CZ20023749A3 - Způsob detekce a pár sond tvořených nukleovou kyselinou - Google Patents

Description

Způsob detekce a pár sond tvořených nukleovou kyselinou

Oblast techniky

Vynález se týká sond tvořených nukleovými kyselinami, které jsou náchylné k chemickému nebo enzymatickému štěpeni a testů a metod, které používají uvedené sondy při detekci cílových sekvencí nukleových kyselin ve vzorku.

Dosavadní stav techniky

Nukleové kyseliny deoxyribonukleová kyselina (DNA) a ribonukleová kyselina (RNA) jsou molekulární zdroj genetické informace. Ve skutečností je každý protein výsledkem informace obsažené v buněčných nukleových kyselinách. Gen je segment DNA, který obsahuje informaci pro funkční biologický produkt, jako je protein nebo RNA. Funkce DNA je uchovávání biologické informace a protože buňka v typickém případě obsahuje tisíce genů, molekuly DNA mají tendenci být velmi velké. Celková délka všech DNA v jediné lidské buňce je přibližně dva metry, přičemž obsahuje biliony nukleotidů.

V eukaryontních organizmech se DNA nachází v jádru buňky. Ale k syntéze proteinu dochází v cytoplazmě na ribozómech, proto genetický vzkaz pro syntézu proteinu přenášejí z jádra do cytoplazmy molekuly jiné, než je DNA. RNA se nachází jak v jádru tak v cytoplazmě a slouží k přenosu genetické informace z DNA na ribozóm. Existuje několik tříd RNA, každá třída má odlišnou funkci. Ribozomální RNA (rRNA) tvoří strukturní složku ribozómů, na kterých probíhá syntéza proteinů. Mediátorová RNA (mRNA) je nukleová kyselina, která nese informaci z genu na ribozóm, kde vznikají odpovídající proteiny. Transferová RNA (tRNA) je adaptorová molekula, která překládá informaci uloženou v mRNA na specifickou sekvenci aminokyselin. Existují také různé varianty RNA se speciálními funkcemi, které mají v buňce další funkce (popisuje se v publikaci Lehninger et al., Principles of biochemistry, second edition, 1993, Worth Publishers, Inc.).

DNA v dvojité helikální konformaci obsahuje dva vzájemně obtočené řetězce polynukleových kyselin. Každá nukleotidová jednotka polynukleotidového řetězce obsahuje dusíkatou bázi (A, T, C nebo G) , cukr deoxyribózu a fosfátovou skupinu. Orientace dvou polynukleotidových řetězců je antiparalelní poněvadž jejich směr od 5' konce k 3'konci je opačný. Řetězce drží pohromadě vodíkové vazby a hydrofóbní interakce. Páry baží v DNA obsahují puriny, jako je adenin (A) a guanin (G), a pyrimidiny, jako je thymin (T) a cytozin (C). Adenin se páruje s thyminem za vzniku dvou vodíkových vazeb, zatímco guanin se páruje s cytozinem za vzniku tří vodíkových vazeb. Tato komplementarita párů baží je podstatným rysem molekuly DNA a je způsobena velikostí, tvarem a chemickým složením baží. Výsledkem geometrie dvojité šroubovice se purin může také párovat s pyrimidinem. Guanin se také bude párovat s cytozinem a adenin se také bude párovat s tyrozinem. Tato jednoduchá a elegantní struktura poskytuje dvojité šroubovici neobyčejnou stabilitu.

Za teplotních podmínek a určité koncentrace iontů, které se nacházejí v buňkách, si DNA uchovává dvouřetězcovou strukturu pomocí vodíkových vazeb mezi páry baží A-T a G-C. Duplexy mohou zvýšením teploty (obvykle v ředěném roztoku sole 0,01 M NaCI) nebo zvýšením hodnoty pH nad 11 denaturovat (denaturace za vzniku jednotlivých řetězců) . Jestliže se teplota sníží a koncentrace iontů v roztoku vzroste nebo jestliže se hodnota pH sníží, jednotlivé řetězce hybridizují nebo reasociují za opětného vzniku duplexů (jestliže je koncentrace v roztoku dostatečně vysoká). Tato vlastnost tvoří základ pro metodu nazvanou hybridizace nukleových kyselin. Ve směsi nukleových kyselin dochází k opětné asociaci pouze komplementárních řetězců. Rozsah jejich opětné asociace není obvykle ovlivněna přítomností nekomplementárních řetězců.

K hybridizaci molekul může docházet mezi komplementárními řetězci buď DNA nebo RNA nebo mezi řetězcem RNA a DNA.

V oboru molekulární biologie je dobře známé použití různých hybridizačních technik, které používají oligonukleotidové sondy k detekci genů (a RNA), které jsou středem zájmu. V obecném případě se sondy navrhly tak, že hybridizují s fragmenty, které obsahují komplementární sekvenci nukleové kyseliny. Existence a množství vytvořených hybridů se detekuje měřením radiace (v případě radioaktivně značených sond), produktů vzniklých působením enzymů (v případě sond značených enzymem), fluorescence (v případě sond značených fluorescenčním činidlem) a podobně v závislosti na podstatě použitého signálu. Aby se odhadla stabilita duplexu komplexů nukleových kyselin, pro které je sonda určena, a aby se snížilo nespecifické navázání (pozadí) sond na DNA nebo RNA, které nejsou cílem, musí se vypočítat různé experimentální podmínky. Když se provádí hybridizační test, je nutné zvažovat řadu proměnných, které zahrnují teplotu denaturace nebo jiné denaturační podmínky, teplotu hybridizace, koncentrace solí, pH a další. Hlavním problémem je pravděpodobnost nespecifického navázání sond tvořených nukleovou kyselinou na sekvence nukleových kyselin, které nejsou jejich cílem. Jedním možným hybridizace je použitím molekulární hybridizace in sítu. Připravila se značená DNA nebo RNA, která je komplementární se specifickými sekvencemi DNA nebo RNA obsaženými ve vzorku. Taková komplementární DNA nebo RNA se nazývá oligonukleotidové sonda. V tomto testu se oligonukleotidové sondy navrhly tak, že hybridizují se specifickou cílovou RNA, jako je mRNA nebo určité přirozené nebo začleněné genové sekvence v DNA. Buňky nebo pruhy tkáně se mohou po krátký časový úsek vystavit působení tepla nebo kyseliny, což fixuje obsah buněk i nukleovou kyselinu na sklíčkách, filtru nebo jiném materiálu. Fixovaná buňka nebo tkáň se pak vystaví působení značených komplementárních DNA nebo RNA sondám určeným pro hybridizací. Značící činidla mohou být radioizotopy, jako je ³²P, fluorescenční barviva, biotinem značené nukleotidové analogy, antigeny nebo libovolné jiné běžně používané značící metody. Po určité době inkubace může být odstraněna nehybridizovaná značená DNA nebo RNA, zatímco hybridizované komplexy jsou detekovány, aby dokázaly přítomnost a/nebo lokaci specifické RNA nebo DNA v jednotlivých buňkách nebo v pruzích tkáně. Ačkoli tato metoda je populární, je nezbytné pokračovat v úsilí zlepšit citlivost testu a snížit nespecifické navázání (pozadí) značených sond (popisuje se v publikaci Darnell et al., Molecular Cell Biology, Second Edition, 1990, Scientific American Books, lne.).

Jinou hybridizační metodou, která se používá v oboru, je hybridizace značených sond s imobilizovanou nukleovou kyselinou. Existuje řada dostupných metod vhodných pro hybridizací značených sond s nukleovými kyselinami, které mohu být imobilizovány na pevných podkladech, jako jsou nitrocelulózové filtry nebo nylonové membrány. Tyto metody se liší v různých faktorech, jako je použité rozpouštědlo nebo teplota, objem rozpouštědla, délka hybridizace, stupeň a způsob míchání, použití činidel, jako je Denhardtovo činidlo nebo BLOTTO, která slouží k blokování nespecifického zachycení sondy na povrchu pevné matrice, koncentrace značené sondy a její specifická aktivita, použití sloučenin, jako je síran dextranu nebo polyethylenglykol, které zvyšují rychlost opětné asociace nukleových kyselin a přísnost podmínek promývání, které následuje po hybridizací.

Při tradičních testovacích metodách se mohou použít k blokování nespecifického zachycení sondy na povrchu pevného podkladu různé typy činidel. Taková činidla zahrnují Denhardtovo činidlo, heparin, netučné sušené mléko a podobně. Tato činidla se často používají v kombinaci s denaturovaným, štěpeným spermatem lososa nebo kvasinkovou DNA a detergenty, jako je SDS. Blokační činidla jsou také zahrnuta jak v prehybridizačním tak v hybridizačním roztoku v případě, že se použijí nitrocelulózové filtry. Když se používá k imobilizaci nukleových kyselin nylonová membrána, je možné často z hybridizačního roztoku vynechat blokační činidla, protože se věří, že vysoké koncentrace proteinu interferují s hybridizací sondy se svým cílem. Za účelem minimalizovat problémy spojené s pozadím, je nejlepší, aby hybridizace trvala co nej kratší dobu, použilo se minimální množství sondy. Není však možné předejít veškerému nespecifickému navázání sond, zvláště, když podmínky jsou takové, že detekovatelné množství nukleové kyseliny je malé (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Clonning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Hybridizace nukleové kyseliny je také nejspolehlivější metodou pro vyhledávání klonů v knihovnách cDNA. Použitím sond tvořených nukleovými kyselinami je možné současně a rychle testovat velké množství klonů. Různé metody používají sondy různých délek a specifikace. Homologní sondy obsahují alespoň část přesné sekvence nukleové kyseliny požadované cDNA. Můžou se použít různými způsoby, jako je použití určitého klonu existující cDNA za účelem izolace klonu knihovny cDNA v celé délce. Hybridizace s homologními sondami se provede za přísných podmínek. Částečně homologní sondy se používají k detekci klonů cDNA, které jsou příbuzné, ale nikoliv shodné se sekvencí sondy. Jestliže se například klonoval stejný gen pocházející z jiných živočišných druhů nebo příbuzný gen ze stejného druhu, je možné experimentálně stanovit, zda sekvence nukleové kyseliny je dostatečně konzervativní, aby umožnila testování knihovny cDNA hybridizací. Je nezbytné stanovit podmínky, které umožní použít předem klonovaný gen jako sondu pro cDNA, aniž dochází k interferenci s nespecifickou hybridizací, což vede k nespecifickému signálu. Detailnější • · • · informace o hybridizačních testech a podmínkách se uvádějí v publikaci Sambrook et al., Molecular Clonning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Existuje několik různých činidel, které se mohou během hybridizačních testů použít k blokování . nespecifického tvořených nukleovými kyselinami na povrchy shora v textu) . Je však nutné poskytnout zdokonalené metody vhodné pro použití sond tvořených nukleovou kyselinou při hybridizačních metodách, které zesilují poměr signál ku šumu pozadí a snižují tvorbu nespecifického signálu.

navázání sond (popisuje se

Podstata vynálezu

Vynález popisuje sondy tvořené degradovatelnými nukleovými kyselinami a testy a metody použití těchto sond při detekci cílových sekvencí nukleové kyseliny obsažených ve vzorku. Účel degradačního postupu je snížení tvorby nespecifického signálu.

Vynález dále popisuje test detekce cílené sekvence nukleové kyseliny, který používá uvedené degradovatelné sondy. Test je s výhodou založen na hybridizaci nukleové kyseliny v roztoku nebo in šitu se sondami tvořenými nukleovou kyselinou, které jsou náchylné k chemické nebo enzymatické degradaci. Test zahrnuje (1) hybridizaci značené sondy (sond) tvořené degradovatelnou nukleovou kyselinou s cílovou sekvencí, přičemž vzniká produkt specifický pro cíl, (2) degradaci nebo separaci oblasti komplementární s cílem od značené oblasti sondy (sond) a (3) detekci přítomnosti značené oblasti.

V jednom provedení vynálezu se popisuje způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, kdy alespoň jeden pár sond nukleové kyseliny hybridizuje s cílovou nukleovou kyselinou. Sondy jsou charakterizovány dvěmi oblastmi nukleové kyseliny, které tvoří po spárování baží sond s přilehlými oblastmi sekvence cílové nukleové kyseliny terminální větev nebo kmen sonda-sonda. Tyto oblasti sondy, které jsou schopny tvořit zde popsanou větev nebo kmen sonda-sonda, se nazývají „kmenové oblasti nebo „oblasti sonda-sonda. Sondy obsahují alespoň jednu řetězící sloučeninu umístěnou v uvedené kmenové oblasti alespoň jedné sondy z páru sond. Kmenová oblast druhé sondy páru sond začleňuje činidlo, které je schopné tvořit kovalentní vazbu se řetězící sloučeninou kmenové oblasti první sondy. V jiném případě obě kmenové oblasti mohou začlenit řetězící sloučeninu schopnou tvořit kovalentní vazbu reakcí dvou řetězících sloučenin, jako je dimarizace. Kovalentní vazba se objevuje po párování baží sond s cílovou sekvencí nukleové kyseliny a tím trvale dochází k vzájemnému řetězení kmenových oblastí párů sond. Navíc alespoň jedna z kmenových oblastí sond obsahuje detekovatelnou část nebo část generující signál, která je navázána na konci cílové oblasti. Signál se tvoří a detekuje po vytvoření řetězce kmene, který se naopak objevuje po párování baží sond se sekvencí nukleové kyseliny. Sondy tvořené nukleovou kyselinou se navrhují tak, že hybridizační oblast sondy specifické pro cíl nebo oblast sondy komplementární s cílem se může oddělit od detekovatelně značené oblasti prostřednictvím degradačního postupu. Proto zbývající část sond obsahuje kmen a značku. Účel této separace je zlepšení poměru signál ku šumu pozadí snížením specifického nebo nespecifického šumu pozadí.

Vynález dále popisuje sondy tvořené nukleovou kyselinou, které obsahují sekvenci nukleové kyseliny, která zahrnuje upravenou nebo neupravenou oblast nukleové kyseliny navrženou tak, že tvoří po párování baží alespoň dvou sond s přilehlými oblastmi cílové sekvence nukleové kyseliny větev nebo kmen sonda-sonda. Oblasti sondy, které jsou schopné tvořit kmen se také nazývají „kmenové oblasti nebo „oblasti sonda-sonda. Alespoň jedna z kmenových oblastí sond obsahuje detekovatelnou část, jako je značka vázaná na konci kmenové oblasti. Ve výhodném provedení vynálezu kmenová oblast sondy páru sond ·· ·· ·· obsahuje upravené nebo neupravené purinové nukleotidy nebo deriváty, jako jsou upravené nebo neupravené adeninové zbytky a alespoň jednu řetězící sloučeninu, zatímco kmenová oblast jiné sondy páru sond obsahuje upravené nebo neupravené pyrimidinové nukleosidy nebo deriváty, které fungují jako reakční činidlo pro řetězící sloučeninu. Jedno výhodné reakční činidlo obsahuje upravené nebo neupravené thymidinové zbytky. Sondy hybridizují s přilehlými oblastmi cílové sekvence a tvoří větev nebo kmen sonda-sonda, který obsahuje tříramenné rozvětvení. Následně po párování sond se sousedními oblastmi cílové nukleové kyseliny kmenové oblasti páru sond jsou zřetězeny a tvoří se terminální kmen nebo větev sonda-sonda. Kovalentní řetězení je možné vyvolat světelným zářením nebo jinými způsoby. Zřetězený kmen se pak oddělí od cílové komplementární oblasti a následně se detekuje. Popsané řetězící sloučeniny jsou stabilní, světlem aktivovatelné a nejsou nukleosidy a obsahují kumarinylové deriváty. Příklady řetězících sloučenin, které reagují s reakčními činidly řetězících sloučenin tak, že upravené nebo neupravené pyrimidinové nukleosidy nebo deriváty jsou deriváty kumarinu zahrnující (1) 3-(7-kumarinyl)glycerol, (2) psoralen a jeho deriváty, jako je 8-methoxypsoralen nebo 5-methoxypsoralen, (3) cis-benzodipyron a jeho deriváty, (4) trans-benzodipyron a (5) sloučeniny obsahující fúzované kruhové systémy kumarincinnolin. Všechny z těchto molekul obsahují nezbytnou řetězící skupinu umístěnou ve správné orientaci a vzdálenosti, aby se mohla řetězit s nukleotidem. Všechny tyto molekuly jsou navíc deriváty kumarinu a proto všechny obsahují základní kumarinový kruhový systém, na kterém je molekula založena.

Jiné provedení vynálezu popisuje kmenovou oblast páru sond, která obsahuje upravený nebo neupravený purin a/nebo pyrimidin nebo jejich deriváty a první řetězící sloučeninu, zatímco kmenová oblast jiné sondy páru sond obsahuje upravené nebo neupravené purinové a/nebo pyrimidinové nukleosidy nebo jejich deriváty a druhou řetězící sloučeninu. Po párování baží sond s přilehlými oblastmi cílové nukleové kyseliny jsou kmenové oblasti párů sond řetězeny reakcí (například dimerizací) řetězících sloučenin po ozáření světlem a tvoří se kmen nebo větev sonda-sonda. Zde popsané řetězící sloučeniny jsou stabilní, aktivují se působením světla a nejsou nukleosidy a obsahují deriváty arylolefinu. Dvojitá vazba arylolefinu je skupina aktivovaná světlem, která se kovalentně řetězí s vhodným reakčním činidlem, jako je jiný derivát arylolefinu umístěný na opačném řetězci větve sonda-sonda. Dvojitá vazba arylolefinu se nachází ve správné orientaci a vzdálenosti, aby mohlo dojít k řetězení s reakčním činidlem, které není nukleosid a nachází se v opačné oblasti sonda-sonda po párování baží sond se sousedícími oblastmi cílové nukelové kyseliny.

Zvláště vhodné provedení vynálezu popisuje cílově specifickou hybridizační oblast sond nebo oblast sond komplementární s cílem, která se před detekcí separuje degradačním postupem od detekovatelné, značené oblasti sond. Jedním úkolem vynálezu je udržet kovalentní spojení prostřednictvím příčné vazby mezi dvěma konci sond, které tvoří značenou větev nebo kmen sonda-sonda, zatímco se odstraní libovolná část sond až do místa příčné vazby, zvláště pak oblast sondy, jenž je komplementární s cílem. Oblast sond komplementární s cílem bude degradovaná nebo separovaná (například odstraněna štěpením) oblast kmene sond. Metody degradace a štěpení zahrnují chemické a enzymatické způsoby, kde zvolená metoda závisí na složení sond. Oblast sond komplementární s cílem může obsahovat ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy nebo nepřirozené substituenty nahrazující nukleotidovou jednotku(y. Pak tento systém je navržen tak, aby poskytoval sondy, ve kterých oblast kmene je rezistentní vůči požadované metodě degradace nebo štěpení užívaných k separaci nebo odstranění oblasti sondy, která je komplementární s cílem. Po degradaci separovaná a detekovatelná část sond obsahuje kmen a značku, která je následně měřena a kvantifikována. Separace oblasti komplementární s cílem od detekovatelné oblasti sond redukuje nespecifické navázání sond a tím zlepšuje poměr sinál ku šumu pozadí. Výsledkem je, že se podstatně redukuje specifický nebo nespecifický signál pozadí.

V jiném výhodném provedení vynálezu kmenové oblasti sond obsahují detekovatelnou část a záchytovou část, která je vázána na konci oblastí kmene. Detekovatelná část může být libovolnou signální reportní skupinou a záchytovou částí může být libovolná záchytová skupina. Určitou záchytovou a signální reportní skupinou může být biotin respektive fluorescein. V jiném provedení vynálezu jedna nebo obě oblasti kmene sond obsahují detekovatelné části, které jsou vázány na konce oblastí kmene. Detekovatelné části mohou obsahovat značky, jako jsou fluorofóry, radioizotopy, antigeny nebo enzymy. Značky mohou být dále navrženy tak, že interakce mezi dvěma značkama generuje detekovatelný signál.

V jiném výhodném provedení vynálezu se sondy vybraly ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO:8.

Vynález dále popisuje detekci cílových sekvencí zahrnujících, ale nikoli omezených, na geny v plné délce, diagnostické markerové geny, exprimovaná sekvence tag (EST), polymorfizmus způsobeným jediným nukleotidem (SNP), genomová DNA, cDNA, cccDNA, rekombinantní geny a mRNA a rRNA.

a) Definice a obecné parametry

Dále v textu jsou uvedeny definice, které ilustrují a definují významy a rozsah specifických termínů používaných podle vynálezu.

,oligonukleotid, .nukleová

Termíny „polynukleotid, kyselina nebo sekvence nukleové kyseliny zahrnuje, ale není omezen na mRNA, cDNA, cccDNA, genomovou DNA a syntetické sekvence DNA a RNA obsahující přirozené nukleosidové báze adenin, guanin, cytozin, thymin a uráčil a také zahrnuje sekvence, které mají jeden nebo více upravených nukleosidů. Termín „nukleová kyselina nebo „sekvence nukleové kyseliny zahrnuje olígonukleotidy i polynukleotidy. Termíny nejsou omezeny ani délkou ani syntetickým původem.

Termíny „hybridizační oblast sondy specifická pro cíl nebo „oblast sondy komplementární s cílem znamená sekvenci nukleové kyseliny sondy, která je schopná tvořit vodíkové vazby s jinou sekvencí nukleové kyseliny, zvláště se specifickou cílovou sekvencí v hybridizačních podmínkách, jaké tvoří pufrovaný fyziologický roztok (pH 7,0 až 7,5) (například 1 mM až 2 M NaCl) při teplotě místnosti. Ačkoli hybridizační podmínky budou záviset na délce zúčastněných polynukleotidů, v typickém případě budou zahrnovat přítomnost alespoň jednoho kationtu, jako je Na⁺, K⁺, Mg²⁺ nebo Ca²⁺, skoro neutrální pH a teplotu nižší než 55°C. Ačkoli sekvence, které hybridizují s polynukleotidem, mohou být komplementární s polynukleotidem přibližně 90 až 100% a jestliže sekvence jsou dostatečně dlouhé, v roztoku je dostatečně vysoká koncentrace nukleotidy mohou dokonce 50 %.

případě obsahují vzorek. Termín solí a/nebo teplota je nízká, pak hybridizovat s komplementaritou 70 nebo Sekvence, které hybridizují, v typickém alespoň 10 nukleotidů a s výhodou alespoň přibližně 15 až 30 nukleotidů a nikoli však více než přibližně 1 000 nukleotidů, které jsou komplementární s cílovým polynukleotidem.

Termín „vzorek zmiňovaný v souvislosti se spojením „způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku může být vzorek tkáně nebo tělesné tekutiny nebo izolovaný ,tkáň se používá ve spojení s libovolnou biologickou hmotou, kterou tvoří jedna buňka, více buněk, shluk buněk nebo celý orgán. Termín „tkáň zahrnuje buňku nebo buňky, které mohou být normální nebo abnormální (to znamená nádorové). Termín „tělní tekutina může být libovolná kapalná látka vyluhovaná, vyměšovaná nebo vylučovaná organizmem nebo jeho tkání. Tělní tekutina nemusí nezbytně obsahovat buňky. Tělní tekutiny podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na celou krev, sérum, plazmu, moč, mozkomíšní mok, slzy a plodovou vodu. Termín „izolovaný vzorek znamená, že materiál obsahující vzorek se odstranil ze svého původního prostředí (přirozené vyskytuj e) . vyskytuj ící prostředí je například to, kde se přirozeně Například se nikdy neizolovaly přirozeně se polynukleotidy přítomné v živém zvířeti nebo v pruzích tkáně, ale stejné polynukleotidy mohou existovat izolované v roztoku mimo své přirozené prostředí nebo mohou být součástí vektoru nebo sloučeniny, přičemž vektor ani uvedená sloučenina nejsou součástí jejich původního prostředí.

Termín „detekovatelná část znamená část tvořící signál, signální reportní skupinu, značící činidlo nebo značku, která je spojena se sekvencí nukleové kyseliny nebo sondou za účelem sledovat nebo detekovat ve vzorku cílovou nukleovou kyselinu, jako je DNA nebo RNA. Detekovatelná část může být spojena s jednou nebo více sond, které fungují samostatně nebo ve vzájemné kombinaci. Detekovatelná část, jako je radioizotop, fluorofór nebo značka tvořená enzymem (například enzym konjugovaný přímo se sondou), může být detekovatelná přímo, nebo je-li tvořená například antigenem, na který je vázán konjugát enzym-protilátka, jenž mění substrát enzymu na detekovatelný produkt, se detekuje nepřímo. V jiném případě se může použít fluorescein nebo libovolná jiná detekovatelná část.

Termíny „záchytová část nebo „záchytová skupina je část, která pracuje v kombinaci s detekovatelnou částí, kde jedna sonda tvořená nukleovou kyselinou v páru sond je značena detekovatelnou částí a druhá sonda v páru sond je značena

•	•		··	··	1» *
•	v	•	•	• ·	•
•	•	•	•	• ·	•
• « ·	• · ·			9 9	• 9 9 9

záchytovou částí. Záchytovou částí může být libovolný antigen, receptor, substrát nebo biotin, který způsobuje navázání produktu na pevný podklad obsahující protilátku, receptor nebo avidin nebo streptavidin. K záchytu produktu dochází pokud je záchytová skupina vázána na produkt. V závislosti na používaných částech biotin bude vázaný na avidin nebo streptavidin, antigen bude vázaný protilátkou nebo receptorový substrát bude vázaný receptorem.

Termín „degradovatelná sonda znamená sekvenci nukleové kyseliny nebo sondy, ve které detekovatelná oblast sondy se může oddělit od oblasti sondy komplementární s cílem chemickým nebo enzymatickým způsobem, za účelem zlepšit poměr signál vůči šumu pozadí tím, že se snižuje specifický nebo nespecifický signál pozadí. Detekovatelná nebo separovatelná oblast páru sond se také nazývá větev nebo kmen sonda-sonda. Větev nebo kmen sonda-sonda obsahují části každé sondy, které nejsou komplementární s cílem, ale jsou navrženy tak, aby spolu vzájemně reagovaly. Degradovatelné sondy se mohou použít například v testu pro detekci, jako je hybridizační test. Zde popsané enzymatické způsoby zahrnují, ale nejsou omezeny na enzymatická činidla, která mají schopnost degradovat DNA a/nebo RNA. Příklady enzymatických činidel, které degradují nebo štěpí deoxyribonukleotidy jsou nukleázy, jako je DNáza I, mikrokokální nukleáza, nukleáza SI nebo nukleáza fazole mungo nebo exonukleázy, jako je exonukleáza III. Příklady enzymatických činidel, která degradují ribonukleotidy jsou ribonuklázy, jako je fosfodiesteráza I, fosfodiesteráza II nebo RNáza H chemické způsoby zahrnují, ale nejsou omezeny na chemická činidla, která degradují RNA, jako je hydroxid sodný, nebo chemická činidla, která degradují DNA, jako jsou přirozená antibiotika (například bleomycin, neokarzinostatin) nebo syntetická činidla (například komplexy methidiumpropyl-EDTA železnaté).

nebo štěpí RNáza A, Sl, Zmíněné • · «<· ··· r»»Mř· «» ··*·

Termín „řetězící sloučenina znamená chemickou sloučeninu, která je umístěna ve zde popsané nukleotidové sekvenci sondy. Řetězící sloučenina může být umístěná v oblasti větve sondasonda nebo v oblasti kmene jedné sondy páru sond nebo sady sond, kde jedna sonda může mít začleněnou řetězící sloučeninu, zatímco druhá sonda může obsahovat jeden nebo více upravených nebo neupravených purinových nebo pyrimidinových nukleosidů nebo derivátů, které fungují jako reakční činidlo pro řetězící sloučeninu. Řetězící sloučenina je navržena tak, aby tvořila kovalentní vazbu s reakčním činidlem po párování baží sond s cílovou sekvencí nukleové kyseliny. V jiném případě obě oblasti kmene začleňují řetězící sloučeninu, která je schopná při reakci tvořit kovalentní vazbu (například dimerizace) po párování baží sond s cílovou sekvencí nukleové kyseliny. Řetězící sloučeniny podle vynálezu se popisují v patentovém dokumentu WO 00/27860 a v patentovém dokumentu USA č. 6 005 093, č. 5 082 934 a č. 4 826 967.

Termíny „větev sonda-sonda” a „kmen je možné zaměnit a popisují oblast sondy tvořenou nukleovou kyselinou, která se řetězí působením světla po párování baží dvou sond s přilehlými oblastmi cílové sekvence nukleové kyseliny a pak se oddělí od oblastí každé sondy, které jsou specifické pro cílovou sekvenci. Oblasti sond, které jsou schopny tvořit kmen nebo větev sonda-sonda se zde označují jako „kmenové oblasti nebo „oblast sonda-sonda. Kmenové oblasti nejdříve reagují nekovalentně pomocí vodíkových vazeb, solných můstků a/nebo Van der Waalových sil. Řetězení kmene se pak objeví po hybridizaci páru sond s komplementární sekvencí. Řetězení je možné, protože sondy mají alespoň jednu řetězící sloučeninu uloženou v jedné z kmenových oblastí páru sond. Další kmenová oblast páru sond začleňuje reakční činidlo, které tvoří kovalentní vazbu s řetězící sloučeninou kmene po párování baží sond s přilehlými oblastmi cílové nukleové kyseliny. V jiném případě obě kmenové oblasti začleňují řetězící sloučeninu * · · ·· ·· • » · · · * » a · e · · » · · · • · * · · · * «·· ··· »»···»· <9 ···· schopnou tvořit kovalentní vazbu při reakci způsobené světlem (dimerizace) po párováni bázi sond se sekvenci s nukleovou kyselinou. Kmenová oblast libovolné sondy existuje v nehybridizované formě do té doby, kdy oblast sondy, která se váže na cil, hybridizuje s komplementární cílovou sekvencí. Proto kmenová oblast libovolné dané sondy může být odlišitelná od zbytku sondy pokud se tvoří kmen. Termíny kmen sonda-sonda, kmen, oblast(i) sonda-sonda a kmenová(é) oblast (i) by neměly být příliš omezeny. Použití těchto termínů není omezeno ani velikostí ani délkou oblasti. Odborníkovi je zřejmé, že variace těchto termínů jsou obsahem nároků. V případě, že se při detekci RNA používají sondy DNA nebo RNA, výsledná větev nebo kmen sonda-sonda se mohou separovat tak, že za nimi zůstává pouze struktura kmene. Ačkoli cílová komplementární oblast se v podstatě degraduje, několik baží cílové RNA zůstává zachyceno na kmeni, což nebude interferovat s účelem vynálezu. V jiném případě, když se používají sondy DNA nebo RNA k detekci DNA, výsledná větev sonda-sonda nebo kmen se také nemusí oddělit tak, že zůstává pouze struktura kmene. Podobně, oblast komplementární s cílem bude s velké části degradována, ale několik baží DNA cíle může zůstat zachyceno na kmeni, což nebude interferovat s účelem vynálezu. Stejné platí za podmínek, při kterých sondy nebo cíle obsahují upravené nukleové kyseliny, deriváty nukleových kyselin nebo analogy nukleových kyselin. Řetězená větev sonda-sonda se může oddělit z cílové komplementární oblasti a následně se může detekovat s ohledem na délku a velikost větve nebo kmene sonda-sonda.

Symbol „N se používá ke znázornění jedné nebo více upravených nebo neupravených nukleových kyselin, derivátů nukleových kyselin nebo analogů nukleových kyselin. Vynález dále popisuje sondy obsahující neupravené purinové a/nebo pyrimidinové nukleosidy nebo deriváty, kde symbol N se může použít k ilustraci libovolného počtu takových zbytků. Příklady • ·

• · · · · · nebo thymidin, cytozin, případě vynález popisuje neupravených zbytků jsou thymin adenin, guanin a uráčil. V jiném sondy obsahující upravený purinové a/nebo pyrimidinové nukleosidy nebo jejich deriváty. Podobně symbol N se může použít k zobrazení libovolného počtu takových upravených zbytků. Příklady upravených zbytků jsou deoxythymidin, deoxythymidinfosfát, 5-fluorouracil a podobně. Použití termínu „N není omezeno velikostí nebo délkou. Symboly ,,N(a) nebo ,,N(b) se používají ke znázornění libovolného počtu upravených nebo neupravených nukleových kyselin, derivátů nukleových kyselin nebo analogů nukleových kyselin, jako je sonda nebo cílová sekvence. Indexy „a a „b znamenají libovolný počet celých čísel a tím libovolný počet zbytků. Jestliže se symbol a rovná 0 až 20, pak termín N(a) se rovná libovolnému číslu od 0 do 20 upraveným nebo neupraveným zbytkům nukleové kyseliny, derivátům nukleové kyseliny nebo analogům nukleové kyseliny. Odborníkovi je zřejmé, že symboly N(a) a N (b) se používají k ilustraci vhodného počtu zbytků v sondě nebo v cílové sekvenci. Proto termíny N, N(a) a N(b) nejsou příliš omezeny velikostí nebo délkou.

b) hybridizační test používající degradovatelné sondy

Vynález popisuje hybridizační testy v roztocích a in sítu za použití sond tvořených nukleovou kyselinou, které jsou náchylné k chemickému nebo enzymatickému štěpení vynálezu je použití hybridizační vlastnosti, specifické pro sekvenci, použití sond tvořených nukleovou kyselinou za účelem detekce přítomnosti cílové sekvence, za vzniku produktu, který je specifický pro cíl, degradovat nebo separovat oblast sondy(sond) komplementární s cílem a detekovat přítomnost cílového specifického produktu. Význam degradace je zlepšit poměr signálu ku šumu pozadí snížením tvorby specifického nebo nespecifického signálu pozadí.

Účel podle které jsou • · · · · · • · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ·♦ · · · ·

Vynález popisuje způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, čímž alespoň jeden pár sond nukleové kyseliny hybridizuje s cílovou nukleovou kyselinou. Způsob se uskutečnil kombinováním cílové nukleové kyseliny se sondami nebo páry sond v médiu, které je vhodné pro párování baží. Nukleovou kyselinou může být DNA nebo RNA, jedno nebo dvou řetězcová molekula nebo jiná molekula, která obsahuje pyrimidiny a/nebo puriny schopné párování.

Jedno provedení vynálezu zvláště popisuje degradovatelné sondy. Sondy jsou charakterizované oblastmi nukleových kyselin, které tvoří po párování baží alespoň dvou sond s přilehlými oblastmi cílové sekvence nukleové kyseliny větev nebo kmen sonda-sonda. Sondy tvořené nukleovou kyselinou přednostně obsahují sekvenci nukleové kyseliny, která zahrnuje upravenou nebo neupravenou oblast nukleové kyseliny, která se navrhla tak, že tvoří po párování baží alespoň dvou sond s přilehlými oblastmi cílové sekvence nukleové kyseliny větev nebo kmen sonda-sonda. Pár sond je komplementární s cílovou sekvencí mimo oblast sond, které tvoří kmen. Každá ze sond obsahuje kmenovou oblast, která se neváže na cílovou sekvenci. Kmenové oblasti existují v nehybridizovatelné formě až do okamžiku, kdy oblasti sondy, které nehybridizuj1 s cílovou nukleovou kyselinou, hybridizují s komplementární cílovou sekvencí. Následně kmenová oblast libovolné dané sondy se může odlišit od zbytku sondy dokud se nevytvoří kmen. Kmenové oblasti nejdříve reagují nekovalentně pomocí vodíkové vazby, solných můstků a/nebo Van der Waalsových sil. Pak po párování baží sond s přilehlými oblastmi cílové nukleové kyseliny se kmenové oblasti páru sond řetězí a vzniká kmen. Řetězení je možné, protože sondy mají alespoň jednu řetězící sloučeninu umístěnou v jedné kmenové oblasti páru sond. Druhá kmenová oblast páru sond začleňuje reakční činidlo, které tvoří kovalentní vazbu s řetězící sloučeninou kmene. V jiném případě obě kmenové sloučeniny začleňují řetězící sloučeninu, která je • β ·· ·· ··· · . ., ¹⁸ ·:· ’ * U.;..’ schopná tvořit kovalentní vazbu působením světla (například dochází k dimerizaci). Po dostatečné inkubaci sondy hybridizují s cílovou nukleovou kyselinou obsaženou ve vzorku a řetězící systém se aktivuje, což vede ke vzniku kovalentní vazby mezi oběma sondama. Proto se objevuje kovalentní vazba po párování baží sond se sekvencí cílové nukleové kyseliny a tak dochází k vzájemnému permanentnímu řetězení kmenových oblastí. Kmen se pak separuje od cílové komplementární oblasti a následně se detekuje.

Každou sondu tvoří alespoň 10 nukleotidů, přednostně přibližně 15 až 30 nukleotidů a nikoli více než přibližně 1000 nukleotidů, kde sekvence není méně než z 80 % homologní s cílovou sekvencí, výhodnější je, když sekvence je 90 až 100% homologní s cílovou sekvencí. Oblasti párování baží přítomné v cílové nukleové kyselině se v normálním případě budou separovat více než přibližně 10 nukleotidy, obvykleji ne více než přibližně 5 nukleotidy a s výhodou ne více než přibližně 1 nukleotidem. V preferovaném provedení vynálezu sondy obsahují přibližně 20 až 30 nukleotidů a jsou přibližně z 95 % homologní s cílem, kde oblasti párování baží přítomné v cílové nukleové kyselině jsou odděleny jedním nukleotidem. Rozumí se, že bez ohledu na použitou sondu k detekci dané cílové sekvence, délka každé sondy v páru sond může kolísat. Každá ze sond má oblast, která může tvořit kmen nebo větev sonda-sonda s jinou sondou páru sond. Po navázání sond na komplementární cílovou sekvenci řetězící sloučenina umístěná v kmenu jedné z kmenových oblastí páru sond je aktivována kovalentní vazbou s reakčním činidlem umístěným v kmenové oblasti jiné sondy v páru sond a tak se permanentně vzájemně řetězí s kmenovými oblastmi každého člena páru sond. Navíc alespoň jedna ze sond v páru sond obsahuje detekovatelnou část nebo část generující signál, která je vázána na 5' nebo 3' konec jeho kmenové oblasti. Signál je detekován nebo generován po řetězení kmene, který se naopak objeví po párování baží sond se cílovou sekvencí nukleové kyseliny.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je oblast sond, která je komplementární s požadovanou cílovou sekvencí nukleové kyseliny ve vzorku, odstranitelná z detekovatelné oblasti sond. Sondy tvořené nukleovou kyselinou se navrhly takovým způsobem, že hybridizační oblast specifická pro cíl nebo oblast sondy komplementární s cílem se separuje od detekovatelné části nebo od části generující signál pomocí degradačního postupu. Po navázání sond na přilehlé oblasti cílové sekvence nukleové kyseliny a výsledném řetězení kmene, cílová komplementární sond se může odstranit pomocí chemické nebo enzymatické degradace. Protože zbývající část sond obsahuje kmen a signál, který se může jednoduše detekovat v testu, když se dokončí vhodný krok promývání. Účel uvedené separace je zlepšit poměr signál ku šumu pozadí zeslabením tvorby tvorby specifického nebo nespecifického pozadí. Standardní hybridizační testy jsou známy v oboru a běžný problém je nespecifické navázání materiálů nukleové kyseliny a produkce nespecifického signálu v testu. Oddělením částí tvořících signál z hybridizační oblasti nukleové kyseliny se může minimalizovat nespecifický signál. Zbývající signál odvozený od kmene řetězené sondy a zachycená část nebo části, které jsou přímo úměrné cílové sekvenci v libovolném daném vzorku.

Jedním předmětem vynálezu je udržet kovalentní spojení pomocí řetězení mezi dvěma konci sond, které tvoří značenou větev nebo kmen sonda-sonda, zatímco odstranění libovolné části sond až do místa řetězení, zvláště oblast sond komplementární s cílem. Oblast sond komplementární s cílem se degraduje nebo odděluje (například odštěpením) od kmenové oblasti sond. Způsoby degradace nebo štěpení zahrnuje chemické nebo enzymatické způsoby, způsob volby závisí na složení sond. Oblast sond komplementární s cílem může obsahovat • · · · · ·· · · · · ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy nebo nepřirozené substituenty nahrazující nukleotidovou jednotku v sondách. Následně degradační metody závisí na typu sondy, která se používá v testu.

V jednom provedení vynálezu deoxyribonukleotidy obsahují oblast sondy komplementární s cílem, kde se může použít pro selektivní degradaci nebo štěpení sondy řada nukleáz a to jednotlivě nebo v kombinaci. Enzymy s endonukleázovou aktivitou, které hydrolyzují dvouřetězcovou DNA, jako je DNáza I nebo mikrokokální nukleáza, se mohou použít k degradací oblasti sondy komplementární s cílem přímo po kroku řetězení. Enzymy s endonukleázovou aktivitou, které hydrolyzují jednořetězcovou DNA, jako je nukleázy SI nebo nukleáza fazolí mungo se mohou použít při metodách denaturace libovolných duplexů sonda-cílová sekvence. V jiném případě dvě orientací specifické exonukleázy se mohou použít v kombinaci za účelem degradovat sondy páru sond. Exonukleáza III například vykazuje vyšší exonukleázovou aktivitu u dvouřetězcové DNA na 3-konci než na 5'-konci, zatímco exonukleáza bakteriofága lambda vykazuje vyšší exonukleázovou aktivitu na 5'-konci než na 3'konci. Dvě nukleázy se mohou zavést do vzorku přímo po kroku řetězení, aby se ovlivnila požadovaná degradační reakce sond. Jsou známy další exonukleázy, které vyžadují jako substrát jednořetězcovou DNA, a je nutné před zavedením enzymu do

Při degradaci deoxyribonukleotidů činidla štěpící DNA. Příklady takových činidel zahrnují přirozená antibiotika bleomycin a neokarzinostatin, stejně jako syntetická činidla, jako jsou komplexy methidiumpropyl-EDTA železnaté).

V jiném provedení vynálezu ribonukleotidy obsahují oblast sondy komplementární s cílem, kde je možné použít k degradaci nebo štěpení sondy silně bazický roztok. V typickém případě se roztok hydroxidu sodného v koncentraci 0,1 až 5M nechá působit na sondu a výsledný roztok se může inkubovat při teplotě vzorku tuto DNA denaturovat se mohou použít chemická

	21	.i • · • · · • · • · · · · ·	• • · • • • • · ·	·· ·· ·· ♦ · » · · • · · · • · · · · • · · · ···· ·· ··«·
místnosti nebo při vyšší	teplotě,	například	30	až 90 °C.
Bazický roztok způsobí v	polohách	baží RNA v	řetězci sondy
zlomy, kde časový úsek	potřebný	pro reakci	závisí na

koncentraci hydroxidového iontu a teplotě inkubace. K degradaci a štěpení ribonukleotidových míst se může také použít řada enzymatických způsobů. Enzymy známé tím, že štěpí jednořetězcovou RNA, zahrnují například ribonukleázu A, Sl, fosfodiesterázu I, fosfodiesterázu II. V případě, že enzym selektivně působí na jednořetězcovou RNA, může se roztok upravit pro denaturaci (například zahřátím na teplotu vyšší než je denaturační teplota duplexu), čímž se před počátkem enzymatického procesu oddělí duplex řetězené sondy a cílové sekvence od cílového řetězce. Enzymy s endonukleázovou aktivitou, jako je RNáza A a Sl, se mohou použít jednotlivě, aby ovlivnily účinek požadované degradační reakce u jednotlivých sond sady sond. Enzymy, které vykazují exonukleázovou aktivitu závislou na orientaci se s výhodou používají v párech, aby se zaručila požadovaný účinek degradační reakce u každé sondy. Fosfodiesteráza I například vykazuje vyšší exonukleázovou aktivitu na 5-konci než na 3'konci a fosfodiestaráza II vykazuje aktivitu na 3'-konci vyšší než na 5'-konci. Jestliže chceme daegradovat obě sondy sady, použijí se s výhodou dva enzymy, protože jedna oblast sondy komplementární s cílovou sekvencí končí 5'-koncem, zatímco oblast druhé sondy komplementární s cílem končí 3'-koncem. V jiném případě RNáza H se může použít selektivně k degradaci RNA části sondy. RNáza H vykazuje hydrolyzační aktivitu RNA v případě duplexu RNA/DNA. V tomto případě sondy s oblastí komplementární s cílovou sekvencí obsahující ribonukleotidy se aplikují při detekci cílů DNA. Když se sondy uvedou do kontaktu se vzorkem a nechají se hybridizovat a řetězit, může se použít RNáza H, aby selektivně hydrolyzovala ribonukleotidové jednotky sond, které jsou hybridizovány s cílovou DNA.

• ·

Kmen je navržen tak, že struktura za místem řetězení není přijatelná nebo rozeznatelná pro enzymatické nebo chemické činidlo a proto nedochází k štěpení nebo degradaci. To se může dosáhnout úpravou cukerné fosfátové kostry sondy sekvence nukleové kyseliny. Oblast kmene sondy může obsahovat ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy, deriváty ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů nebo komponenty, které nejsou nukleové kyseliny. Typ nukleové kyseliny nebo části, které nejsou nukleovou kyselinou, používané v kmenu se vybraly z libovolné shora popsané skupiny, která nejsou náchylné ke štěpení činidlem, jenž se používá k degradaci oblasti sondy komplementární s cílem. Když se například při degradaci používají nukleázy DNA, kmenová oblast sondy může obsahovat ribonukleotidy. Naopak, když se používají při degradaci nukleázy RNA, kmenová část může obsahovat deoxyribonukleotidy. Je známo, že některé nukleáza hydrolyzují substráty DNA i RNA, je to například SI a fosfodiesteráza I a II, v tomto případě jsou nutné deriváty přirozených nukleotidů nebo komponenty, které nejsou nukleovou kyselinou a jsou rezistentní vůči nukleáze. Je známa řada chemických úprav přirozené nukleotidové struktury, aby se část stala rezistentní vůči nukleáze. Například ve fosforečnanové části je možné atom kyslíku nahradit atomem síry nebo zastavit enzymatickou hydrolýzu. Enzymatickou rezistenci také zaručuje nahrazení fosfátové skupiny methylfosfonátovou skupinou. Enzymy také nerozeznávají nepřirozené vazby a poskytují tak použitelné způsoby pro konstrukci kmenové části sondy. Je například známo, že peptidové vazby slouží jako části kostry ve struktuře nukleových kyselin, které chrání schopnost tvořit v komplementárních duplexech páry baží, ale přitom tato nepřirozená kostra není rozeznávána žádným enzymem.

Vynález také popisuje přirozeně se vyskytující části nukleové kyseliny, které se mohou použít v oblasti kmene sond mezi řetězujícím činidlem a libovolnou značkou na konci sondy sloučeninu požadované nebo mezi místem řetězení a libovolnou značkou na konci sondy bez ohledu na typ použité metody degradace. V případě, že počet přirozených baží mezi řetězícím činidlem nebo místem řetězení a značeným koncem sondy je méně než 10, výhodněji méně než 3, aktivita nukleáza je podstatně opožděna, protože řetězící činidlo a značící část mění místo, které rozeznává enzym.

Aby došlo k vytvoření kmene, každá kmenová oblast sondy, která obsahuje polovinu kmene, může zahrnovat alespoň 2 nebo 3 párované nukleotidy a obvykle ne více než přibližně 20 párů baží. V preferovaném provedení vynálezu páry nukleotidů budou A a T a nukleotidy v jedné kmenové oblasti mohou být stejné nebo se mohou lišit. To znamená, že v jedné kmenové oblasti jsou samé Tav druhé kmenové oblasti jsou tedy samé A nebo v obou kmenových oblastech páru sond je směs A a Τ. V jiném případě se G a C mohou použít samostatně nebo v kombinaci s A a T. Nejvýhodnější je, když kmen obsahuje 3 nukleotidové jednotky, kde jedna kmenová oblast obsahuje T a druhá kmenová oblast obsahuje dva A a jednu řetězící sloučeninu, nebo když jedna kmenová oblast obsahuje dvě T a jednu řetězící sloučeninu a druhý kmen obsahuje dvě A a jednu řetězící Rozumí se, že volba nukleotidu bude záviset na afinitě, jednoduchosti syntézy, interakce s kovalentní řetězící sloučeninou, typu degradační metody a podobně.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje, že kmenové oblasti sond obsahují detekovatelnou část a záchytovou část, která se váže na konec kmenových oblastí. Detekovatelnou částí může být libovolná signální reportní skupina a záchytovou částí může být libovolná záchytová skupina. Záchytovou skupinou a signální reportní skupinou může být biotin respektive fluorescein. V jiném provedení vynálezu obě kmenové oblasti sondy obsahují detekovatelní části, které jsou vázány na konec kmenových oblastí. Detekovatelné části mohou • · » · obsahovat značky, jako jsou fluorofóry, radioizotopy, antigeny nebo enzymy. V jiném provedení vynálezu obě kmenové oblasti sond obsahují části, které v kombinaci reagují za vzniku detekovatelného signálu, jako jsou páry přenášející energii fluorescenční rezonance nebo páry aktivátor/receptor.

V jiném provedení vynálezu kmenová oblast sondy páru sond obsahuje upravené a neupravené purinové nukleosidy nebo deriváty, jako jsou upravené nebo neupravené adenosinové zbytky a alespoň jedna řetězící sloučenina, zatímco kmenová oblast druhé sondy páru sod obsahuje upravené nebo neupravené pyrimidinové nukleosidy nebo deriváty, které fungují jako reakční činidla pro řetězící sloučeninu. Jedno výhodné reakční činidlo obsahuje upravené nebo neupravené thymidinové zbytky. Sondy hybridizují s přilehlými oblastmi cílové sekvence a tvoří větev nebo kmen sonda-sonda, které zahrnují tříramenné větvení. Následně po párování baží sond s přilehlými oblastmi cílové nukleové kyseliny jsou kmenové oblasti páru sond řetězeny a tvoří se kmen nebo větev sonda-sonda. Kovalentní řetězení je možné vyvolat světelným zářením nebo jinými způsoby. Navíc kovalentní řetězení může způsobit aktivaci značky a sondy se stávají detekovatelně. Kmen se pak separuje od oblasti komplementární s cílovou sekvencí a následně se detekuje. Zde popsané řetězící sloučeniny jsou stabilní, fotoaktivní sloučeniny, které obsahují kumarinylové deriváty, a nejsou nukleosidy. Kumarinylové deriváty se připravily spojením fenylového kruhu molekuly kumarinu nebo jeho derivátu s molekulou hydroxyuhlovodíku nebo polyhydroxyuhlovodíku. Vhodné jsou terminální hydroxyskupiny molekuly glycerolu. (Póly)hydroxyuhlovodíková část výsledné sloučeniny je ekvivalentní s cukrem nukleosidu, zatímco kumarinová část obsadila polohu báze. Sloučeniny je možné začlenit do polynukleotidových oblastí. Dvojitá vazba mezi polohami 3 a 4 kruhového systému kumarinu je fotoaktivní skupinou, která tvoří kovalentní vazbu s nukleosidy v opačném řetězci obsahujícím oblast sonda-sonda po párování baží sond páru sond s přilehlými oblastmi řetězících sloučenin, řetězících sloučenin, cílové nukleové kyseliny. Příklady které reagují s reakčními činidly jako jsou upravené nebo neupravené pyrimidinové nukleosidy nebo jeho deriváty, jsou deriváty kumarinu zahrnující 1) 3-(7-kumarinyl)glycerol, 2) psoralen a jeho deriváty, jako je 8-methoxypsoralen nebo 5-methoxypsoralen, 3) cis-benzodipyron a jeho deriváty, 4) trans-benzodipyron a 5) sloučeniny obsahující fúzované kruhové systémy kumarin-cinolin. Všechny tyto molekuly obsahují nezbytné řetězící skupiny (aktivované dvojné vazby) umístěné v opačné orientaci a v pravé vzdálenosti pro řetězení s nukleotidem. Navíc všechny tyto molekuly jsou deriváty kumarinu a tak všechny obsahují základní kumarinový (benzopyron) kruhový systém, na kterém je založena molekula zbytku. Tyto řetězící sloučeniny se detailněji popisují v patentovém dokumentu USA

č. 6 005 093.

V jiném provedení vynálezu kmenová oblast sondy páru sond obsahuje upravené nebo neupravené purinové a/nebo pyrimidinové nukleosidy nebo jejich deriváty a první řetězící sloučeninu, zatímco kmenová oblast druhé sondy páru sond obsahuje upravené nebo neupravené purinové a/nebo pyrimidinové nukleosidy nebo jejich deriváty a druhou řetězící sloučeninu. Po párování baží sond s přilehlými oblastmi cílové nukleové kyseliny kmenové oblasti páru sond jsou řetězeny pomocí reakce (například dimerizace) řetězících sloučenin po ozáření světlem a tvoří se kovalentně spojený kmen nebo větev sonda-sonda. Řetězící sloučeniny jsou stabilní, fotoaktivní sloučeniny, které obsahují deriváty arylolefinů a nejsou nukleosidy. Deriváty arylolefinů se připravují vazebným spojením arylové části s molekulou saturovaného nebo nesaturovaného uhlovodíku, který se stal funkční. Funkční uhlovodíková část výsledné sloučeniny je ekvivalentní s cukrem nukleozidu, zatímco arylolefinová část obsadí místo báze. V souladu s tím se sloučeniny mohou

začlenit do polynukleotidů. Dvojná vazba arylolefinu je skupinou, kterou je možné aktivovat světlem a která se kovalentně řetězí s vhodným reakčním činidlem, jako je arylolefinový derivát umístěný v opačném řetězci větve sondasonda. Dvojná vazba arylolefinu se nachází ve správné orientaci a ve správné vzdálenosti pro řetězení s reakčním činidlem, kterým není nukleosid, v obrácené oblasti sondasonda po párování baží sond s přilehlými oblastmi cílové nukleové kyseliny a následným ozářením světlem. Tyto řetězící se sloučeniny se detailněji popisují v publikaci WO 00/27 860.

V ještě jiném výhodném provedení vynálezu se sondy vybraly ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 8.

Vynález dále popisuje detekci cílových sekvencí zahrnující geny plné délky, diagnostické markerové geny, exprimované sekvenční značky (EST), polymorfizmy jediného nukleotidu (SNP) , genomovou DNA, cDNA, cccDNA, rekombinantní geny a mRNA a rRNA. Cílové sekvence mohou být dvouřetězcové nebo jednořetězcové. Dále se mohou vyskytovat ve své přirozené formě nebo v umělé formě. Cílové sekvence mohou být izolované nebo neizolované a existují v roztoku nebo v tekutině nebo v tkáni.

Vynález popisuje sondy tvořené nukleovou kyselinou, které jsou náchylné k chemické a enzymatické degradaci a způsoby použití takových sond při detekci cílových sekvencí nukleové kyseliny. Smysl tohoto systému je získat sondy, ve kterých kmenová oblast sondy je rezistentní vůči požadovanému způsobu degradace nebo štěpení používaném k separaci oblasti sondy komplementární s cílem od značených oblastí sondy. Po degradaci separovaná a detekovatelná oblast sond obsahuje kmen a značku, která je následně měřena a kvantifikována. Separace oblasti komplementární s cílovou sekvencí od detekovatelné oblasti sond snižuje nespecifické navázání sond a tím zlepšuje poměr signál ku šumu pozadí. Výsledkem je, že tvorba specifického nebo nespecifického signálu pozadí se podstatně redukuj e.

c) Protokol

Následující protokol popisuje provedení vynálezu, kde dvě sondy DNA tvoří řetězec za vzniku větve nebo kmene sonda-sonda a jako degradační činidlo se používá endonukleáza.

Sondy*:

1. Kombinované sondy v roztoku vzorku (obsahuje cílovou sekvenci):

B F (sonda 1) ^A

AGCGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC ^T (sonda 2)

CTCCAATCACTCACCAACCTCTTGT

GATGCTATTCGCGGTTTTAAGCGTCAGGGGTTG - GAGGTTAGTGAGTGGTTGGAGAACA cílová sekvence

2. Řetězení dvou sond:

B F \ /

A T

X=T (sonda 1) AT (sonda 2)

AGCGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC CTCCAATCACTCACCAACCTCTTGT

GATGCTATTCGCGGTTTTAAGCGTCAGGGGTTG - GAGGTTAGTGAGTGGTTGGAGAACA cílová sekvence

3. Použití endonukleázových restrikčních enzymů k degradaci sond (a jiných materiálů tvořených nukleovou kyselinou)

B F \ /

A T

X=T *Pomlčka v cílových sekvencích slouží pouze k ochraně uspořádání baží ve dvou řetězcích, dvě báze, které lemují pomlčku jsou spojeny normální fosfodiesterovou vazbou, symbol B znamená biotin symbol F znamená fluorescein symbol X znamená řetězící sloučeninu symbol „= mezi X a T znamená kovalentní příčnou vazbu.

Kmen je navržen tak, že struktura za místem příčné vazby není citlivá k působení enzymu nebo není enzymem rozeznatelná, proto ji enzym neštěpí. Toho je možné dosáhnout bez úpravy nebo s úpravou cukerné fosfátové kostry (například fosforothioát, methylfosfonát, peptidová vazba a podobně).

Části sond, které zůstávají obsahují dvě vázané značky, kterými v tomto provedení vynálezu jsou biotinová a fluoresceinová skupina nebo záchytová skupina a signální reportní skupina. V jiném případě dvě značky mohou být fluorofóry, které mohou eragovat za vzniku signálu prostřednictvím přenosu fluorescenční rezonanční energie. Test se může provést se záchytovou skupinou, která je zachycuje značený kmen na pevný podkládá, pak následují kroky promývání, aby se odstranil nevázaný materiál a sondy (sondy se štěpí) a pak se provádějí kroky detekce přítomnosti signální reportní skupiny (popisuje se v odstavci detekční metody dále v textu). Kmen je zachycen pokud záchytová skupina, jako je biotin, je spojena s kmenem. V tomto provedení vynálezu se biotin váže na částice potažené avidinem nebo streptavidinem.

Shora v textu se také popisuje několik variaci tohoto určitého provedeni vynálezu.

RNA sondy:

Použiti RNázy A jako enzymatického činidla při degradaci sond.

Použiti hydroxidu sodného jako chemického činidla při degradaci sond.

DNA sondy:

Použiti DNázy I jako enzymatického činidla při degradaci sond.

Použiti endonukleázy jako enzymatického činidla při degradaci sond (to je mikrokokálni nukleázy).

V následujících provedeních vynálezu se používají sondy uvedené v tabulce č. 1. V sadě sond DNA se testuje jejich schopnost hybridizovat se sekvencemi nukleových kyselin a detekují se prostřednictvím značících částí. Porovnávají se degradovaní a nedegradované sondy.

Tabulka č. 1: Sekvence sond

sonda	1	5’-TCTGCCGATCCATACTGCGGAACAXAB	SEQ	ID	NO:	1
sonda	2	5hFP*TTTTCCTAGCMGCTTGTTTTGCTCGC	SEQ	ID	NO:	2
sonda	3	5 ’-TATATGGATGATGTGGTATTGGAXAB	SEQ	ID	NO:	3
sonda	4	5’-FP*TTTGGGCCAAGTCTGTACARCATC	SEQ	ID	NO:	4
sonda	5	5’-CATTTGTTCAGTGGTTCGYAGGGCAXAB	SEQ	ID	NO:	5
sonda	6	5’-FP*TTTTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG	SEQ	ID	NO:	6
sonda	7	5 ’-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACAXAB	SEQ	ID	NO:	7
sonda	8	5’-FP*TTTTTCTCTCAATTTTCTAGGG	SEQ	ID	NO:	8

symbol * označuje diester fosforothioátu (místo normálního fosfodiesteru) symbol X označuje 3-(7-kumarinyl)glycerol symbol P označuje tetraethylenglykol symbol B označuje biotin TEG (firma Glen Research) symbol F označuje fosforamidit fluoresceinu (firma Cruachem) symbol M je A a C symbol X je C a T.

Protokol pro úpravu vzorků.

Vzorky se připravily kombinací lyzačního roztoku (119,2 μΐ), roztoku sond (36,4 μΐ) a neutralizačního roztoku (44,4 μΐ) do prohlubní mikrotitračních destiček s 96 prohlubněmi.

Lyzační roztok je 0,1875 M hydroxid sodný. Připravily se dva typy lyzačního roztoku. Jeden obsahoval pouze hydroxid sodný, druhý také obsahoval 24 fmol plazmidového vektoru, který zahrnuje genom viru hepatitidy B. Tyto roztoky se vařily po dobu 30 minut. Výsledné lyzáty se před nanesením do prohlubní destiček filtrovaly přes filtr Acrodisk s velikostí pórů 4 5 μπι.

V roztoku sond koncentrace řetězící sondy (tabulka č. 1:

sonda 1, 3, 5 nebo 7) byla 54,9 nM a koncentrace reakční sondy (tabulka č. 1: sonda 2, 4, 6 nebo 8) byla 137,4 nM. Roztok sond také obsahoval 0,012% bovinního sérového albuminu, 1,815 M chlorid sodný a 0,001 % fenolovou červeň, která slouží jako indikátor hodnoty pH.

Neutralizační roztok obsahoval 0,15 M kyselinu citrónovou, 0,31 M dihydrogenfosforečnan sodný, 1,5 M chlorid sodný, 0,42 % Tween 20 a 35 % formamid.

Po zkombinování všech činidel se destičky inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě 40 °C a pak se ozářily světlem pěti osmi wattových žárovek (F8T5/350BL, Sylvania) při vlnové délce 300 až 370 nm přes filtr 1,5 mm Pyrex po dobu 30 minut, zatímco se teplota inkubace udržovala na hodnotě 40 °C.

Do každé prohlubně se přidaly paramagnetické částice potažené streptavidinem (75 g, Dynal M280) a vše se inkubovalo při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

V každém z následujících kroků se mikrotitrační destička umístila na magnetickou desku, aby se shromáždily paramagnetické částice do peletu, kapalina se odsála a do prohlubní se přidal nový roztok, aby se resuspendovaly paramagnetické částice.

Vzorky se nejdříve promyly 100 μΐ promývacího roztoku (50 mM hydroxid sodný, 0,1 % dodecylsulfát sodný). Dále se vzorky promyly jedenkrát 200 μί promývacího roztoku II (lx

koncentrovaný SSC a	0,1	% Tween 20).
Vzorky se	pak	inkubovaly	s různými	kombinacemi
restrikčních enzymů	a	ošetřily se	protilátkovým	konj ugátem.
Použité kombinace	jsou	uvedeny v	tabulce č. 2	Ve všech

případech se použil stejný pufrovací roztok a restrikční enzym, monokokální nukleáza a protilátkový konjugát, antifluorescein/alkalická fosfatáza, které se kombinují nebo se používají jednotlivě.

Pufrovací roztok byl 0,1 M Tris (hodnota pH je 7,5), 0,1125 M chlorid sodný, 0,5 x koncentrovaný SSC, 1,0 mM chlorid hořečnatý, 1,0 mM chlorid vápenatý, 0,1 % Tween 20 a 0,25 % bovinní sérový albumin. Množství užívané mikrokokální nukleázy je jedna jednotka. Anti-fluorescein/alkalická fosfatáza se použila v ředění 1/20 000.

Při první inkubaci se do prohlubní přidalo 50 μΐ vhodného pufru a prohlubně se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Vzorky se pak dvakrát promyly 220 μί promývacího roztoku

II. Při druhé inkubaci se přidalo opět 50 μί vhodného pufru a destičky se inkubovaly pod obu 30 minut při teplotě 37 °C.

Vzorky se pak čtyřikrát promyly 220 μί promývacího roztoku II. Nakonec se promývací roztok nahradil 100 μί roztoku Attophos™. Substrát se inkuboval po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a v prohlubních se odečítal fluorescenční signál na čtecím zařízení fluorimetru vhodném pro titrační destičky (firma Packard Instruments).

I. Značení jedné sondy detekovatelnou částí a použití následujících detekčních metod:

1. Homogenní detekce fluorescenční polarizační spektroskopií.

2. Hmotnostní spektroskopie (MALDI, TOF, Elektrospray, atd.).

3. Oddělení produktu podle hmotnosti a náboje (například chromatografií nebo elektroforézou), pak následuje detekce fluorescence, hmotnostní spektroskopie, katalyzovaná aktivace reportní skupiny, atd.

II. Značení každé sondy členem interakčního páru a použití následujících detekčních metod:

1. Přenos fluorscenční rezonanční energie.

2. Způsob LOCI.

III. Značení jedné sondy detekovatelnou částí a druhé sondy záchytovou částí a použití následujících detekčních metod:

1. Záchytovou částí může být například biotin, antigen nebo receptorový substrát, kdy každá odděleně vyvolá navázání produktu na pevný podklad, který obsahuje například avidin nebo streptavidin, protilátku nebo receptor. Detekovatelná část může být detekovatelná přímo, například fluorofór, radioizotop nebo přímá enzymatická značka (například enzym konjugovaný přímo se sodnou), nebo nepřímo, například antigen, na který se váže konjugát enzym-protilátka, který přeměňuje substrát enzymu na detekovatelný produkt.

Páry sond:

Pár sond tvoří dvě sondy. V tabulce č. 1 uvedené shora v textu následující páry tvoří čtyři páry sond: (1,2), (3,4), (5,6) a (7,8) .

Páry sond se navrhly tak, že dvě sondy hybridizují s přilehlými oblastmi a tvoří tak větev nebo kmen sonda-sonda, který obsahuje tříramenné rozvětvení. Ve větvi nebo kmeni ** ·· · * * ·· • · · · • « • · • · »· · * -»«· tříramenného rozvětvení jedna sonda měla řetězící sloučeninu a biotinovou značku, přičemž druhá sonda obsahovala thymidinové báze (reakční činidlo pro řetězící sloučeninu), fosforothioátovou vazbu mezi posledním thymidinem a mezerník tetraethylenglykolu a fluoresceinovou část.

Každý pár sond se testoval třemi způsoby, každý v přítomnosti nebo v nepřítomnosti cílové DNA:

(1) Štěpení jiné než enzymem.

(2) Enzymatické štěpení a po štěpení se naváže protilátka.

(3) Enzymatické štěpení a během štěpení se naváže protilátka.

Tabulka č. 2 a 3 ilustruje podmínky, za kterých se testovaly sondy.

Tabulka č. 2: Podmínky (A až F) používané při testování páru sond

podmínky	A	B	C	D	E	F
cílová	ne	ano	ne	ano	ne	ano
DNA
inkubace 1	pufr	pufr	enzym	enzym	pufr	pufr
inkubace	proti-	proti-	proti-	proti-	enzym/pro-	enzym/pro-
2	látka	látka	látka	látka	tilátka	tilátka

Tabulka č. 3: Výsledky

signál:jednotky relativní fluorescence
sada sond	podmínky
	A	B	C	D	E	F
(1,2)	108	910	33	2 199	31	2 026
(3,4)	69	523	29	1 929	30	1 535
(5,6)	124	896	38	2 114	34	1 708
(7,8)	42	1 066	25	1 546	24	1 591

*·· ···«

V případě všech čtyř párů sond se pozorovaly podobné výsledky. Nespecifický signál u negativních vzorků se snížil (podmínky C a E se porovnaly s kontrolou A) a signál specifický pro cílovou sekvenci byl silnější u vzorků, které se ošetřily, aby došlo k degradaci sond (podmínky D a F se porovnaly s kontrolou B).

Porovnáním signálů pozorovaných v nepřítomnosti cílové DNA (podmínky A, C, E) se zjistilo, že vzorky ošetřené restrikční endonukleázou (C, E) vykazují signály, které byly oba nižší a více jednotné (vzorek C: průměrná hodnota: 31,25, %CV: 17,8, vzorek E: průměrná hodnota 29,75, %VC: 14,1). Naopak signály u neošetřených vzorků byly vyšší a podstatně kolísají (průměrná hodnota: 85,75, %CV: 42,4). Enzymatické štěpení vzorků vykazuje u negativních vzorků nižší nespecifické signály (signál pozadí).

Porovnáním signálů pozorovaných v přítomnosti cílové DNA (podmínky B, D, F) se zjistilo, že vzorky ošetřené restrikční endonukleázou vykazují signály, které jsou o 50 až 300 % vyšší než signál získaný u neošetřených vzorků. Silnější signál je způsoben podstatnou redukcí velikosti a náboje detekovatelného produktu, což je výsledek enzymatického degradačního postupu, čímž poskytuje výhodnějšího vazebného partnera pro protilátkový konjugát nebo vhodnější prostředí pro následnou enzymatickou reakci, aby mohl vzniknout detekovatelný fluorescenční produkt.

• · · · * · » ·· ····

Seznam sekvencí <110> Van Alta, Reuel Albagli, David Wood, Michael Cheng, Peter <120> Způsob detekce a pár sond tvořených nukleovou kyselinou <130> 14 251 - 0025 <140> 09/551 305 <141> 18. dubna 2000 <160> 11 <170> Patentln verze 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> cDNA <220>

<221> misc_feature <222> (25)...(25) <223> Biotin TEG je zachycen na 3'konci sekvence.

<220>

<221> misc_feature <222> (24)...(25) <223> 3-(7-kumarinyl)glycerol se začlenil mezi polohu 24 a 25 <400> 1 tctgccgatc catactgcgg aacaa 25

<210>	2
<211>	26
<212>	DNA
<213>	cDNA

<220>

• · • · · · <221> misc_feature <222> (11)...(11) <223> Symbol m značí, že v poloze 11 může být buď a nebo c. <220>

<221> misc_feature <222> (1)...(1) <223> Na 5'-konci je prostřednictvím diesteru fosforothioátu zachycen fosforamidit fluoresceinu a tetraethylenglykol.

<400> 2 ttttcctagc mgcttgtttt gctcgc ₂θ <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> cDNA <220>

<221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> Biotin TEG je zachycen na 3'konci sekvence.

<220>

<221> misc_feature <222> (23)...(24) <223> 3-(7-kumarinyl)glycerol se začlenil mezi polohu 23 a 24. <400> 3 tatatggatg atgtggtatt ggaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> cDNA <220>

<221> misc_feature <222> (20)...(20) <223> Symbol r značí, že v poloze 20 může být buď g nebo a.

<220>

<221> misc_feature <222> (1)...(1) <223> Na 5'-konci je prostřednictvím diesteru fosforothioátu zachycen fosforamidit fluoresceinu a tetraethylenglykol.

<400> 4 tttgggccaa gtctgtacar catc ₂₄ <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> cDNA <220>

<221> misc_feature <222> (26)...(26) <223> Biotin TEG je zachycen na 3'konci sekvence.

<220>

<221> misc_feature <222> (25)...(26) <223> 3-(7-kumarinyl)glycerol se začlenil mezi polohu 25 a 26. <220>

<221> misc_feature <222> (19)...(19) <223> Symbol y značí, že v poloze 19 může být buď c nebo t. <400> 5 catttgttca gtggttcgya gggcaa 26

<210>	6
<211>	27
<212>	DNA
<213>	cDNA
<220>
<221>	mise	feature
<222>	(D-	(1)

• · • · · ·

<223> Na 5'-konci je prostřednictvím diesteru fosforothioátu zachycen fosforamidit fluoresceinu a tetraethylenglykol.

<400> 6 ttttttcccc cactgtttgg ctttcag 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> cDNA <220>

<221> misc_feature <222> (25)...(25) <223> Biotin TEG je zachycen na 3'konci sekvence.

<220>

<221> misc_feature <222> (24)...(25) <223> 3-(7-kumarinyl)glycerol se začlenil mezi polohu 24 a 25. <400> 7 cagagtctag actcgtggtg gacaa ₂5 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> cDNA <220>

<221> misc_feature <222> (1)...(1) <223> Na 5'-konci je prostřednictvím diesteru fosforothioátu zachycen fosforamidit fluoresceinu a tetraethylenglykol.

<400> 8 tttttctctc aattttctag gg 22 <210> 9 <211> 27 ··· ··· ······· · · ····

<212>	DNA
<213>	CDNA
<220>

<221> mise feature

<222>	(26)...(27)
<223>	3-(7-kumarinyl)glycerol se začlenil mezi polohu 26 a 27.
<220>

<221> mise feature

<222>	(27)...(27)
<223>	Biotin TEG je zachycen na 3'konci sekvence.
<400>	9

agcgccaaaa ttcgcagtcc ccaacaa 27

<210>	10
<211>	28
<212>	DNA
<213>	cDNA
<220>

<221> misc_feature <222> (1)...(1) <223> Na 5'-konci je prostřednictvím diesteru fosforothioátu zachycen fosforamidit fluoresceinu a tetraethylenglykol.

<400> 10 tttctccaat cactcaccaa cctcttgt ²⁸

<210>	11
<211>	58
<212>	DNA
<213>	cDNA
<400>	11

gatgctattc gcggttttaa gcgtcagggg ttggaggtta gtgagtggtt ggagaaca 58

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje

   i) kombinování vzorku s párem sond za podmínek hybridizace specifické pro sekvenci, kde každá sonda má na libovolném konci oblast tvořící větev sonda-sonda, jenž není komplementární s uvedenou cílovou sekvencí nukleové kyseliny a je schopna tvořit prostřednictvím interakce s druhou sondou větev sonda-sonda, přičemž v oblasti tvořící větev sonda-sonda jedné sondy je umístěna alespoň jedna řetězící sloučenina, která tvoří kovalentní příčnou vazbu s reakčním činidlem řetězící sloučeniny umístěným v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy páru sond po párování baží sond s uvedenou cílovou sekvencí nukleové kyseliny, a alespoň jedna detekovatelná část je vázána na alespoň jednu ze sond, ii) ozáření uvedeného vzorku světlem, aby došlo k řetězení oblasti tvořících větev sonda-sonda přilehlých párů sond, lil) oddělení řetězené oblasti sond, která tvoří větev sondasonda, od oblasti komplementární s cílem a iv) detekci přítomnosti alespoň jedné oddělené, řetězené větve sonda-sonda, což dokazuje přítomnost uvedené cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku.
2. 2. Způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje

   i) kombinování vzorku s párem sond za podmínek hybridizace specifické pro sekvenci, kde každá sonda má na libovolném konci oblast tvořící větev sonda-sonda, jenž není komplementární s uvedenou cílovou sekvencí nukleové kyseliny a je schopna tvořit prostřednictvím interakce s druhou sondou větev sonda-sonda, přičemž první řetězící • · · · • · · * · t sloučenina je umístěna v oblasti tvořící větev sondasonda první sondy páru sond a druhá řetězící sloučenina je umístěna v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy páru sond, a alespoň jedna detekovatelná část je vázána na alespoň jednu ze sond, ii) ozáření uvedeného vzorku světlem, aby došlo k řetězení oblasti tvořících větev sonda-sonda přilehlých párů sond, iii) oddělení řetězené oblasti sond, která tvoří větev sondasonda, od oblasti komplementární s cílem a iv) detekci přítomnosti alespoň jedné oddělené, řetězené větve sonda-sonda, což dokazuje přítomnost uvedené cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že detekovatelná část se vybrala ze skupiny obsahující fluorescein, fluorofór, radioizotop, antigen nebo enzym.
4. 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že pár sond obsahuje ribonukleovou nebo deoxyribonukleovou kyselinu.
5. 5. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že oblast tvořící větev sonda-sonda každé sondy páru sond obsahuje alespoň dva, s výhodou přibližně dva až přibližně osm nukleotidů, které tvoří páry baží.
6. 6. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že sondy se vybraly ze skupiny zahrnující SEQ

   ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 8.
7. 7. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že oddělení řetězené větve sonda-sonda sond od oblasti komplementární s cílem se provede chemickou nebo enzymatickou degradací.
8. 8. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že uvedená cílová sekvence nukleové kyseliny • β · · je jednořetězcová, dvouřetězcová deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina.
9. 9. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že uvedená cílová sekvence nukleové kyseliny vykazuje rozdíl mezi sekvencemi homologními s páry sond ne větší než přibližně dva nukleotidy.
10. 10. Způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje

    i) kombinování vzorku s párem sond za podmínek hybridizace specifické pro sekvenci, kde každá sonda má na libovolném konci oblast tvořící větev sonda-sonda, jenž není komplementární s uvedenou cílovou sekvencí nukleové kyseliny a je schopna tvořit prostřednictvím interakce s druhou sondou větev sonda-sonda, přičemž v oblasti tvořící větev sonda-sonda jedné sondy je umístěna alespoň jedna řetězící sloučenina, která tvoří kovalentní příčnou vazbu s reakčním činidlem řetězící sloučeniny umístěným v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy páru sond po párování baží sond s uvedenou cílovou sekvencí nukleové kyseliny, a alespoň jedna signální reportní skupina je vázána na jedné sondě a alespoň jedna záchytová skupina vázaná na druhé sondě, ii) ozáření uvedeného vzorku světlem, aby došlo k řetězení oblasti tvořících větev sonda-sonda přilehlých párů sond, iii) oddělení řetězené oblasti sond, která tvoří větev sondasonda, od oblasti komplementární s cílem a iv) detekci přítomnosti alespoň jedné oddělené, řetězené větve sonda-sonda, což dokazuje přítomnost uvedené cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku.
11. 11. Způsob podle nároku 1 nebo 10, vyznačuj ící se tím, že řetězící sloučenina se vybrala ze skupiny zahrnující kumarin, deriváty kumarinu, 3-(7-kumarinyl)glycerol, psoralen, deriváty psoralenu, 8-methoxypsoralen, 5-methoxypsoralen, cis-benzodipyron, deriváty cis« · benzodipyronu, trans-benzodipyronu, deriváty trans-benzodipyronu a sloučeniny obsahující fúzované kruhové systémy kumarin-cinnolin.
12. 12. Způsob podle nároku 1 nebo 10, vyznačuj ící se tím, že reakční činidlo řetězící sloučeniny se vybralo ze skupiny obsahující pyrimidiny a jejich deriváty.
13. 13. Způsob detekce cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje

    i) kombinování vzorku s párem sond za podmínek hybridizace specifické pro sekvenci, kde každá sonda má na libovolném konci oblast tvořící větev sonda-sonda, jenž není komplementární s uvedenou cílovou sekvencí nukleové kyseliny a je schopna tvořit prostřednictvím interakce s druhou sondou větev sonda-sonda, přičemž první řetězící sloučenina je umístěna v oblasti tvořící větev sondasonda první sondy páru sond a druhá řetězící sloučenina je umístěna v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy páru sond, a alespoň jedna signální reportní skupina je vázána na jednu sondu a alespoň jedna záchytová skupina je vázána na druhou sondu, ii) ozáření uvedeného vzorku světlem, aby došlo k řetězení oblasti tvořících větev sonda-sonda přilehlých párů sond, iii) oddělení řetězené oblasti sond, která tvoří větev sondasonda, od oblasti komplementární s cílem a iv) detekci přítomnosti alespoň jedné oddělené, řetězené větve sonda-sonda, což dokazuje přítomnost uvedené cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku.
14. 14. Způsob podle nároku 10 nebo 13, vyznačuj ící se tím, že signální reportní skupina se vybrala ze skupiny obsahující fluorescein, fluorofór, radioizotop, antigen nebo enzym.
15. 15. Způsob podle nároku 10 nebo 13, vyznačuj ící se tím, že záchytová skupina se vybrala ze skupiny zahrnující biotin, antigen nebo receptorový substrát.
16. 16. Způsob podle nároku 2 nebo 13, vyznačuj ící se tím, že řetězící sloučeniny se vybraly ze skupiny zahrnující arylolefiny a jejich deriváty.
17. 17. Sonda tvořená nukleovou kyselinou zahrnuje:

    i) oblast komplementární s cílem, jejíž báze se párují s oblastí cílové sekvence, ii) oblast tvořící větev sonda-sonda, která nehybridizuje s cílovou sekvencí, iii) alespoň jednu řetězící sloučeninu umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda, která může tvořit po párování baží sond s cílovou sekvencí kovalentní příčnou vazbu s alespoň jedním reakčním činidlem řetězící sloučeniny umístěným v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy, iv) alespoň jednu detekovatelnou část vázanou na oblast tvořící větev sonda-sonda alespoň jedné ze sond a

    v) degradační místo mezi oblastí komplementární s cílem a oblastí tvořící větev sonda-sonda.
18. 18. Sonda tvořená nukleovou kyselinou zahrnuje:

    i) oblast komplementární s cílem, jejíž báze se párují s oblastí cílové sekvence, ii) oblast tvořící větev sonda-sonda, která nehybridizuje s cílovou sekvencí, iii) první řetězící sloučeninu umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda jedné sondy, která může při reakci s druhou řetězící sloučeninou umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy po párování baží sond s cílovou sekvencí tvořit kovalentní příčnou vazbu, iv) alespoň jednu detekovatelnou část vázanou na oblast tvořící větev sonda-sonda alespoň jedné ze sond a

    v) degradační místo mezi oblastí komplementární s cílem a oblastí tvořící větev sonda-sonda.
19. 19.Sonda tvořená nukleovou kyselinou podle nároku 17 nebo 18, jejíž sekvenci tvoří přibližně 15 až přibližně 50 nukleotidů.
20. 20. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou obsahující

    i) v každé sondě oblast komplementární s cílem, jejíž báze se párují s oblastí cílové sekvence, ii) v každé sondě oblast tvořící větev sonda-sonda, která nehybridizuje s cílovou sekvencí, iii) alespoň jednu řetězící sloučeninu umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda, která může tvořit po párování baží sond s cílovou sekvencí kovalentní příčnou vazbu s alespoň jedním reakčním činidlem řetězící sloučeniny umístěným v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou, iv) alespoň jednu detekovatelnou část vázanou na oblast tvořící větev sonda-sonda alespoň jedné ze sond uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou a

    v) degradační místo mezi oblastí komplementární s cílem a oblastí tvořící větev sonda-sonda.
21. 21. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou obsahující

    i) v každé sondě oblast komplementární s cílem, jejíž báze se párují s oblastí cílové sekvence, ii) v každé sondě oblast tvořící větev sonda-sonda, která nehybridizuje s cílovou sekvencí, iii) alespoň jednu řetězící sloučeninu umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda, která může tvořit po párování baží sond s cílovou sekvencí kovalentní příčnou vazbu s alespoň jedním reakčním činidlem řetězící sloučeniny umístěným v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou, iv) alespoň jednu signální reportní skupinu vázanou na oblast tvořící větev sonda-sonda jedné ze sond uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou a alespoň jednu záchytovou skupinu vázanou v oblasti tvořící větev sonda»♦ • » · • · sonda druhé sondy páru sond tvořených nukleovou kyselinou a

    v) degradační místo mezi oblastí komplementární s cílem a oblastí tvořící větev sonda-sonda.
22. 22. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou obsahující

    i) v každé sondě oblast komplementární s cílem, jejíž báze se párují s oblastí cílové sekvence, ii) v každé sondě oblast tvořící větev sonda-sonda, která nehybridizuje s cílovou sekvencí, iii) první řetězící sloučeninu umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda jedné sondy, která může při reakci s druhou řetězící sloučeninou umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou po párování baží sond s cílovou sekvencí tvořit kovalentní příčnou vazbu, iv) alespoň jednu detekovatelnou část vázanou na oblast tvořící větev sonda-sonda alespoň jedné ze sond uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou a

    v) degradační místo mezi oblastí komplementární s cílem a oblastí tvořící větev sonda-sonda.
23. 23. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou obsahující

    i) v každé sondě oblast komplementární s cílem, jejíž báze se párují s oblastí cílové sekvence, ii) v každé sondě oblast tvořící větev sonda-sonda, která nehybridizuje s cílovou sekvencí, iii) první řetězící sloučeninu umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda jedné sondy, která může při reakci s druhou řetězící sloučeninou umístěnou v oblasti tvořící větev sonda-sonda druhé sondy uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou po párování baží sond s cílovou sekvencí tvořit kovalentní příčnou vazbu, iv) alespoň jednu signální reportní skupinu vázanou na oblast tvořící větev sonda-sonda jedné ze sond uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou a alespoň jednu záchytovou skupinu vázanou na oblast tvořící větev sondasonda druhé sondy páru sond tvořených nukleovou kyselinou a

    v) degradační místo mezi oblastí komplementární s cílem a oblastí tvořící větev sonda-sonda.
24. 24. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle libovolného z nároků 20 až 23, kde každá sonda uvedeného páru sond tvořených nukleovou kyselinou má sekvenci tvořenou přibližně 15 až přibližně 50 nukleotidy.
25. 25. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou zahrnuje následující větev sonda-sonda:

    L L’ \ . /

    N(a) N(a)

    X = Y N(b) N(b)

    i) kde je přítomen alespoň jeden L a L' a znamená značku, ii) kde symbol N znamená nukleovou kyselinu, iii) kde symboly a a b jsou nezávisle na sobě celá čísla, která značí počet N, iv) kde symbol X je první řetězící sloučenina,

    v) kdy symbol Y je druhá řetězící sloučenina nebo reakční činidlo řetězící sloučeniny a vi) kde se první řetězící sloučenina kovalentně váže na druhou řetězící sloučeninu nebo na reakční činidlo řetězící sloučeniny, aby došlo ke stálému spojení uvedené větve sonda-sonda.
26. 26. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou zahrnuje následující větev sonda-sonda:

    • · · ·

    L L’ \ /

    P(a) P’(a)

    X = Y P(b) P’(b)

    i) kde je přítomen alespoň jeden L a L' a znamená značku, ii) kde symbol P znamená purin nebo jeho derivát, iii) kde symbol P' znamená pyrimidin nebo jeho derivát, iv) kde symboly a a b jsou nezávisle na sobě celá čísla, která značí počet Pa P',

    v) kde symbol X je řetězící sloučenina, vi) kdy symbol Y je reakční činidlo řetězící sloučeniny a vii) kde se řetězící sloučenina kovalentně váže na reakční činidlo řetězící sloučeniny, aby došlo ke stálému spojení uvedené větve sonda-sonda.
27. 27. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle nároku 25 nebo 26, kde symbol L je signální reportní skupina a symbol L'je záchytová skupina.
28. 28. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle nároku 25 nebo 26, kde uvedená signální reportní skupina se vybrala ze skupiny zahrnující fluorescein, fluorofór, radioizotop, antigen nebo enzym.
29. 29. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle nároku 25 nebo 26, kde uvedená záchytová skupina se vybrala ze skupiny zahrnující biotin, antigen nebo receptorový substrát.
30. 30. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle libovolného z nároků 25 nebo 26, kde každá sonda páru sond má délku sekvence, kde symbol a je 0 až 20 a symbol b je 0 až 80.
31. 31. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle nároku 25 nebo

    26, kde se řetězící sloučenina vybrala ze skupiny zahrnující kumarin, deriváty kumarinu, 3-(7-kumarinyl)glycerol, psoralen, deriváty psoralenu, 8-methoxypsoralen, 5-methoxypsoralen, cis-benzodipyron, deriváty cis-benzodipyronu, trans-benzodipyronu, deriváty trans-benzodipyronu a sloučeniny obsahující fúzované kruhové systémy kumarin-cinnolin, arylolefiny a deriváty arylolefinu.
32. 32. Pár sond tvořených nukleovou kyselinou podle nároku 25 nebo 26, kde se reakční činidlo řetězící sloučeniny vybralo ze skupiny zahrnující pyrimidyny a jeho deriváty, puriny a jeho deriváty.