CN102703584B

CN102703584B - 自组装聚合分支dna探针的制备方法

Info

Publication number: CN102703584B
Application number: CN 201210116515
Authority: CN
Inventors: 郭晏海; 颜真; 王萌; 向安; 刘永兰; 汪钦; 包晗
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: CN102703584A

Abstract

本发明涉及一种自组装聚合分支DNA探针的制备方法。将常规探针高密度固定于芯片上可提高探针的杂交检测效率，但目前分支状DNA探针的制作操作复杂，制造成本高。本发明将互补探针溶于交联缓冲液中，加热变性降至室温静置，紫外光交联使互补结合的探针间形成共价结合，从而形成稳定的自组装聚合分支DNA探针；交联缓冲液配制方法为：将1.0g精氨酸和20g聚乙二醇1000溶解于0.1mol/L、700mL的PBS中，PBS的pH为7.2，然后用PBS定容至1L。本发明制备方法简捷快速、制备成本低，可有效提高芯片检测的灵敏性，交联缓冲液加精氨酸后所获探针杂交检测灵敏度提高10倍。

Description

自组装聚合分支DNA探针的制备方法

技术领域

本发明涉及一种DNA探针的制备方法，具体涉及一种自组装聚合分支DNA探针的制备方法。

背景技术

基因芯片是将不同单链DNA探针固定于固相表面不同位置形成的探针阵列。由于各DNA探针核酸序列可与相应靶核酸序列互补，因此基因芯片可以实现同步高通量地检测样品中多种靶核酸。基因芯片固定的探针为单链DNA，也有采用肽核酸（PNA）或锁核酸（LNA）合成的探针，后两者虽然在杂交灵敏性和特异性方面较前者有所提高，但由于合成本较高一般较少采用。探针的长度对杂交的特异性有影响，短探针的特异性高于长探针。长DNA探针多是由基因克隆扩增、PCR扩增或其它扩增技术获得的，长度一般为数十至数百个碱基，可用于基因表达分析；短DNA探针多为人工合成的寡聚核苷酸链，长度一般为8-30个碱基，由于短探针杂交检测的特异性高，杂交速度快，因此短探针常用于基因芯片，可用于核酸突变或单核苷酸多态性检测。

芯片上的探针固定有两类方法，一是采用光引导的原位合成技术在芯片表面直接合成所需要的探针，该方法适用于制备高密度基因芯片；二是采用点样的方法直接将制备好的探针点于芯片上，通过探针末端标记的活性基团或是通过紫外光照射，使探针与芯片表面羟基或氨基等基团发生共价结合，固定于芯片表面。由于第一类方法制备成本很高，因此制备中、低密度基因芯片时一般采用第二类方法，尤其是紫外光固定探针的方法，不需要对芯片表面和探针做特殊处理和标记，操作方便快捷，使得芯片制备成本降低、易实现规模化生产。通过紫外照射探针可以与芯片表面基团（如羟基）发生共价结合，其中最易发生结合反应的是核酸序列中的胸腺嘧啶（T），因此寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸（Poly（T））常被设计在探针的末端，以利于紫外光激发探针与固相结合。

芯片表面的探针与液相靶核酸的杂交反应，属于固相-液相杂交，由于芯片上固定的探针失去液相中的自由度，同时固相表面还存在静电、氢键或离子键等分子间作用力，使芯片表面探针的杂交效率不如液相中的高。为了提高芯片探针的杂交效率，可在探针设计和固定方面采用多种策略。策略一：提高探针固定密度。芯片探针固定区单位面积有效探针数量是影响芯片检测灵敏性的重要因素，提高单位面积探针密度可以提高杂交效率，提高芯片检测灵敏度，但是探针固定密度不可过高，过高的探针密度会由于探针拥挤效应影响靶核酸的进入，降低杂交效率；策略二：增加探针检测序列与固相表面间的距离并增加探针在立体空间的分布密度。在探针与固相表面间增加连接臂可使探针杂交效率提高上百倍，同时增加探针在立体空间的分布密度，可以提高探针与液相中靶核酸的碰撞几率，提高检测的灵敏度和杂交速度。因此，提高探针的空间分布密度是提高芯片探针杂交效率的有效手段。

分枝DNA探针、多聚核酸杂交探针以及多孔材料中（聚丙烯酰胺凝聚基质）固定探针等技术方法均可提高探针的空间分布密度。其中，分支DNA探针和多聚核酸探针是将多拷贝的探针序列单元聚合在一个大分子中，每个探针序列单元是由至少8个碱基序列组成，每个聚合分子中的探针序列单元可以是相同的序列也可是不同的序列，分别构成同源多聚物（homopolymer）和异源多聚物（copolymer）。探针序列单元间以直接末端结合或通过连接臂相互结合。虽然分支和多聚探针提高了探针的空间分布密度，提高了检测的灵敏度，但是这类探针需要合成探针分支骨架或多聚探针链，工艺较为复杂，合成成本高。例如制备多聚核酸杂交探针（Polymeric nucleic acid hybridization probes - US2005112636A1）时，需要用DNA连接酶反应将单个探针单元联接起来、或通过链替代扩增反应扩增含探针序列单元的环状核酸模板，获得的扩增产物便成为含有多拷贝探针序列单元的多聚探针。除分支和多聚探针，还有不用合成复杂探针，而仅采用常规核酸探针便可实现提高探针空间分布密度的方法。该方法是将常规探针固定于聚丙烯酰胺凝聚基质的多孔分子骨架上，但是这种方法的探针固定操作、以及芯片的保存和使用均不方便。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺简单、成本更低、能快速固定于玻璃芯片表面的自组装聚合分支DNA探针的制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

自组装聚合分支DNA探针的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：于内表面硅烷化处理的eppendorf管中，将探针结构分别为5’-α-β-γ-3’和5’-γ-α’-β’- 3’的两种探针各10 μmol/L等摩尔浓度溶于交联缓冲液中；

其中，探针捕获序列γ区与DNA靶序列互补，α区与α’区互补，β区与β’互补；

步骤二：将溶有探针的交联缓冲液加热至80℃-94℃变性1min，然后自然降至20℃-25℃，放置5-10min，使探针互补形成由氢键连接的分支探针链；

步骤三：采用波长为254nm 、光强为100μJ/cm²的紫外光处理，紫外光交联3-4min使溶液中互补结合的探针间形成共价结合，从而形成稳定的自组装聚合分支DNA探针。

步骤一中，交联缓冲液配制方法为：将1.0g精氨酸和20g聚乙二醇1000溶解于摩尔浓度为0.1mol/L、体积为700mL的 PBS中，PBS的pH 为7.2；然后用pH 为7.2、摩尔浓度为0.1mol/L的 PBS定容至1L。

本发明具有以下优点：

本发明所涉及的制备方法简捷快速、制备成本低，可提高芯片检测的灵敏性。本发明使用了含有精氨酸和聚乙二醇的PBS缓冲液，较之单独使用0.1mol/L PBS缓冲液（pH7.2）和TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0）等，可明显提高探针杂交检测的灵敏度；精氨酸易与核酸结合，尤其是易与带有更多负电荷的双链DNA结合，在精氨酸与双链DNA结合以及缓冲液其它成分的共同作用的情况下，紫外光照射可使双链间更牢固地结合，提高自组装聚合分支DNA探针结构的稳定性。该发明只需将合成的探针对等摩尔比溶于所发明的交联缓冲液中，通过一定强度的紫外光照射，便可形成结构稳定的自组装聚合分支DNA探针。实验证明交联缓冲液加精氨酸后所获的探针，其杂交检测灵敏度比未加精氨酸的可提高10倍。

附图说明

图1为自组装聚合分支DNA探针的结构。

图2为探针对的结构。

图3为毛细管芯片杂交检测结果。

图4为不同缓冲液对所制备探针的杂交检测灵敏度的影响。

图2中：

γ区为探针捕获区，与DNA靶序列互补；

α区与α’区互补；

β区与β’互补。

图3中：

A探针：单独固定A探针；

A’探针：单独固定A’探针；

A+A’探针：固定自组装聚合分支DNA探针；

1：靶序列浓度为1.0μM；

2：靶序列浓度为0.1 μM；

3：靶序列浓度为0.01 μM；

4：靶序列浓度为1.0nM；

5：靶序列浓度为0.1nM；

6：靶序列浓度为0.01nM。

图4中：

1：PBS缓冲液；

2：TE缓冲液；

3：聚乙二醇缓冲液+PBS；

4：精氨酸+聚乙二醇缓冲液+PBS缓冲液；

A：靶序列浓度为0.1 μM；

B：靶序列浓度为0.01 μM；

C：靶序列浓度为1.0nM。

具体实施方式

本发明设计合成针对靶序列的一对探针对，探针对中的每个探针均含有捕获序列，而在捕获序列的5’或3’ 分别带有可以互补结合的序列（见图1），以用于形成聚合探针。为了形成稳定的聚合分支DNA探针，使探针在杂交过程中保持聚合分支状结构，不发生解离，本发明是将探针对等摩尔比溶于所发明的探针联接缓冲液，通过一定强度的紫外光照射可形成结构稳定的自组装聚合分支DNA探针。

为说明本发明所涉及的自组装聚合分支DNA探针的制备方法，下面将以具有具体序列结构的DNA靶序列为例，对探针序列的设计进行具体阐述。所涉及的DNA靶序列结构为（记为seq1）：

5’-TCGAGAGCTCAGA-GTCTAGTCAGTCA-GAAGATTCGGA-3’

DNA靶序列中部的序列为（记为seq2）：

5’-GTCTAGTCAGTCA-3’

（1）首先，针对DNA靶序列设计探针结构分别为5’-α-β-γ-3’和5’ -γ-α’-β’- 3’的探针。为了与DNA靶序列中部的序列互补，将探针捕获序列γ区序列设计为（记为seq3）：

5’-TGACTGACTAGAC-3’

（2）在该γ区序列的5’端设计5’-α-β-3’序列。其中5’-α-3’的序列为富含胸腺嘧啶的脱氧核苷酸序列，如5’-TTGTTGTTGT-3’ （记为seq4）；5’-β-3’的序列为5’-GGGGGGGGGG-3’ （记为seq5）。得到针对靶序列的5’-α-β-γ-3’探针A的序列即为（记为seq6）：

5’-TTGTTGTTGT-GGGGGGGGGG-TGACTGACTAGAC-3’

（3）或在该γ区序列的3’端设计5’-α’-β’- 3’序列，其中5’-α’-3’的序列是与5’-α-3’-互补的序列，即5’-ACAACAACAA-3’ （记为seq7）；5’-β’-3’的序列是与5’-β-3’-互补的序列，即5’-CCCCCCCCCC- 3’ （记为seq8）。得到针对靶序列的5’ -γ-α’-β’- 3’探针A’序列则为（记为seq9）：

5’- TGACTGACTAGAC-ACAACAACAA-CCCCCCCCCC-3’

用DNA合成仪合成上述探针A和A’，以及5’标记有生物素的DNA靶序列（为了后续检测用），靶序列及每种探针各合成10 OD。

本发明所涉及的自组装聚合分支DNA探针的制备方法，具体步骤为：

步骤一：于内表面硅烷化处理的eppendorf管中，将探针结构分别为5’-α-β-γ-3’和5’-γ-α’-β’- 3’的两种上述探针各10 μmol/L等摩尔浓度溶于交联缓冲液中；

步骤二：将溶有探针的交联缓冲液加热至80℃-94℃变性1min，然后自然降至20℃-25℃，放置5-10min，使探针互补结合形成分支探针链；

步骤三：采用波长为254nm 、光强为100μJ/cm²的紫外光处理，紫外光交联3-4min使溶液中互补结合的探针间形成共价结合，形成稳定的自组装聚合分支DNA探针。

将上述含有自组装聚合分支DNA探针溶液，以及含单独探针A或A’的探针溶液，各0.5μl点于毛细管芯片玻璃基质U型槽内表面， 37℃孵箱中放置15min使液滴挥干，然后用254nm波长100μJ/cm²紫外光照射点有探针的芯片表面1min，使探针固定于芯片玻璃基质U型槽内表面。

其中，交联缓冲液配制方法为：将1.0g精氨酸和20g聚乙二醇1000溶解于摩尔浓度为0.1mol/L、体积为700mL的 PBS中，PBS的pH 为7.2；然后用pH 为7.2、摩尔浓度为0.1mol/L的 PBS定容至1L。

点探针前，毛细管芯片玻璃基质U型槽的处理：将长5.0cm，内径1.8mm，外径2.0mm的中性玻璃基质U型槽置于浓度为6.5%硝酸溶液中，70℃水浴超声清洗1小时；再置于浓度为10%的氢氧化钠溶液中，80℃水浴超声清洗1小时；超纯水清洗后，真空干燥30分钟。前处理的目的是为了对U型槽进行彻底清理，去除U型槽中的尘埃等物质。

固定有核酸探针玻璃基质U型槽放置于清洗后的6cm长的透明高分子热缩套管的中央，90℃烘箱内均匀受热5分钟，热缩后透明的套管与玻璃基质U槽紧密结合，在内部形毛细管微通道，制成毛细管芯片。

高分子热缩套管清洗、准备：用注射器将一根长1m，内径为3.0mm，热缩比为2：1的铁氟龙透明高聚物热缩管注满6.5%的硝酸溶液，并将管盘绕置于浓度为6.5%的硝酸溶液中，70℃水浴超声清洗1小时；蒸馏水清洗管内外后，用注射器向管中注入10%的氢氧化钠溶液，再将管盘绕置于浓度为10%的氢氧化钠溶液中，80℃水浴超声清洗1小时；50mL无水乙醇来回穿梭冲洗10次，用超纯水清洗管内外；真空干燥30分钟；洁净工作区，剪切成6cm长的短套管，室温保存待用。

本发明所涉及的毛细管芯片杂交检测上述靶序列的实验如下：

1、毛细管芯片预杂交：

芯片腔道内吸入15μl的预杂交液，预杂交液成份为：100μg/ml鲑鱼精、0.1%十二烷基硫酸钠溶液、0.1%牛血清白蛋白和5×柠檬酸钠缓冲液，微通道芯片垂直固定于杂交仪内旋转杆上，在37℃、40转/分钟的条件下，预杂交液在微通道芯片腔道内穿梭20分钟，可适当调整旋转速度以保证预杂交液能穿梭腔道全长。10ml超纯水以30ml/min流速冲洗微通道芯片腔道，1000rpm水平式离心5分钟。

2. 上述标记有生物素的DNA靶序列（DT）与杂交溶液按1：4体积比混合得到杂交反应液。杂交溶液的成份为：50%甲酰胺、5×柠檬酸钠缓冲液和0.1%十二烷基硫酸钠溶液。杂交仪内，37℃，15μl杂交反应液，40转/分钟，在微通道芯片腔道内穿梭30分钟。

3. 杂交混合液洗脱：

45℃条件下，将5.0ml洗脱液1以30ml/min流速冲洗微通道芯片腔道，100μl洗脱液1的成份为： 20×柠檬酸钠缓冲液10μl、10%十二烷基硫酸钠溶液1μl和无菌超纯水89μl；然后将10ml洗脱液2以30ml/min流速冲洗微通道芯片腔道，100μl洗脱液2的成份为： 20×柠檬酸钠缓冲液0.5μl、10%十二烷基硫酸钠溶液1μl和无菌超纯水98.5μl。

4. 亲和链霉素-碱性磷酸酶与核酸靶序列连接：

芯片腔道内吸满由pH为7.0的磷酸盐缓冲液经1500倍稀释后的亲和链霉素-碱性磷酸酶，于37℃下避光放置20分钟，再由10μl、pH为7.0的磷酸盐缓冲液以30ml/min流速冲洗芯片腔道。

5.杂交信号显色：

将25μl显色液加入微通道芯片腔道，37℃下避光放置20分钟，显色液的成分为：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、氯化硝基四氮唑蓝和磷酸盐缓冲液，质量比为5：10：1500。

6. 结果观察：

拍照记录结果。参见图2可知，自组装聚合分支DNA探针的检测灵敏度为1.0nM，单独A或A’探针的检测灵敏度为0.01μM。

本发明使用了含有精氨酸和聚乙二醇的PBS缓冲液，交联缓冲液配制方法为：将1.0g精氨酸和20g聚乙二醇1000溶解于摩尔浓度为0.1mol/L、体积为700mL的 PBS中，PBS的pH 为7.2；然后用pH 为7.2、摩尔浓度为0.1mol/L的 PBS定容至1L。该交联缓冲液比单独使用0.1mol/L PBS缓冲液（pH7.2）和TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0）可明显提高探针杂交检测灵敏度的作用。其中的精氨酸在整个缓冲液的体系中尤为重要，精氨酸为碱性氨基酸，在中性和弱碱性缓冲液中带正电荷，易与核酸结合，尤其是易与带有更多负电荷的双链DNA结合，经紫外光照射，双链DNA链间和精氨酸分子与DNA链间形成共价键结合，使自组装聚合分支DNA探针在固定和杂交检测过程中保持结构稳定。

为说明本发明所涉及的交联缓冲液在灵敏度方面的优势，除了上述含精氨酸的交联剂外，还分别采用0.1mol/L PBS缓冲液（pH7.2）、TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0），以及聚乙二醇缓冲液（20g/L聚乙二醇1000, 0.1mol/L PBS （pH7.2））进行探针交联实验。参见图3可知，精氨酸+聚乙二醇缓冲液+PBS缓冲液制备的自组装聚合分支DNA探针的检测灵敏度为0.1nM，较其它缓冲液所获得探针的检测灵敏度（＞0.01μM）提高了10倍以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 自组装聚合分支DNA探针的制备方法

<130> 2012-1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgagagctc agagtctagt cagtcagaag attcgga 37

<210> 2

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtctagtcag tca 13

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<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

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tgactgacta gac 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttgttgttgt 10

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<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggggggggg 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgttgttgt gggggggggg tgactgacta gac 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acaacaacaa 10

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<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccccccccc 10

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgactgacta gacacaacaa caaccccccc ccc 33

Claims

1.自组装聚合分支DNA探针的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

5’-α-β-γ-3’的具体序列为5’-TTGTTGTTGT-GGGGGGGGGG-TGACTGACTAGAC-3’；

5’-γ-α’-β’- 3’的具体序列为5’- TGACTGACTAGAC-ACAACAACAA-CCCCCCCCCC-3’；

步骤三：采用波长为254nm 、光强为100μJ/cm²的紫外光处理，紫外光交联3-4min使溶液中互补结合的探针间形成共价结合，从而形成稳定的自组装聚合分支DNA探针；

所述的步骤一中，交联缓冲液配制方法为：将1.0g精氨酸和20g聚乙二醇1000溶解于摩尔浓度为0.1mol/L、体积为700mL的 PBS中，PBS的pH 为7.2；然后用pH 为7.2、摩尔浓度为0.1mol/L的 PBS定容至1L。