CN102168146B - 高特异性高灵敏度的基因芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高特异性高灵敏度的基因芯片及其制备方法与应用。该高特异性高灵敏度的基因芯片为三层结构，底层为基质载体，中间层为中介层，顶层为核酸探针层。其中，核酸探针为根据检测目的通过化学合成法或PCR法制备得到，得到的基因芯片不仅具有特异性，而且具有高出原位合成法芯片3-5倍的灵敏度。由于核酸探针分子不经饰处理，因而有效规避了基于修饰探针随带的探针在溶液中和表面上因探针分子间的自交联引起的芯片灵敏度随贮存时间不断降低的问题，因此本发明所述的基因芯片稳定性高。将核酸探针固定于中介层上，核酸探针分子能远离表面因而极大减少表面的空间阻隔效应，大大提高杂交反应的效率，进一步提高该基因芯片的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片，特别涉及一种高特异性高灵敏度的基因芯片及其制备方法与应用。
背景技术
基因芯片技术是近十多年来生物研究技术的重大突破性进展之一，其技术特征是将数量庞大的生物探针有序地固定在相对小的固体表面如玻璃或硅表面上，每个探针点通常直经小于100微米。因此，在普通的显微玻片上可排列成千上万个不同的生物探针。这种表面带有高密度的玻片或硅质片就是通常所说的生物芯片。带有大量的特性各异的探针芯片和被测试物接触反应如核酸间的杂交反应时，可以同时检测被测试物中各种复杂成份的存在及数量。目前，基因芯片技术已广泛应用于基础生物学研究中。此技术在近年来也逐步应用在临床诊断上。
基因芯片制造方法粗略可分为两大类：原位合成法和点样法。原位合成法就是直接在玻璃或硅载体表面上通过单体聚合来合成寡核苷酸探针。这种方法最先由美国的Affymatrix公司开发成功，其技术特征是利用半导体工业上普遍采用的精密光刻蚀技术根据每个探针点上的序列制成一组模片，用这种模片可控制在每个反应循环各个探针点的反应活性从而达到可控聚合反应而获得各探针点所需的探针序列。这种方法的最大优势是可在很小的表面上合成高密度的探针。但其主要缺点是此方法可塑性很差，不同的芯片设计就要制备一整套全新的模片。而另一大缺点是每个反应循环各探针点涉及封闭和解封反应，因而影响聚合反应的效率。由于每步聚合反应的效率低和循环时间长，Affymetrix芯片技术生产的芯片，其探针长度一般不超过25个碱基。后来由Nimblegen开发出的无模片原位合成技术彻底克服了Affymetrix芯片技术的困难，即单体聚合反应的效率显著提高。由Nimblegen无模片原位合成技术生产的芯片，其探针长度可长达80至100碱基。另一与Affymetrix和Nimblegen技术不同的是Agilent公司原位合成芯片技术。Agilent技术是采用传统的寡核苷酸合成方法，用高精度的点样机将单体直接点印到预定探针点上进行分步聚合反应，多步循环后生成所需探针序列。但这种点样法在所得的芯片的探针密度方面难以逾越Nimblegen或Affymetrix技术。
点样法生物芯片技术是用点样机将制备好的探针点印到载体表面上，经紫外线交联或化学缩聚反应，探针固化在表面上形成探针点阵列。这类芯片也叫微阵列(Microarray)。与原位合成法不同的是，点样法生产的芯片的探针序列几乎是无长度限制的。例如，用点样法可将长达300,000个碱基对的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome)DNA制成探针微阵列，用于准确测定人基因组中的拷贝数。常用的点样法芯片制备方法是将DNA用点样机点印到带有氨基的玻璃表面上，在一定湿度条件下用紫外线将DNA交联到表面上形成探针点，随后用化学方法将表面多余的氨基封闭以免因表面氨基质子化形成正电性对带负电的DNA试样产生非特异性吸附造成高的背景信号。另一比较常用的方法是将探针点印到带过氧基团的玻璃表面上，但这种方法同样存在将表面多余活性过氧基团完全脱活的问题。以上所述的常用的点样法，其基因芯片生产方法多用于制备对灵敏度或定量要求不高的基因芯片，如用于基因表达谱研究的芯片。对于灵敏度和定量准确度要求极高的比较基因组杂交芯片，以上所提的两种点样法生产的芯片皆因高背景信号及灵敏度不足而在实际中很少应用。
由Cai及Bradley(美国专利6,048,695；6,858,713)开发的基于DNA化学修饰的基因芯片生产方法成功解决了生物芯片的低灵敏度及高背景信号问题。这种芯片制备方法的特点是将探针分子先硅氧烷化处理，使得经处理过的探针带有对玻璃或石英表面有特异反应活性的硅醇基团。经这样修饰的探针可和不经活化处理的玻璃表面反应形成共价结合。这种化学修饰的探针的一个最大优点是探针间在脱水后能相互交联形成三维的织物状结构，因而大大提高杂交反应效率。另外，因芯片表面无需活化及脱活处理，因此不会产生表面背景信号。但是，这种预修饰方法的一大缺点是硅烷化探针因互相间能发生交联反应，在溶液中存放时间长时会因交联作用而慢慢失效。
点样法制备的基因芯片和原位合成法生产的芯片相比通常有更高的灵敏度，其主要原因是所用的探针较长因而覆盖区间大。但这也同时带来探针的特异性变动性大和难以在探针设计上加以控制，因为点样法所用的探针多为克隆的基因片段如cDNA片段。而用于比较基因组杂交芯片的探针可取自长达300,000碱基对的细菌人工染色体DNA。这种来自基因组片段(genomic fragment)的DNA平均约一半是无特异性的重复性序列(repetitive sequences)。这种重复性序列若不能有效封闭则会降低整个探针点特异性，甚至因此整个探针失去效用。但是，目前并没有很有效的方法去除大基因组片段中的重复性序列而保存特异性序列(uniquesequences)。
点样法与原位合成法相比，一个最大的优点是设备要求不高和芯片成本低。而原位合成法生产的芯片的成本与芯片表面探针的密度关系不大。因此，对于探针密度不高的芯片原位合成法的生产成本高，毫无优势。例如，售价为一百万美元的Nimblegen原位合成法芯片生产系统一天24小时只能生产三个芯片，但一个10万美元的点样机可以在24小时内产出200个表面有一万个探针点的芯片。
综上所述，可知点样法具有高灵敏度，但是特异性低；原位合成法具有高特异性，但是灵敏度低，且生产成本高；而基于DNA化学修饰的基因芯片生产方法虽然解决了很多点样法存在的技术难题，但其主要缺点是硅烷化修饰处理的探针在溶液中稳定性降低，存放时间长时会因交联作用而慢慢失效。在探针数量较多的情况下，探针的失效会显著增加芯片的生产成本。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高特异性高灵敏度的基因芯片。
本发明的第二目的在于提供所述的高特异性高灵敏度的基因芯片的制备方法。
本发明的第三目的在于提供所述高特异性高灵敏度的基因芯片的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高特异性高灵敏度的基因芯片，为三层结构，底层为基质载体，中间层为中介层，顶层为核酸探针层。
所述的基质载体为表面平整的固体，优选为表面平整的玻璃、金属、塑料或二氧化硅。
所述的基质载体经超声表面净化处理及强酸活化后，进一步进行化学修饰使表面氨基化、醛基化、环氧基团化、或羧基化。
所述的表面氨基化是用有末端氨基的硅氧烷处理洁净表面。此类硅氧烷包括：4-氨基丁基三乙氧基硅烷(4-aminobutyltriethoxysilane)；3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(3-aminopropyldimethylethoxysilane)；3-氨基丙基甲基-二乙氧基硅烷(3-aminopropylmethyldiethoxysilane)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)；3-氨基丙基三羟基硅烷(3-aminopropylsilanetriol)；3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)。
所述的醛基化是用3-(三乙氧基硅基)丁醛[3-(triethoxysilyl)butyl aldehyde]处理表面。
所述的环氧基团化是带环氧基团的硅氧烷化合物处理表面。能用的化合物包括：2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷[2-(3，4-epoxycyclohexyl)ethyltrimethoxysilane]；2-(3，4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷[2-(3，4-epoxycyclohexyl)ethyltriethoxysilane]；5，6-环氧己基三乙氧基硅烷[5，6-epoxyhexyltriethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)mehtyldiethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)triethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane]。
所述的羧基化是用带羧基的硅氧烷处理表面。此类化合物包括：二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮[3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride]；羧乙基三羟基硅烷(carboxyethylsilanetriol)。
所述的中介层的组成物质为无意义DNA序列或是带羧基基团的聚合物。无意义DNA序列指的是与所用杂交反应混合物无序列相似性即无杂交反应的任何DNA序列。
所述的无意义DNA序列的长度优选为500～50000bp(base pair，碱基)。
所述的带羧基基团的聚合物优选为异丁烯马来酸共聚物[Poly(isobutylene-co-maleicacid)]；乙烯马来酸酐共聚物[Poly(ethylene-alt-maleic anhydride)]；甲氧基乙烯马来酸共聚物)[Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic acid)]；丙烯酸马来酸共聚物[Poly(acrylic acid-co-maleicacid)]；聚(2-乙基丙烯酸)[Poly(2-ethylacrylic acid)]；聚(2-丙基丙烯酸)[Poly(2-propylacrylicacid)]；N-异丙基丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物[Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylicacid)]；聚甲基丙烯酸[Poly(methacrylic acid)]；聚(N-异丙基丙烯酰胺)[Poly(N-isopropylacrylamide)]；丙烯酸丙烯酰胺共聚物[Poly(acrylamide-co-acrylic acid)]；或聚丙烯酸(polyacrylic acid)。
所述的核酸探针层中的核酸探针的长度优选为100～5000bp。
所述的核酸探针通过化学合成法或是PCR方法进行制备。PCR方法即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。
由于化学合成法得到核酸片段一般小于100bp，因此所述的核酸探针通过化学合成法制备时，还优选将化学合成得到的DNA产物依次通过T4DNA磷酸化酶激酶和T4DNA连接酶(Ligase)作用，进行连接反应，使其长度为100～5000bp。
所述的连接反应优选在组分为无意义DNA的中介层上进行。核酸探针分子可以连接到中介层DNA分子的3’末端上。
所述的连接反应是DNA产物分子优选在在辅助引物(helper primer)的协助下进行连接反应。
所述的连接反应的条件优选如下：先用T4磷酸化酶激酶于37℃作用DNA产物分子1小时；接着加入T4连接酶和辅助引物，于15℃反应18小时；辅助引物的摩尔用量与核酸探针摩尔数相等；更具体如下：
将DNA探针、连接酶反应缓冲液(pH7.6、50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl，10mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇dithothreitol，1mM ATP)和T4DNA磷酸化酶激酶(Kinase)混合，于37℃反应；然后加入与核酸探针等摩尔的8～12bp随机序列引物，终浓度为质量体积比15％的PEG，及终浓度为10-20单位的T4DNA连接酶，在16℃下反应16-30小时，探针分子互相串接成大于200bp的多单元探针分子；
所述的PEG优选为PEG8000；
所述的辅助引物是长度为8～16个碱基的核苷酸，其序列与探针分子的两端分别有至少4碱基的互补吻合(图1)。优选的辅助引物是8～12bp组成的随机序列，更优选为N10随机序列辅助引物。
通过连接反应，可以使得到的核苷酸探针分子量是原来的核苷酸分子量的至少10倍。不同的核苷酸分子也可用这种方法连接成序列复杂性更高的探针。这种方法制备探针特别适用于制造高灵敏度和高特异性的比较基因组杂交芯片。
中介层为含羧基的聚合物时，核酸探针分子需要导入氨基，通过氨基与羧基的缩聚反应将核酸探针分子联结到中介层上。
所述的核酸探针通过PCR方法进行制备时，优选在PCR反应中加入5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐(5-Aminoallyl-2′-deoxyuridine-5′-Triphosphate)或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐(5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate)。5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐可使得到的PCR产物为带有氨基的核酸探针。
所述的5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐的用量优选为每条核酸序列上带有3～10个氨基为宜。
所述的PCR的条件优选为先在93℃变性3分钟，然后进行下系列温度循环：93℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒；进行20次循环后，加入5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐，继续循环10次，最后在72℃延长5分钟；5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐在PCR反应体系中的浓度为0.1mM；
所述的核酸探针优选通过紫外线(254nm紫外光)或化学交联剂交联固化于中介层上。
所述的带有氨基的核酸探针更优选通过下列的化学方法固定到成分为含羧基的聚合物的中介层上：
(1)氨基与中介层中羧基团在EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]存在下缩合反应，形成酰胺键(amide)。
(2)氨基与有环氧基团在pH 7.5～10条件下产生开环反应形成共价结合。
(3)氨基化探针可直接与经酯化活化处理的聚丙稀酸中介层形成酰胺键。
所述的高特异性高灵敏度的基因芯片的制备方法，包含以下步骤：
(1)基质载体的制备：基质载体经超声表面净化处理及强酸活化后，可进一步进行化学修饰使表面氨基化、醛基化、环氧基团化、或羧基化；优选的基质载体是低荧光背景的显微玻片，经超声波水洗去除表面吸附物后在1-2M盐酸中活化表面，表面经脱水处理后可直接用于承载经硅烷化处理的中介层。酸活化表面进一步处理使其带有氨基、醛基或环氧基团。经功能基团修饰的表面可用于固定无化学修饰的中介层。所述的进一步处理的步骤具体如下：将硅烷化合物稀释在乙醇或异丙醇中成0.1M溶液，进一步稀释到质量体积比50％ PEG300水溶液成硅烷化合物的终浓度为2mM的表面活化点印液。将表面活化点印液移到点印孔板(95或384孔板)。用点样机点印到预设的玻片表面的探针点上，在50℃恒温箱中固化36小时。用玻璃刀标记玻片取向，将玻片浸入纯水中洗去表面上的点印液，然后浸入无水丙酮中脱水。玻片在真空或充氮气的干燥器中保存。硅烷化合物为下列化合物可得氨基活化基团：4-氨基丁基三乙氧基硅烷(4-aminobutyltriethoxysilane)；3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(3-aminopropyldimethylethoxysilane)；3-氨基丙基甲基-二乙氧基硅烷(3-aminopropylmethyldiethoxysilane)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)；3-氨基丙基三羟基硅烷(3-aminopropylsilanetriol)；3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)。硅烷化合物为下列化合物可得过氧基活化表面：2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷[2-(3，4-epoxycyclohexyl)ethyltrimethoxysilane]；2-(3，4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷[2-(3，4-epoxycyclohexyl)ethyltriethoxysilane]；5，6-环氧己基三乙氧基硅烷[5，6-epoxyhexyltriethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)mehtyldiethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)triethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane]。硅烷化合物为下列化合物可得羧基活化表面：二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮[3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride]；羧乙基三羟基硅烷(carboxyethylsilanetriol)。用下列化合物可得醛基活化表面：3-(三乙氧基硅基)丁醛[3-(triethoxysilyl)butyl aldehyde]。
(2)中介层与基质载体连接：中介层为无意义的DNA或带有羧基的聚合物。
①中介层为无意义的DNA时，无意义的DNA可以点印到带氨基的基质载体的表面上，然后用紫外线将DNA与氨基交联，多余的表面氨基再用羧酐封闭去活。另一种方法是将无意义的DNA点印到带环氧基的表面上，表面的环氧基团可直接与DNA反应形成交联。
②中介层为带有羧基的聚合物时，带有羧基的聚合物可点印到带氨基的表面上，氨基与羧基在碳化二亚胺(Carbodiimide)的存在下缩合反应形成交联。但首选的方法是将羧基的聚合物硅烷化。如此处理的羧基聚合物可点印到经酸洗但不经修饰的玻璃表面上，固化后即成稳定的带羧基中介层。所述的带有羧基的聚合物优选为聚丙烯酸，特别优选为通过如下方法制备得到的聚丙烯酸：将分子量大于30万的聚丙烯酸溶于水中制成质量体积比0.1％的聚丙烯酸溶液。取100μl质量体积比0.1％的聚丙烯酸溶液、100μl 0.1M 3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液(pH7.0)和50mg水溶性EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]混合溶解。置60℃恒温箱中反应2小时。反应物过sephadex-50柱两次除去未发应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，得到反应后的聚丙烯溶液。将反应后的聚丙烯溶液移到96或384孔板。用点样机点印到干净玻璃表面，然后置60℃恒温箱干燥固化22小时即得带聚丙烯酸中介层探针点的芯片载体。
(3)高灵敏度高特异性探针的制备：根据检测目的进行设计，用化学合成法或PCR方法进行制备，其中：
①应用化学合成法制备时，得到的DNA产物连接，得到长度为100～5000bp的高灵敏度高特异性探针；优选依次通过T4DNA磷酸化酶激酶和T4DNA连接酶，在辅助引物的协助下进行连接反应。连接的方式优选为：将DNA产物、连接酶反应缓冲液(pH7.6、50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl，10mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇dithothreitol，1mMATP)和T4DNA磷酸化酶激酶(Kinase)混合，于37℃反应；然后加入与核酸探针等摩尔的8～12bp随机序列引物，终浓度为质量体积比15％的PEG 8000，及终浓度为10-20单位的连接酶，在16℃下反应16-30小时，探针分子互相串接成大于200bp的多单元探针分子，同时连接到中介层为无意义DNA探针点上。
②通过PCR方法进行制备时，在PCR反应中加入5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐，得到的带有氨基修饰的高灵敏度高特异性探针。所述的PCR的条件优选为先在93℃变性3分钟，然后进行下系列温度循环：93℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒；进行20次循环后，加入5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐，继续循环10次，最后在72℃延长5分钟；5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸钠盐在PCR反应体系中的浓度为0.1mM。
(4)将步骤(3)得到的高灵敏度高特异性的探针点印到步骤(2)得到的连接在基质载体上的中介层的表面位点上。
①中介层为无意义的DNA时，对于化学合成法的核酸探针优选的方法是通过连接酶连接到中介层中的无意义的DNA分子上。而对于PCR扩增法制备的核酸探针或从克隆中提取的DNA片段，优选的方法是用紫外线将探针分子交联到中介层中无意义的DNA上。此外，核酸探针分子也可用化学交联物联接到中介层上。这类化学交联剂包括：1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-Butanediol diglycidyl ether)；甘油二缩水甘油醚(Glycerol diglycidyl ether)；二甘醇二缩水甘油醚(Diethylene glycol diglycidyl ether)；1，4-环己烷二甲醇二缩水甘油醚(1，4-Cyclohexanedimethanol diglycidyl ether)；新戊二醇二缩水甘油醚(Neopentyl glycoldiglycidyl ether)。
紫外线交联法的步骤优选为将DNA探针稀释到如下组成的点印液中：50mM Tris-HCl(pH7.5)，体积百分比1％乙二醇，0.2M NaCl，体积百分比5％ DMSO，质量体积比5％PEG300。探针浓度为50-150ng/μl。用点样机将探针溶液点印到有DNA中介层的探针点上。芯片用Stratalinker在254nm波长紫外线照射下交联5-15分钟。然后，用纯水漂洗芯片表面。芯片存于常温干燥器中备用。
用化学交联剂将DNA探针交联固化到有DNA中介层的探针点上，优选的步骤是将DNA探针稀释到0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中，浓度控制在75ng/μl。用点样机将探针溶液点印到有DNA中介层的探针点上。随后点印上5mM的交联剂溶液启动交联反应。反应在常温下进行2-5小时。反应后用纯水漂洗芯片表面。芯片置于0.1M硫醇溶液中将残留交联剂去活。芯片存于常温干燥器中备用。下列的化合物可用作交联剂：1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-Butanediol diglycidyl ether)；甘油二缩水甘油醚(Glycerol diglycidyl ether)；二甘醇二缩水甘油醚(Diethylene glycol diglycidyl ether)；1，4-环己烷二甲醇二缩水甘油醚(1，4-Cyclohexanedimethanol diglycidyl ether)；新戊二醇二缩水甘油醚(Neopentyl glycoldiglycidyl ether)。也可用戊二醛等交联剂将探针关联到DNA中介层上。但交联反应后，在纯水中漂洗芯片后置于2M硼氢化纳溶液中反应2-5小时，然后置2M乙胺溶液(pH9-10)中常温反应30分钟封闭未反应的醛基。
②中介层为带有羧基的聚合物时，这种中介层尤其适合用于固定带有氨基修饰的DNA探针。通过探针分子上氨基与中介层中羧基在碳化二亚胺(Carbodiimide)协助下产生的缩合反应，探针分子可共价连结到中介层上。中介层的羧基的聚合物也可经活化处理使其对氨基有特异反应活性。例如，中介层的羧基可以用羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole)活化变成对氨基有强反应性的酰基咪唑(Acylimidazole)。酰基咪唑与氨基反应可生成稳定的酰胺键。另一羧基活化法是将羧基团在EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]协助下与N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide，又称Sulfo-NHS)酯化反应变成稳定的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。NHS酯与氨基反应也可生成酰胺键，得到高特异性高灵敏度的基因芯片。
步骤(4)②中，当中介层为聚丙烯酸中介层时，将氨基化核酸探针用点样机点印到带聚丙烯酸中介层探针点上，芯片移到65℃恒温箱中干燥30分钟，在原探针点上点上新鲜配制的含0.2M EDC的50％二甲基亚砜(DMSO)水溶液。芯片移到37℃、湿度75-85％的恒温箱反应过夜(约22小时)。芯片用去离子水漂洗，移到65℃恒温箱中干燥20分钟。芯片放置在干燥器中常温保存。
优选为将聚丙烯酸中介层活化，再与氨基化核酸探针连接；所述的活化为将羧基酯化活化，从而氨基化探针与活化的羧基在温和条件形成稳定的酰胺键。
所述的活化的具体步骤为：①将羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole)溶于DMSO中制成0.2M溶液，并将此溶液用点样机点印到带聚丙烯酸中介层探针点上，在常温下反应2小时，用无水丙酮洗去反应液；
或者步骤(4)②为将EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide，sulfo-NHS)分别溶于DMSO中制备1M贮备液。将两种贮备液稀释到0.2M、pH7.2的磷酸钠溶液，制成0.1M EDC和0.1M sulfo-NHS的反应液。将此液用点样机点印到步骤(2)制备的带聚丙烯酸中介层探针点上，在常温下反应3小时，用体积百分比50％乙醇溶液洗去反应液；
所述的氨基化探针与活化的聚丙烯酸中介层的连接通过如下反应进行：将氨基化探针稀释到0.1M碳酸氢钠溶液中(pH9.0)，浓度调至75ng/μl。将探针液用点样机点印到活化的聚丙烯酸中介层探针点上，在常温(22～25℃)下反应过夜。用TE(pH7.6)缓冲液漂洗芯片，再用体积百分比80％乙醇溶液清洗即可。
上述制备方法特别适用于大规模生产用于临床检测的基因芯片。
所述的高特异性高灵敏度的基因芯片在临床中的应用，其特别适合作为检测器材在临床中进行应用。
本发明的原理：本发明采用点样法在技术操作上简易的优点，结合创新的探针制备方法及相配的芯片制作过程，从而使得生产基因芯片具备高灵敏度及高特异性优点。本发明的两大技术关键是高灵敏度及高特异性探针制备和相配基因芯片载体的制备。
本发明的芯片制造法主要采用化学合成法和PCR扩增法制备的探针原料经进一步处理使得最终探针产物在固定于基质上后探针分子能远离表面因而极大减少表面的空间阻隔效应，大大提高杂交反应的效率。而本发明提供的相配套的基质制备方法也是为此目的而设计。
目前，DNA探针制备方法主要有三种：①用化学合成法；②用PCR扩增法；③从细菌克隆中提取DNA。化学合成法制备的探针通常不会超过100bp(base pair，即碱基)，此方法的最大优点是探针的反应特异性能通过选择独特的探针序列进行严格控制，探针纯度及可靠性高而且成本相对较低；但主要缺点是探针长度有限，用目前常用的探针固定方法难以将如此短的探针分子固定在载体表面上而又不影响其杂交性能。一般情况下，化学合成法探针会被过度关联固化，至使其杂交灵敏度大大降低。因此，用化学合成法探针及点样法生产的芯片一般无法用于高灵敏度要求的场合，比如检测人类基因组片段的缺失。此类芯片多用于对灵敏性要求不高的低等生物，如细菌的研究。用PCR扩增法可较易得到长200～2000bp的DNA片段。在优化条件下，用PCR扩增法可获得长达10,000bp的DNA片段。PCR扩增法制备的探针的特异性可以通过引物(primers)的选择在一定程度控制，而所获得探针片段长度适宜，用常用的探针固定法如紫外线交联可将探针固定在基质表面上。但此法的缺点是单个扩增反应所得的探针量有限，不同扩增反应的产物产率变动悬殊。从细菌克隆中提取DNA片段用于生物芯片是最早但现在仍用的方法。这种方法的优点是较易得到大量的探针，制备成本低，而且探针片段的长度不受限制。但缺点是探针的特异性难以控制，而且经准确定位的克隆来源有限。
本发明方法的特征之一是用化学合成法所得的寡核苷酸通过如图1所示的连接酶反应可以生成长度在200碱基以上的探针分子。这种复聚后的长探针分子可直接点印到带氨基、醛基或过氧基表面上进行交联固化。但这样固化的探针分子在表面上呈平卧状构型(图2)，离表面近，空间自由度有限，因此杂交反应效率并不理想。本发明提供的一种解决办法是将表面上的探针点预先固上500-50000碱基的与被测试物无杂交反应的DNA或合成高聚物中介层，后将探针分子交联到中介层上(图3)，探针分子远离表面，空间自由度大为提高。可用的交联方法包括紫外线交联和化学交联。适合的化学交联剂为分子两端带有醛基如戊二醛或过氧基团的化合物。本发明优先选择的方法是用连接酶直接将寡核苷酸在表面上进行连接复聚反应，同时将生成的长探针分子连接到中介层DNA分子的3’末端上。这样固定的探针分子在溶液中呈伸直状构型(图4)，因此有极高的杂交反应效率(图5)。
由PCR扩增法制备的探针也可以直接点印到带有预固化的DNA中介层的探针点上，然后用紫外线或化学交联剂交联固化。更为有效的方法是在PCR扩增反应中添加入少量的氨基脱氧苷三磷酸钠，使得生成的探针平均每分子带有3至10个氨基。这种氨基修饰的探针可用一系列化学方法固定到表面上。用聚丙烯酸作为中介层固化氨基化DNA探针和以上所述的用DNA作为中介层的效果相近，但用聚丙烯酸不存在被测试物与中介层产生交叉杂交(crosshybridization)的可能性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)芯片灵敏度高而且可调
本发明的最主要成就是系统解决了现有芯片制备技术的灵敏度相对较低的难题。采用现有的点样法制备的寡核苷酸(Oligonucleotide)芯片因灵敏度过低，无法用作比较基因组杂交芯片检测复杂基因组如人类基因组中DNA拷贝数变化。而用原位合成法生产的芯片虽可用作比较基因组杂交芯片，但因灵敏度不足，往往结果并不完全可靠。本发明提供的探针制备方法及相配的芯片生产技术，成功地将点样法用于制造比较基因组杂交的寡核苷酸基因芯片。据估算，用本发明方法产生的比较基因组杂交的寡核苷酸基因芯片的灵敏度要高出原位合成法芯片的3-5倍。
本发明方法的一大优势是芯片的灵敏度可以通过增加探针分子序列的复杂性进行调节。例如将多个来自同一基因组区间的探针混合，串接成长的复杂探针分子制成芯片，这样的芯片的灵敏度比单个探针序列制成的芯片的灵敏度要高数倍。这种复合序列探针点的制备用原位合成法是无法实现的。
(2)芯片具有高特异性
芯片上探针的特异性是指探针对相似序列产生杂交发应的分辩能力。这是芯片的一个重要指标之一，它决定芯片定量测定的分辩率。探针的特异性能主要是由探针序列本身的独特性(Uniqueness)决定，在很多情况下可选择完全无交叉杂交反应的探针来实现。但很多探针序列并非完全独特，例如在人的基因组中随机挑选60bp的非重复性序列作为探针，有约20％的这类探针含有20bp以上的序列在基因组的另处可找到100％吻合(Matched)的序列。这样的探针点在正常杂交反应条件下会富集各处有20bp吻合的序列，大大降低其杂交反应的特异性。传统的补救方法是在杂交反应后，用低盐缓冲液在适当温度下漂洗(即苛洗，Stringentwash)，可有效降低由相似序列引起的交叉杂交信号。但原位合成法芯片中的探针分子是通过单个硅氧键连接到表面上的，在苛洗条件下，硅氧键会水解断裂，结果是杂交信号与探针一起被连根拨除。因此，原位合成法芯片的特异性不能通过杂交反应后苛洗加以提高，其后果是约15-25％的探针会产生假阴性结果。对此，本发明方法制备的芯片，每个探针分子与中介层形成极为稳定的共价键连接，而中介层是经多触点与基质表面交联在一起，这样的探针分子与中介层形成的构型，类似于树木的根茎状结构。作为茎的探针分子远离固体表面，有利于杂交反应，而作为根的中介层因与表面交联，能经受最严苛的漂洗。我们的比较试验表明，用本发明方法制备的芯片，在苛洗条件下(1X SCC+0.5％SDS，65℃)漂洗3小时，探针无明显的损失。但在相同条件下，原位合成法芯片会丢失95％以上的探针。
(3)芯片有极高稳定性
芯片的架上寿命(shelf life)也是衡量芯片技术优劣的重要参数之一。本发明方法将探针连接到多聚线性分子中介层上，探针分子不经饰处理，因而有效规避了Cai和Bradley基于修饰探针随带的探针在溶液中和表面上因探针分子间的自交联引起的芯片灵敏度随贮存时间不断降低的问题。用Cai和Bradley方法制备的芯片在室温下贮存超过6个月芯片的灵敏度即有明显的降低。但用本发明方法即使放置一年，其灵敏度仍无明显改变(如图8所示)。
附图说明
图1是连接酶反应生成核苷酸多连体示意图。
图2是探针分子直接与表面交联的构像示意图。
图3是探针分子交联到中介层的构像示意图。
图4是探针分子与DNA中介层分子的3’末端连接一起时的构像示意图。
图5是探针分子固定在有中介层和无中介层表面上杂交反应效率比较图。
图6是完全与未完全连接酶反应对照凝胶电泳照片图。
图7是Duchenne肌肉委缩症芯片检测到的异常与正常的比对结果曲线图，其中：
X轴为探针序号；Y轴为相对拷贝数；曲线A为正常样本与正常DNA杂交；曲线B为Duchenne样本与正常DNA杂交。
图8是本发明方法制备的芯片的稳定性与用Cai和Bradley方法制备的芯片的稳定性比较图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
Duchenne肌肉委缩症是最常见的肌肉委缩症。在约3500男孩中就有一例患者。其成因是X染色体上的一个跨距约240万碱基对的基因缺失所致。这一区间的缺失可以用基因芯片按比较基因组杂交方法进行检测。
(1)探针设计。如下的探针序列是从Duchenne区间的独特基因组序列中选出。每个探针的解链温度为75℃左右，为I组探针。
探针A：5’-GATTATATCGTGATGGCCCTCCAAAACTCCAAGTGGACATCTCGGC-3’；
探针B：5’-CCCCTGGAGATGGCAGTAGAAGGCAGAGATGAAGATCATTTGCTGAC-3’；
探针C：5’-CCTAGACTGGAAACTAGCCTAAGGGGCCTTTCCTGTGTGTCCTTTC-3’；
探针D：5’-CGCCCCCCATTCTCTCTCCAGACAAGTATGATTCAGGTGGATCTTT-3’；
探针E：5’-CCAAATATCTTCCATCTTGCTGTCCTACCCTTCCTCCTTTGCTGATCTCTAC-3’；
探针F：5’-CCAATTCCAGGAACACAAAAAACCCATGCTAAAGCACAGCCCACAGTTC-3’；
探针G：5’-CCATTTTGTCGTCCGACAGGCGCAGGAAGTAGCGGAAGAAGTTCTC-3’；
探针H：5’-GCCTTACGAGGCAATGGCTAAAGACCCACTGGCCTTGATTCATAGATTC-3’；
探针J：5’-GCCATCCTCTGTTTTTCTAGGGGGTTGTAGGGAGGTGTCATGAATAAGAA-3’；
探针K：5’-CCTCTAGTTAATCCTCCCTGACATCTTTTCAGCCTACCCCCAACCC-3’；
探针L：5’-CCCTAACCTCAGGCCCAGCAGACCCTAAAATTAAACCCTCATTTTAACATTC-3’；
探针M：5’-CCTAAATTCACTTAGGTCAGTTCACAGCAGGTGGAATTTGAGGCAGTGTGC-3’；
探针N：5’-CCTTTCCCCCTACCCTTCTTTATTTGTGTGCACCTGGGATTTGTCTTC-3’；
探针O：5’-CCTTAAGCACCACCCTTCCATCCCCAGGCCAATACACATCATATTAC-3’；
探针P：5’-GCCATGCAAGCCTTCAGACCCATGCAAAGTCCTGTCTACCTAAATGAT-3’；
探针Q：5’-CCTGGGACACTGGGAGCAGGGTCTGTTTTTAACCTATCCCGAATATAAC-3’；
探针R：5’-CCCACCCCGCTCAAACTGCTGAGGAAGGTGAACCATGCAGTTCATC-3’；
探针S：5’-GCCAAGGCTAAAGGGATACACGGAGCCAGCAGTTAGAGGCATCTAG-3’；
探针T：5’-CCTAGAAAGCGTTCATTCTACTTCAGCAGGGAACTATGGCTGTGAAGGAAAAC-3’；
探针U：5’-GCCTACTCGCCTCATAATATGGCTGAACCATCCTCAACCCTGAGTAAC-3’；
探针V：5’-CCAAAGCCAGATGACCATAACGACTTGATAGGGAGGGTTTCAAGAGAAC-3’；
如下探针是从常染体选取的参照探针，为II组探针：
探针1：5’-CCTTACTCCCTGGCTTTTTAACACATTGGAGGCAAAGAAACCC-3’；
探针2：5’-CGCCCGCCTTAATATGATTGGTTTTTGTTCCTGTCACTCTAGGATCCA-3’；
探针3：5’-CCGCCAAGACCTGTTTGCTGAGTCAGAGATAGAGGTAGCATACGATTTC-3’；
探针4：5’-GCCATCATTTTAATCCACCAAACTATCATTCTATTCATATTCACCATGAGGG-3’；
探针5：5’-AAATCATTTATGCAATCATATTATGCCAAACCTGTAATCACGACTGACCACGGC-3’；
探针6：5’-CCTGCTCCCAGGACGGGAGAGGGAAGGGTAAACGTCGTCTCGAC-3’；
探针7：5’-CCAGATCCGCCATTAAACTCGCCCAGATCAGCAGCAAAGAGTAAAAGC-3’；
探针8：5’-GCCTAAAACTCATATCTGAGGATAAGAGATTGGAATTTATAGAATCATGGAA-3’；
探针9：5’-CCTTTCATCTTCCCTTACTCCGTGTCAGGAGCATCGTCAAGCAACC-3’；
探针10：5’-CATTACTGGACAACATAATCCGCAGTTCTGTGGGAAGCAGGAAGCG-3’；
探针11：5’-CAAGACTCACTAGCCTTTGAAGAACAGGAAGCAGCCCTGGACAGAG-3’；
探针12：5’-GGTGGACTGAGTGGAAATGAGGCCAGTTTCTGCCTAGAGGACTCTT-3’；
探针13：5’-GTGAAGGGCCCATTAAGGAAGCACTTCCCCTGGTCATGATATCTAG-3’；
探针14：5’-CAAATCCACCATGTTACTTCTTTTCGTGCTTCTTGGTTAACTCCC-3’；
探针15：5’-CGAAGCCTGGAGCAGAGAAAGAGAGGGATTAAGGTTGGGAGAAAAG-3’；
探针16：5’-CATCCACATGGTCCTGCTTCTCTATGATCACCCAGTGCTCCCCCAT-3’；
探针17：5’-TGATGTAAAGGTCGTTGCCTTTGTAACTGTTCACCAGGCCTCTACC-3’；
探针18：5’-AATCAAGACCGAGTGGTAAAGAGGCCACCGAAGGAGGGCAATTT-3’；
探针19：5’-GAAAGTTCCCCTTCTCCCTTCCATGTGCTGTGGTCCCTAACTTT-3’；
探针20：5’-TCCCTCCTGCCCTAGGAGCAAACAGGTATTCCTTGCTCCTGTTTAA-3’；
探针21：5’-CATTGTTAGAACAGGCTGACTCTGCTCTCACAAACACAGGCATGCAG-3’；
探针22：5’-CGAGAGGGCGGGACTGTAAACTGCTGGACTGGAGACTGGGCTATAT-3’；
所有探针由服务商(Invitrogen)用化学合成法制备。
(2)Duchenne芯片制备
①取3μg 45-60bp的探针I组和II组分别混合后置于1.5ml离心管中。均分别加入3μl 10×T4磷酸化酶激酶缓冲液(组成为pH 7.6、0.5M Tris-HCl，0.1M MgCl2，20mM二硫苏糖醇dithiothreitol)，3μl 10mM ATP，补水至总体积为30μl。加入5单位T4磷酸化酶激酶(New EnglandBiolabs)，混匀，置于37℃恒温箱反应1小时。然后，再加30μl 2倍连接反应缓冲液(100mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇，2mM ATP，20％wt.PEG 8000)，1000单位T4连接酶(New England Biolabs)以及2μg N10随机序列辅助引物(Invitrogen)，混匀，置于15℃恒温箱反应18小时。反应后，加入7μl 5M NaCl，70μl异丙醇，混匀，置于-20℃冰箱中15分钟或更长。在14,000rpm下离心10分钟，去除上清液，用体积百分比80％的乙醇溶液漂洗沉淀，吸除乙醇溶液，空气中风干，得到长度大于600bp的多聚体(组I的探针形成高灵敏度高特异性探针，组II的探针形成的多聚体为对照)。将高灵敏度高特异性探针溶解在1×TE缓冲液并置于-20℃冰箱中保存。从图6中可以看出成功连接的高灵敏度高特异性探针条带清晰，探针碱基数目大。与此对照，在T4连接酶用量或反应时不足时，连接产物分子量较低。
②制备带DNA中介层探针点的芯片载体
取20μg Lambda DNA置于1.5ml离心管中，用50mM NaOH溶液稀释至250μl，接着加入30μl 5M NaCl和20μl 0.1M 3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷(3-glycidoxypropyltriethoxysilane)溶液，混匀，置60℃恒温箱反应2小时。加入300μl异丙醇，混匀，置于-20℃冰箱中15分钟或更长。在14,000rpm下离心10分钟，去上清液，用体积百分比80％乙醇溶液洗涤沉淀，吸除乙醇溶液，空气中风干。将风干的DNA溶于50mM NaOH溶液中，浓度调节在100～350ng/μl。加等体积0.5M Tris-HCl(pH7.0)，混匀。将DNA溶液移到96或384孔板。用点样机点印到干净玻璃表面，然后置60℃恒温箱干燥固化22小时。常温干燥环境下保存待用。
干净玻璃为低荧光背景的显微玻片，经超声波水洗去除表面吸附物后在1-2M盐酸中活化表面，表面经脱水处理后可。
③制备高灵敏度高特异性芯片
将步骤①制备的高灵敏度高特异性探针稀释到含质量体积比10％ PEG 300的0.1M醋酸钾溶液中，浓度调至100ng/μl。移到384孔板中，用点样机将探针液点印到步骤(2)制得的DNA中介层探针点的芯片载体的探针点上，芯片移到50℃恒温箱中，在湿度70-80％条件下处理60分钟，然后移到紫外线交联箱(Stratalinker)，在254nm波长紫外线照射下交联10分钟。用纯水漂洗芯片，芯片置于60％乙醇溶液中，在65℃恒温箱中处理3小时，取出芯片使其自然风干，然后置干燥器中保存。同时使用组II的探针形成的多聚体制备对照芯片。
(3)测试样本的荧光标记
取0.5μg Duchnenne患者基因组DNA用Invitrogen的CGH试剂盒按照提供的操作步骤进行荧光标记，荧光标记为cy5。取等量的正常男性对照DNA用同法制成cy3对照标记物。
(4)杂交反应
将步骤(3)制得的cy5标记DNA和cy3标记DNA在1.5mL微试管中混合，加以50μg人类Cot I DNA(约50μl)，再用5M NaCl调至终浓度为0.5M，最后加等体积的异丙醇，混和后置于-20℃冰箱中20分钟。离心沉淀DNA，去除上清液，加300μl体积百分比80％乙醇溶液漂洗两次。去除上清液后，沉淀立即用20μl TE溶解，加入100μl组成如下的反应液：2.5×SSC，体积百分比50％甲酰胺，质量体积比12％ PEG 17000，质量体积比2％SDS。混和得杂交液，然后置于90℃加热孔块(Heating block)热变性5分钟。反应液稍冷后移到高灵敏度高特异性芯片表面，用盖玻片(Coverslip)盖上并将反应液展开。芯片封在带湿度的杂交反应盒中，在45℃下，在摇架的温箱中缓慢摇动下杂交过夜(约20-22小时)。
(4)后杂交反应
杂交反应后，将芯片浸在有30mL组分为1XSSC+0.5％ SDS+0.2％ Triton-100的清洗液的有盖培养皿(Petri dish)中，待3-5分钟，用镊子将芯片与盖玻片分离。用20mL上述清洗液在室温(25℃)下漂洗两次，除去清洗液，加入30mL新清洗液，移到60℃带摇架的温箱中缓慢摇动下漂洗30分钟。取出芯片，移到脱氧去离子水中漂洗两次。用纯氮气迅速吹干芯片表面。
(5)荧光扫描及定量
芯片用Perkin Elmer微阵列荧光扫描仪将芯片上的cy3和cy5荧光讯号扫描成像。探针点的荧光强度用GenPix6.0软件分析定量。DNA的拷贝数由cy3与cy5在Duchenne区的探针点与常染色体上探针点相对强度比较分析得出。图7是一例Duchenne样本的分析结果，分别是Duchenne样本与正常DNA杂交得到的曲线和正常样本与正常DNA杂交得到的曲线，结果表明与正常样本相比，Duchenne样本在Duchenne区间因有基因片段的缺失而呈现明显的拷贝数变化(缺失)。
实施例2
(1)PCR扩增法制备高灵敏度高特异性探针(氨基化DNA探针)
取30ng人基因组DNA放到PCR反应薄壁管中，加入引物(5’-GACAAATCTTCAATCTCATTC-3’和5’-GTGCTGAATAAGGTCTGA-3’)至最终浓度为0.5μM，dNTP 0.2mM，10单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，10μl 10倍浓度PCR反应缓冲液，加水到总体为100μl。先在93℃变性3分钟，然后进行下系列温度循环：93℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒。进行20次循环后，加入10μl 1.0mM 5-氨基烯丙基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸钠盐。继续循环10次，最后在72℃延长5分钟，得到长度为650bp的PCR产物。PCR产物移到1.5ml细管中，加入10μl 5M NaCl，100μl异丙醇，置于-20℃冰箱中15分钟或更长。在14,000rpm下离心10分钟。吸去液体，用500μl 80％乙醇溶液洗涤沉淀一次。室温下风干。DNA溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，浓度为75ng/μl。此溶液可直接点印到聚丙烯酸中介层探针点上，在EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]协助下进行交联反应。
(2)制备带聚丙烯酸中介层探针点的芯片载体
将分子量大于30万的聚丙烯酸溶于水中制成质量体积比0.1％的聚丙烯酸溶液。取100μl质量体积比0.1％的聚丙烯酸溶液、100μl 0.1M 3-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液(pH7.0)和50mg水溶性EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprol)carbodiimide]混合溶解。置60℃恒温箱中反应2小时。反应物过sephadex-50柱两次除去未发应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，得到反应后的聚丙烯溶液。将反应后的聚丙烯溶液移到96或384孔板。用点样机点印到干净玻璃表面(干净玻璃为低荧光背景的显微玻片，经超声波水洗去除表面吸附物后在1-2M盐酸中活化表面，表面经脱水处理后可)，然后置60℃恒温箱干燥固化22小时即得带聚丙烯酸中介层探针点的芯片载体。芯片载体常温干燥环境下保存待用。
(3)制备带聚丙烯酸中介层探针点的芯片
将如上(1)制得的氨基化探针用点样机点印到带聚丙烯酸中介层探针点上，芯片移到65℃恒温箱中干燥30分钟，在原探针点上点上新鲜配制的含0.2M EDC的50％二甲基亚砜(DMSO)水溶液。芯片移到37℃、湿度75-85％的恒温箱反应过夜(约22小时)。芯片用去离子水漂洗，移到65℃恒温箱中干燥20分钟。芯片放置在干燥器中常温保存。
(4)制备活化聚丙烯酸中介层的芯片载体
步骤(2)制备的带聚丙烯酸中介层探针点的芯片载体可用如下两种方法将羧基酯化活化。氨基化探针与活化的羧基在温和条件形成稳定的酰胺键。
a)将羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole)溶于DMSO中制成0.2M溶液，并将此溶液用点样机点印到步骤(2)制备的带聚丙烯酸中介层探针点上，在常温下反应2小时，用无水丙酮洗去反应液。活化的芯片载体可置于干燥器中常温保存。
b)将EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide，sulfo-NHS)分别溶于DMSO中制备1M贮备液。将两种贮备液稀释到0.2M和pH7.2的磷酸钠溶液，制成0.1M EDC和0.1M sulfo-NHS的反应液。将此液用点样机点印到步骤(2)制备的带聚丙烯酸中介层探针点上，在常温下反应3小时，用体积百分比50％乙醇溶液洗去反应液。载体风干后置于干燥器中常温保存。
(5)用活化聚丙烯酸中介层的芯片载体和氨基化探针制备芯片
将氨基化探针稀释到0.1M碳酸氢钠溶液中(pH9.0)，浓度调至75ng/μl。将探针液用点样机点印到步骤(4)制备的活化聚丙烯酸中介层探针点上，在常温(22～25℃)下反应过夜。用TE(pH7.6)缓冲液漂洗芯片两次，再用体积百分比80％乙醇溶液清洗一次，芯片风干后置于干燥器中常温保存。
(6)表面带活性化学基团探针点的基质载体的制备
将硅烷化合物稀释在乙醇或异丙醇中成0.1M溶液，进一步稀释到质量体积比50％PEG300水溶液成硅烷化合物的终浓度为2mM的表面活化点印液。将表面活化点印液移到点印孔板(95或384孔板)。用点样机点印到预设的玻片表面的探针点上，在50℃恒温箱中固化36小时。用玻璃刀标记玻片取向，将玻片浸入纯水中洗去表面上的点印液，然后浸入无水丙酮中脱水。玻片在真空或充氮气的干燥器中保存。硅烷化合物为下列化合物可得氨基活化基团：4-氨基丁基三乙氧基硅烷(4-aminobutyltriethoxysilane)；3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(3-aminopropyldimethylethoxysilane)；3-氨基丙基甲基-二乙氧基硅烷(3-aminopropylmethyldiethoxysilane)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)；3-氨基丙基三羟基硅烷(3-aminopropylsilanetriol)；3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)。硅烷化合物为下列化合物可得过氧基活化表面：2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷[2-(3，4-epoxycyclohexyl)ethyltrimethoxysilane]；2-(3，4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷[2-(3，4-epoxycyclohexyl)ethyltriethoxysilane]；5，6-环氧己基三乙氧基硅烷[5，6-epoxyhexyltriethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)mehtyldiethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)triethoxysilane]；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷[(3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane]。硅烷化合物为下列化合物可得羧基活化表面：二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮[3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride]；羧乙基三羟基硅烷(carboxyethylsilanetriol)。用下列化合物可得醛基活化表面：3-(三乙氧基硅基)丁醛[3-(triethoxysilyl)butyl aldehyde]。
(7)紫外线交联法制备基因芯片
此方法能快速将探针固定到有DNA中介层的探针点。对灵敏度要求不高的芯片为首选法。步骤是将DNA探针稀释到如下组成的点印液中：50mM Tris-HCl(pH7.5)，体积百分比1％乙二醇，0.2M NaCl，体积百分比5％ DMSO，质量体积比5％ PEG300。探针浓度为50-150ng/μl。用点样机将探针溶液点印到有DNA中介层的探针点上。芯片用Stratalinker在254nm波长紫外线照射下交联5-15分钟。然后，用纯水漂洗芯片表面。芯片存于常温干燥器中备用。
(8)化学交联法制备基因芯片
用化学交联剂也可很方便将DNA探针交联固化到有DNA中介层的探针点上。步骤是将DNA探针稀释到0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中，浓度控制在75ng/μl。用点样机将探针溶液点印到有DNA中介层的探针点上。随后点印上5mM的交联剂溶液启动交联反应。反应在常温下进行2-5小时。反应后用纯水漂洗芯片表面。芯片置于0.1M硫醇溶液中将残留交联剂去活。芯片存于常温干燥器中备用。下列的化合物可用作交联剂：1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-Butanediol diglycidyl ether)；甘油二缩水甘油醚(Glycerol diglycidyl ether)；二甘醇二缩水甘油醚(Diethylene glycol diglycidyl ether)；1，4-环己烷二甲醇二缩水甘油醚(1，4-Cyclohexanedimethanol diglycidyl ether)；新戊二醇二缩水甘油醚(Neopentyl glycoldiglycidyl ether)。也可用戊二醛等交联剂将探针关联到DNA中介层上。但交联反应后，在纯水中漂洗芯片后置于2M硼氢化纳溶液中反应2-5小时，然后置2M乙胺溶液(pH9-10)中常温反应30分钟封闭未反应的醛基。
(9)带聚丙烯酸中介层探针点的基因芯片制备方法
将方法(7)制备的氨基化DNA探针溶液点印到带聚丙烯酸中介层探针点上，随后点印0.1M的EDC DMSO溶液。在常温(22-25℃)下反应2-4小时。芯片经纯水漂洗后风干，置于干燥器中常温下保存。
(10)无中介层探针点的基因芯片制备方法
对于灵敏度要求不高的基因芯片，DNA探针可直接交联到带活性化学基团的探针点表面上。虽然存在多种化学方法可将DNA探针固化到表面上，本发明方法因活性基团只限在探点内，因此本方法制备的基因芯片比通常用的整个表面都活化的芯片有更低的背景信号，芯片因此也具有比传统方法制备的芯片有更高的灵敏度和准确性。各不同化学方法的操作步骤基本类似。首先，探针DNA稀释在含20％DMSO的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中，探针浓度控制在50-150ng/μl。用点样机点印到用方法5制备的带活性化学基团探针点上。然后按不同活性基团的化学性质进行相应的后处理步骤将探针固化。本方法不但适用于基因芯片的制备，还可用于制备其他生物芯片如蛋白质芯片。制备基因芯片的探针长度最好在100碱基以上，带掺合氨基的探针效果更好。下列是不同化学基团固化反应在点印探针后的后处理方法。
过氧基表面：芯片存放在室温下湿度为70-80％的环境中16-24小时，用纯水漂洗后浸在含25％硫醇的50％酒精中保存备用。
氨基表面：芯片在70-80％湿度环境下用Stratalinker在254nm波长紫外线照射下交联5-15分钟。然后，用纯水漂洗芯片表面。芯片存于常温干燥器中备用。
醛基表面：芯片存放在室温下湿度为70-80％的环境中3-8小时，纯水中漂洗芯片后置于2M硼氢化纳溶液中反应2-5小时，芯片在纯水中漂洗后移到2M乙胺溶液(pH9-10)中常温反应30分钟，芯片在纯水中漂洗两次。丙酮表面脱水后干燥器中常温保存备用。
实施例3：有中介层与无中介层芯片的灵敏度比较
(1)DNA探针及芯片制备
用如下四组引物(primer pairs)和用30ng的人基因组DNA在标准PCR条件(94℃变性2分钟，30次如下循环：94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 20秒；最后72℃下2分钟)下进行扩增反应。分别得到长为337bp、523bp、322bp、及258bp的特异性探针约2μg。
引物1-1：5’-TGGAACCAATGCACCTACA-3’；
引物1-2：5’-GCGTGTGGATTGATGGAA-3’；
引物2-1：5’-CACTCCTTCCAGGGTGGAA-3’；
引物2-2：5’-TGGGAGCATCCAAGCAGA-3’；
引物3-1：5’-AGACATCTTGGTCTGTAG-3’；
引物3-2：5’-GTGAATATCAAATACATGTT-3’；
引物4-1：5’-AACCTCATGCTCCCTGCAG-3’；
引物4-2：5’-CAAAGGCCAGAGAATAGTG-3’。
将所得探针经乙醇沉淀处理纯化，然后溶于点印液中(50mM Tris-HCl(pH7.5)，体积百分比1％乙二醇，0.2M NaCl，5％ DMSO，质量体积比5％PEG300)，探针浓度调为75ng/μl。将探针液点印到用实例1方法(2)②制备的带Lambda DNA中介层的探针点上，芯片用Stratalinker在254nm波长紫外线照射下交联10分钟。然后，用纯水漂洗芯片表面。此为有中介层芯片。芯片风干后备用。将探针液点印到用实例2方法(6)制备的带氨基的玻片表面探针点上，在80％-90％湿度条件下，芯片用Stratalinker在254nm波长紫外线照射下交联10分钟，用清水洗净表面，由此得无中介层芯片。
(2)芯片杂交试验
由步骤(1)制备的有中介层和无中介层芯片各取一块，在合成面对面结构夹间用双面薄透明粘带将两芯片粘定，中间隔成厚度约为30微米的间隙。将含3μg带荧光标记的基因组DNA的杂交反应液(标记的具体验操作及杂交反应液和实例1中相同)充于间隙中，在60℃下反应23小时，用纯水清洗芯片，氮气吹干后用PE ScannArray5000扫描仪录取荧光图像。如图5所示两种芯片的灵敏度有明显的差别。定量分析比较结果表明有中介层的探针点的平均荧光强度是相应无中介层探针点的20到50倍。
实施例4
直接连接法制备基因芯片
将T4连接酶稀释到连接反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇，1mMATP，7.5％ PEG 8000)中，浓度为100单位/μl。用点样机点印到实施例1步骤(2)②制备的带DNA中介层探针点的芯片载体上的探针点上。
将实施例1步骤(2)③制备的高灵敏度高特异性探针稀释在连接反应缓冲液中，浓度调控到100ng/μl，加入10bp随机序列(N10)辅助引物至终浓度为20ng/μl。将此探针溶液点印到如上已附有T4连接酶的探针点上。将芯片放到湿度为60-70％、温度16℃的恒温箱反应18-20小时。然后，用纯水漂洗芯片表面。芯片存于常温干燥器中备用。
实施例5
稳定性比较
用Cai和Bradley方法制备的芯片在室温下贮存超过6个月芯片的灵敏度即有明显的降低。但用本发明方法制备得到的高特异性高灵敏度的基因芯片(实施例1制备的)即使放置一年，其灵敏度仍无明显改变(如图8所示)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高特异性高灵敏度的基因芯片，其特征在于为三层结构，底层为基质载体，中间层为中介层，顶层为核酸探针层；
所述的基质载体为经过超声表面净化处理及强酸活化的表面平整的固体，或是经过超声表面净化处理及强酸活化后再进一步进行化学修饰使表面氨基化、醛基化、环氧基团化或羧基化的表面平整的固体；
所述的中介层的组成物质为无意义DNA序列；无意义DNA序列指的是与所用杂交反应混合物无序列相似性即无杂交反应的任何DNA序列。
2.根据权利要求1所述的高特异性高灵敏度的基因芯片，其特征在于：
所述的表面氨基化是用有末端氨基的硅氧烷处理洁净表面；有末端氨基的硅氧烷为4-氨基丁基三乙氧基硅烷、 3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷、3-氨基丙基甲基-二乙氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三羟基硅烷或3-氨基丙基三甲氧基硅烷中的一种或至少两种；
所述的醛基化是用3-（三乙氧基硅基）丁醛处理表面；
所述的环氧基团化是带环氧基团的硅氧烷化合物处理表面；带环氧基团的硅氧烷化合物为2-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷或3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷中的一种或至少两种；
所述的羧基化是用带羧基的硅氧烷处理表面；带羧基的硅氧烷为二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮或羧乙基三羟基硅烷中的一种或两种；
所述的无意义DNA序列的长度为500～50000bp；
所述的核酸探针层中的核酸探针的长度为100～5000bp；
所述的核酸探针的制备方法为化学合成法或PCR方法。
3.根据权利要求2所述的高特异性高灵敏度的基因芯片，其特征在于：
所述的核酸探针为通过化学合成法制备时，得到的DNA产物需要进行连接反应，得到长度为100～5000bp的核酸探针；
所述的核酸探针为通过PCR方法进行制备时，在PCR反应中加入5-氨基烯丙基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸钠盐，得到的带有氨基修饰的核酸探针。
4.根据权利要求3所述的高特异性高灵敏度的基因芯片，其特征在于：所述的连接反应包括如下步骤：将化学合成法制备得到的DNA产物、连接酶反应缓冲液和T4 DNA磷酸化酶激酶混合，于37℃反应；然后加入与核酸探针等摩尔的8～12bp随机序列引物，终浓度为质量体积比15% 的聚乙二醇，及终浓度为10-20单位的T4 DNA连接酶，在16℃下反应16～30小时，得到互相串接、长度为100～5000bp的核酸探针；连接酶反应缓冲液的组成如下：pH7.6、50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM二硫苏糖醇，1 mM ATP；
所述的PCR反应的条件为先在93℃变性3分钟，然后进行下系列温度循环：93℃ 30秒，55 ℃ 30秒，72℃ 30秒；进行20次循环后，加入5-氨基烯丙基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸钠盐，继续循环10次，最后在72℃延长5分钟；5-氨基烯丙基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸钠盐或5-氨基烯丙基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸钠盐在PCR反应体系中的浓度为0.1mM。
5.根据权利要求4所述的高特异性高灵敏度的基因芯片，其特征在于：所述的聚乙二醇为平均分子量大于2000乙二醇线性多聚物。
6.根据权利要求4所述的高特异性高灵敏度的基因芯片，其特征在于：所述的连接反应在组分为无意义DNA的中介层上进行。
7.权利要求1～6任一项所述的高特异性高灵敏度的基因芯片的制备方法，其特征在于：
（1）基质载体的制备：基质载体经超声表面净化处理及强酸活化后使用；或是进一步进行化学修饰使表面氨基化、醛基化、环氧基团化或羧基化后使用；
（2）中介层与基质载体连接：
将无意义的DNA点印到带氨基的基质载体的表面上，然后用紫外线将DNA与氨基交联，多余的表面氨基再用羧酐封闭去活；或是将无意义的DNA点印到带环氧基的基质载体的表面上，表面的环氧基团直接与DNA反应形成交联；
（3）高灵敏度高特异性探针的制备：根据检测目的进行设计、制备得到；
（4）高特异性高灵敏度的基因芯片的制备：将步骤（3）得到的高灵敏度高特异性的探针连接到步骤（2）中的已连接在基质载体上的中介层上，得到高特异性高灵敏度的基因芯片。
8.根据权利要求7所述的高特异性高灵敏度的基因芯片的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的基质载体为低荧光背景的显微玻片，其处理过程为：经超声波水洗去除表面吸附物后在 1～2M 盐酸中活化表面，表面经脱水处理后直接用于承载经硅烷化处理的中介层；或是酸活化表面进一步处理使其带有氨基、醛基或环氧基团，用于固定无化学修饰的中介层；
步骤（4）中所述的连接为：中介层为无意义的DNA时，化学合成法的核酸探针是通过连接酶连接到中介层中的无意义的DNA分子上；PCR方法制备的核酸探针或从克隆中提取的DNA片段，是用紫外线交联法将探针分子交联到中介层中无意义的DNA上；或者通过化学交联物将核酸探针分子连接到中介层，化学交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、1,4-环己烷二甲醇二缩水甘油醚或新戊二醇二缩水甘油醚。
9.根据权利要求8所述的高特异性高灵敏度的基因芯片的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的紫外线交联法包括如下步骤：将DNA探针稀释到如下组成的点印液中：pH7.5、50 mM Tris-HCl，体积百分比1% 乙二醇，0.2 M NaCl，体积百分比5% DMSO，质量体积比5% PEG300，探针浓度为50-150ng/μl；用点样机将探针溶液点印到有DNA中介层的探针点上，芯片用Stratalinker在254 nm波长紫外线照射下交联5-15分钟；然后，用纯水漂洗芯片表面，芯片存于常温干燥器中备用；
步骤（4）中所述的通过化学交联物将核酸探针分子连接到中介层的步骤如下：将核酸探针稀释到pH7.2、0.1M 磷酸钠缓冲液中，核酸探针的浓度为75 ng/μl；接着用点样机将探针溶液点印到有DNA中介层的探针点上，随后点印上5 mM的交联剂溶液启动交联反应，反应在常温下进行2-5小时；反应后用纯水漂洗芯片表面，芯片置于0.1M硫醇溶液中将残留交联剂去活。
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