합될 수 있다. 예를 들어, 제1 단일 가닥의 3' 말단에 제1 형광염료가 결합된 경우, 비오틴은 제1단일가닥의 5' 말단에 결합될 수 있다.
비오틴이 결합된 DNA 분자는 메틸화 과정을 거친 후, 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하기 전, 아비딘이 코팅(또는 고정)된 기재에 처리하여 DNA 분자의 비오틴과 아비딘을 결합하여 DNA 분자를 기재에 고정시킬 수 있다. 이후, 상기 기재에 염 용액을 처리하면, DNA 분자에서 구조전이가 일어나, 이에 따른 FRET 신호의 변화를 연속적으로 측정할 수 있고, 그 정확도를 더욱 높일 수 있다는 점에서 유리하다.
본 발명의 메틸화된 DNA 분자를 기재와 반응시킨 후 세척하여 고정되지 않는 DNA 분자를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "고정"이란 기재의 표면에 생체 분자를 부착 또는 결합하는 것을 의미하는 것으로, 일 예로 기재의 표면에 아비딘을 코팅하는 것 또는 기재에 부착된 분자에 DNA를 결합시키는 것일 수 있다. 고정 방법은 본 발명의 기술분야에 공지된 방법을 이용할 수 있고, 일 예로 항원-항체 결합, 클릭 화학 등을 이용하여 생체 분자를 고정할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약물"이란 질병의 치료, 개선 또는 예방을 위하여 사용되는 물질을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명에서 "후보약물" 이란 그 효과 또는 DNA 분자를 포함하는 생체분자에 미치는 영향을 규명하기 위하여 시험되는 약물을 의미한다. 또한, 본 발명에서 "후보약물"이란 특정 약물이 목적하는 기전에 효과가 있는지 확인하기 위하여 시험되는 약물을 의미한다. 상기 "약물의 생체분자에 대한 영향"이란, 상기 약물이 생체분자에서 구조전이를 일으키는지 여부 및/또는 유발되는 구조전이의 정도 등을 의미한다.
본 발명에서 용어 "구조전이"란 DNA의 이중 가닥의 구조가 일반적인 조건에서 존재하는 B-형에서 특정 조건에서 나타나는 Z-형으로 이중 가닥 사이의 나선 구조의 형태, 길이 등이 변하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "B형 DNA(B-DNA)" 및 "Z형 DNA(Z-DNA)"란 DNA는 이중나선의 구조의 형태를 의미하는 것이다. 구체적으로 DNA 이중나선은 오른손 방향의 B형 DNA 이중나선 외에도 다양한 구조를 취할 수 있고, 그 일 예로 왼손 방향 나선구조를 갖는 것을 Z형 DNA 구조라고 한다.
어떤 특정 구조 전이에 대해서는 메틸화가 그 구조전이에 필요한 조건을 크게 바꿔준다. 따라서 메틸화되지 않은 DNA는 특정 조건에서는 구조전이가 일어나지 않지만 메틸화된 DNA의 경우 같은 조건에서도 구조전이가 쉽게 발생한다. 개별 분자 수준에서 일어나는 수 나노미터 수준의 DNA 구조전이는 두 개의 가닥 사이의 거리의 변화로 형광 신호의 변화를 나타내고, 단분자 FRET 기술을 통해서 민감하고 정밀하게 측정할 수 있다. 이를 통해, DNA 분자들 상태의 분포를 알 수 있고, 개별 분자의 추적을 통해 한 분자가 다양한 조건 변화에 따라 어떻게 거동이 달라지는지 추적이 가능하며, 시간에 따른 동적 양상의 추적도 가능하다. 또한, 개별 분자를 검출할 수 있어, 소비되는 샘플의 양을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명에서는 FRET 결과를 통해서 Z형 DNA와 B형 DNA의 분포를 확인하여, Z-DNA가 갖는 비율을 얻을 수 있다. 이때, 동일한 조건이라고 하더라도 DNA 분자가 메틸화 된 경우 및/또는 메틸화된 시토신의 개수가 많을수록, Z-DNA로의 구조전이가 잘 일어나기 때문에, Z-DNA의 비율이 높을수록 DNA의 메틸화 정도를 확인할 수 있다. 또한, 시험에 사용된 DNA 분자의 Z-DNA 비율을 이미 알고 있는 DNA 분자를 이용한 정량 곡선 결과와 비교하여, 시험에 사용된 DNA 분자에서 메틸화된 염기의 개수를 정량적으로 측정하는 것이 가능하다. 또한, 메틸전달효소로 메틸화하나 DNA 분자와 메틸전달효소 및 후보약물로 함께 반응시켜 메틸화한 DNA 분자 사이에, 동일 염농도 조건에서 B-Z 구조전이가 다르게 확인되는 경우, 상기 후보약물이 메틸화에 관여하는 것임을 확인할 수 있다. 즉, B형에서 Z형으로 DNA 구조전이가 일어난 정도를 확인하여, DNA 분자의 메틸화 여부 및 메틸화의 정량을 분석할 수 있고, 이를 통해서, 메틸전달효소의 활성을 촉진 또는 억제하는 후보약물을 스크리닝 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "단분자 FRET"이란 표면에 개별 분자를 고정한 상태에서, 전반사 형광 현미경 기술을 이용하여 개별 분자의 형광 또는 형광 신호의 변화를 관찰할 수 있는 기술을 의미한다. 상기 프렛이란 두 형광염료가 Forster length라고 부르는 수 nm의 특정한 길이로 떨어지면 제1 형광염료(도너, donor) 분자에 레이저 등의 조사에 의해 전달된 에너지가 제2 형광염료(억셉터, acceptor) 분자로 전달되어 대신 형광을 내는 현상을 가리키며 이를 이용하여 나노미터 수준에서 일어나는 분자의 구조 변화 및 분자간 결합을 측정할 수 있는 기술을 의미한다. 본 발명에서는 일반적인 조건에서 B-형 DNA로 존재하나, 특정 염이 존재하는 조건에서 메틸 시토신의 포함 여부에 따라서 DNA가 Z-형으로 구조전이를 일으키는 현상을 통해서, Z-DNA로 구조전이되는 경우 나타나는 FRET 신호의 변화를 확인하여, DNA 메틸화 여부를 도출할 수 있다.
상기 FRET을 측정하는 단계는 고정되지 않은 DNA 분자를 포함하는 시료에서 공초점 방식의 단분자 FRET을 통해 FRET의 변화를 측정할 수 있다.
또한, 상기 FRET을 측정하는 단계는 기재에 고정된 메틸화 DNA 분자를 이용하여 연속적으로 FRET의 변화를 측정할 수 있다. 또한, 기재에 고정된 메틸화 DNA 분자를 포함하는 샘플 챔버에서 염 용액을 바꾸어 주면, 상기 조건에 따라 DNA의 구조전이가 함께 변화할 것이므로, 염 용액의 조건에 따라서 변화하는 FRET의 변화를 실시간으로 추적할 수 있고, 이러한 결과값으로부터 DNA 메틸화 분석을 할 수 있다.
상기 FRET의 측정은 상용 멀티채널 챔버(예. ibidi channel)와 호환성을 갖도록 설계할 수 있고, (micro)fluidics channel 사용을 통한 high-throughput 장치로 개발할 수 있다. 또한, 제안된 분자 디자인과 처리 과정을 spectrophotometer에 적용하여 앙상블 프렛을 측정할 수 있다. 이를 통해서, 간단하고 우수한 감도로 DNA 메틸화 여부와 메틸화 억제 약물 스크리닝을 간단히 수행할 수 있다.
본 발명에서, DNA의 구조전이를 확인하기 위해서, 구조전이 여부의 확인이 필요한 DNA 분자를 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 구조전이를 유도하는 것을 포함한다. 상기 구조전이 여부의 확인이 필요한 DNA는 메틸전달효소의 기질로 반응시킨, 즉 메틸화 반응을 시킨 DNA 분자이다.
DNA는 메틸화/비메틸화 여부, 또는 메틸화된 염기의 수에 따라서, 양이온성 염이 존재하는 조건에서 Z형 DNA로 구조전이를 일으키는 양상이 다르게 나타난다, 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 이를 실험적으로 확인하였고, 각각 상이한 개수의 메틸화 염기를 표준 DNA 샘플들의 Z-DNA 분포값을 통해 정량곡선을 구하고, 이를 기초로, 시험에 사용된 DNA 분자에서 메틸화를 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다.
보다 구체적으로, DNA 구조전이는 FRET을 측정한 히스토그램에서 FRET 반응 전 형광에서 최고값(pick)과 FRET 반응 후 형광에서 최고값(pick)의 면적을 측정하여 B-Z 구조전이를 일으킨 집단의 수를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 FRET 시험을 통해서 얻어진 FE 히스토그램에서 B-DNA(0.5 pick)와 Z-DNA(0.15 내지 0.2 pick)의 면적을 각각 계산하여, B-DNA 집단의 수와 Z-DNA 집단의 수를 각각 계산하여 Z형 DNA 비율을 결정하였다. 상기 히스토그램에서 원하는 구간의 면적은 본 발명 기술분야에서 통상적인 방법에 따라서 계산될 수 있다.
상기 양이온성 염은 1 가 또는 2가의 염 일 수 있고, 일 예로, Mg2+, Ca2+, Ni2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 염 용액은 0.1mM 내지 800mM의 염 용액을 사용할 수 있다. 상기 범위 보다 낮은 염 용액에서는 DNA의 구조전이가 유효하게 일어나지 않고, 상기 범위를 초과하는 경우, 높은 염 농도에 의하여 핵산분자가 오히려 멜팅(melting, denaturation)되거나, 핵산 구조가 뭉쳐, 구조전이에 따른 변화를 관찰할 수 없다.
바람직하게, 본 발명에서는 30 내지 100mM의 염 용액을 사용할 수 있다. 이 경우, DNA의 메틸화 여부/개수에 따라서 Z-DNA 분포 양상이 다르게 나타나는바, 즉, 비-메틸화된 DNA 분자는 상기 범위에서 B-형태로 유지되고, 완전-메틸화된 DNA 분자는 거의 Z-형태로 전환되며, 부분-메틸화된 또는 일부-메틸화된 DNA 분자는 B-DNA와 Z-DNA 상태의 중간 정도의 상대집단 분포를 나타내기 때문이다.
본 발명에 메틸화 반응이 수행된 DNA 분자와 반응시키는 염의 종류 또는 염의 농도는 DNA 분자의 종류에 따라서 달리 선택할 수 있다. 즉, DNA 분자 내 포함된 메틸화된 염기의 수에 따라서, 구조전이를 일으키는 염의 농도 및 염의 농도별 구조전이 정도가 다르게 나타나므로, DNA의 종류에 따라서, 염의 종류와 농도를 다르게 처리할 수 있다.
일 예로, 1가의 이온을 사용하는 경우, DNA 분자에 미치는 영향을 고려하여, 2가의 이온보다 높은 농도의 염 용액을 이용할 수 있다.
다른 일 예로, 본 발명 스크리닝 방법에서 비메틸 DNA 분자를 이용하는 경우, 40 mM 내지 800mM 범위의 염 용액을 이용할 수 있고, 반-메틸 DNA 또는 일부-메틸 DNA를 이용하는 경우, 10mM 내지 500mM 범위의 염 용액, 완전-메틸 DNA를 이용하는 경우 0.1mM 내지 50mM 범위의 염 용액을 이용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 상기한 FRET 결과를 통해서, 후보약물을 분류하는 단계를 더 포함한다. 구체적으로, 메틸전달효소만으로 반응시킨 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율과 비교해서, 메틸전달효소와 후보약물을 함께 반응시킨 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 낮은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 저해제로 분류하고; 메틸전달효소와 후보약물을 함께 반응시킨 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 높은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 촉진제로 분류할 수 있다.
구체적으로, 후보약물에 의하여 메틸전달효소의 활성이 억제되는 경우, DNA 분자의 CpG 반복 서열에서 메틸화가 일어나지 않거나, 메틸화의 정도가 후보약물을 처리하지 않은 경우보다 낮게 나타날 것이므로, 메틸화 반응된 DNA 분자에서 Z-DNA 구조전이가 발생하지 않거나 미미한 수준으로 발행하거나, Z-DNA의 분포가 낮게 나타날 것이므로, 상기 후보약물은 메틸전달효소를 저해하는 효과가 있다고 분류될 수 있다. 반대로, 메틸전달효소 활성을 촉진시키는 후보약물의 경우, 메틸전달효소에 의한 DNA 분자에서 메틸화가 더욱 많이 일어나도록 할 것이므로, 동일한 조건에서 메틸전달효소만으로 반응시킨 DNA 분자와 비교해서 더 많은 메틸 염기를 포함할 것인바, Z-DNA의 분포가 더 높아져, 상기 후보약물은 메틸전달효소를 촉진하는 효과를 갖는다고 분류될 수 있다.
시험에 사용된 메틸전달효소의 저해 정도(DOI), 즉 활성 억제되는 정도는 다음 식으로 계산할 수 있다.
[식 1]
Figure pat00001
상기 식 1에서, P(Z;0)은 억제제와 메틸화효소가 없을 때의 Z-DNA 형성 확률이고, P(Z;MTase) 메틸전달효소(MTase)와 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률, P(Z;MTase&drug)은 메틸전달효소(MTase) 및 저해제 약물과 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률이다(상기 확률은 전체 히스토그램 면적에서 Z에 해당하는 부분의 면적의 비율을 의미한다).
따라서, 약물이 아무런 효과가 없어서 P(Z; MTase & drug) = P(Z; MTase)이면, 상기 식에서 해당 약물은 0의 저해도를 갖는다(DOI=0). 반면에, P(Z)가 메틸전달효소가 없을 때 관찰되는 P(Z;0) 수준으로 완전하게 감소한다면, 저해는 완벽할 것이다(DOI=1).
본 발명은 또한, 비오틴 및 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자; 메틸전달효소; 1가 또는 2가의 양이온성 염을 포함하는 용액, 및 아비딘으로 코팅된 기재를 포함하고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트를 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 대한 내용은 본 발명 키트에도 그대로 준용된다.
본 발명을 이용하면 DNA 분자의 구조전이를 정밀하고 민감하게 검출할 수 있어, 소비되는 샘플의 양을 극단적으로 줄일 수 있어 경제적이고, 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출할 수 있게 해주므로 제약 분야에서 신규 약물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단분자 FRET을 이용한 DNA 메틸화 검출시험을 위한 단분자 설계(도 1a)와 B-Z 구조전이에 따른 FRET의 변화 양상(1b)을 보여준다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 단분자로서 반-메틸화 DNA를 제조하기 위한 합성 모식도이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 염 농도에서 다양한 메틸화 정도를 갖는 DNA 분자의 Z-DNA로의 전이 양상을 확인한 결과이다. 도2a는 Mg2+의 농도에 따른 비메틸화 DNA(UM)에 대한 CpG 코어의 FE 히스토그램이다 (아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(100 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM). 도 2b는 Mg2+의 농도에 따른 반-메틸화 DNA(HM)에 대한 CpG 코어에서 FE 히스토그램이다(아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(50 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM). 도 2c는 Mg2+의 농도에 따른 완전-메틸화 DNA(FM)에 대한 CpG 코어에서 FE 히스토그램(아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(100 mM Na+ 포함), 0.5 mM, 5 mM, 10 mM, 500 mM)과 스크램블 DNA 코어의 Mg2+ 500 mM에서 FE 히스토그램을 보여준다(가장 아래 그래프).
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 메틸화를 갖는 뉴클레오타이드 분자에서 Mg2+의 농도에 따른 Z-DNA 집단의 변이를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 메틸화를 갖는 뉴클레오타이드 분자에서 낮은 Mg2+의 농도에 따른 Z-DNA 집단의 전이를 확대한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 메틸화를 갖는 뉴클레오타이드 분자에서 [Mg2+]=50mM에서 Z-DNA 양상 및 중점을 보여주는 결과이다. Z-DNA 집단은 DNA의 메틸화 정도에 따라 선형적으로 증가한다.
도 2g는 본 발명의 일 실시예에 따른 한 개의 가닥에 5개의 메틸화된 시토신을 포함하는 CpG 코어(QM)의 Mg2+의 농도에 따른 FE 히스토그램이다 (아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(50 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM). 도 2h는 본 발명의 일 실시예에 따른 한 개의 가닥에 5개의 메틸화된 시토신을 포함하고, 나머지 한 개의 가닥에는 11개의 메틸화된 시토신을 포함하는 CpG 코어(TM)의 Mg2+의 농도에 따른 FE 히스토그램이다 (아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(50 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM).
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 M.SssI 농도(1 내지 200U/mL)에서 비메틸화(UM) 코어를 메틸화하는 경우 Z-DNA의 분포를 확인한 결과를 보여준다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 DNMT1 농도(20 내지 400U/mL)에서 반-메틸화(HM) 코어를 메틸화하는 경우 Z-DNA의 분포를 확인한 결과를 보여준다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 M.SssI 농도에서 비메틸화(UM) 코어를 메틸화하는 경우 FE 히스토그램을 보여준다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 DNMT1 농도(20 내지 400U/mL)에서 반-메틸화(HM) 코어를 메틸화하는 경우 FE 히스토그램을 보여준다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 메틸전달효소 저해제의 다양한 농도에서 메틸화 저해률을 확인한 결과(도 4)와, 상기 저해율을 위한 FE 히스토그램 결과이다:
도 4a 및 도 5a는 다양한 농도의 커큐민(0.5, 1, 5, 10, 800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 M.SssI의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과; 도 4b 및 도 5b는 다양한 농도의 커큐민(0.25, 1, 5, 10, 40, 100, 200 uM)의 DNA 메틸화효소 DNMT1의 메틸화 활성의 대한 저해 정도를 확인한 결과; 도 4c 및 도 5c는 다양한 농도의 EGCG(5, 10, 50, 100, 200, 400, 800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 M.SssI의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과; 도 4d 및 도 5d는 다양한 농도의 제니스테인(200, 400, 600, 800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 M.SssI의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과; 그리고 도 4e 및 도 5e는 다양한 농도의 제니스테인(50, 200, 500, 1000, 1800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 DNMT1의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과를 보여준다.
이하, 구체적인 실시예를 통해서 본 발명을 설명할 수 있다. 다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[실시예]
[시험 준비 및 시험 방법]
1. DNA 샘플, DNA 메틸전달효소 및 DNMT1 저해제 준비
염료-표지 DNA 및 비표지 DNA 올리고뉴클레오티드는 모두 IDT, Inc.(Coralville, IA, USA)로부터 구입하였다. 또한, IDT로부터 CG 반복 서열에서 시토신-메틸화된 DNA 올리고뉴클레오티드를 구입하였다. 듀플렉스(duplex) 중 하나의 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 비오틴을 포함하여, 뉴트라비딘-코팅된 유리 기판에 고정화되도록 설계하였다. 실험에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열정보(CG1 및 CG2, m5CG1, m11CG1 및 m11CG2)는 표 1에 나타내었다. 테더(tether) 분자는 표준절차(Kim,S.H., Lim,S.-H., Lee,A.-R., Kwon,D.H., Song,H.K., Lee,J.-H., Cho,M., Johner,A., Lee,N.-K. and Hong,S.-C. (2018) Unveiling the pathway to Z-DNA in the protein-induced B-Z transition. Nucleic Acids Res., 46, 4129-4137 참고)에 따라, T50 완충액(10 mM Tris, 및 50 mM NaCl, pH 8.0)에서 두 상보적인 올리고뉴클레오티드(각각 약 1 μM)를 혼성화하여 준비하였다.
상이한 메틸화 정도를 갖는 DNA 듀플렉스는 조합 방식으로 제조하였다. 비메틸화 코어(UM)의 경우, 2개의 비-메틸화 가닥(CG1 및 CG2)이 혼성화되고; 반- 메틸화 코어(HM)의 경우, 전부-메틸화 가닥(m11CG1) 및 비-메틸화 가닥(CG2)이 혼성화되며; 완전-메틸화 코어(FM)의 경우, 2개의 전부-메틸화 가닥(m11CG1 및 m11CG2)이 혼성화된다.
반-메틸화된 것보다 더 적게 메틸화된 분자를 갖기 위해, 총 5개의 시토신이 메틸화된 CG1-타입 가닥을 사용하였다(m5CG1). 반-메틸화 가닥(m5CG1)과 비메틸화 가닥(CG2)을 혼성화함으로써, 한 가닥에 5개의 메틸화 시토신을 갖는 코어분자(쿼터 메틸화(QM), m5-m0)를 제조하였다. 메틸화도가 반-메틸화와 완전-메틸화 사이의 분자(3/4 메틸화(TM), m5-m11)를 제조하기 위해서, 반-메틸화 가닥(m5CG1)과 전부-메틸화 가닥(m11CG2)을 사용하였다.
서열번호 이름 서열
서열번호 1 CG1(Cy5) 5'PhosGATCCTGGTACGCGCGCGCGCGCGCGCG/iCy5/CGCGATCGAC 3'
서열번호 2 CG2(Biotin,Cy3) 5'PhosTGCCGTCGATCGCGCGCGCGCGCGCGCG/iCy3/CGCGTACC AG-Biotin 3'
서열번호 3 m5CG1 5'/5Phos/ GAT CCT GGT ACG /iMe-dC/ GCG CG /iMe-dC/ G CG /iMe-dC/ G CG /iMe-dC/ G /iCy5/ CG /iMe-dC/ G ATC GAC3'
서열번호 4 m11CG1(Cy5) /5Phos/GATCCTGGTA/iMe-dC/G/iMe-dC/G /iMe-dC/G /iMe-dC /G/iMe-dC/G /iMe-dC/G /iMe-dC/G/iMe- dC/G /iMe-dC/G/iCy5//iMe-dC/G/iMe-dC/GATCGAC 3'
서열번호 5 m11CG2(Cy3) 5'/5Phos/ TGCC GTC GAT /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iCy3/ /iMe-dC/ G /iMe-dC/ GT ACC AG 3'
또한, 효소적 방식으로 불완전한 메틸화 정도를 갖는 DNA 분자를 준비했다(도 1c 참조). 효소적으로 제조된 분자를 B-Z 전이를 위해 구매된 합성 분자와 비교함으로써, 이들이 유사한 거동을 가지고, 효소적으로 메틸화된 분자의 메틸화의 불완전성 수준을 결정할 수 있음을 확인하였다.
메틸전달효소로서, MSssI와 인간 DNA methyltransferase 1(DNMT1)는 NEB로부터 구입하여 사용하였다. S-아데노실 메티오닌(S-Adenosyl methionine, SAM, AdoMet)은 보관 기간이 매우 제한되기 때문에, NEB로부터 정기적으로 구입하여 사용하였다. 한 번 열면 2주 동안 활성 상태로 유지되므로, 개봉 후 1~2 일 이내에 SAM을 사용했습니다. 또한 알려진 메틸화효소(MethylTransferase: MTase) 저해제, 커큐민(curcumin), EGCG 및 제니스테인(genistein)을 Sigma-Aldrich로부터 구입하여 실험에 이용하였다.
형광염료 쌍으로 Cy3(도너)와 Cy5(억셉터)를 사용하였다. 3' 말단에 Cy3(도너)와 비오틴 각각 표지된 제1 단일가닥과 3' 말단에 Cy5(억셉터)가 표지된 제2 단일가닥이 혼성화된 이중가닥 DNA 분자를 이용하였다.
2. DNA 메틸화 반응
메틸전달효소 및 메틸전달효소의 저해제를 이용하여 DNA 메틸화 반응을 수행하였다. 구체적으로, DNMT1 억제제(커큐민, EGCG 또는 제니스테인)의 존재 또는 부재하에 DNA MTase (M.SssI 또는 DNMT1)로 DNA 메틸화 분석을 수행하였다.
억제제-프리 분석에서, SAM, 10x완충액, DNA 및 M.SssI 또는 DNMT1의 순서로 시약을 물(또는 물에서 최대 1.75% DMSO(2.5% DMSO-커큐민))에 첨가하였다. 억제제-프리 DNMT1 분석을 위해서, 20㎕의 반응 혼합물은 반응 완충액(1x DNMT1 완충액(200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 % Glycerol, pH 7.5) 중 160μM SAM 및 100μg/ml BSA)에 25nM DNA 듀플렉스와 100U/ml DNMT1 (20~400 U/ml)을 포함하였다. 억제제-프리 M.SssI 분석을 위해서, 20㎕의 반응 혼합물은 반응 완충액(1x NEB 완충액 2(50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.9) 중 160μM SAM)에 25 nM DNA 듀플렉스와 80U/ml (10~200) M.SssI를 포함하였다.
혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고, 다양한 인큐베이션 시간(전형적으로 2 시간) 이후, 메틸화 반응은 65℃에서 20분 동안 효소의 열 불활성화에 의해 중단되었고, 반응 혼합물은 이후 smFRET 측정 전까지 -20℃에서 저장되었다.
또한, 메틸화 반응에서 DMSO가 DNMT1 저해제의 용매로 사용되기 때문에 그 자체의 효과도 테스트하였다. 2.5% DMSO는 DNA 메틸화에 눈에 띄는 영향을 미치지 않지만 10%를 초과하는 DMSO는 효소 활성을 억제할 수 있음을 확인하여, 이후 실험에서는 10% 농도 미만으로 설정하여 메틸화 반응을 수행하였다.
MTase 억제 분석에서, 다양한 농도의 MTase 저해제를 M.SssI 또는 DNMT1과 함께 첨가되었다. 저해제의 첨가를 제외하고는 반응 및 분석은 완전히 동일하게 수행하였다.
3. 단일 분자 FRET을 이용한 DNA 메틸화 분석
단일 분자 FRET 기술은 수많은 논문에서 검토되었으며, 본 발명에서는 Nucleic Acids Res., 46, 2018(Kim,S.H., Lim,S.-H., Lee,A.-R., Kwon,D.H., Song,H.K., Lee,J.-H., Cho,M., Johner,A., Lee,N.-K. and Hong,S.-C. (2018) Unveiling the pathway to Z-DNA in the protein-induced B-Z transition. Nucleic Acids Res., 46, 4129-4137)에 개시된 바에 따라 분석을 수행하였다. 실험 과정 및 자세한 내용은 Ann. Rev. Biochem., 77, 51, 2008 (Joo C., Balci H., Ishitsuka Y., Buranachai C., Ha T. (2008) Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology의 기재를 함께 참고하여 수행하였다.
커버 슬립 및 슬라이드 글라스는 아세톤으로 초음파 처리하고 플라즈마 세정을 수행하였다. 그 다음, 챔버에 장착하였다. 챔버는 1mg/ml 비오틴 표지된 BSA 및 0.2mg/ml 뉴트라비딘으로 코팅되었다. 이어서, 이 메틸화 반응 수행된 DNA를 포함하는 샘플 용액을 상기 챔버에 도입하고, 10 분 동안 DNA 테더의 고정화를 위해 인큐베이션 하였다. 이어서, 샘플 챔버를 다양한 농도의 Mg2+를 함유하는 4x챔버 부피의 완충 용액으로 세척한 다음 30분 동안 인큐베이트 하였다. 30분 후, 전이는 평형 상태에 도달한다. 형광 측정을 위해, 챔버를 5~500mM MgCl2가 첨가된 산소 제거 용액(2mM Trolox, 2.6mM PCA(Protocatechuaic acid, Sigma), 1unit/ml의 rPCO(Protocatechuate 3,4-dioxygenase, OYC Japan))으로 세척하였다.
　메틸화 정도를 결정하거나 메틸화 수준을 비교하기 위한 분석에서, [Mg2+] = 50mM을 사용하였다.
[실험 결과]
1. DNA 메틸화와 CG 반복 서열에서 B-Z 구조전이 효율의 관계 확인
DNA 메틸화가 B-Z 구조전이를 강화하는지 확인하기 위해서, 비메틸화 코어(UM), 반-메틸화 코어(HM), 완전-메틸화 코어(FM) CG 반복 서열과 중간 정도의 메틸화를 갖는 다른 CG 반복 서열(QM, TM)을 이용하여, 일련의 마그네슘 농도 하에서 B-Z 전이가 일어나는지 여부를 단분자 프렛(smFRET)을 이용하여 확인하였다. 모든 서열은 14bp로 떨어진 FRET 염료 쌍을 포함하도록 하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 비메틸화 코어(UM, m=0)는 매우 높은 [Mg2+] 농도에서 B-Z 구조전이를 보였다. 비메틸화 코어(UM) DNA의 경우, 0.5M 보다 높은 마그네슘 이온[Mg2+]의 농도에서 B-Z 전이의 중점(B상태와 Z상태가 50:50으로 존재)이 나타나는 것을 알 수 있다. 그러나, 도 2b의 반-메틸화 코어(HM, m=11)는 더 낮은 [Mg2+] 농도에서 B-Z 구조전이를 보였다. B-Z 구조전이에 대한 Mg2+ 중점 농도는 0.1 M MgCl2 였고, 300mM 이상의 [Mg2+] 농도에서 반-메틸화 코어(HM)는 주로 Z-형태로 존재하였다. 또한, 도 2c의 완전-메틸화 코어(FM)는 0.5mM의 마그네슘 이온 ([Mg2+]) 중점을 보였고, 이는 Mg2+의 생리학적 농도 범위 내에 포함된다(Cell Biology by the Numbers by Ron Milo & Rob Phillips). 이 중간 농도는 반-메틸화 코어(HM)에 대한 농도보다 50 내지 100배 낮은 농도이다. 쿼터 메틸화 코어(QM, 0-5)는 비메틸화 코어(UM)과 반-메틸화 코어(HM) 사이의 중간적인 과도기적 거동을 보였다(도 2g). 또한, 3/4 메틸화(TM) 코어는 반-메틸화(HM)와 완전-메틸화(FM) 사이의 중간형태의 거동을 보였다(도 2h). 효소적으로 제조된 반-메틸화(HM) DNA 분자는 CG 코어의 불완전한 메틸화와 염료 표지에 의한 간섭 때문에 그 효율이 낮았으나, 메틸화는 합성된 DNA와 비슷한 경향을 보였다. 효소적으로 제조된 완전-메틸화 코어(FM) DNA 분자 역시, 아주 약간 낮은 효율을 보였을 뿐, 합성 DNA 분자와 유사한 경향을 나타냈다.
또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 스크램블 시퀀스로부터 Mg2+ 농도에 상관없이 FRET에 대한 영향이 없으며 Z-DNA가 생기지 않음을 확인하였다. 따라서, FRET 구조전이는 서열 특이적이고, CG 반복 서열에 B-Z 구조전이가 기인한다는 것을 명확하게 알 수 있다.
또한, 도 2d에 나타낸 바에 따라, 메틸화된 시토신 수의 증가는 B-Z 구조전이에서 Mg2+의 필요 농도를 극적으로 낮출 수 있음을 알 수 있다. 또한, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 상기에서 얻어진 실험 결과로부터 메틸화된 시토신의 수와 Z-DNA 상태가 선형관계에 있음을 확인하였다. 이에 따라, DNA 메틸화 정도와 그에 따른 Z-DNA의 형성 확률은 기존 연구 방법과는 달리 정량적인 정보를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
2. 메틸화전달효소를 이용한 CG 코어의 메틸화
상업적으로 이용 가능한 CpG DNA 메틸화전달효소인 M.SssI는 비메틸화 DNA에서 완전 메틸화 DNA로 de novo 메틸화를 유도할 수 있다. 이는 DNMT1 보다 더 강력하고 활성이 강한 효소이다. M.SssI의 DNA 메틸화 활성을 테스트하기 위해 비메틸화 DNA(UM)를 이용해서, 반응 개시 후 0.5, 1, 2, 3 및 4 시간이 각각 경과한 시점에 열에 의한 불활성화를 통해 메틸화 반응을 중단시켰다. 2시간의 인큐베이션 후 효소 활성이 감소함을 확인하였다.
DNMT1 효소의 1 단위(1U)는 37℃에서 30분 동안 25μL의 총 반응 부피에서 1pmol의 메틸기를 폴리 dI.dC 기질로 전이를 촉매하는 데 필요한 효소의 양으로 정의된다. 폴리 dI.dC에 대한 메틸화 효율은 폴리 dG.dC의 메틸화 효율과 비교해서 21배 높고, 반-메틸화 dG.dC의 메틸화 효율과 비교해서 4.6배 높다.
따라서, 메틸-수용 부위(사용된 DNA에서 메틸화될 수 있는 시토신의 총 수)는 다음과 같다: 25nMx11x20μL ~ 5pmol. 400U/mL(= 8U/20μL)와 2시간 인큐베이션을 사용하고, 폴리 dI.dC의 메틸화 속도를 폴리 dG.dC의 메틸화 속도로 변환하면 이론적으로 DNMT1의 1단위는 1pmol x 8(U) x 4(t)/4.6(seq) ~ 7pmol을 메틸화할 수 있다고 추정할 수 있다. 또는 200U/mL의 효소로 1pmolx4(U)x 4(t)/4.6(seq) ~ 3.5pmol을 메틸화할 수 있다고 추정할 수 있다. 이러한 단순화된 추정은 [DNMT1] = 400U/mL (또는 200U/mL)에서 80%(또는 70% 미만)의 Z-상태를 주는 약간 불완전한 시토신 메틸화에 잘 부합된다고 할 수 있고, 이 효소가 우리의 DNA 분자에 대해 잘 작용함을 보여준다.
본 발명의 시험에서 메틸-수용 부위 계산에 사용된 조건은 DNA 분자의 농도는 20μL 용액 중 25nM이고, 인큐베이션 시간은 2시간이었다. 메틸화 시토신(반-메틸화 코어(HM))에서 메틸화된 시토신의 수는 11이었다.
메틸화 활성에 대한 효소의 농도의 효과를 도 3a에 나타낸 바와 같이 확인하였다. 본 실험에서는 상기한 결과를 기초로, 2시간 인큐베이션 한 후 반응을 중단시켰다. 시토신 메틸화 정도를 나타내는 Z-DNA 집단은, M.SssI의 농도에 따라 증가하였고, 100U/ml의 농도 이상에서 Z-DNA는 점차적으로 수평을 유지하였다. M.SssI의 검출 한계 최소 농도는 약 6.3U/ml 정도로 기존 센서보다 높게 측정되었는데, 이는 본 실험에서 11개의 CpG 서열(양쪽 22개)을 메틸화할 수 있어, 기존 방법보다 높은 단백질 농도를 요구하는 것으로 확인된다. 그러나, B-Z 전이에 따른 Z-DNA 형성 확률이 메틸화된 사이토신의 개수에 민감하므로, 단분자 프렛은 DNA 분자 하나에 붙은 형광을 측정할 수 있으며 나노 단위의 DNA 구조변화를 관측할 수 있기 때문에 본 기술은 메틸화 DNA를 검출하는 데 높은 민감성과 다양한 장점을 갖는다.
도 2d에서 얻은 메틸화 시토신의 수와 Z-상태 집단의 관계를 이용해서, DNA에서 메틸화된 시토신의 유효수를 추정하였다. [M.SssI] = 200U/mL의 농도에서, M.SssI는 염료 분자 근처의 시토신을 제외하고, 코어 시퀀스에서 거의 모든 시토신을 메틸화 할 수 있었다.
유사하게, 농도-의존적 방법으로 DNMT1의 효소 활성을 확인하였다. DNMT1이 반-메틸화 CG 반복 서열에 작용한다고 알려져 있기 때문에, 본 실험에서는 반-메틸화 CG 서열(HM)을 이용하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 반-메틸화 코어(HM)의 [Mg2+] 중점은 약 100mM이고, [Mg2+]=50mM에서 39%의 분자가 Z-상태에 있고, 나머지는 B-상태에 있었다.
그 다음, 반-메틸화 코어(HM)를 다양한 농도(0, 20, 50, 100, 200, 및 400U/mL)의 DNMT1과 인큐베이션하여 DNMT1이 반-메틸화 코어(HM)에서 비메틸화 가닥(CG2)을 메틸화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, DNMT1 처리 후 Z-상태의 집단은 반-메틸화 코어와 비교해서 눈에 띄게 증가하였다. 이는 DNMT1이 반-메틸화 DNA 기질을 완전히 메틸화 할 수 있음을 뒷받침한다.
3. 메틸전달효소 저해제 약물의 메틸전달효소 저해 활성 측정
본 발명의 분석법을 통해서 메틸전달효소 저해제의 효소 저해 활성을 측정할 수 있는지 확인하기 위해, 다양한 종류의 메틸전달효소 저해제에 대해서 다양한 농도에서 효과를 확인하였다.
공지된 메틸전달효소 저해제로서 커큐민을 2.5% DMSO를 포함하는 물에 준비하였다. 다른 메틸전달효소 저해제로 제니스테인을 이용하였다. M.SssI 및 DNMT1의 기질로서 각각 비메틸화 분자와 반-메틸화 분자를 이용하였고, 메틸화 저해 정도를 확인하였다. 80U/mL M.SssI와 100U/mL DNMT1를 각각 사용하였고, 시험 시 사용된 마그네슘 이온의 농도는 50mM Mg2+이었다.
효소의 저해 정도(DOI)는 다음 식으로 계산할 수 있다.
[식 1]
Figure pat00002
상기 식 1에서, P(Z;0)은 억제제와 메틸화효소가 없을 때의 Z-DNA 형성 확률이고, P(Z;MTase) 메틸전달효소(MTase)와 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률, P(Z;MTase&drug)은 메틸전달효소(MTase) 및 저해제 약물과 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률이다(상기 확률은 전체 히스토그램 면적에서 Z에 해당하는 부분의 면적의 비율을 의미한다).
따라서, 약물이 아무런 효과가 없어서 P(Z; MTase & drug) = P(Z; MTase)이면, 상기 식에서 해당 약물은 0의 저해도를 갖는다(DOI=0). 반면에, P(Z)가 메틸전달효소가 없을 때 관찰되는 P(Z;0) 수준으로 완전하게 감소한다면, 저해는 완벽할 것이다(DOI=1).
도 4a 및 4b는 커큐민의 농도에 따른 M.SssI 및 DNMT1에 대한 저해 정도(DOI)를 나타내며, 농도 의존적으로 효소의 저해 정도가 증가하는 것을 알 수 있다. M.SssI에 대한 커큐민의 IC50값은 4μM이었고(도 4a), DNMT1에 대한 커큐민의 IC50값은 10μM이었다(도 4b). 도 5a 및 도 5d는 각각 M.SssI 및 DNMT1에 대하여 커큐민의 메틸화 저해에 따른 구조변이의 양상이 상이해짐을 보여준다. 즉, 커큐민의 농도가 높아짐에 따라 메틸화가 억제되어, DNA 분자에서 Z-DNA로 구조전이가 적어지는 분포를 나타냄을 보여준다,
또한, 메틸전달효소에 의한 DNA 메틸화에 대한 EGCG와 제니스테인의 효과를 확인하였다. 탈 이온수에 EGCG를 용해하여 준비하고, 2% DMSO를 포함하는 물에 제니스테인을 포함시켜 준비하였다.
도 4c, 4d 및 4e에 나타낸 바와 같이, M.SssI 및 DNMT1에 대한 EGCG와 제니스테인의 저해도(DOI)는 해당 약물의 농도 의존적으로 증가하였다. M.SssI 효소에 대한 제니스테인의 IC50값이 약 600μM이었고(도 4d), DNMT1의 경우, IC50값이 약 300μM이었다(도 4e).

Claims (18)

  1. a) 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열(CG 반복 서열)을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소 및 후보약물을 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
    b) 대조군으로서 상기 a)와 동일한 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소를 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
    c) 상기 a) 와 b)의 메틸화된 이중가닥 DNA 각각을 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 제1 형광염료와 제2 형광염료 사이의 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하여, 각각 독립적으로 상기 a)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하고, b)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하는 것; 및
    d) 상기 b)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율과 비교해서, a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 낮은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 저해제로 분류하고; a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 높은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 촉진제로 분류하는 것을 포함하는 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 분자는 5 내지 50nt 길이인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 형광염료는 시아닌(cyanine)계, 플루오레세인계, 로다민, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 쿠마린, 알로피코시아닌, R-피코에리트린, 알렉사 플루오르, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 시아닌(cyanine) 계 형광염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 플루오레세인계 염료는 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-카복사미드 핵산 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명) 염료, 예를 들면 알렉사플루오르 488(상표명) 또는 알렉사플루오르 594(상표명)인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단일 가닥 DNA와 제2 단일 가닥 DNA 중 어느 하나는 DNA 5' 또는 3' 말단에 비오틴이 결합된 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 1가 또는 2가의 양이온성 이온은 Mg2+, Ca2+, Ni2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 염용액의 농도는 0.1mM 내지 800mM인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 c)의 FRET 신호의 측정 전에 메틸화된 이중가닥 DNA을 아비딘이 코팅된 기재에 처리하여 비오틴과 아비딘을 결합하여 DNA 분자를 기재에 고정시키는 것을 더 포함하는 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    2 내지 40개의 CG 반복 서열은 제1 또는 제2 단일 가닥 DNA의 중심에 포함되는 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단일 가닥 DNA 및 제2 단일 가닥 DNA는 메틸화된 시토신(C) 염기를 포함하지 않거나, 일부 또는 전부 메틸화된 시토신(C) 염기를 포함하는 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
  13. 비오틴 및 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자; 메틸전달효소; 1가 또는 2가의 양이온성 염을 포함하는 용액, 및 아비딘으로 코팅된 기재를 포함하고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 형광염료는 시아닌(cyanine)계, 플루오레세인계, 로다민, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 쿠마린, 알로피코시아닌, R-피코에리트린, 알렉사 플루오르, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 시아닌(cyanine) 계 형광염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 플루오레세인계 염료는 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-카복사미드 헥산 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명) 염료, 예를 들면 알렉사플루오르 488(상표명) 또는 알렉사플루오르 594(상표명)인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 1가 또는 2가의 양이온성 이온은 Mg2+, Ca2+, Ni2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 염용액의 농도는 0.1mM 내지 800mM인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.
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